Partial salary support for GLB is provided by NIH grant R01HL121527. JWDM is supported by the Currier Fellowship in Neurology.

Nota: Todos os uso de animais nesse protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Mississippi Medical Center. 1. O tratamento de animais e tecidos <ol><li> Administração e Sacrifício <ol><li> Anestesiar os animais utilizando 3% de isoflurano durante 5 min e verificar a profundidade da anestesia através da observação da ausência do reflexo do pé-de aperto. Aplicar pomada veterinária aos olhos para evitar a secura e sob anestesia. </li><li> Pesar o animal e pipetar um dose de 50 mg / kg de ELP quer rodamina-rotulado, SynB1-ELP, ou Tat-ELP para um tubo de 1,5 mL. Guardar a 100 ul dos compostos marcados administrados para a formulação de curvas padrão em etapas posteriores. Nota: É importante que os padrões de ser feita a partir do mesmo lote de proteína marcada administrada aos animais de modo a evitar diferenças devido à variabilidade na eficiência de marcação fluorescente. A fim de remover adequadamente FLUORES fundocência a partir de medições de fluorescência posteriores, um animal não tratado deve ser sacrificado usando os mesmos métodos / reagentes como os animais tratados. </li><li> Administrar uma injecção IV, tal como anteriormente descrito utilizando um quer da veia da cauda ou na veia femoral (que é acedido através de uma de 1 cm da incisão na virilha). Para analgesia, se fazer uma incisão na virilha, administrar por via subcutânea, carprofeno, a uma dose de 5 mg / kg, e aplicar sensorcaine para o local da incisão antes do fecho com um grampo de feridas. Para administrar por via intranasal (IN), colocar o animal em decúbito dorsal. </li><li> Com uma pipeta de 2 ml, elaborar uma queda de 1 mL de composto marcado. Resumidamente deslizar a cabeça do animal a partir do colar anestesia para permitir o acesso às narinas. </li><li> Colocar a ponta da pipeta para a abertura de uma única narina e lentamente o êmbolo, permitindo que a gota corra ao longo do nestejam para dentro da cavidade nasal. Repetir a cada 1 min, alternando narinas cada gota até que a dose completa é administrou. Nota: O volume máximo administrado via não deverá exceder 10 - 15 mL para os ratos. </li><li> Deixar os animais em decúbito dorsal sob anestesia por 10 minutos após a administração final antes de movê-los cada um em uma gaiola individual. Nota: Não deixar os animais sem vigilância até que tenham recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. </li><li> 1 h após a administração, re-anestesiar os animais como antes e sacrificam-los através de perfusão transcardial com PBS (210,0 mg / L KH 2 PO 4, 9,000.0 mg / L de NaCl, 726 mg / L de Na 2 HPO 4 .7H 2 O), 10 mL / min durante um total de 20 mL. Nota: a perfusão dos animais no sacrifício para remover todo o sangue a partir dos tecidos é necessário para determinar as concentrações extravasculares dos compostos marcados. reagentes de perfusão pode resultar em alterações a fluorescência de fundo e devem ser mantidos consistentes. O método de sacrifício deverá ser consistentedentro dos grupos. Diferentes métodos de sacrifício pode resultar em diferentes níveis de sangue no interior da vasculatura, mudando a fluorescência de fundo dos tecidos. </li></ol></li><li> Coleção de tecidos <ol><li> Prepare PBS como descrito acima para enxaguar os tecidos removidos. Nota: Se existir outro tampão foi utilizado como o líquido de perfusão, lavar tecidos no mesmo tampão. </li><li> Remover do coração, pulmões, estômago, fígado, baço, rins e por meio de dissecção simples. Resumidamente lavar em PBS antes de usar laboratório limpa para pat seco ou afastar a humidade em excesso e colocar os tecidos sobre o tapete de imagem. </li><li> Decapitar o mouse e remover a parte superior do crânio usando cortadores de osso ou fórceps. Utilizando uma pinça, retire cuidadosamente o cérebro, mantendo os bulbos olfatórios intacta. Lavar, secar, e colocá-lo na esteira de imagem fornecidos. </li><li> Para remover a medula espinhal através rápida de ejeção 7, encher uma seringa de 10 ml com PBS e anexar uma agulha de calibre 18 entorpecido. Nota: 18 encaixa calibreo adulto canal espinhal de muitas linhas de rato. O diâmetro necessário irá variar com o tamanho do animal. </li><li> Colocar o animal em decúbito ventral, assegurando que a abertura do canal medular no local decapitação é claramente marcados e livre de sangue. </li><li> Retire a pele em torno da coluna vertebral. Usando cortadores de ossos pontiagudos ou tesoura, corte através da coluna vertebral na seção lombar diretamente rostral para os quadris. </li><li> Resumidamente enxaguar com PBS para visualizar o canal medular. Insira com cuidado a agulha no canal medular. Nota: A agulha deve se sentir confortável e pode exigir algum rolamento lenta e para trás durante a inserção. Caso a agulha sentir-se solta, um corte mais rostral pode ser feita ou uma agulha de diâmetro maior pode ser necessário. </li><li> Usando o polegar eo dedo indicador, aplicar pressão sobre a coluna vertebral em torno da agulha inserida. O êmbolo com pressão moderada e constante. A medula espinhal ejecta-se intacta da abertura rostral na espinalcoluna. Nota: A remoção completa, a lavagem e secagem de todos os principais órgãos podem ser razoavelmente concluído em 5-7 min. Este curto tempo evita a necessidade de armazenamento