The authors have no acknowledgements.

<ol>
	<li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proc Natl Acad of Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li><li>Milbury, C. A., Li, J., Makrigiorgos, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-based+methods+for+the+enrichment+of+minority+alleles+and+mutations.">PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations.</a> Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).</li><li>Albitar, A., Ma, W., DeDios, I., Estella, J., Agersborg, S., Albitar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+selection+and+high+sensitivity+test+for+MYD88+mutations+using+locked+nucleic+acid.">Positive selection and high sensitivity test for MYD88 mutations using locked nucleic acid.</a> Int J Lab Hematol. 38 (2), 133-140 (2016).</li><li>Dominguez, P. L., Kolodney, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+blocking+polymerase+chain+reaction+for+detection+of+single+nucleotide+minority+mutations+from+clinical+specimens.">Wild-type blocking polymerase chain reaction for detection of single nucleotide minority mutations from clinical specimens.</a> Oncogene. 24 (45), 6830-6834 (2005).</li><li>Gray, P. N., Dunlop, C. L. M., Elliott, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Not+All+Next+Generation+Sequencing+Diagnostics+are+Created+Equal:+Understanding+the+Nuances+of+Solid+Tumor+Assay+Design+for+Somatic+Mutation+Detection.">Not All Next Generation Sequencing Diagnostics are Created Equal: Understanding the Nuances of Solid Tumor Assay Design for Somatic Mutation Detection.</a> Cancers. 7 (3), 1313-1332 (2015).</li><li>Smith, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+estimates+of+clonal+evolution+and+subclonal+heterogeneity+can+arise+from+PCR+duplicates+in+deep+sequencing+experiments.">Biased estimates of clonal evolution and subclonal heterogeneity can arise from PCR duplicates in deep sequencing experiments.</a> Genome Biol. 15 (8), 420 (2014).</li><li>Varettoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+clinical+significance+of+the+MYD88+(L265P)+somatic+mutation+in+Waldenstr&#246;m's+macroglobulinemia+and+related+lymphoid+neoplasms.">Prevalence and clinical significance of the MYD88 (L265P) somatic mutation in Waldenstr&#246;m's macroglobulinemia and related lymphoid neoplasms.</a> Blood. 121 (13), 2522-2528 (2013).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MYD88+L265P+in+Waldenstr&#246;m+macroglobulinemia,+immunoglobulin+M+monoclonal+gammopathy,+and+other+B-cell+lymphoproliferative+disorders+using+conventional+and+quantitative+allele-specific+polymerase+chain+reaction.">MYD88 L265P in Waldenstr&#246;m macroglobulinemia, immunoglobulin M monoclonal gammopathy, and other B-cell lymphoproliferative disorders using conventional and quantitative allele-specific polymerase chain reaction.</a> Blood. 121 (11), 2051-2058 (2013).</li><li>Gertz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waldenstr&#246;m+macroglobulinemia:+2012+update+on+diagnosis,+risk+stratification,+and+management.">Waldenstr&#246;m macroglobulinemia: 2012 update on diagnosis, risk stratification, and management.</a> Amer J Hematol. 87 (5), 503-510 (2012).</li><li>Salar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MYD88+(L265P)+Mutation+Confers+Very+Poor+Response+and+Outcome+after+Second-Line+Therapy+in+Patients+with+Diffuse+Large+B-Cell+Lymphoma+(DLBCL).">MYD88 (L265P) Mutation Confers Very Poor Response and Outcome after Second-Line Therapy in Patients with Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL).</a> Blood. 124 (21), 1690-1690 (2014).</li><li>Ngo, V. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenically+active+MYD88+mutations+in+human+lymphoma.">Oncogenically active MYD88 mutations in human lymphoma.</a> Nature. 470 (7332), 115-119 (2011).</li><li>Pasqualucci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+coding+genome+of+diffuse+large+B-cell+lymphoma.">Analysis of the coding genome of diffuse large B-cell lymphoma.</a> Nat Genet. 43 (9), 830-837 (2011).</li><li>Dieffenbach, C., Lowe, T., Dveksler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+concepts+for+PCR+primer+design.">General concepts for PCR primer design.</a> PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments.">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923 (2012).</li><li>Applied Biosystems. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> User Guide for Applied Biosystems 3730/3730xl DNA Analyzer. , (2014).</li><li>Applied Biosystems. