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Declaração de Ética: Todos os testes de amostras humanas foi realizada após a obtenção Institutional Review Board aprovação (IRB). 1. Extracção de DNA a partir de FFPE tecido, sangue periférico, medula óssea e Aspirar <ol><li> Para osso tecido FFPE medula com o kit de extracção de ADN FFPE <ol><li> Comece com o tecido FFPE de lâminas não coradas (5 - 10 em secções de 5 - 10? M de espessura). NOTA: Se início com aparas de tecido, usar 3 - 6 secções de 5 - 10? M de espessura e avance para o passo 1.1.6. </li><li> Colocar as lâminas em um carrinho deslizante e preparar quatro reservatórios de lavagem (duas por xileno e duas para 100% de álcool). Adicionar um volume mínimo de 600 ml de solução para cada carrinho. </li><li> Desparafinar as lâminas fazendo uma lavagem de xileno 5 min na primeira bandeja. Transferir as lâminas para o segundo reservatório de lavagem xileno durante um adicional de 5 min. </li><li> Após desparafinizao, lavar as lâminas com uma álcool 100% durante 5 min. Transferir as lâminas para a segundareservatório de lavagem de álcool durante um adicional de 5 min. </li><li> Permitir que as lâminas secar completamente sob uma capa antes raspando-as com uma lâmina de barbear para um tubo de microcentrífuga. NOTA: Se um slide de H &amp; E com a região do tumor indicado está disponível, alinhar as lâminas e raspar apenas a região do tumor. </li><li> Prossiga com as instruções do fabricante folheto incluídos no kit. </li></ol></li><li> Para BM aspirado e sangue periférico <ol><li> Extracto de acordo com as instruções folheto do fabricante com estas especificações. NOTA: Existem numerosos conjuntos e métodos de extracção de ADN a partir de tecidos e células FFPE disponíveis comercialmente. Praticamente, todos podem ser utilizados. Use um método que é criada em laboratório. <ol><li> Use 200 uL de sangue periférico (PB) ou 100 ul BM + 100 uL de PBS. </li><li> Use 4 uL de RNase A solução estoque. </li><li> Eluir com 100 mL de tampão de eluição. </li></ol></li></ol></li><li> Quantificação de DNA<ol><li> Medir as concentrações de ADN, utilizando um espectrofotómetro de assegurar um / A280 nm 260 nm de aproximadamente 1,8 (para o ADN puro). Se a proporção é sensivelmente menor, que pode indicar a presença de proteína, de fenol, ou outros contaminantes que podem interferir com as aplicações a jusante. </li><li> Ajustar as concentrações de ADN de, aproximadamente, 50 - 100 ng / mL com tampão de eluição adequado. </li></ol></li></ol> 2. Bloqueio de Tipo Selvagem de PCR <ol><li> projeto Primer <ol><li> Concepção e obtenção de iniciadores para genes de interesse de acordo com o anteriormente descrito orientações gerais do projecto de iniciador de PCR 13. Incluem-M13 para frente e reverso iniciadores de sequenciação universais em iniciadores de PCR. NOTA: O ensaio de MyD88 foi desenvolvido para amplificar o exão 5 de MyD88 (G259 - N291) e 110 nucleótidos localizados na região 5&#39; intrónica para cobrir o local de splicing e parte do intr 4. O directo e inverso foram concebidos iniciadores com um 5&#39; -M13 sequência (H13-forward: tgt aaa ACG ACG gcc agt; M13-reverso: CAG GAA ACA GCT ATG ACC) para permitir a hibridação dos iniciadores de sequenciação complementares (ver Materiais Tabela). </li></ol></li><li> Ácido nucléico bloqueado Oligonucleotide projeto <ol><li> Desenhar o oligonucleótido de bloqueio para ser de aproximadamente 10 - 15 bases de comprimento e complementar ao modelo WT, onde é desejado o enriquecimento mutante. NOTA: Um oligo mais curto irá melhorar a discriminação incompatibilidade. Para alcançar alta especificidade alvo, é importante para não usar demais nucleotídeos bloqueio pois isso pode resultar em um oligonucleotídeo muito &quot;pegajoso&quot;. O conteúdo e o comprimento de nucleótidos e bloqueio deve ser optimizar de acordo com as sequências de nucleótidos específicas que têm de ser bloqueados. É importante para conseguir a especificidade de ligação de elevada sem comprometer a estrutura secundária e correr o risco de auto-complementaridade. </li><li> Conceber o oligo de bloqueio para ter uma Tm de 10 - 15 ° C acima da temperat extensãoure durante ciclos tmicos. Ajustar a Tm por adição ou remoção de bases de bloqueio ou por substituição de bases de bloqueio para o ADN, evitando trechos longos (3 - 4 bases) de bloqueio de bases G ou C. <ol><li> Navegar até o site ferramentas de oligo (ver Tabela de Materiais) e selecione o &quot;bloqueio Oligo Tm Prediction&quot; ferramenta. </li><li> Colar a sequência do molde WT que é desejado para ser bloqueado na caixa &quot;Oligo Sequência&quot;. Adicionar &quot;+&quot; na frente de bases para indicar bases bloqueador. </li><li> Selecione o botão &quot;Calcular&quot; para determinar o aproximada T m do híbrido de ADN-Blocker. </li></ol></li><li> Conceber o oligo de bloqueio para evitar a formação de estruturas secundárias ou auto-dímeros. <ol><li> Navegar até o site ferramentas de oligo (ver Tabela de Materiais) e selecione o &quot;bloqueio Oligo Optimizer&quot; ferramenta. </li><li> Colar a sequência do molde WT que é desejado para ser bloqueado na caixa. Adicionar &quot;+&quot; na frente de bases para indicar o bloqueio bases. </li><li> Selecione as duas caixas para &quot;estrutura secundária&quot; e &quot;Self Only&quot;. Pressione o botão Analisar para analisar o oligo de estruturas secundárias potencialmente problemáticos ou auto-dímeros. NOTA: As pontuações representam estimativas muito grosseiras da T m &#39;s das estruturas secundárias e auto-dímeros. As pontuações mais baixas são portanto ideal e pode ser conseguida limitando bloqueador-bloqueador de emparelhamento. O oligonucleótido bloqueador para MyD88 [MYD88blocker (TCAGA + AG + C + G + A + C + D + G + A + T + CC / invdT /)] foi concebida para cobrir aminoácidos Q262-I266 e apresenta uma 3&#39;-invertida dT para inibir tanto a extensão por polimerase de ADN e da degradação por 3&#39;-exonuclease. Este oligo bloqueio específico é um 17-mero com 10 bases de bloqueio que são denotados como &quot;+ N&quot;. Os restantes 7 bases são nucleótidos de ADN comuns. </li></ol></li></ol></li><li> Configuração WTB-PCR e ciclos de temperatura <ol><li> Preparar um WTB-PCR mi mestrex (MMX) utilizando 2,5 mL de PCR de tampão de reacção 10 x w / 20 mM de MgCl2, 250 ^ M de dNTP, 0,2 uM iniciador directo e inverso, 1,2 uM MYD88blocker, e DNAse, RNAse-livre, ultra-pura H2O para criar uma definitiva volume da solução de 21,75 mL por reacção. NOTA: Trabalhando concentrações referem-se ao volume de reacção final de 25 ul (após a adição de DNA molde e polimerase). PCR convencional MMX é preparado por simplesmente omitindo a adição do bloqueador. Todos os passos do protocolo permanecem idênticas para ambos WTB e PCR convencional. Isso pode ser usado em validação e determinação de enriquecimento alcançado pela adição de bloqueador. <ol><li> Ao calcular a quantidade de MMX para preparar a certificar-se de que são responsáveis ​​por reacções adicionais 3 (controlos positivos e negativos e um controlo não-modelo para verificar se há contaminação) e pelo menos uma reacção adicional para erros de pipetagem. </li></ol></li><li> Vortex MMX completamente. A MMX pode ser armazenado a -80 ° C durante até ayorelha. </li><li> Adicionar 0,25 mL de Taq DNA polimerase por reacção à MMX e invertido para misturar. Uma vez que a polimerase foi adicionado à MMX, mantê-lo em gelo. </li><li> Colocar uma nova placa de 96 poços de PCR sobre uma placa fria e pipeta de 22 uL da MMX com polimerase, para cada cavidade de reacção. </li><li> Adiciona-se 3 mL de ADN genómico (50 - 100 ng / mL para cada um dos poços que contêm a MMX com polimerase. </li><li> Selar a placa e Centrifugar brevemente para garantir que a solução atinge o fundo de cada poço. </li><li> Carregar a placa de PCR num termociclador. <ol><li> Definir as condições de termociclização para a reacção WTB-PCR como se segue: desnaturação inicial a 95 ° C durante 6 minutos; 40 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 30 s, emparelhamento de iniciador a 56 ° C durante 30 s e extensão a 72 ° C durante 1 min 20 s; extensão final a 72 ° C durante 10 min. NOTA: Melhor prática envolve completar o restante do protocolo em uma área separada fisicamente para evitar a contaminação amplicon in futuras configurações. </li></ol></li></ol></li><li> Efectuar a electroforese de gel de acordo com protocolos anteriormente descritos 14, a fim de determinar se WTB-PCR foi bem sucedida e para confirmar a falta de amplificação no controlo não-molde. </li><li> Purificação de PCR produtos por esferas magnéticas <ol><li> Remover esferas magnéticas a partir de 4 ° C e trazer para a temperatura ambiente. </li><li> Transferir 10 uL do produto de PCR para uma nova placa de PCR. </li><li> Vortex as esferas magnéticas vigorosamente para voltar a suspender totalmente as partículas magnéticas. </li><li> Adicionar 18 mL esferas magnéticas a cada poço na nova placa. Pipeta misturar 10 vezes. </li><li> Incubar à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Colocar a placa de PCR para a placa de íman contornado-lado durante 2 minutos para separar as pérolas da solução. </li><li> Aspirar o sobrenadante com uma pipeta de canais múltiplos, evitando-se o sedimento de grânulo. </li><li> Dispensar 150 uL de 70% de etanol a cada poço e incubar à temperatura ambiente for pelo menos 30 s. Aspirar o etanol com uma pipeta multicanal e descartar dicas. Repetir este procedimento de lavagem mais uma vez. </li><li> Usando uma pipeta de múltiplos canais 20 uL aspirar o etanol remanescente a partir de cada cavidade e descartar dicas. </li><li> Depois dos poços são secos (~ 10 min), remover da placa íman e adicionar 40 uL de água livre de nuclease a cada poço e mistura pipeta 15 vezes ou vórtice suavemente. </li><li> Incubar à temperatura ambiente durante 2 min. </li><li> Colocar a placa de PCR no prato íman durante 1 min para separar as pérolas a partir de solução. </li><li> Transferência de 35 uL de produto purificado para uma nova placa de PCR. Este produto de PCR é purificado é agora pronto para prosseguir com a sequenciação bidireccional ou pode ser armazenado a -20 ° C até ser necessário. Nota: Quando o desenvolvimento de um novo ensaio, a quantificação de produto de PCR purificado pode ser necessária. 1-3 ng de ADN amplic / uL é ideal para sequenciação bi-direccional. Se a concentração é consistentemente baixa, aumentar o produto de PCR e magnéticos grânulos proportionally (1: 1,8). Se a concentração é consistentemente elevado, elui-se com um maior volume de água. </li></ol></li></ol> 3. Sequência de WTB-PCR produtos <ol><li> Sequenciamento Bi-direcional NOTA: O protocolo seguinte é uma forma modificada de instruções do fabricante que foi optimizado para usar menos reagentes. <ol><li> Preparar para a frente e reverso reacção de sequenciação mistura-se com 0,25 mL Pronto mistura de reacção, 1,88 mL Sequenciação Tampão, 1,78 uM M13-F ou M13-R iniciadores de sequenciação e adicionar e DNAse, RNAse-livre, ultra-pura H2O para criar uma solução final volume de 9 mL por reacção. Esta mistura de reacção de sequenciação pode ser armazenado a -20 ° C durante até um ano. </li><li> Pipeta 9 pL da mistura de reacção de sequenciação para a frente em cada poço de uma nova placa de 96 poços de PCR para a reacção de sequenciação para a frente. Repetir em uma placa separada para a reacção de sequenciação reversa. </li><li> Adicionar 1 mL do produto purificado t WTB-PCRO cada poço em ambas as placas para a frente e reverso. </li><li> Selar a placa e Centrifugar brevemente para garantir que a solução atinge o fundo de cada poço. </li><li> Carregar a placa de PCR num termociclador. <ol><li> Definir as condições de termociclização para a reacção de sequenciação como se segue: 96 ° C durante 1 min; 30 ciclos de 96 ° C durante 10 s, 50 ° C durante 5 segundos, 60 ° C durante 4 min; manter a 4 ° C até estar pronta para purificação. </li></ol></li></ol></li><li> Purificar Sequencing produtos <ol><li> Prepara-se uma solução 01:25 de acetato de fresco de sódio 3M (pH 5,2) e etanol a 100%. </li><li> Prepara-se uma solução fresca de etanol a 70%. </li><li> Adicionar 30 ul de acetato de sódio / solução de etanol a 100% a cada poço de ambas as placas para a frente e inverso de sequenciação e mistura pipeta de 5 vezes. </li><li> Selar a placa e incubar no escuro à temperatura ambiente durante 20 min. </li><li> Centrifugar a placa a 2250 xg durante 15 min. </li><li> Remova o vedante de placa e inverta sobre um desperdíciorecipiente. NOTA: Inverter apenas uma ou a pelota pode soltar a partir do fundo bem. </li><li> Colocar a placa invertida sobre uma toalha de papel limpa e centrifugar a 150 xg durante 1 min. </li><li> Adicionar 150? L de 70% etanol a cada poço. </li><li> Selar a placa e girar a 2250 xg durante 5 min. </li><li> Repita os passos 3.2.6 e 3.2.7. </li><li> Se os poços não são completamente seca, permitir-lhes secar ao ar à temperatura ambiente. Certifique-se as amostras são protegidas da luz durante a secagem. </li><li> Adicionar 10 mL de formamida a cada poço e pipeta mix 10 vezes. Selar a placa. </li><li> Desnaturar no termociclador a 95 ° C durante 3 minutos seguido de 4 ° C durante 5 min. </li><li> Após desnaturação, substituir o vedante de placa com um septo e a sequência na plataforma de sequenciação de acordo com as instruções do fabricante 15. </li></ol></li></ol> 4. Análise dos Resultados Sequencing <ol><li> Visualizar os traços de sequenciação utilizando um dat sequenciaçãoum software de análise de acordo com as instruções do fabricante 16 e alinham com as respectivas sequências de referência. MyD88 alinhar a sequcia de refercia do NCBI &quot;NM_002468&quot;. </li></ol>