alargado em PBS, o que poderá resultar na exposição excessiva à luz e a lixiviação de proteínas marcadas a partir do tecido. </li></ol></li></ol> 2. Whole-órgão Ex Vivo Fluorescência de imagem <ol><li> Parâmetros de imagem <ol><li> Inicie o software de aquisição de imagem. No canto inferior direito do painel de controle de aquisição, clique em &quot;inicializar&quot;. </li><li> Em &quot;modo de imagem&quot;, selecione a opção &quot;fluorescente&quot;. Em &quot;tempo de exposição&quot;, selecione &quot;AUTO&quot;. </li><li> Em &quot;binning&quot;, selecione &quot;pequeno&quot; e definir o F / Stop para 2. </li><li> Escolha de excitação de 535 nm e filtros de emissão de 580 nm. Nota: Isto irá variar dependendo do marcador utilizado. </li><li> Selecione &quot;Campo de visão B&quot; e defina o target altura de 0,3 cm. Nota: Isto irá variar dependendo do tecido a ser visualizado. </li><li> Uma vez que o indicador de temperatura fica verde (o que significa que a máquina está totalmente inicializado), colocar os tecidos para o tapete fundo preto fornecida, garantindo que os tecidos estão completamente separados um do outro. Coloque a esteira no gerador de imagens, garantindo que todos os tecidos estão dentro da grade área seleccionada. tecidos maiores e não-homogéneas, tais como o fígado inteiro, deve ser disposto de modo a reduzir a sobreposição dos lobos. Nota: Os tecidos podem ser dispostos em conjunto num único grupo, permitindo que uma imagem para acomodar um único animal ou todos os tecidos de um tipo semelhante. Isso faz com que a análise e organização mais fácil depois. Se grandes diferenças na intensidade da fluorescência estão presentes entre os vários tecidos, que é melhor para a imagem-los individualmente ou em grupos do mesmo tipo de tecido, como um único tempo de exposição pode não ser ideal para todas as intensidades de tecido. </li><li> Clique em &quot;Adquirir&quot;. </li><li> Depois de imagem, remover os tecidos imediatamente e armazenar ou congelá-los para histologia quantitativa, conforme descrito na etapa 4. </li></ol></li></ol> 3. Normas e Processamento de Imagem <ol><li> Padrões <ol><li> Em PBS, criar duas diluições em série de cada proteína utilizada no tratamento dos animais, a partir da concentração original, com um total de 15 diluições. Nota: O intervalo de concentração deve apontar para incluir as concentrações nos tecidos esperados e pode exigir diluições adicionais da amostra original, dependendo da concentração de partida. </li><li> Pipetar 100 L de cada padrão em cada poço de uma placa de 96 poços preta. Incluir um poço de PBS puro para se obter uma medida de fluorescência de fundo. </li><li> Imagem os padrões com os mesmos parâmetros utilizados para a imagiologia de tecidos. </li><li> No software de aquisição de imagem &quot;Paleta de ferramentas&quot; em &quot;Ferramentas de ROI&quot;, selecione a &quot;região de interesse (ROI) &quot;Círculo e desenhar o ROI em torno de um bem. Copie esse ROI a todos os outros poços cheios e clique em &quot;medir o ROI.&quot; </li><li> Subtrair o valor da eficiência radiante média do PBS puro a partir dos valores das normas de outros; isto elimina a fluorescência de fundo. Traçar os valores contra a concentração conhecida em um gráfico de dispersão. Nota: A equação resultante da linha de tendência linear pode então ser usado para calcular o valor da fluorescência relativa. </li></ol></li><li> Processamento de imagem <ol><li> No software de aquisição de imagem, selecione a ferramenta ROI de forma livre e desenhar ROIs em torno de cada um dos tecidos individuais. Clique em &quot;medida&quot;. </li><li> Com a média de medidas de eficiência radiantes resultantes, subtrair os valores medidos a partir do animal sem tratamento para cada tipo de tecido e traçar esses valores na curva padrão criado anteriormente. Nota: Os valores de fluorescência relativa resultantes fornecem uma visão rápida e precisa dobiodistribuição do composto marcado. </li></ol></li></ol> 4. Histologia Tissue Quantitative <ol><li> Preparação e Congelamento de tecidos para corte <ol><li> Criar ou comprar recipientes de tamanho suficiente para congelar os tecidos escolhidos e criostato para ser utilizado. Envolvendo a folha de alumínio em torno de um objeto de tamanho adequado e em forma funciona bem. </li><li> Prepara-se uma mistura de isopropanol e gelo seco, preenchendo metade de um copo de 500 mL com a adição de gelo seco e ~ 350 ml de isopropanol de modo que haja quantidade suficiente de líquido acima do gelo seco para submergir parcialmente o recipiente de congelação. Nota: azoto líquido resulta muitas vezes na fractura do composto de temperatura óptima de corte (OCT), e tecidos embutidos e deve ser evitado. </li><li> Encha o recipiente de congelamento parcial com OCT, garantindo que não há bolhas de presentes. Se houver bolhas, trabalhar as bolhas para fora da solução usando uma pinça ou implementar um similar. </li><li> Remover o tecidode PBS e secá-la completamente, quer por batendo suavemente com um laboratório de apagamento ou tocando as bordas de tecidos delicados para um laboratório de limpeza e permitindo que o líquido para afastar. </li><li> Colocar o tecido suavemente para a OCT no interior do recipiente de congelação, garantindo a não introduzir bolhas por baixo do tecido. Uma vez que o tecido está no lugar, adicionar outubro até que o tecido