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> User Guide for SeqScape Software 3. , (2012).</li><li>Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., M&#248;ller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+nucleotide+polymorphism+genotyping+using+locked+nucleic+acid+(LNA).">Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA).</a> Expert Rev Mol Diagn. 3 (1), 27-38 (2003).</li><li>Quach, N., Goodman, M. F., Shibata, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+mutation+artifacts+after+formalin+fixation+and+error+prone+translesion+synthesis+during+PCR.">In vitro mutation artifacts after formalin fixation and error prone translesion synthesis during PCR.</a> BMC Clin Pathol. 4 (1), (2004).</li><li>Gallegos Ruiz, M. I., Floor, K., Rijmen, F., Gr&#252;nberg, K., Rodriguez, J. A., Giaccone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+and+K-ras+mutation+analysis+in+non-small+cell+lung+cancer:+comparison+of+paraffin+embedded+versus+frozen+specimens.">EGFR and K-ras mutation analysis in non-small cell lung cancer: comparison of paraffin embedded versus frozen specimens.</a> Anal Cell Pathol. 29 (3), 257-264 (2007).</li><li>Solassol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KRAS+mutation+detection+in+paired+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+colorectal+cancer+tissues.">KRAS mutation detection in paired frozen and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) colorectal cancer tissues.</a> Int J Mol Sci. 12 (5), 3191-3204 (2011).</li><li>Yost, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+high-confidence+somatic+mutations+in+whole+genome+sequence+of+formalin-fixed+breast+cancer+specimens.">Identification of high-confidence somatic mutations in whole genome sequence of formalin-fixed breast cancer specimens.</a> Nucleic Acids Res. 40 (14), e107-e107 (2012).</li><li>Do, H., Wong, S. Q., Li, J., Dobrovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+sequence+artifacts+in+amplicon-based+massively+parallel+sequencing+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+DNA+by+enzymatic+depletion+of+uracil-containing+templates.">Reducing sequence artifacts in amplicon-based massively parallel sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded DNA by enzymatic depletion of uracil-containing templates.</a> Clin Chem. 59 (9), 1376-1383 (2013).</li><li>Oldenburg, R. P., Liu, M. S., Kolodney, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+amplification+of+rare+mutations+using+locked+nucleic+acid+oligonucleotides+that+competitively+inhibit+primer+binding+to+wild-type+DNA.">Selective amplification of rare mutations using locked nucleic acid oligonucleotides that competitively inhibit primer binding to wild-type DNA.</a> J Invest Dermatol. 128 (2), 398-402 (2008).</li><li>Mancini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+novel+methods+for+rapid+detection+and+quantification+of+DNMT3A+R882+mutations+in+acute+myeloid+leukemia.">Two novel methods for rapid detection and quantification of DNMT3A R882 mutations in acute myeloid leukemia.</a> J Mol Diagn. 17 (2), 179-184 (2015).</li><li>Parsons, B. L., Heflich, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+selection+methods+for+the+direct+analysis+of+point+mutations.">Genotypic selection methods for the direct analysis of point mutations.</a> Mutat Res Rev Muta Res. 387 (2), 97-121 (1997).</li><li>Liu, Q., Swiderski, P., Sommer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Truncated+amplification:+a+method+for+high-fidelity+template-driven+nucleic+acid+amplification.">Truncated amplification: a method for high-fidelity template-driven nucleic acid amplification.</a> BioTechniques. 33 (1), 129-139 (2002).</li><li>Kaur, M., Zhang, Y., Liu, W. H., Tetradis, S., Price, B. D., Makrigiorgos, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation+of+a+primer+at+a+mutation:+a+method+to+detect+low+level+mutations+in+DNA.">Ligation of a primer at a mutation: a method to detect low level mutations in DNA.</a> Mutagenesis. 17 (5), 365-374 (2002).</li><li>Albitar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Sensitivity+Testing+Shows+Multiclonal+Mutations+in+Patients+with+CLL+Treated+with+BTK+Inhibitor+and+Lack+of+Mutations+in+Ibrutinib-Naive+Patients.">High Sensitivity Testing Shows Multiclonal Mutations in Patients with CLL Treated with BTK Inhibitor and Lack of Mutations in Ibrutinib-Naive Patients.</a> Blood. 126 (23), 716 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