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	<li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proc Natl Acad of Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li><li>Milbury, C. A., Li, J., Makrigiorgos, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-based+methods+for+the+enrichment+of+minority+alleles+and+mutations.">PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations.</a> Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).</li><li>Albitar, A., Ma, W., DeDios, I., Estella, J., Agersborg, S., Albitar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+selection+and+high+sensitivity+test+for+MYD88+mutations+using+locked+nucleic+acid.">Positive selection and high sensitivity test for MYD88 mutations using locked nucleic acid.</a> Int J Lab Hematol. 38 (2), 133-140 (2016).</li><li>Dominguez, P. L., Kolodney, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+blocking+polymerase+chain+reaction+for+detection+of+single+nucleotide+minority+mutations+from+clinical+specimens.">Wild-type blocking polymerase chain reaction for detection of single nucleotide minority mutations from clinical specimens.</a> Oncogene. 24 (45), 6830-6834 (2005).</li><li>Gray, P. N., Dunlop, C. L. M., Elliott, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Not+All+Next+Generation+Sequencing+Diagnostics+are+Created+Equal:+Understanding+the+Nuances+of+Solid+Tumor+Assay+Design+for+Somatic+Mutation+Detection.">Not All Next Generation Sequencing Diagnostics are Created Equal: Understanding the Nuances of Solid Tumor Assay Design for Somatic Mutation Detection.</a> Cancers. 7 (3), 1313-1332 (2015).</li><li>Smith, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+estimates+of+clonal+evolution+and+subclonal+heterogeneity+can+arise+from+PCR+duplicates+in+deep+sequencing+experiments.">Biased estimates of clonal evolution and subclonal heterogeneity can arise from PCR duplicates in deep sequencing experiments.</a> Genome Biol. 15 (8), 420 (2014).</li><li>Varettoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+clinical+significance+of+the+MYD88+(L265P)+somatic+mutation+in+Waldenstr&#246;m's+macroglobulinemia+and+related+lymphoid+neoplasms.">Prevalence and clinical significance of the MYD88 (L265P) somatic mutation in Waldenstr&#246;m's macroglobulinemia and related lymphoid neoplasms.</a> Blood. 121 (13), 2522-2528 (2013).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MYD88+L265P+in+Waldenstr&#246;m+macroglobulinemia,+immunoglobulin+M+monoclonal+gammopathy,+and+other+B-cell+lymphoproliferative+disorders+using+conventional+and+quantitative+allele-specific+polymerase+chain+reaction.">MYD88 L265P in Waldenstr&#246;m macroglobulinemia, immunoglobulin M monoclonal gammopathy, and other B-cell lymphoproliferative disorders using conventional and quantitative allele-specific polymerase chain reaction.</a> Blood. 121 (11), 2051-2058 (2013).</li><li>Gertz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waldenstr&#246;m+macroglobulinemia:+2012+update+on+diagnosis,+risk+stratification,+and+management.">Waldenstr&#246;m macroglobulinemia: 2012 update on diagnosis, risk stratification, and management.</a> Amer J Hematol. 87 (5), 503-510 (2012).</li><li>Salar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MYD88+(L265P)+Mutation+Confers+Very+Poor+Response+and+Outcome+after+Second-Line+Therapy+in+Patients+with+Diffuse+Large+B-Cell+Lymphoma+(DLBCL).">MYD88 (L265P) Mutation Confers Very Poor Response and Outcome after Second-Line Therapy in Patients with Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL).</a> Blood. 124 (21), 1690-1690 (2014).</li><li>Ngo, V. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenically+active+MYD88+mutations+in+human+lymphoma.">Oncogenically active MYD88 mutations in human lymphoma.</a> Nature. 470 (7332), 115-119 (2011).</li><li>Pasqualucci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+coding+genome+of+diffuse+large+B-cell+lymphoma.">Analysis of the coding genome of diffuse large B-cell lymphoma.</a> Nat Genet. 43 (9), 830-837 (2011).</li><li>Dieffenbach, C., Lowe, T., Dveksler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+concepts+for+PCR+primer+design.">General concepts for PCR primer design.</a> PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments.">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923 (2012).</li><li>Applied Biosystems. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> User Guide for Applied Biosystems 3730/3730xl DNA Analyzer. , (2014).</li><li>Applied Biosystems. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> User Guide for SeqScape Software 3. , (2012).</li><li>Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., M&#248;ller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+nucleotide+polymorphism+genotyping+using+locked+nucleic+acid+(LNA).">Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA).</a> Expert Rev Mol Diagn. 3 (1), 27-38 (2003).</li><li>Quach, N., Goodman, M. F., Shibata, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+mutation+artifacts+after+formalin+fixation+and+error+prone+translesion+synthesis+during+PCR.">In vitro mutation artifacts after formalin fixation and error prone translesion synthesis during PCR.</a> BMC Clin Pathol. 4 (1), (2004).</li><li>Gallegos Ruiz, M. I., Floor, K., Rijmen, F., Gr&#252;nberg, K., Rodriguez, J. A., Giaccone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+and+K-ras+mutation+analysis+in+non-small+cell+lung+cancer:+comparison+of+paraffin+embedded+versus+frozen+specimens.">EGFR and K-ras mutation analysis in non-small cell lung cancer: comparison of paraffin embedded versus frozen specimens.</a> Anal Cell Pathol. 29 (3), 257-264 (2007).</li><li>Solassol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KRAS+mutation+detection+in+paired+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+colorectal+cancer+tissues.">KRAS mutation detection in paired frozen and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) colorectal cancer tissues.</a> Int J Mol Sci. 12 (5), 3191-3204 (2011).</li><li>Yost, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+high-confidence+somatic+mutations+in+whole+genome+sequence+of+formalin-fixed+breast+cancer+specimens.">Identification of high-confidence somatic mutations in whole genome sequence of formalin-fixed breast cancer specimens.</a> Nucleic Acids Res. 40 (14), e107-e107 (2012).</li><li>Do, H., Wong, S. Q., Li, J., Dobrovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+sequence+artifacts+in+amplicon-based+massively+parallel+sequencing+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+DNA+by+enzymatic+depletion+of+uracil-containing+templates.">Reducing sequence artifacts in amplicon-based massively parallel sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded DNA by enzymatic depletion of uracil-containing templates.</a> Clin Chem. 59 (9), 1376-1383 (2013).</li><li>Oldenburg, R. P., Liu, M. S., Kolodney, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+amplification+of+rare+mutations+using+locked+nucleic+acid+oligonucleotides+that+competitively+inhibit+primer+binding+to+wild-type+DNA.">Selective amplification of rare mutations using locked nucleic acid oligonucleotides that competitively inhibit primer binding to wild-type DNA.</a> J Invest Dermatol. 128 (2), 398-402 (2008).</li><li>Mancini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+novel+methods+for+rapid+detection+and+quantification+of+DNMT3A+R882+mutations+in+acute+myeloid+leukemia.">Two novel methods for rapid detection and quantification of DNMT3A R882 mutations in acute myeloid leukemia.</a> J Mol Diagn. 17 (2), 179-184 (2015).</li><li>Parsons, B. L., Heflich, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+selection+methods+for+the+direct+analysis+of+point+mutations.">Genotypic selection methods for the direct analysis of point mutations.</a> Mutat Res Rev Muta Res. 387 (2), 97-121 (1997).</li><li>Liu, Q., Swiderski, P., Sommer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Truncated+amplification:+a+method+for+high-fidelity+template-driven+nucleic+acid+amplification.">Truncated amplification: a method for high-fidelity template-driven nucleic acid amplification.</a> BioTechniques. 33 (1), 129-139 (2002).</li><li>Kaur, M., Zhang, Y., Liu, W. H., Tetradis, S., Price, B. D., Makrigiorgos, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation+of+a+primer+at+a+mutation:+a+method+to+detect+low+level+mutations+in+DNA.">Ligation of a primer at a mutation: a method to detect low level mutations in DNA.</a> Mutagenesis. 17 (5), 365-374 (2002).</li><li>Albitar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Sensitivity+Testing+Shows+Multiclonal+Mutations+in+Patients+with+CLL+Treated+with+BTK+Inhibitor+and+Lack+of+Mutations+in+Ibrutinib-Naive+Patients.">High Sensitivity Testing Shows Multiclonal Mutations in Patients with CLL Treated with BTK Inhibitor and Lack of Mutations in Ibrutinib-Naive Patients.</a> Blood. 126 (23), 716 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