está completamente coberta. </li><li> Submergir o recipiente de congelação é, tanto quanto possível sem permitir a isopropanol para entrar em contacto com a OCT exposta no interior do recipiente. Permitir 30 - 90 s (ou potencialmente mais para os tecidos maiores) para a OCT e tecido para congelar completamente antes de armazenar a -80 ° C durante o tempo que for necessário. </li></ol></li><li> Elaboração de normas para corte. <ol><li> Preparar e rotular apropriadamente de 1 ml de uso único seringas, removendo a extremidade do cano, de tal modo que todo o comprimento da seringa tem um diâmetro. Isto irá permitir que o cilindro congelado para ser empurrado para fora mais tarde. </li><li> Nosing outubro, criar um 15-passo dupla diluição em série de compostos administrados, como foi feito com PBS anteriormente, mas com um volume final de 1 ml resultando. Incluir uma amostra de pura outubro para a remoção de valores de fluorescência de fundo. </li><li> A viscosidade de outubro faz a mistura adequada difícil. Inverta os tubos e permitir que o OCT para resolver completamente antes de inverter novamente. Repetir este 10 - 20 vezes para assegurar uma mistura uniforme. Manter as soluções padrão a 4 ° C e ao abrigo da luz durante a mistura. </li><li> Após a mistura, novamente preparar uma mistura de isopropanol e gelo seco, como antes. Nota: O nitrogénio líquido também pode ser utilizado no lugar da mistura de gelo isopropanol / seco, desde que as seringas são rapidamente removido depois de terem congelado. </li><li> Desenhe o padrão de outubro para dentro da seringa, tendo o cuidado de apresentar como algumas bolhas quanto possível. Após a elaboração da solução de outubro, mergulhe imediatamente a seringa diretamente no isopropanol e permitir que a solução para congelar completamentedentro da seringa por 10 - 20 s. Armazenar as seringas a -80 ° C durante o tempo necessário. </li></ol></li><li> De corte de tecidos e Normas <ol><li> Colocar ambos os tecidos e padrões de -20 ° C e permitir tempo suficiente para que todas as amostras atingir a temperatura. Nota: A temperatura ideal de corte geralmente cai em torno de -10 ° C intervalo para a maioria dos tecidos, mas em última análise, depende do tamanho do tecido e teor de gordura e deve ser refinado empiricamente. </li><li> Usando um criostato, cortar tecidos em fatias grossas 20 mícrons e montá-los em lâminas, como descrito anteriormente 8. Armazenar as lâminas a -20 ° C e mantê-los ao abrigo da luz tanto quanto possível durante o corte e que a digitalização. Nota: É importante aqui que as secções a serem medidos são adequadamente distribuída por toda a espessura do tecido. </li><li> Para montar as normas sobre o mandril criostato, pegue a seringa do freezer e aquecer o exterior para 3 - 5 s por holding-lo na mão. Empurrar o êmbolo até que uma pequena secção de (~ 1 cm) do cilindro de outubro está fora da seringa. <ol><li> Usando uma lâmina de barbear, cortar através do cilindro e coloque a seção de cilindro resultando perpendicularmente sobre o mandril, usando OCT para segurá-la no lugar. Esta configuração deve resultar em círculos bem definidos que está sendo cortado. </li></ol></li><li> Corte os cilindros a 20 uM, colocando uma fatia de cada diluição para uma única lâmina, de modo que uma lâmina representa toda a curva padrão. Armazenar os slides a -20 ° C até que esteja pronto para a digitalização. </li></ol></li><li> Digitalização e quantificação <ol><li> Inicie o software matriz de digitalização e clique em &quot;543 a laser&quot; para iniciar o procedimento de inicialização laser. Espere por 15 min para o laser para ficar pronto. </li><li> Uma vez que o laser está pronto, remover as lâminas entre -20 ° C e movê-los para um grande recipiente, luz-protegido para atingir a temperatura e a secar durante 3 min. Isso vai evitar o acúmulo de umidade na SLIde scanner. </li><li> Carregue a lâmina no receptáculo de slides sobre o scanner de slides. Clique em &quot;scan&quot; e selecione &quot;executar verificação fácil.&quot; </li><li> Defina a resolução de digitalização para 50 mm. </li><li> Selecione a primeira opção &quot;Use&quot; em &quot;Fluoróforo&quot; e selecione &quot;TRITC.&quot; Defina o Ganho PMT para 80%. Nota: Estas configurações irão variar dependendo do fluoróforo e a concentração das moléculas marcadas. </li><li> Do lado da mão esquerda, garantir que a área de digitalização inclui toda a lâmina. Clique em &quot;Iniciar&quot;. </li><li> Após a digitalização, selecione &quot;Arquivo&quot; e &quot;salvar como&quot;, e em seguida, salvar a imagem como um .tif. Nota: Slides de tecidos e padrões devem ser verificados nas mesmas opções. </li><li> Carregar as imagens resultantes em ImageJ e selecione ROIs em torno dos tecidos e padrões. Sob a guia &quot;analisar&quot;, selecione &quot;definir medidas&quot; e selecione &quot;significa valor de cinza.&quot; Click220; medida &quot;. Nota: Tal como acontece com a técnica anterior, fluorescência de fundo deve ser subtraída de todos os valores medidos. </li><li> Traçar as mensurações de valor cinza médios das normas contra a concentração conhecida para criar uma curva padrão. Nota: As medições resultantes dos tecidos deve ser calculada a média dentro de cada tecido e representados graficamente em que a curva padrão para determinar a concentração no interior do tecido. </li></ol></li></ol>