فحص WTB-PCR الموصوفة هنا يستخدم مجموعة عامة من الاشعال مع جزئية منع يهدف إلى منع التضخيم من WT DNA خلال تمديد (الشكل 1). ثم التسلسل المنتج WTB-PCR لتحليل طفرية. فائدة WTB-PCR / سانجر تكمن في بساطته، ذات حساسية عالية، والإنتاجية العالية. باستخدام الإرشادات الموضحة هنا، فإن معظم المقايسات القائمة سانجر أساس يمكن تعديلها ببساطة عن طريق إضافة قليل النوكليوتيد حجب لزيادة كبيرة في الحساسية. في المثال فحص المقدمة هنا زادت إضافة قليل النوكليوتيد الحجب واحد لPCR الحد من الكشف عن حوالي 16٪ أليل متحولة في خلفية WT للمقايسة التقليدية إلى&gt; 0.5٪ في فحص WTB-PCR 3. وأثر ذلك هو تخفيض 64٪ في السلبيات كاذبة ينظر في الاختبارات السريرية 3. مؤكدا وجود طفرات في MYD88 ديه impl التشخيص والنذير كبيرications. بلاغ كاذب عن القضية بأنها سلبية قد تكون له عواقب خطيرة على العلاج الشامل والتعامل مع المرضى. اختبار مع WTB-PCR ذلك من أهمية كبيرة، خاصة في المرضى الذين يعانون الخلوية غير الطبيعية منخفضة نسبيا. تقنيات WTB-PCR تختلف إلى حد كبير ويشار أحيانا إلى بالتبادل مع LNA، BNA، أو بوساطة السلطة الوطنية الفلسطينية-PCR لقط أو PCR-المشبك مسبار المقايسات 2 و 4 و 23 و 24. بعض الاختلافات الاستفادة WTB-PCR تنطوي على فحص QPCR الذي يستوجب تصميم التحقيق الفلورسنت إضافي لكل طفرة معينة. يتضمن تحديا كبيرا المرتبطة مع هذه التقنية الحاجة إلى تطوير تحقيقات ملزمة تنافسية التي تميز بدقة بين الأليلات WT ومتحولة. وعلاوة على ذلك، لأنه لا بد من تحقيق طفرة محددة، ونهج QPCR يفتقر إلى القدرة على الكشف عن mutatio غير معروفنانو ثانية. اختلاف آخر من WTB-PCR كتل WT التضخيم بطريقة-أليل معين. بدلا من استخدام بادئات-طفرة معينة ومع ذلك، محددة عرقلة التحقيق لالأليل WT يمنع التمهيدي الكامل ملزمة. في حين لا يتطلب هذا النهج تحقيق-طفرة معينة مثل QPCR، فإنه فشل في التمييز بين الطفرات والأخطاء الناجمة عن البلمرة يمكن أن يؤدي إلى زيادة ايجابيات كاذبة. التضخيم الهائل من تلك الأخطاء البلمرة التي يسببها من خلال PCR قد تخفي الكشف عن أحداث طفرة وراثية نادرة. أي نهج يستخدم PCR التضخيم لإثراء للطفرات ودقتها محدودة بسبب تكرار أخطاء PCR 25 و 26 و 27. وهناك ميزة أساسية من WTB-PCR / سانجر على العديد من المنهجيات ذات حساسية عالية الأخرى هو أنه يمنع التضخيم كل قالب WT ومتحولة القالب الذي يحدث خارج المنطقة الجينات المستهدفة من قبل oligonucleoti حجب الطفراتدي. لذلك، يتم تصفيتها الأخطاء PCR الذي عرضته بلمرة بفعالية جنبا إلى جنب مع WT DNA. وخلافا للAS-PCR أو QPCR ومع ذلك، يتم الاحتفاظ تخصيب للطفرات غير معروفة التي تحدث داخل المنطقة بنسبة ضئيلة منع تغطيتها. في حالة MYD88، سمح WTB-PCR للكشف عن كل من L265P وR264 * الطفرات 3. وأفادت الآخرين بالمثل كشف متعددة، والطفرات التردد المنخفض مع استخدام WTB-PCR 4، 28. وهذا يجعل WTB-PCR مثالية لكل من البحث وأغراض الطبية. جنبا إلى جنب مع حساسية عالية والضوابط الداخلية الكامنة للقضاء على ايجابيات كاذبة، والمرونة WTB-PCR لتكييف مقايسة تسلسل القائمة مع عدد قليل جدا من خطوات إضافية مع تصميم مانع جعلها خيارا جذابا لكثير من مختبرات مع المقايسات المعمول بها. يمكن عادة نفس مجموعة الاشعال PCR تستخدم في فحص التقليدي أن تستخدم في الاختلاف WTB-PCR. بعد التمديدالتغييرات بروتوكول لها ويوصى بشدة لWTB-PCR-بما في ذلك العلاج UDG من الأنسجة FFPE وتنقية ما بعد PCR المناسبة منهجيات وللتحويل على حد سواء. تصميم مانع، لذلك هو عنصر حاسم في تنفيذ فحص WTB-PCR. على الرغم من أن المبادئ التوجيهية الواردة في هذا البروتوكول تمثل أهم العوامل ذات الصلة في هذا التصميم، وينبغي اختبار مختلف أليغنوكليوتيد حجب العثور على واحد الذي يمنع WT التضخيم بكفاءة دون آثار الثانوية لPCR. يتضمن هذا إضافة أو إزالة القواعد مانع لضبط T م، تحول موقف بنسبة ضئيلة حجب نسبة إلى قالب WT، وتغيير الطول الإجمالي للبنسبة ضئيلة. وينبغي أيضا أن تستخدم مانع التجارب المعايرة لإقامة توازن بين الحوادث مقبولة من التحف التسلسل والحد من الكشف. اختيار منهجية ملائمة للكشف عن الطفرات التي تكون موجودة في أجزاء الخلية الدقيقة يعتمد إلى حد كبير على التطبيق البريد وأنواع المرض / الطفرة. إذا كان المطلوب الكمي متحولة، QPCR أو رقمية PCR قد تقدم حلولا أكثر قدرة على البقاء من WTB-PCR / سانجر. على الرغم من WTB-PCR هو في المقام الأول الفحص النوعي، فمن الممكن لتحديد تقدير تقريبي للتردد أليل متحولة عن طريق اختبار عينة مع التقليدية وWTB-PCR في نفس الوقت. لأن الحد من الكشف عن الفحص التقليدي ~ 10 - أليل متحولة 20٪ في خلفية WT، فمن المناسب أن نخلص إلى أن الطفرات الكشف عنها بواسطة الفحص WTB-PCR ولكن ليس التقليدية موجودة بتركيز أقل من الحد الكشف عن الفحص التقليدي. بضعة فحوصات توفر التنوع والبساطة ومتانة WTB-PCR. منخفضة التكلفة والفترة الزمنية قصيرة يجعلها مثالية لتقييم مرض المتبقية بعد العلاج أو مراقبة الطفرات المقاومة الناشئة خلال فترة العلاج. بالإضافة إلى ذلك، القدرة على الكشف عن الطفرات غير موصوف سابقا تجعل WTB-PCR مثالية لأغراض البحث.