O ensaio WTB-PCR descrita aqui utiliza um conjunto genérico de iniciadores com um oligo de bloqueio concebido para bloquear a amplificação de ADN WT durante a extensão (Figura 1). O produto WTB-PCR é, em seguida, sequenciados para análise mutacional. O utilitário de WTB-PCR / Sanger reside na sua simplicidade, de alta sensibilidade, e de alto rendimento. Usando as diretrizes descritas aqui, a maioria dos ensaios baseados em Sanger existentes podem ser simplesmente modificadas por meio da adição de um oligonucleótido bloqueador para aumentar grandemente a sensibilidade. No exemplo aqui apresentado ensaio a adição de um único oligonucleótido bloqueador para PCR aumentou o limite de detecção de aproximadamente 16% alelo mutante em um fundo de WT para o ensaio convencional de&gt; 0,5% no ensaio de PCR WTB-3. O efeito de que é uma redução de 64% em falsos negativos observados em testes clínicos 3. Confirmando a presença de mutações em MyD88 tem impl diagnóstico e prognóstico significativoications; falsamente relatar um caso como negativo pode ter consequências graves sobre a terapia global e gestão paciente. Testando com WTB-PCR é, portanto, de grande importância, particularmente em pacientes com relativamente baixa celularidade anormal. Técnicas WTB-PCR variar consideravelmente e são por vezes referidos indiferentemente com LNA, BNA, ou ensaios de fixação de PCR ou PCR-clamp-sonda de PNA-mediadas 2, 4, 23, 24. Algumas variações utilizando WTB-PCR envolvem um ensaio qPCR o que torna necessário conceber uma sonda fluorescente adicional para cada mutação específica. Um desafio significativo associado com esta técnica inclui a necessidade de desenvolver sondas de ligação competitivos com precisão que discriminam entre alelos WT e mutantes. Além disso, porque uma sonda específica mutação é necessária, a abordagem qPCR não tem a capacidade de detectar mutatio desconhecidons. Outra variação de WTB-PCR amplificação blocos WT de uma forma específica para o alelo. Em vez de utilizar os iniciadores específicos de mutações no entanto, uma sonda específica de bloqueio para o alelo WT inibe a ligação do iniciador completo. Embora esta abordagem não requer uma sonda específica para a mutação como qPCR, ele não consegue discriminar entre mutações e erros de polimerase induzida pode levar a um aumento de falsos positivos. amplificação exponencial destas polimerases de erros induzidos por PCR podem obscurecer a detecção de eventos mutacionais raras. Qualquer abordagem que utiliza amplificação por PCR para enriquecer mutações tem sua precisão limitada pela frequência de erros de PCR 25, 26, 27. Uma vantagem fundamental da WTB-PCR / Sanger longo de muitas outras metodologias de alta sensibilidade é que ele evita a amplificação tanto molde WT e molde mutante cujas mutações ocorrem fora da região do gene alvo pelo bloqueio oligonucleotide. Portanto, os erros de PCR introduzidas por polimerases são efectivamente filtrados para fora juntamente com o ADN WT. Contrariamente ao AS-PCR ou qPCR no entanto, o enriquecimento é retido para mutações desconhecidos que ocorrem dentro da região coberta pelo oligo bloqueio. No caso de MyD88, WTB-PCR permitiu a detecção de ambos os L265P e R264 * 3 mutações. Outros relataram semelhante a detecção de mutações múltiplas, de baixa frequência, com o uso de PCR WTB-4, 28. Isso faz com que WTB-PCR ideal tanto para fins clínicos e de investigação. Juntamente com alta sensibilidade e controlos internos inerentes para eliminar falsos positivos, a flexibilidade do WTB-PCR para a adaptação de um ensaio de sequenciação existentes com muito poucos passos adicionais de criação bloqueador tornam opção atraente para muitos laboratórios com ensaios estabelecidos. O mesmo conjunto de iniciadores de PCR utilizados num ensaio convencional pode ser tipicamente utilizada na variação WTB-PCR. Otsuas alterações de protocolo que são altamente recomendadas para WTB-PCR, incluindo o tratamento com UDG de tecido FFPE e purificação de pós-PCR apropriados metodologias são igualmente transferíveis. Bloqueador de criação, por conseguinte, é o elemento crítico na implementação de um ensaio WTB-PCR. Embora as orientações apresentadas neste protocolo representam os factores mais importantes no que desenho, vários oligonucleótidos bloqueadores devem ser testados para encontrar um que bloqueia WT amplificação eficiente sem efeitos secundários para PCR. Isto inclui a adição ou a remoção de bases bloqueador para ajustar Tm, deslocando a posição do oligo de bloqueio em relação ao modelo de WT, e mudando o comprimento global do oligo. Bloqueador de experiências de titulação devem também ser utilizado para estabelecer um equilíbrio entre ocorrências aceitáveis ​​de artefactos de sequenciação e limite de detecção. Seleccionar uma metodologia apropriada para a detecção de mutações que estão presentes nas fracções celulares hora depende grandemente the aplicação e tipos de doença / mutação. Se quantificação mutante é desejada, qPCR ou digital de PCR pode oferecer soluções mais viável que WTB-PCR / Sanger. Embora WTB-PCR é principalmente um ensaio qualitativo, é possível determinar uma estimativa grosseira da frequência do alelo mutante por teste de uma amostra com convencional e WTB-PCR em paralelo. Uma vez que o limite de detecção para o ensaio convencional é de aproximadamente 10-20% do alelo mutante em um fundo de WT, que é adequado para concluir que as mutações detectadas pelo ensaio WTB-PCR, mas não o convencional estão presentes numa concentração inferior ao limite de detecção para o ensaio convencional. Alguns ensaios de oferecer a versatilidade, simplicidade e robustez da WTB-PCR. O baixo custo e tempo de resposta curto torna-a ideal para a avaliação de doença residual após terapia ou monitorização mutações resistentes emergentes durante a terapia. Além disso, a capacidade de detectar mutações anteriormente undescribed fazer WTB-PCR ideal para fins de pesquisa.