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Enquanto ex vivo de imagem de órgão inteiro é geralmente simples, a adesão a alguns conceitos e técnicas básicas podem melhorar a precisão das medições de bio-distribuição. comprimentos de onda curtos da luz experiência um elevado grau de espalhamento e a absorvância na maioria dos tecidos, o que tem um impacto significativo a utilidade dos fluoróforos de curto comprimento de onda. Estes fluoróforos têm aplicação em estudos de tecidos profundos limitado, mas eles têm sido usados ​​com eficácia em experiências olhando para tecidos da superfície ou dentro do olho. Por outro lado, longos comprimentos de onda de luz sofrer significativamente menor espalhamento e absorção, resultando em uma maior penetração e resultados mais precisos com tecidos mais espessos 10. Os fluoróforos que se enquadram na gama do infravermelho distante-vermelho e próximo (NIR) (excitação ~ 600 nm) do espectro são geralmente escolhidos para animais inteiros ou tecidos maiores. Para as experiências que usam estes fluoróforos de longo comprimento de onda, a auto-fluorescência de particular tissues ou materiais é provável uma consideração chave. Por exemplo, a bílis da vesícula biliar para dentro de roedores é altamente auto-fluorescente a comprimentos de onda nos 500 - 600 nm, gama. Porque isso pode distorcer significativamente os valores do fígado, muitas vezes é melhor para remover a vesícula biliar antes da imagem. Alternativamente, se são necessários o fígado e vesícula intacta, a escolha de um fluoróforo com um comprimento de onda de excitação na extremidade muito longe do espectro pode limitar a influência da bílis auto-fluorescência. Além disso, muitas das comidas roedores comuns contêm alfalfa não purificada, que fluoresce altamente ao longo dos meados e de longo faixas do espectro. Se as etiquetas escolhidas cair dentro desses comprimentos de onda e o tracto digestivo está a ser trabalhada, uma mudança na dieta é provavelmente a melhor opção. Enquanto sistemas de imagens ao vivo são projetados para medir com precisão os tecidos grossos, com tecidos não homogéneos e em particular de espessura (por exemplo, fígado de ratos inteiros), medições mais precisas pode oftPT ser obtido por espalhar para fora do tecido, de tal modo que os lóbulos do fígado sobrepõem tão pouco quanto possível. Além disso, nos casos em que os tecidos têm uma distribuição altamente distorcida de moléculas marcadas, imagiologia de múltiplos lados do tecido e fazendo a média dessas medições pode aumentar a precisão. Em última análise, o tipo de tecido a ser visualizado, o auto-fluorescência dos materiais associados a esses tecidos, e a distribuição do potencial das moléculas marcadas administrada deve ser cuidadosamente considerado, a fim de escolher um fluoróforo com excitação e de emissão comprimentos de onda adequadas que limitam interferência tanto quanto possível. Ao realizar a histologia do tecido quantitativa, há vários detalhes importantes para manter em mente. A fim de que os resultados para ser preciso, as fatias devem ser tomadas ao longo de todo o tecido ou região a ser analisada. Isto significa que estes tecidos não estará disponível para outros processos. Pode ser possível para corrigir e mancha depoisdigitalização, mas é normalmente melhor para permitir que as fatias para secar um pouco antes de colocá-los para o scanner, o que poderia afetar a coloração futuro. Da mesma forma, a análise irá causar algum nível de foto-branqueamento, reduzir o potencial de sinal em processos subsequentes. Para aplicações de microscopia jusante, secções superiores são tipicamente conseguida através da fixação de tecidos e equilibrando-os em uma solução de sacarose antes do corte. No entanto, este processo é melhor evitados no protocolo histologia quantitativa acima, devido aos efeitos de fixação e / ou longa sacarose embebe na intensidade de fluorescência. Além disso, dependendo da quantidade de sinal presente, fatias podem sofrer foto-branqueamento se exposto ao mesmo baixos níveis de luz ambiente. Mantendo as lâminas frio e ao abrigo da luz irá melhorar significativamente a precisão das medições resultantes. No geral, manipulação e preparação cuidadosa pode melhorar drasticamente o resultado final. Há uma variedade de outrosmétodos utilizados para o estudo da bio-distribuição e farmacocinética de macromoléculas administradas que variam muito na dificuldade técnica, produção, precisão, e os equipamentos necessários 11. imunoensaios quantitativos e ensaios de bioactividade pode ser tanto tecnicamente complicado e requer anticorpos ou reagentes específicos para as moléculas administradas, adicionando significativamente ao custo e de trabalho. Vários métodos baseados na rotulagem de radioisótopos têm sido utilizados no passado, com diferentes precisão, mas a integração de radioisótopos a macromoléculas, bem como a recolha de dados em si, pode exigir uma preparação significativa e muitas vezes podem tornar os tecidos totalmente inutilizável para análises mais 12. Finalmente, outros métodos mostraram ser eficazes, incluindo a tomografia de emissão de positrões e espectrometria de massa, são normalmente excluída simplesmente devido à falta do equipamento necessário. O protocolo descrito acima usa dois métodos para a determinação em conjunção com eficiência the bio-distribuição de moléculas marcadas de uma maneira rápida e de baixo custo, preciso e de fácil acesso devido à availably regular do equipamento necessário. Este método foi utilizado para gerar os dados acima, o melhor identificação do vector e via de administração para a distribuição de moléculas marcadas para o SNC. A partir dos dados ex vivo, administrado em PEL e ELP administrado IV foram identificados para posterior caracterização por meio de histologia do tecido quantitativa. histologia do tecido quantitativa, em seguida, desde que as concentrações de moléculas marcadas em regiões específicas do sistema nervoso central, permitindo que as conclusões finais a ser tirada. Os dois métodos em conjunto, representam uma maneira rápida e eficaz para realizar um exame detalhado do bio-distribuição de vários compostos específicos.