وكان سانجر تسلسل تقليديا معيار الذهب في اختبار لكل من الطفرات الجسدية المعروفة وغير المعروفة. واحد من أوجه القصور في سانجر التسلسل هو الحد الأقصى لها من الكشف (~ 10-20٪ أليل متحولة في خلفية WT) 1. هذا المستوى من الحساسية غير مناسب للكشف عن الطفرات الجسدية المستوى المنخفض التي قد تكون موجودة في عينات من أنسجة ما قبل سرطان أو المرضى الذين يعانون من بعض تعميم الخلايا السرطانية، أو عندما نخاع العظم (BM) غير متجانس. وهذا أيضا يجعل تقييم المرض المتبقية بعد العلاج أو الكشف عن الطفرات المقاومة الناشئة خلال فترة العلاج الصعبة التي التسلسل التقليدي وحده 2. من خلال استبدال PCR التقليدية مع الحمض النووي مقفل (LNA) بوساطة من النوع البري منع PCR (WTB-PCR) في سانجر تسلسل والحساسيات تصل إلى 0.1٪ أليل متحولة في خلفية WT يمكن أن يتحقق 2 و 3 و 4. فيWTB-PCR، ويتحقق إثراء لالأليلات متحولة عن طريق إضافة قصيرة (~ 10-14 NT) منع (LNA) النوكليوتيد التي ترتبط بشكل تفضيلي WT DNA وبالتالي منع التضخيم من WT DNA. والتخصيب المنتج WTB-PCR متحولة يمكن بعد ذلك التسلسل. من خلال منع WT DNA بدلا من اختيار للطفرات محددة WTB-PCR يسمح لتخصيب كل من الطفرات المعروفة وغير المعروفة الموجودة في أجزاء الخلية دقيقة. وتستخدم أساليب متعددة في الوقت الحالي للكشف عن الطفرات في خلايا صغيرة كسور. وهذا يشمل PCR، التضخيم الحرارية نظام أليل محددة طفرة (ARMS)، تغيير طبيعة عالية الأداء اللوني السائل (DHPLC)، والخرز، والمستحلبات، والتضخيم، والمغناطيسية (مبتهجا)، الكهربائية الإفراج الناجم عن الميدان والقياس (EFIRM)، وارتفاع القرار نقطة انصهار وغيرها. ومع ذلك، فإن معظم هذه الأساليب تقتصر كل ايجابيات كاذبة والقدرة على كشف فقط طفرة واحدة التي تم تصميمها الفحص لمدة 4 </سوب&gt;. WTB-PCR، ومع ذلك، تسمح للمستخدم تصور آثار التسلسل الذي يمكن من اكتشاف أنواع الطفرات متعددة ويمكن أن تساعد في استبعاد ايجابيات كاذبة بسبب القطع الأثرية أو الأحداث نزع الأمين. الجيل التالي من التسلسل (خ ع) قد تقدم بديلا مناسبا لالتسلسل التقليدي، ومع ذلك، أكبر بكثير التكاليف والتعقيد وقتا أطول فحص تجعلها خيارا غير ضروري بالنسبة لكثير من أنواع المرض مع بعض الواسمات الجزيئية متميزة أو لرصد المرضى على العلاج لالناشئة الطفرات المقاومة. وعلاوة على ذلك، فإن معدلات إيجابية كاذبة عالية عندما يكتشف المتغيرات مع الترددات أليل متحولة أقل من 5٪، يمكن أن تشكل مشكلة بالنسبة NGS القائم على amplicon 5، 6. نحن هنا لشرح الزيادة في الحساسية WTB-PCR الذي تحقق في الكشف عن الطفرات في التمايز النخاعي عامل 88 الجين كما وصفها البيطار وآخرون. 3 MYD88 mutatioنانوثانية هي العوامل التشخيصية والنذير مهمة في مرض فالدنشتروم (WM)، الغلوبولين المناعي وحيدة النسيلة اعتلال غامائي من أهمية مجهولة (الغلوبولين المناعي-MGUS)، الطحال الغدد الليمفاوية منطقة هامشية (SMZL)، ومنتشر كبير سرطان الغدد الليمفاوية B-الخلية (DLBCL). تم العثور على الطفرات MYD88 تقريبا في جميع حالات WM، وحوالي 50٪ من المرضى الذين يعانون المناعي M (الغلوبولين المناعي) -secreting MGUS. متضارب، تم العثور على الطفرات MYD88 في المائة فقط 0-6 المرضى الذين يعانون من SMZL وغائبة في المايلوما المتعددة 7 و 8. بسبب تداخل المورفولوجية، immunophenotypic، خلوي، والخصائص السريرية بين WM وSMZL أو المايلوما الغلوبولين المناعي-متعددة يمكن في كثير من الأحيان إلى تعقيد تشخيصات تفريقية، وجود طفرة MYD88 قد يكون بمثابة عامل تحديد المفيد 9. كما تم المرتبطة الطفرات MYD88 مع عبئا أكبر المرض في المرضى الذين يعانون من DLBCL وضعف البقاء على قيد الحياة بعد العلاج 7، </سوب&gt; 10. بالإضافة إلى ذلك، لأن الطفرات MYD88 هي أكثر كثيرا ما وجدت في مثل B-الخلية (ABC) DLBCL تفعيلها من مركز جرثومي B-الخلية مثل (GCB) DLBCL أو الأساسي سرطان الغدد الليمفاوية المنصفية B-الخلية (PMBL)، MYD88 وضع طفرة قد تكون بمثابة علامة بديلة لنوع فرعي ABC 11 و 12. بروتوكول مفصل المقدمة هنا بمثابة القالب الذي يمكن تطويرها فحوصات جديدة أو معظم فحوصات تسلسل القائمة يمكن أن تتكيف بسهولة مع الكشف بدقة الطفرات التردد المنخفض في مختلف أنواع العينة. ويمكن أيضا أن النهج أن تستخدم لرصد واكتشاف الطفرات المقاومة التي قد تتطور في أورام أو حتى البكتيريا التي قد تتطور بينما يعالج المرضى مع العلاج الموجه أو المضادات الحيوية. وعلاوة على ذلك، فإنه يتناول وسائل الانتصاف العديد من القضايا المرتبطة بتخصيب طفرة، ولا سيما في الأنسجة الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 or 2 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05-402-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% alcohol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-084</td>
			<td>Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3730XL sequencer</td>
			<td>ABI</td>
			<td></td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>For magnetic bead PCR purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum sealing foils</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>T-2451-1</td>
			<td>For PCR and cold storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4337455</td>
			<td>For bi-directional sequencing. With 5X Sequencing Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804 Series</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>A-2-DWP rotor (for PCR plate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold plate for 96 well plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z606634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse, RNAse-free, ultra-pure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs (100mM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-96 Side-Skirted Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12027</td>
			<td>For use in PCR Purification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Absolute&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td>200 proof, for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exiqon website Oligo Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.exiqon.com/oligo-tools">www.exiqon.com/oligo-tools</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastStart Taq DNA polymerase (5 U/ul)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12032937001</td>
			<td>With10X concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2% agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRead DNA FFPE extraction Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>180134</td>
			<td>Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Di Formamide</td>
			<td>ABI</td>
			<td>4311320</td>
			<td>For sequencing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LNA oligonucleotide</td>
			<td>Exiqon</td>
			<td>500100</td>
			<td>5&#39;-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13-F Sequencing Primer</td>
			<td>ABI</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-tgt aaa acg acg gcc agt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13-R Sequencing Primer</td>
			<td>ABI</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-cag gaa aca gct atg acc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastercycler Pro S Thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>E950030020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Model 5430</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 ml microcentrifuge tubes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR forward primer</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR reverse primer</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR plates</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>T-3107-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20, 200, 1000 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate septa, 96 well</td>
			<td>ABI</td>
			<td>4315933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51304</td>
			<td>For BM aspirate and peripheral blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeqScape Sortware v3.0</td>
			<td>ABI</td>
			<td>4474978</td>
			<td>For sequencing analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide basket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (3M, pH 5.2)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filtered pipette tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20, 200, 1000 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer C&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex genie</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash reservoir</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>~1000 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-088</td>
			<td>Histology grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wild-type blocking pcr combined with direct sequencing as a highly sensitive method for detection of low-frequency somatic mutations