Sanger de sequenciação tem sido, tradicionalmente, o padrão de ouro em ambos os testes para mutações somáticas conhecidos e desconhecidos. Uma das limitações de Sanger de sequenciação é o seu limite de detecção (~ 10 - 20% alelo mutante em um fundo de WT) 1. Este nível de sensibilidade é inadequado para a detecção de mutações somáticas de baixo nível, que podem estar presentes em amostras a partir de tecidos pré-malignas ou doentes com algumas células tumorais em circulação, ou quando a medula óssea (BM) é irregular. Isto também faz com que a avaliação de doença residual após terapia ou detecção de mutações resistentes emergentes durante a terapia difícil por sequenciação convencional sozinho 2. Através da substituição de PCR convencional com ácido nucleico bloqueado (LNA) mediada de tipo selvagem bloqueio de PCR (WTB-PCR), na sequenciação de Sanger, sensibilidades de até 0,1% alelo mutante em um fundo de WT pode ser obtida 2, 3, 4. DentroWTB-PCR, o enriquecimento para os alelos mutantes é conseguido através da adição de uma pequena (~ 10-14 NT) de bloqueio (LNA) oligonucleótido que se liga preferencialmente ao ADN WT impedindo assim a amplificação de ADN WT. O produto WTB-PCR enriquecido mutante pode em seguida ser sequenciados. Ao bloquear ADN WT em vez de seleccionar para mutações específicas WTB-PCR permite o enriquecimento de ambas as mutações conhecidas e desconhecidas presentes em fracções celulares hora. Vários métodos são actualmente utilizados para a detecção de mutações em fracções de células pequenas. Isto inclui por PCR, do sistema específico de alelo amplificação refractário mutação (ARMS), desnaturante cromatografia líquida de alta eficiência (DHPLC), grânulos, emulsões, amplificação, e magnetos (radiante), libertação induzida por um campo eléctrico e de medição (Efirm), de alta resolução ponto de fusão e outros. No entanto, a maioria desses métodos são limitados por falsos positivos e a capacidade de detectar apenas uma mutação que o ensaio foi concebido para quatro </sup&gt;. WTB-PCR, no entanto, permite ao utilizador visualizar os traços de sequenciação que permite a detecção de vários tipos de mutação e podem auxiliar na exclusão de falsos positivos devido a artefactos ou eventos de desaminação. sequenciação próxima geração (NGS) pode oferecer uma alternativa adequada para a sequenciação convencional, no entanto, substancialmente maiores custos, complexidade e tempo de ensaio mais o tornar uma opção desnecessária para muitos tipos de doenças com alguns marcadores moleculares distintos ou para a monitorização de pacientes em terapia para emergente mutações de resistência. Além disso, as altas taxas de falsos positivos, quando detectam variantes com frequências de alelos mutantes de menos de 5% pode representar um problema para NGS à base de amplicon 5, 6. Aqui demonstramos o aumento da sensibilidade obtida por WTB-PCR em rastreio de mutações no gene de diferenciação mielóide factor de 88, tal como descrito por Albitar et al. Mutatio 3 MyD88ns são factores de diagnóstico e prognóstico importantes em Macroglobulinemia de Waldenstrom (WM), IgM monoclonal gamopatia de significado desconhecido (IgM-MGUS), linfoma da zona marginal esplénica (SMZL), e linfoma difuso de grandes células B (DLBCL). MyD88 mutações são encontrados em quase todos os casos de WM e aproximadamente 50% dos pacientes com Imunoglobulina M (IgM) secretores MGUS. Em contraste, as mutações MyD88 são encontrados em apenas 0-6% dos doentes com SMZL e estão ausentes no mieloma múltiplo 7, 8. Porque morfológica sobreposição, imunofenotípicas, citogenética, e características clínicas entre WM e SMZL ou mieloma múltiplo IgM muitas vezes pode complicar o diagnóstico diferencial, a presença de uma mutação MyD88 pode servir como um factor de identificação útil 9. MyD88 mutações também têm sido associadas com uma maior carga da doença em pacientes com DLBCL e sobrevivência global pobre seguintes terapia 7, </sup&gt; 10. Além disso, porque as mutações MyD88 são mais frequentemente encontrados na célula B semelhante (ABC) DLBCL activada do que o centro germinal B-célula-like (GCB) DLBCL ou linfoma de células B do mediastino primário (PMBL), estado de mutação MyD88 pode servir como um marcador substituto para o subtipo de ABC 11, 12. O protocolo detalhado fornecida aqui serve como um molde a partir do qual novos ensaios podem ser desenvolvidos ou a maioria dos ensaios de sequenciação existentes podem ser facilmente adaptadas para detectar com precisão as mutações de baixa frequência em vários tipos de amostras. A abordagem também pode ser utilizada para monitorar e detectar mutações resistentes que podem desenvolver-se tumores ou mesmo bactérias que podem desenvolver enquanto os pacientes estão a ser tratados com terapia direcionada ou antibióticos. Além disso, aborda e remédios muitos dos problemas associados com o enriquecimento de mutação, especialmente no tecido embebido em parafina fixado em formalina (FFPE).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 or 2 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05-402-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% alcohol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-084</td>
			<td>Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3730XL sequencer</td>
			<td>ABI</td>
			<td></td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>For magnetic bead PCR purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum sealing foils</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>T-2451-1</td>
			<td>For PCR and cold storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4337455</td>
			<td>For bi-directional sequencing. With 5X Sequencing Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804 Series</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>A-2-DWP rotor (for PCR plate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold plate for 96 well plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z606634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse, RNAse-free, ultra-pure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs (100mM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-96 Side-Skirted Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12027</td>
			<td>For use in PCR Purification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Absolute&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td>200 proof, for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exiqon website Oligo Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.exiqon.com/oligo-tools">www.exiqon.com/oligo-tools</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastStart Taq DNA polymerase (5 U/ul)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12032937001</td>
			<td>With10X concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2% agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRead DNA FFPE extraction Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>180134</td>
			<td>Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Di Formamide</td>
			<td>ABI</td>
			<td>4311320</td>
			<td>For sequencing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LNA oligonucleotide</td>
			<td>Exiqon</td>
			<td>500100</td>
			<td>5&#39;-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13-F Sequencing Primer</td>
			<td>ABI</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-tgt aaa acg acg gcc agt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13-R Sequencing Primer</td>
			<td>ABI</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-cag gaa aca gct atg acc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastercycler Pro S Thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>E950030020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Model 5430</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 ml microcentrifuge tubes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR forward primer</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR reverse primer</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR plates</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>T-3107-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20, 200, 1000 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate septa, 96 well</td>
			<td>ABI</td>
			<td>4315933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51304</td>
			<td>For BM aspirate and peripheral blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeqScape Sortware v3.0</td>
			<td>ABI</td>
			<td>4474978</td>
			<td>For sequencing analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide basket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (3M, pH 5.2)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filtered pipette tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20, 200, 1000 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer C&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex genie</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash reservoir</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>~1000 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-088</td>
			<td>Histology grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wild-type blocking pcr combined with direct sequencing as a highly sensitive method for detection of low-frequency somatic mutations