rotulagem fluorescente é um método eficaz e facilmente utilizado para a determinação do bio-distribuição de compostos, utilizando uma gama de equipamento que é comum para muitos laboratórios. Os fluoróforos estão amplamente disponíveis, relativamente barato, e vem em uma variedade de comprimentos de onda, de tal forma que várias moléculas rotulados podem ser utilizados simultaneamente sem interferência. A maioria dos fluoróforos tem uma gama de produtos químicos para a conjugação com diferentes grupos reactivos em compostos alvo, e o processo de conjugação é geralmente simples para a maioria dos tipos de locais reactivos. Além disso, o equipamento necessário para as medições de compostos marcados com fluorescência são comuns em muitos laboratórios. microscópios fluorescentes, geradores de imagens, e scanners de slides podem ser usados ​​em circunstâncias diferentes, tornando o uso de marcação fluorescente altamente acessível. Os marcadores fluorescentes são frequentemente utilizados para determinar a biodistribuição e a cinética de compostos tanto in vivo como ex vivo com dispositivos de imagens ao vivo, como o IVIS Spectrum Imager, e por histologia tecido quantitativa 2,3. O uso de ex vivo de imagem de órgão inteiro usando dispositivos de geração de imagens ao vivo tem aumentado ao longo do tempo devido à sua facilidade de uso e capacidade de criar rapidamente uma comparação precisa das concentrações relativas de compostos marcados sem exigir que o tratamento posterior de tissues4. No entanto, enquanto ex vivo de imagens de órgãos conjunto pode permitir a fácil análise e comparação, não se gera uma medida quantitativa das concentrações de compostos dentro de um tecido absolutos. Isto é devido aos efeitos de dispersão de luz dentro de órgãos intactos. Desde que a dispersão de luz (e, em menor grau, absorvância) varia de acordo com o tamanho e densidade dos tecidos, imagiologia de órgãos todo pode subestimar níveis de tecido em órgãos grandes ou densos. Formulação de normas adequadas para medições de concentração absoluta também é difícil porque é preciso imitar a espessurae a densidade de cada órgão individual. Por outro lado, a imagem de órgão inteiro é um método rápido de obtenção dos níveis teciduais relativas de um agente, e que é ideal para comparar a bio-distribuição relativa de várias moléculas relacionadas (por exemplo, em estudos de selecção de medicamentos). Uma estratégia alternativa é utilizar histologia fluorescência quantitativa, uma técnica derivada a partir do método de autoradiografia quantitativa, para se obter os níveis absolutos de tecido de um agente de teste 5,6. Ao invés de colocar um animal ou órgão inteiro em um dispositivo de imaginação, a histologia do tecido quantitativa exige que cada tecido ser cortado, montadas em lâminas, digitalizados e analisados ​​individualmente. Padrões de o agente de teste são preparadas e cortadas com a mesma espessura como as amostras de órgãos. Ao cortar todos os órgãos e as normas para a mesma espessura, a variabilidade devido à dispersão da luz ou absorvância é eliminada, e a intensidade de fluorescência do tecido pode ser apto para a curva padrão para determinar concent absolutaração. Enquanto este método, quando feito corretamente, é quantitativa, mas também é trabalho intensivo e facilmente mal utilizado. Dada a natureza mais complexa da histologia quantitativa e significativamente maior custo do trabalho, quando comparado à imagem do órgão inteiro, torna-se útil analisar em que cada processo é mais prático para usar quando se examina o bio-distribuição de compostos marcados com fluorescência. Este protocolo fornece uma descrição detalhada de como estes métodos podem ser usados ​​em conjunto para comparar de forma eficiente a bio-distribuição do marcada com rodamina elastina como polipéptido (ELP), com ou sem a adição dos péptidos de penetração de células SynB1 ou Tat, através do intranasal (IN) e intravenosa (IV) vias de administração.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="819">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Reagents</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:332px;"></td>
		</tr>
		<tr height="77">
			<td height="77" style="height:77px;width:231px;">Maleimide derivitized fluorophors (e.g. tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide)</td>
			<td style="width:99px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:159px;">T6027, A20342</td>
			<td>Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:231px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">1002243569</td>
			<td>PBS Buffer for rinsing</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="59" style="height:59px;width:231px;">Optimal Cutting Temperature Compound</td>
			<td style="width:99px;">Tissue-Tek</td>
			<td style="width:159px;">4585</td>
			<td>Used for freezing and mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Equipment</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">IVIS Spectrum</td>
			<td style="width:99px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td>For ex vivo whole organ imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Cryomicrotome</td>
			<td style="width:99px;">Thermo</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td>For cryosectioning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Fluorescence slide scanner</td>
			<td style="width:99px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td>For slide scanning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of ex vivo whole-organ imaging and quantitative tissue histology to determine the bio-distribution of fluorescently labeled molecules