كشف دقيق وتحديد الطفرات التردد المنخفض يمكن أن يكون مشكلة عند تقييم مرض المتبقية بعد العلاج، والكشف عن الطفرات المقاومة الناشئة خلال فترة العلاج، أو عند المرضى الذين لديهم عدد قليل من تعميم الخلايا السرطانية. النوع البري منع PCR تليها تحليل التسلسل يوفر حساسية عالية، والمرونة، والبساطة كمنهجية للكشف عن هذه الطفرات التردد المنخفض. بإضافة مصممة خصيصا مقفل الحمض النووي النوكليوتيد لفحص تسلسل PCR أساس تقليدي جديد أو سابقا المعمول بها، الحساسيات ما يقرب من 1 أليل متحولة في خلفية من 1000 الأليلات WT يمكن أن يتحقق (1: 1000). التحف التسلسل المرتبطة بالأحداث نزع الأمين توجد عادة في الفورمالين الثابتة البارافين جزءا لا يتجزأ من الأنسجة يمكن معالجتها جزئيا عن طريق استخدام glycosylase DNA اليوراسيل خلال خطوات استخراج. بروتوكول الأمثل هنا هو محدد للكشف عن MYD88 الطفرة، ولكن يمكن أن تكون بمثابة نموذج لتصميم أيWTB-PCR الفحص. مزايا الفحص WTB-PCR على فحوصات أخرى تستخدم عادة للكشف عن الطفرات ذات التردد المنخفض بما فيها أليل محددة PCR في الوقت الحقيقي والكمي PCR تشمل الحوادث أقل من ايجابيات كاذبة، وزيادة المرونة وسهولة التنفيذ، والقدرة على كشف كل معروف والطفرات غير معروفة.