A detecção precisa e identificação de mutações de baixa frequência pode ser problemática quando se avalia doença residual após terapia, o rastreio de mutações de resistência emergente durante a terapia, ou quando os pacientes têm poucas células tumorais circulantes. De tipo selvagem bloqueio de PCR seguido por análise de sequenciação oferece alta sensibilidade, flexibilidade e simplicidade como uma metodologia para detectar essas mutações de baixa frequência. Ao adicionar um projetado bloqueado oligonucleótido ácido nucleico para um ensaio de sequenciação baseada em PCR convencional novo ou previamente estabelecida, sensibilidades de aproximadamente um alelo mutante de um fundo de 1.000 alelos WT pode ser conseguida (1: 1000). artefactos de sequenciação associados com eventos de desaminação comumente encontrados em tecidos embebidos em parafina fixados com formalina pode ser parcialmente remediada pela utilização de glicosilase de uracilo de ADN durante os passos de extracção. O protocolo optimizado aqui é específico para a detecção de mutação MyD88, mas pode servir como um modelo para conceber qualquerensaio WTB-PCR. As vantagens do ensaio de WTB-PCR em relação a outros ensaios vulgarmente utilizados para a detecção de mutações de baixa frequência, incluindo alelo específico PCR e PCR em tempo real quantitativo incluem menos ocorrências de falsos positivos, maior flexibilidade e facilidade de aplicação, e a capacidade para detectar tanto conhecida e mutações desconhecidas.