Rotulagem fluorescente é um processo bem estabelecido para examinar o destino de moléculas marcadas sob uma variedade de condições experimentais in vitro e in vivo. As sondas fluorescentes são particularmente úteis para determinar a biodistribuição das moléculas grandes administradas, em que a adição de um marcador fluorescente de pequena molécula não é susceptível de afectar a cinética ou bio-distribuição do composto. Uma variedade de métodos existentes para analisar bio-distribuição que variam de forma significativa na quantidade de esforço necessária e se as medições resultantes são completamente quantitativa, mas usando vários métodos de conjugação pode proporcionar um sistema rápido e eficiente para a análise bio-distribuição. Ex vivo de imagens de órgãos todo é um método que pode ser utilizado para comparar rapidamente as concentrações relativas das moléculas fluorescentes dentro de tecidos bem como entre vários tipos de tecidos ou os grupos de tratamento. Usando um plat de imagemformulário concebido para live-animal ou de imagem de órgão inteiro, fluorescência dentro de tecidos intactos pode ser determinada sem processamento adicional, economizando tempo e trabalho ao fornecer uma imagem precisa da bio-distribuição geral. Este processo é ideal em experiências de tentativa de determinar a especificidade de tecido ou de um composto de comparação de vários compostos diferentes. histologia do tecido quantitativa por outro lado, requer processamento adicional extensa de tecidos, a fim de criar uma medida quantitativa dos compostos marcados. Para avaliar com precisão bio-distribuição, todos os tecidos de interesse deve ser cortado, digitalizado e analisado em relação a curvas padrão, a fim de fazer comparações entre os tecidos ou grupos. histologia tecido quantitativa é o padrão ouro para determinar as concentrações de compostos absolutos dentro dos tecidos. Aqui, nós descrevemos como ambos os métodos podem ser utilizados em conjunto de forma eficaz de avaliar a capacidade de diferentes métodos de administração, umaND modificações compostos alvo e entregam moléculas marcadas com fluorescência para o sistema nervoso central 1.