وقدم لمحة المفاهيمية للWTB-PCR خلال التمديد في الشكل 1. بسبب عدم تطابق النوكليوتيدات واحد في هجين مانع DNA يقلل إلى حد كبير درجة حرارة انصهاره (ΔT م = 20 - 30 ° C)، والتضخيم من الأليل WT يتم حظر حين متحولة DNA قالب حر في استكمال تمديد 17. وبهذه الطريقة، يتم تضخيمه DNA متحولة بشكل كبير في حين يتم تضخيمه WT DNA خطيا. ويرد دليل على تخصيب متحولة من قبل WTB-PCR المحرز في الشكل 2. تم اختبار الحمض النووي الجيني من المرضى الذين يعانون من الطفرات ودون كل من التقليدية وWTB-PCR ومن ثم تسلسل للتدليل على تخصيب نموذجية للتحقيق من قبل WTB-PCR وعدم وجود ايجابيات كاذبة في WT DNA. ينبغي تحديد تركيز عمل مانع المستخدمة في WTB-PCR MMX من خلال التجارب المعايرة والصورةhould معها تحقيق المستوى المطلوب من تخصيب متحولة في حين لا يؤدي إلى ايجابيات كاذبة أو حجب التضخيم من WT DNA تماما. تحليل تسلسل المنتج WTB-PCR يوضح تخصيب للأليل متحولة والحد من الكشف ما يزيد على 0.5٪ أليل متحولة في خلفية WT مقارنة مع 16٪ في PCR التقليدية 3. قد تختلف آثار هذه الزيادة في الحساسية في التجارب السريرية اعتمادا على الكمية النسبية للخلايا الورمية في العينات التي تم اختبارها. في دراسة أساليب المقارنة، وقد أثبتت فحص WTB-PCR هو موضح هنا أن 64٪ من الطفرات MYD88 سيتم غاب عن الاختبار التقليدي للمرضى الذين يعانون من WM أو MGUS 3. وغالبا ما ينظر الى مميزة الانزال في إشارة شدة (الشكل 3) إذا تركيز عالية جدا من مانع يستخدم أو إذا كان في مرحلة ما بعد PCR purificaفشل نشوئها لإزالة مانع قبل التسلسل ثنائية الاتجاه. ويتجلى هذا الأخير عندما يتم استبدال تنقية حبة المغناطيسي لتنقية الأنزيمية. على الرغم من تنقية الأنزيمية هي خيارا جذابا عند العمل مع أرقام عينة أكبر، فإنه من غير المناسب للتطبيق مع WTB-PCR كما فشل في إزالة مانع من حل قبل التسلسل. مثال على القطع الأثرية تسلسل كثيرا ما وجد في DNA المستمدة FFPE-نتيجة السيتوزين نزع الأمين (C: G&gt; T: A) وترد في الشكل 4 3، 18، 19، 20. على الرغم من أن الأسباب الفعلية لنزع الأمين السيتوزين غير مفهومة، فإن أي فحص PCR أساس أن يثري لأليل متحولة اكتشاف هذه القطع الأثرية ذات التردد المنخفض 21 و 22. ايجابيات كاذبة بسبب كالة مكافحة المخدراتمن الأفضل تجنب mination من خلال البدء مع المواد قالب عالية الجودة؛ في كثير من الحالات حيث لم يكن ذلك ممكنا، والمعاملة مع glycosylase اليوراسيل DNA (UDG) خلال استخراج يمكن أن تساعد في الحد من وتيرة وشدة القطع الأثرية نزع الأمين. deaminated العلاج UDG من الأنسجة FFPE خلال استخراج (كجزء من مجموعة DNA FFPE) المكوس بقايا السيتوزين وبالتالي منع اصطناعي C: G&gt; T: A الطفرات. ومع ذلك، يتم deaminated بقايا 5-ميثيل سيتوزين التي تحدث بشكل متكرر في dinucleotides الدليل السياسي الشامل لالثايمين، والتي لا يمكن رفعه من قبل UDG. القطع الأثرية التسلسل الناتجة التعرف إلى حد ما، وغالبا ما تظهر كما الطفرات جنبا إلى جنب كما رأينا في الشكل (4). إذا تم بالفعل استخراج عينات والعلاج UDG يمكن تنفيذها في استخراج الثانوي مع فقدان DNA منخفضة نسبيا. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/55130/55130fig1.jpg" /> الشكل 1: المفاهيمي اوفهrview من WTB-PCR. عدم تطابق النوكليوتيدات واحد في هجين مانع-DNA يقلل T م بنسبة تصل إلى 30 ° C. من خلال تصميم النوكليوتيد منع أن يكون T م من 10-15 ° C أعلى من درجة الحرارة خلال التمديد، يتم حظر التضخيم من WT DNA بينما يسمح تضخيم DNA متحولة. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55130/55130fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/55130/55130fig2.jpg" /> تم اختبار الحمض النووي الجيني من المرضى الذين يعانون من الطفرات ودون كل من التقليدية وWTB-PCR ومن ثم تسلسل للتدليل على تخصيب نموذجية للتحقيق من قبل WTB-PCR: الشكل 2. وقد تم اختيار تركيز النهائي من مانع استخدامها لتحقيق WTB-PCR لتحقيق أقصى قدر من تخصيب متحولة في حين لا تسبب ايجابيات كاذبة في WT DNA أو عرقلة amplificaنشوئها WT DNA تماما. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55130/55130fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/55130/55130fig3.jpg" /> الشكل (3): المميزة الانزال في كثافة إشارة ينظر عند استخدام تنقية PCR الأنزيمية بدلا من حبات مغناطيسية. وهذا هو الأرجح بسبب فشل تنقية الأنزيمية لإزالة مانع قبل التسلسل ثنائية الاتجاه. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55130/55130fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/55130/55130fig4.jpg" /> الشكل 4: C: G&gt; T: • A التحف التسلسل تنشأ في الأنسجة FFPE عندما السيتوزين أو السيتوزين ميثليته وdeaminatedالجيش العراقي الفورمالين التثبيت لاليوراسيل أو ثايمين، على التوالي. اليوراسيل DNA glycosylase (UDG) يمكن استئصال اليوراسيل قبل WTB-PCR المساعدة على الحد من التحف التسلسل. ومع ذلك، ثايمين الناتجة عن deaminated 5-ميثيل سيتوزين، والذي يحدث في كثير من الأحيان في الجزر الدليل السياسي الشامل، لا يمكن رفعه من قبل UDG. خفض تركيز مانع المستخدمة في WTB-PCR قد تساعد على تقليل حدوث التحف التسلسل التي لم يتم علاجها عن طريق العلاج UDG. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55130/55130fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations at JoVE.com