Uma visão geral conceitual de WTB-PCR durante a extensão é apresentado na Figura 1. Uma vez que um único nucleótido mal emparelhado o híbrido ADN-bloqueador diminui consideravelmente a sua temperatura de fus (? T m = 20 - 30 ° C), a amplificação do alelo WT é bloqueado enquanto ADN molde mutante é livre para completar a extensão 17. Neste modo, o DNA mutante é amplificada exponencialmente, enquanto ADN WT é amplificado linearmente. Uma demonstração do enriquecimento mutante obtida por WTB-PCR é apresentado na Figura 2. O ADN genómico de pacientes com e sem as mutações foram testados por tanto convencional e WTB-PCR e, em seguida, sequenciados para demonstrar o enriquecimento típico realizável por WTB-PCR e uma falta de falsos positivos em ADN WT. A concentração de trabalho de bloqueadores usado em WTB-PCR MMX deve ser determinado por experiências de titulação e should alcançar o nível desejado de enriquecimento mutante enquanto não resultam em falsos positivos ou bloqueando a amplificação de ADN WT inteiramente. A análise de sequenciação de produto WTB-PCR demonstra o enriquecimento para o alelo mutante e um limite de detecção de excesso de 0,5% alelo mutante em um fundo de WT em comparação com 16% em PCR convencional 3. Os efeitos deste aumento na sensibilidade em testes clínicos podem variar dependendo da quantidade relativa de células neoplásicas nas amostras testadas. Em um estudo de comparação de métodos, o ensaio de PCR-WTB aqui descrito demonstrou que 64% das mutações MyD88 iria ser dispensada por meio de testes convencionais de pacientes com WM ou MGUS 3. Um drop-off característica na intensidade do sinal (Figura 3) é visto muitas vezes, se uma concentração demasiado elevada de bloqueador é utilizado ou se pós-PCR Purificação não conseguiu remover bloqueador antes da sequenciação bi-direcional. Este último é demonstrada quando purificação pérola magnética é substituído para purificao enzimica. Embora purificação enzimática é uma opção atraente quando se trabalha com um número maior de amostras, não é apropriado para aplicação com WTB-PCR, uma vez que não consegue remover o bloqueador de solução antes da sequenciação. Um exemplo de artefactos de sequência frequentemente encontrada em ADN FFPE-derivado como um resultado da citosina desaminação (C: G&gt; T: A) são apresentados na Figura 4 3, 18, 19, 20. Embora as causas reais de desaminação da citosina está mal compreendida, qualquer ensaio baseado em PCR que enriquece para alelos mutantes irá detectar estes artefactos de baixa frequência 21, 22. Os falsos positivos devido a deaminação são evitados melhor, começando com material de modelo de alta qualidade; em muitos casos onde isto não é possível, o tratamento com glicosilase de uracilo de ADN (UDG) durante a extraco pode ajudar a limitar a frequência e intensidade de artefactos de desaminação. tratamento com UDG de tecido FFPE durante a extracção (como parte do kit de ADN FFPE) excises desaminado resíduos de citosina, impedindo assim induzida artificialmente de C: G&gt; T: A mutações. No entanto, os resíduos de 5-metilcitosina que frequentemente ocorrem em dinucleidos CpG são desaminados para a timina, o que não pode ser excisado por UDG. Os artefactos de sequenciação resultantes são bastante reconhecível e frequentemente aparecem como mutações em tandem como se vê na Figura 4. Se as amostras já ter sido extraído, o tratamento com UDG pode ser implementada em uma extracção secundária com perda de ADN relativamente baixo. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55130/55130fig1.jpg" /> Figura 1: conceptual Overview de WTB-PCR. A incompatibilidade de um único nucleótido no híbrido Bloqueador-ADN diminui Tm até 30 ° C. Ao desenhar o oligonucleótido bloqueador para ter uma Tm de 10 - 15 ° C acima da temperatura durante a extensão, a amplificação de ADN WT é bloqueado, permitindo a amplificação de ADN mutante. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55130/55130fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55130/55130fig2.jpg" /> Figura 2: O DNA genómico de pacientes com e sem as mutações foram testados por tanto convencional e WTB-PCR e, em seguida, sequenciados para demonstrar o enriquecimento típico realizável por WTB-PCR. A concentração final de bloqueador utilizados para alcançar WTB-PCR foi seleccionado para alcançar o enriquecimento máximo mutante apesar de não causar falsos positivos em ADN WT ou bloqueando amplificação de WT DNA inteiramente. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55130/55130fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55130/55130fig3.jpg" /> Figura 3: Característica queda na intensidade do sinal quando visto de purificação de PCR enzimática é usada em vez de esferas magnéticas. Isto é provavelmente porque purificação enzimática não consegue remover bloqueador antes da sequenciação bi-direccional. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55130/55130fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55130/55130fig4.jpg" /> Figura 4: C: G&gt; T: v A artefactos de sequenciação surgir no tecido FFPE quando citosina metilada ou citosina são desaminadosIA formalina fixação de uracilo ou timina, respectivamente. Uracil-ADN-glicosilase (UDG) pode excisar uracilo antes WTB-PCR ajudando a reduzir os artefactos de sequenciação. No entanto, timina resultante da desaminado 5-metilcitosina, que freqüentemente ocorre em ilhas CpG, não pode ser retirado por UDG. Diminuir a concentração de bloqueadores usado em WTB-PCR pode ajudar a reduzir a ocorrência de artefactos de sequenciação que não sejam remediadas por tratamento com UDG. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55130/55130fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations at JoVE.com