Os dados abaixo descrevem a entrega de três compostos: um vector de entrega de droga conhecida como PEL e duas versões do PEL modificado com péptidos de penetração de células (SynB1-ELP e Tat-ELP) 9. Todos os três compostos foram marcadas com tetrametilrodamina-5-maleimida e entregue através de duas vias de administração (EM e IV). O objectivo destas experiências foi o de determinar qual composto e via de administração resultaria na melhor penetração no sistema nervoso central (SNC) 3. Figura 1A exibe representante ex vivo imagens de órgãos conjunto dos órgãos dos animais tratados. O mapa de calor sobreposição mostra os níveis de fluorescência na eficiência radiante no interior dos tecidos. Ao desenhar os ROIs em torno dos tecidos individuais e representando graficamente esses valores na sua correspondente curva padrão, os valores de fluorescência normalizados ilustrados na figura 1B são gerados. O fluorescen padronizadoce valores podem então ser utilizados para comparações precisas sobre as concentrações relativas dos diferentes compostos. Estes dados descrevem com precisão tanto o efeito da modificação ELP na penetração em tecidos específicos, bem como o efeito da via de administração em cada composto. Com estes resultados, é imediatamente claro que a entrega ELP via de administração IN é a combinação mais eficaz para atingir o CNS. Embora estes resultados ajudam a determinar o melhor composto e fornecimento penetrando método, eles não descrevem a concentração real ou localização regional de compostos dentro do SNC. histologia quantitativa é por isso ideal para completar a descrição do bio-distribuição destes compostos, uma vez que permite as medições quantitativos das regiões cerebrais seleccionadas. A Figura 2A mostra uma fatia representativa dos animais tratados com EM ELP, e a Figura 2B descreve a quantificação de ROIs separando obulbos olfatórios, hemisférios e cerebelo. A partir destes dados, é claro que, embora a administração ELP pela via NO pode resultar em concentrações elevadas no SNC, ele faz isso principalmente nos bulbos olfativos e cerebelo. Por outro lado, ELP entregue IV tem menores concentrações globais, mas é igualmente distribuído em todo o cérebro. Dependendo do destino destes compostos administrados e o potencial para efeitos em outros órgãos, dentro ou administração IV pode ser a melhor escolha. Este não foi possível concluir, sem a adição da histologia quantitativa. Tecnicamente, histologia quantitativo poderia ter sido utilizado em todos os tecidos de cada grupo, mas utilizando ambos os métodos em conjunto, uma grande quantidade de tempo e trabalho foi guardado enquanto ainda resultando na mesma conclusão. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54987/54987fig1.jpg" /> Figura 1: Ex Vivo Whole-órgão FluorescênciaMedições. A) Imagens representativas do grupo PEL. A escala do mapa de calor foi definida como a eficiência radiante. B) Os valores de eficiência radiante média obtida a partir da criação de ROIs em torno dos tecidos individuais que foram analisadas numa curva padrão, a fim de gerar os valores de fluorescência padronizados utilizados para a comparação de bio-distribuição. As barras de erro representam SEM. Barra de escala = 5 mm. (Modificado de McGowan, et al;. Drug Design, Desenvolvimento e Terapia; 2016) <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54987/54987fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54987/54987fig2.jpg" /> Figura 2: Medições quantitativas Histologia do tecido. A) Imagem representativa do ELP IN- ou animais tratados com IV criadas pelo cérebro que cortam 20 mm de espessura, montar as fatias de on slides, e depois inventariar os slides usando um scanner de fluorescência slide. B) Os valores médios obtidos a partir da criação de ROIs em torno do bulbo olfativo, hemisférios e cerebelo, medida como o valor de cinza média e ajuste a uma curva padrão para gerar as medições da concentração ug / ml. As barras de erro representam SEM. Barra de escala = 5 mm. (Modificado de McGowan, et al;. Drug Design, Desenvolvimento e Terapia; 2016) <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54987/54987fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Ex vivo de imagens de órgãos todo é um método rápido para a determinação das concentrações relativas dos compostos marcados com fluorescência no interior e entre os tecidos ou os grupos de tratamento. Por outro lado, a histologia quantitativa de fluorescência, enquanto que mais trabalho intensivo, permite a quantificação dos níveis absolutos de tecido de moléculas marcadas.