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.

من النوع البري منع PCR جنبا إلى جنب مع التسلسل المباشر كوسيلة الحساسة بشدة للكشف عن التردد المنخفض الجسدية الطفرات

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

wild-type-blocking-pcr-combined-with-direct-sequencing-as-highly

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

11.6K Views.  NeoGenomics Laboratories. Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.

Video: Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

الكشف عن نسخة عدد التعديلات عن طريق التسلسل خلية واحدة

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been investigated in various organs and tissues in rat. However, standard methods for the purification of miRNAs and detection of their expression in rat peritoneal membrane have not been well established. We have developed an effective and reliable method to purify and quantify miRNAs using quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) in rat peritoneal membrane. This protocol consists of four steps: 1) purification of peritoneal membrane sample; 2) purification of total RNA including miRNA from peritoneal membrane sample; 3) reverse transcription of miRNA to produce cDNA; and 4) qRT-PCR to detect miRNA expression. Using this protocol, we successfully determined that the expression of six miRNAs (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327, and miRNA-34a-5p) increased significantly in the peritoneal membrane of a rat peritoneal fibrosis model compared with those in control groups. This protocol can be used to study the profile of miRNA expression in the peritoneal membrane of rats in many pathological conditions.

Here we present a protocol for the detection of microRNA expression in rat peritoneal membrane using quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction. This method is suitable for studying the microRNA expression profile in rat peritoneal membrane in several pathological conditions.

الكشف عن التعبير ميكرورنا في الغشاء البريتوني من الفئران باستخدام الكمي في الوقت الحقيقي ير

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

عزل الحمض النووي قوية وبناء مكتبة التسلسل الفائق للعينات دار النباتات

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

الكشف عن حالة نادرة باستخدام الحمض النووي لتصحيح الخطأ وتسلسل الحمض النووي الريبي

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a routine procedure is widely utilized throughout the world and its main limitation resides in the poor efficacy of transgene integration, resulting in a low yield of founder animals. Only few percent of animals born after implantation of injected fertilized oocytes have integrated the transgene. In contrast, lentiviral vectors are powerful tools for integrative gene transfer and their use to transduce fertilized oocytes allows highly efficient production of founder transgenic mice with an average yield above 70%. Furthermore, any mouse strain can be used to produce transgenic animal and the penetrance of transgene expression is extremely high, above 80% with lentiviral mediated transgenesis compared to DNA microinjection. The size of the DNA fragment that can be cargo by the lentiviral vector is restricted to 10 kb and represents the major limitation of this method. Using a simple and easy to perform injection procedure beneath the zona pellucida of fertilized oocytes, more than 50 founder animals can be produced in a single session of microinjection. Such a method is highly adapted to perform, directly in founder animals, rapid gain and loss of function studies or to screen genomic DNA regions for their ability to control and regulate gene expression in vivo.

Here, we present a protocol to promote transgene integration and production of founder transgenic mice with high efficacy by a simple injection of a lentiviral vector in the perivitelline space of a fertilized oocyte.

لينتيفيرال توسط إنتاج فئران المحورة وراثيا: طريقة بسيطة وذات كفاءة عالية للدراسة مباشرة من مؤسسي

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near full-length (intact and defective), HIV-1 proviruses. FLIPS allows determination of the genetic composition of integrated HIV-1 within a cell population. Through identifying defects within HIV-1 proviral sequences that arise during reverse transcription, such as large internal deletions, deleterious stop codons/hypermutation, frameshift mutations, and mutations/deletions in cis acting elements required for virion maturation, FLIPS can identify integrated proviruses incapable of replication. The FLIPS assay can be utilized to identify HIV-1 proviruses that lack these defects and are&#160;therefore potentially replication-competent. The FLIPS protocol involves: lysis of HIV-1 infected cells, nested PCR of near full-length HIV-1 proviruses (using primers targeted to the HIV-1 5&#39; and 3&#39; LTR), DNA purification and quantification, library preparation for Next-generation Sequencing (NGS), NGS, de novo assembly of proviral contigs, and a simple process of elimination for identifying replication-competent proviruses. FLIPS provides advantages over traditional methods designed to sequence integrated HIV-1 proviruses, such as single-proviral sequencing. FLIPS amplifies and sequences near full-length proviruses enabling replication competency to be determined, and also uses fewer amplification primers, preventing the consequences of primer mismatches. FLIPS is a useful tool for understanding the genetic landscape of integrated HIV-1 proviruses, especially within the latent reservoir, however, its utilization can extend to any application in which the genetic composition of integrated HIV-1 is required.

Full-length individual proviral sequencing (FLIPS) provides an efficient and high-throughput method for the amplification and sequencing of single, near full-length (intact and defective) HIV-1 proviruses and allows for determination of their potential replication-competency. FLIPS overcomes limitations of previous assays designed to sequence the latent HIV-1 reservoir.

التضخيم من القرب من كامل طول فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس للجيل التالي التسلسل

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation into thousands of nano-sized water-in-oil individual reactions. Recently, ddPCR has become one of the most accurate and sensitive tools for circulating tumor DNA (ctDNA) detection. One of the major limitations of the standard ddPCR technique is the restricted number of mutations that can be screened per reaction, as specific hydrolysis probes recognizing each possible allelic version are required. An alternative methodology, the drop-off ddPCR, increases throughput, since it requires only a single pair of probes to detect and quantify potentially all genetic alterations in the targeted region. Drop-off ddPCR displays comparable sensitivity to conventional ddPCR assays with the advantage of detecting a greater number of mutations in a single reaction. It is cost-effective, conserves precious sample material, and can also be used as a discovery tool when mutations are not known a priori.