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.

De tipo selvagem Bloqueio de PCR combinada com sequenciação directa como um método altamente sensível para a detecção de Baixa Frequência mutações somáticas

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

wild-type-blocking-pcr-combined-with-direct-sequencing-as-highly

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

11.6K visualizações.  NeoGenomics Laboratories. Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.

Vídeo: Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

Detecção de Copy Number Alterações Usando Sequencing única célula

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Genética

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been investigated in various organs and tissues in rat. However, standard methods for the purification of miRNAs and detection of their expression in rat peritoneal membrane have not been well established. We have developed an effective and reliable method to purify and quantify miRNAs using quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) in rat peritoneal membrane. This protocol consists of four steps: 1) purification of peritoneal membrane sample; 2) purification of total RNA including miRNA from peritoneal membrane sample; 3) reverse transcription of miRNA to produce cDNA; and 4) qRT-PCR to detect miRNA expression. Using this protocol, we successfully determined that the expression of six miRNAs (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327, and miRNA-34a-5p) increased significantly in the peritoneal membrane of a rat peritoneal fibrosis model compared with those in control groups. This protocol can be used to study the profile of miRNA expression in the peritoneal membrane of rats in many pathological conditions.

Here we present a protocol for the detection of microRNA expression in rat peritoneal membrane using quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction. This method is suitable for studying the microRNA expression profile in rat peritoneal membrane in several pathological conditions.

Detecção da expressão de microRNA na Membrana Peritoneal de Ratos Usando PCR Quantitativa em Tempo Real

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

Isolamento do DNA robusto e construção de biblioteca de sequenciamento de alto rendimento para espécimes de herbário

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

Deteção de evento raro usando o DNA de correção de erro e a sequenciação do ARN

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a routine procedure is widely utilized throughout the world and its main limitation resides in the poor efficacy of transgene integration, resulting in a low yield of founder animals. Only few percent of animals born after implantation of injected fertilized oocytes have integrated the transgene. In contrast, lentiviral vectors are powerful tools for integrative gene transfer and their use to transduce fertilized oocytes allows highly efficient production of founder transgenic mice with an average yield above 70%. Furthermore, any mouse strain can be used to produce transgenic animal and the penetrance of transgene expression is extremely high, above 80% with lentiviral mediated transgenesis compared to DNA microinjection. The size of the DNA fragment that can be cargo by the lentiviral vector is restricted to 10 kb and represents the major limitation of this method. Using a simple and easy to perform injection procedure beneath the zona pellucida of fertilized oocytes, more than 50 founder animals can be produced in a single session of microinjection. Such a method is highly adapted to perform, directly in founder animals, rapid gain and loss of function studies or to screen genomic DNA regions for their ability to control and regulate gene expression in vivo.

Here, we present a protocol to promote transgene integration and production of founder transgenic mice with high efficacy by a simple injection of a lentiviral vector in the perivitelline space of a fertilized oocyte.

Particulas de Lentivirus mediada produção de camundongos transgênicos: um método simples e altamente eficiente para estudo direto dos fundadores

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near full-length (intact and defective), HIV-1 proviruses. FLIPS allows determination of the genetic composition of integrated HIV-1 within a cell population. Through identifying defects within HIV-1 proviral sequences that arise during reverse transcription, such as large internal deletions, deleterious stop codons/hypermutation, frameshift mutations, and mutations/deletions in cis acting elements required for virion maturation, FLIPS can identify integrated proviruses incapable of replication. The FLIPS assay can be utilized to identify HIV-1 proviruses that lack these defects and are&#160;therefore potentially replication-competent. The FLIPS protocol involves: lysis of HIV-1 infected cells, nested PCR of near full-length HIV-1 proviruses (using primers targeted to the HIV-1 5&#39; and 3&#39; LTR), DNA purification and quantification, library preparation for Next-generation Sequencing (NGS), NGS, de novo assembly of proviral contigs, and a simple process of elimination for identifying replication-competent proviruses. FLIPS provides advantages over traditional methods designed to sequence integrated HIV-1 proviruses, such as single-proviral sequencing. FLIPS amplifies and sequences near full-length proviruses enabling replication competency to be determined, and also uses fewer amplification primers, preventing the consequences of primer mismatches. FLIPS is a useful tool for understanding the genetic landscape of integrated HIV-1 proviruses, especially within the latent reservoir, however, its utilization can extend to any application in which the genetic composition of integrated HIV-1 is required.