O uso de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Imagem de órgãos inteiros e Histologia Tissue quantitativa para determinar o Bio-distribuição das moléculas fluorescente etiquetado

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

the-use-ex-vivo-whole-organ-imaging-quantitative-tissue-histology-to

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

9.5K visualizações.  The University of Mississippi Medical Center.  Ex vivo de imagens de órgãos todo é um método rápido para a determinação das concentrações relativas dos compostos marcados com fluorescência no interior e entre os tecidos ou os grupos de tratamento. Por outro lado, a histologia quantitativa de fluorescência, enquanto que mais trabalho intensivo, permite a quantificação dos níveis absolutos de tecido de moléculas marcadas. 

Vídeo: The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Actina Ensaio Co Sedimentação; para a Análise da proteína de ligação a F-Actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Biologia

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

Uso do Kit de Detecção de Protease Fluorescente para determinar a atividade de protease

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentivirus mediada Durante Knockdown Ex Vivo Eritropoese de Células-Tronco Hematopoéticas

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

Ex vivo Cultura do Rato Embryonic pele e Live-imaging de Migração melanoblasto

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, and membrane potential. All of these approaches depend on measurement of activity at one or multiple locations along the gut simultaneously which are then interpreted to provide a sense of overall motility patterns. Recently, the development of video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques have made it possible to observe and analyze complex patterns in ex vivo whole segments of colon and intestine. Once recorded and digitized, video records can be converted to STmaps in which the luminal diameter is converted to grayscale or color [called diameter maps (Dmaps)]. STmaps can provide data on motility direction (i.e., stationary, peristaltic, antiperistaltic), velocity, duration, frequency and strength of contractile motility patterns. Advantages of this approach include: analysis of interaction or simultaneous development of different motility patterns in different regions of the same segment, visualization of motility pattern changes over time, and analysis of how activity in one region influences activity in another region. Video recordings can be replayed with different timescales and analysis parameters so that separate STmaps and motility patterns can be analyzed in more detail. This protocol specifically details the effects of intraluminal fluid distension and intraluminal stimuli that affect motility generation. The use of luminal receptor agonists and antagonists provides mechanistic information on how specific patterns are initiated and how one pattern can be converted into another pattern. The technique is limited by the ability to only measure motility that causes changes in luminal diameter, without providing data on intraluminal pressure changes or muscle tension, and by the generation of artifacts based upon experimental setup; although, analysis methods can account for these issues. When compared to previous techniques the video recording and STmap approach provides a more comprehensive understanding of gastrointestinal motility.

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Recently available video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques make it possible to visualize and quantify both propagating and mixing patterns of intestinal motility. The goal of this protocol is to explain the generation and analysis of STmaps using the GastroIntestinal Motility Monitoring (GIMM) system.

Mapeamento espacial e temporal da motilidade em<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Preparações dos intestinos

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, is expressed in neurons in response to various stimuli. The protein product can be readily detected with immunohistochemical techniques leading to the use of c-FOS detection to map groups of neurons that display changes in their activity. In this article, we focused on the identification of brainstem neuronal populations involved in the ventilatory adaptation to hypoxia or hypercapnia. Two approaches were described to identify involved neuronal populations in vivo in animals and ex vivo in deafferented brainstem preparations. In vivo, animals were exposed to hypercapnic or hypoxic gas mixtures. Ex vivo, deafferented preparations were superfused with hypoxic or hypercapnic artificial cerebrospinal fluid. In both cases, either control in vivo animals or ex vivo preparations were maintained under normoxic and normocapnic conditions. The comparison of these two approaches allows the determination of the origin of the neuronal activation i.e., peripheral and/or central. In vivo and ex vivo, brainstems were collected, fixed, and sliced into sections. Once sections were prepared, immunohistochemical detection of the c-FOS protein was made in order to identify the brainstem groups of cells activated by hypoxic or hypercapnic stimulations. Labeled cells were counted in brainstem respiratory structures. In comparison to the control condition, hypoxia or hypercapnia increased the number of c-FOS labeled cells in several specific brainstem sites that are thus constitutive of the neuronal pathways involved in the adaptation of the central respiratory drive.

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.

A proteína c-Fos Detecção imuno: Uma ferramenta útil como um marcador de vias centrais envolvidos em respostas fisiológicas específicas<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; Ex Vivo</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.

In Vitro e In Vivo de abordagens para determinar a permeabilidade da célula epitelial Intestinal

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-Clear: Um método de compensação por imagem tridimensional do tecido adiposo tecido

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and cell debris, through bulk endocytosis. This pathway plays an essential role in a variety of cellular processes, including the regulation of immune responses and cancer cell metabolism. Given this importance in biological function, examining cell culture conditions can provide valuable information by identifying regulators of this pathway and optimizing conditions to be employed in the discovery of novel therapeutic approaches. The study describes an automated imaging and analysis technique using standard laboratory equipment and a cell imaging multi-mode plate reader for the rapid quantification of the macropinocytic index in adherent cells. The automated method is based on the uptake of high molecular weight fluorescent dextran and can be applied to 96-well microplates to facilitate assessments of multiple conditions in one experiment or fixed samples mounted onto glass coverslips. This approach is aimed at maximizing reproducibility and reducing experimental variation while being both time-saving and cost-effective.

Automated assays using multi-well microplates are advantageous approaches for identifying pathway regulators by allowing the assessment of a multitude of conditions in a single experiment. Here, we have adapted the well-established macropinosome imaging and quantification protocol to a 96-well microplate format and provide a comprehensive outline for automation using a multi-mode plate reader.

Imagem e Análise Automatizada para a Quantificação de Macropinoss fluorescentes rotulados

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and ...

O uso de

Resumo

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