Here, we present a protocol to accurately quantify multiple genetic alterations of a target region in a single reaction using drop-off ddPCR and a unique pair of hydrolysis probes.

قطره واحدة رقمي البلمرة المتسلسل لكشف شامل ومتزامن من الطفرات في المناطق الساخنة

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to perform and its ability to standardize the fitness of many strains to a wild-type organism. The technique is limited, however, by available phenotypic markers and the number of strains that can be assessed simultaneously, creating the need for a great number of replicate experiments. Concurrent with large numbers of experiments, the labor and material costs for quantifying bacteria based on phenotypic markers are not insignificant. To overcome these negative aspects while retaining the positive aspects, we have developed a molecular-based approach to directly quantify microorganisms after engineering genetic markers onto bacterial chromosomes. Unique, 25 base pair DNA barcodes were inserted at an innocuous locus on the chromosome of wild-type and mutant strains of Salmonella. In vitro competition experiments were performed using inocula consisting of pooled strains. Following the competition, the absolute numbers of each strain were quantified using digital PCR and the competitive indices for each strain were calculated from those values. Our data indicate that this approach to quantifying Salmonella is extremely sensitive, accurate, and precise for detecting both highly abundant (high fitness) and rare (low fitness) microorganisms. Additionally, this technique is easily adaptable to nearly any organism with chromosomes capable of modification, as well as to various experimental designs that require absolute quantification of microorganisms.

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

This molecular-based approach for determining bacterial fitness facilitates precise and accurate detection of microorganisms using unique genomic DNA barcodes that are quantified via digital PCR. The protocol describes calculating the competitive index for Salmonella strains; however, the technology is readily adaptable to protocols requiring absolute quantification of any genetically-malleable organism.

مؤشر تنافسي رقمي قائم على PCR لتحليل عالي الإنتاجية للياقة البدنية في السالمونيلا

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

Validating Whole Genome Nanopore Sequencing, using Usutu Virus as an Example

Whole genome sequencing can be used to characterize and to trace viral outbreaks. Nanopore-based whole genome sequencing protocols have been described for several different viruses. These approaches utilize an overlapping amplicon-based approach which can be used to target a specific virus or group of genetically related viruses. In addition to confirmation of the virus presence, sequencing can be used for genomic epidemiology studies, to track viruses and unravel origins, reservoirs and modes of transmission. For such applications, it is crucial to understand possible effects of the error rate associated with the platform used. Routine application in clinical and public health settings require that this is documented with every important change in the protocol. Previously, a protocol for whole genome Usutu virus sequencing on the nanopore sequencing platform was validated (R9.4 flowcell) by direct comparison to Illumina sequencing. Here, we describe the method used to determine the required read coverage, using the comparison between the R10 flow cell and Illumina sequencing as an example.

We previously validated a protocol for amplicon-based whole genome Usutu virus (USUV) sequencing on a nanopore sequencing platform. Here, we describe the methods used in more detail and determine the error rate of the nanopore R10 flow cell.

التحقق من صحة تسلسل الجينوم كله نانوبور، وذلك باستخدام فيروس Usutu كمثال

Whole genome sequencing can be used to characterize and to trace viral outbreaks. Nanopore-based whole genome sequencing protocols have been described for ...

Optimization for Sequencing and Analysis of Degraded FFPE-RNA Samples

Gene expression analysis by RNA sequencing (RNA-seq) enables unique insights into clinical samples that can potentially lead to mechanistic understanding of the basis of various diseases as well as resistance and/or susceptibility mechanisms. However, FFPE tissues, which represent the most common method for preserving tissue morphology in clinical specimens, are not the best sources for gene expression profiling analysis. The RNA obtained from such samples is often degraded, fragmented, and chemically modified, which leads to suboptimal sequencing libraries. In turn, these generate poor quality sequence data that may not be reliable for gene expression analysis and mutation discovery. In order to make the most of FFPE samples and obtain the best possible data from low quality samples, it is important to take certain precautions while planning experimental design, preparing sequencing libraries, and during data analysis. This includes the use of appropriate metrics for precise sample quality control (QC), identifying the best methods for various steps during the sequencing library generation, and careful library QC. In addition, applying correct software tools and parameters for sequence data analysis is critical in order to identify artifacts in RNA-seq data, filter out contamination and low quality reads, assess uniformity of gene coverage, and measure the reproducibility of gene expression profiles among biological replicates. These steps can ensure high accuracy and reproducibility for profiling of very heterogeneous RNA samples. Here we describe the various steps for sample QC, library preparation and QC, sequencing, and data analysis that can help to increase the amount of useful data obtained from low quality RNA, such as that obtained from FFPE-RNA tissues.

This method describes the steps to improve the quality and quantity of sequence data that can be obtained from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) RNA samples. We describe the methodology to more accurately assess the quality of FFPE-RNA samples, prepare sequencing libraries, and analyze the data from FFPE-RNA samples.

الأمثل لتسلسل وتحليل العينات FFPE-RNA المتدهورة

Gene expression analysis by RNA sequencing (RNA-seq) enables unique insights into clinical samples that can potentially lead to mechanistic understanding ...