Full-length individual proviral sequencing (FLIPS) provides an efficient and high-throughput method for the amplification and sequencing of single, near full-length (intact and defective) HIV-1 proviruses and allows for determination of their potential replication-competency. FLIPS overcomes limitations of previous assays designed to sequence the latent HIV-1 reservoir.

Amplificação de perto completos provírus HIV-1 para a próxima geração de sequenciamento

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation into thousands of nano-sized water-in-oil individual reactions. Recently, ddPCR has become one of the most accurate and sensitive tools for circulating tumor DNA (ctDNA) detection. One of the major limitations of the standard ddPCR technique is the restricted number of mutations that can be screened per reaction, as specific hydrolysis probes recognizing each possible allelic version are required. An alternative methodology, the drop-off ddPCR, increases throughput, since it requires only a single pair of probes to detect and quantify potentially all genetic alterations in the targeted region. Drop-off ddPCR displays comparable sensitivity to conventional ddPCR assays with the advantage of detecting a greater number of mutations in a single reaction. It is cost-effective, conserves precious sample material, and can also be used as a discovery tool when mutations are not known a priori.

Here, we present a protocol to accurately quantify multiple genetic alterations of a target region in a single reaction using drop-off ddPCR and a unique pair of hydrolysis probes.

Reação em Cadeia da Polimerase Digital de Gota Única para Detecção Abrangente e Simultânea de Mutações em Regiões de Hotspot

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to perform and its ability to standardize the fitness of many strains to a wild-type organism. The technique is limited, however, by available phenotypic markers and the number of strains that can be assessed simultaneously, creating the need for a great number of replicate experiments. Concurrent with large numbers of experiments, the labor and material costs for quantifying bacteria based on phenotypic markers are not insignificant. To overcome these negative aspects while retaining the positive aspects, we have developed a molecular-based approach to directly quantify microorganisms after engineering genetic markers onto bacterial chromosomes. Unique, 25 base pair DNA barcodes were inserted at an innocuous locus on the chromosome of wild-type and mutant strains of Salmonella. In vitro competition experiments were performed using inocula consisting of pooled strains. Following the competition, the absolute numbers of each strain were quantified using digital PCR and the competitive indices for each strain were calculated from those values. Our data indicate that this approach to quantifying Salmonella is extremely sensitive, accurate, and precise for detecting both highly abundant (high fitness) and rare (low fitness) microorganisms. Additionally, this technique is easily adaptable to nearly any organism with chromosomes capable of modification, as well as to various experimental designs that require absolute quantification of microorganisms.

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

This molecular-based approach for determining bacterial fitness facilitates precise and accurate detection of microorganisms using unique genomic DNA barcodes that are quantified via digital PCR. The protocol describes calculating the competitive index for Salmonella strains; however, the technology is readily adaptable to protocols requiring absolute quantification of any genetically-malleable organism.

Índice competitivo baseado em PCR digital para análise de alta produtividade de aptidão em Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

Validating Whole Genome Nanopore Sequencing, using Usutu Virus as an Example

Whole genome sequencing can be used to characterize and to trace viral outbreaks. Nanopore-based whole genome sequencing protocols have been described for several different viruses. These approaches utilize an overlapping amplicon-based approach which can be used to target a specific virus or group of genetically related viruses. In addition to confirmation of the virus presence, sequencing can be used for genomic epidemiology studies, to track viruses and unravel origins, reservoirs and modes of transmission. For such applications, it is crucial to understand possible effects of the error rate associated with the platform used. Routine application in clinical and public health settings require that this is documented with every important change in the protocol. Previously, a protocol for whole genome Usutu virus sequencing on the nanopore sequencing platform was validated (R9.4 flowcell) by direct comparison to Illumina sequencing. Here, we describe the method used to determine the required read coverage, using the comparison between the R10 flow cell and Illumina sequencing as an example.

We previously validated a protocol for amplicon-based whole genome Usutu virus (USUV) sequencing on a nanopore sequencing platform. Here, we describe the methods used in more detail and determine the error rate of the nanopore R10 flow cell.

Validando o sequenciamento de nanoporos de genoma inteiro, usando o vírus Usutu como exemplo

Whole genome sequencing can be used to characterize and to trace viral outbreaks. Nanopore-based whole genome sequencing protocols have been described for ...

Optimization for Sequencing and Analysis of Degraded FFPE-RNA Samples

Gene expression analysis by RNA sequencing (RNA-seq) enables unique insights into clinical samples that can potentially lead to mechanistic understanding of the basis of various diseases as well as resistance and/or susceptibility mechanisms. However, FFPE tissues, which represent the most common method for preserving tissue morphology in clinical specimens, are not the best sources for gene expression profiling analysis. The RNA obtained from such samples is often degraded, fragmented, and chemically modified, which leads to suboptimal sequencing libraries. In turn, these generate poor quality sequence data that may not be reliable for gene expression analysis and mutation discovery. In order to make the most of FFPE samples and obtain the best possible data from low quality samples, it is important to take certain precautions while planning experimental design, preparing sequencing libraries, and during data analysis. This includes the use of appropriate metrics for precise sample quality control (QC), identifying the best methods for various steps during the sequencing library generation, and careful library QC. In addition, applying correct software tools and parameters for sequence data analysis is critical in order to identify artifacts in RNA-seq data, filter out contamination and low quality reads, assess uniformity of gene coverage, and measure the reproducibility of gene expression profiles among biological replicates. These steps can ensure high accuracy and reproducibility for profiling of very heterogeneous RNA samples. Here we describe the various steps for sample QC, library preparation and QC, sequencing, and data analysis that can help to increase the amount of useful data obtained from low quality RNA, such as that obtained from FFPE-RNA tissues.

This method describes the steps to improve the quality and quantity of sequence data that can be obtained from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) RNA samples. We describe the methodology to more accurately assess the quality of FFPE-RNA samples, prepare sequencing libraries, and analyze the data from FFPE-RNA samples.

Otimização para Sequenciamento e Análise de Amostras de RNA FFPE-RNA degradadas

Gene expression analysis by RNA sequencing (RNA-seq) enables unique insights into clinical samples that can potentially lead to mechanistic understanding ...