This research was supported by the Brain Research Program through the National Research Foundation (NRF) funded by the Korean Ministry of Science, ICT, and Future Planning (NRF-2015M3C7A1028790).

experiências em animais devem estar em conformidade com todas as normas governamentais e institucionais relevantes. 1. Preparação dos Reagentes <ol><li> Para a solução de hidrogel monómero (A4P0): Adiciona-se 20 g de acrilamida e 450 mL de 0,1 x solução salina tamponada com fosfato (PBS) e ajustar o volume a 500 ml com 0,1 x PBS. CUIDADO: monómeros acrilamida são tóxicos. Efectuar todos os procedimentos em um exaustor com equipamento de protecção pessoal, incluindo um escudo de rosto, uma bata de laboratório, luvas e sapatos fechados. <ol><li> Imediatamente antes de usar, adicionar 100 mg de 2,2&#39;-azobis [2- (2-imidazolin-2-il) propano] di-hidrocloreto a 40 mL de solução de monómero de hidrogel (A4P0) num tubo cónico de 50 mL sob uma coifa . </li></ol></li><li> Para a limpeza de tecidos electroforética (ETC) tampão: Adicionar 40 g de sulfato de dodecilo de sódio (SDS) e 12,37 g de ácido bórico e 800 mL de H 2 O desionizada (dH2O). Ajustar o pH para 8,5 com NaOH e ajustar o volume para1 L com DH adicional de 2 O. CUIDADO: SDS é um produto químico prejudicial; portanto, lidar com isso com cuidado. </li><li> Para a solução CUBIC de montagem: Adicionar 250 g de sacarose, 125 g de ureia e 125 g de N, N, N &#39;, N&#39; -tetraquis (2-hidroxipropil) etilenodiamina e 150 ml de dH 2 O e perfazer o volume para 500 mL com dH2O </li></ol> 2. Preparação de amostras e Fixação <ol><li> Eutanásia do mouse. <ol><li> Prepara-se o alfaxalona (1 mg / kg) e xilazina (0,5 mg / kg) na mesma seringa. </li><li> Intraperitoneal injetar a mistura de alfaxalona e xilazina e permitir que 3 min para o mouse para se tornar inconsciente. </li><li> Espere até que o rato anestesiado já não responde a estímulos dolorosos, como uma pitada cauda, ​​antes de prosseguir. ATENÇÃO: Siga as orientações institucionais apropriados para a manipulação de animais. </li></ol></li><li> Transcardialmente perfundir o rato com 100 mL de NaCl a 0,9% (pH 7,4-7,5) solução decontendo heparina (100 U / mL) para desangrar, seguido por 100 mL de 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS 1x (pH 7,4) 14. CUIDADO: solução PFA é tóxico. A preparação da solução de PFA e todo o tratamento posterior deve ser conduzida em um exaustor e com equipamento de protecção individual. </li><li> Cortar a cabeça do rato, abrir a pele, e quebrar o crânio entre os olhos usando uma tesoura pequena. </li><li> Remover pedaços do crânio usando pequenas pinças, curvado. </li><li> Retire do cérebro ou órgãos desejados. </li><li> Incubar o cérebro e os órgãos em pós-fix solução PFA a 4% a 4 ° C durante a noite. NOTA: Para específica da região de compensação de tecidos, dissecar a região específica ou cortar o tecido após a fixação do tecido. CUIDADO: solução PFA é tóxico. A perfusão transcardial e todo o tratamento posterior do rato deve ser conduzida em um exaustor e com equipamento de protecção individual. </li></ol> 3. Hidrogel Monómero de infusão e Polymerization <ol><li> Incubar os órgãos fixos em solução hidrogel monómero A4P0 a 4 ° C durante 12-24 horas com agitação suave. </li><li> Hidrogel monómero-infundido polimerização tecido. <ol><li> Transfira a amostra para um tubo de fundo redondo de 10 mL com 5 mL de solução de monómero de hidrogel. Enrole a parte superior do tubo de fundo redondo com Parafilm. </li><li> Remover o oxigénio a partir do tubo de fundo redondo contendo o rato inteiro amostra infundidos cérebro-hidrogel fazendo borbulhar azoto através do líquido durante 1 minuto. De forma rápida e firmemente fechar o tubo contendo amostra. </li></ol></li><li> Transferir o tubo para um banho-maria (37 ° C) durante 2 h. </li><li> Lava-se a amostra polimerizada brevemente com 0,1 x PBS para remover o excesso de hidrogel. CUIDADO: monómeros de hidrogel são tóxicos. Para evitar o contato da pele com monômero de hidrogel, execute todos os procedimentos em um exaustor e com equipamento de protecção pessoal, incluindo um escudo de rosto, uma bata de laboratório e luvas. NOTA: polimerizado tecidospode ser armazenada em 0,1X PBS contendo azida de sódio durante mais de 2 semanas a 4 ° C. CUIDADO: A azida sódica é altamente e altamente tóxico. Efectuar todos os procedimentos em um exaustor e com equipamento de protecção pessoal, incluindo um escudo de rosto, uma bata de laboratório e luvas. </li></ol> 4. eletroforética Tissue Clearing (ETC) <ol><li> Transferir a amostra polimerizada a um recipiente de tecido e colocar o recipiente na câmara de tecido, etc. </li><li> Encha a câmara ETC ETC com tampão usando a bomba peristatic. </li><li> Defina as condições ETC e executar o ETC. Use as seguintes configurações. <ol><li> Para configurações etc para órgãos inteiros, utilize as seguintes definições: (1,5 AMP), temperatura (37 ° C), hora (6,0 h), a velocidade da bomba (30 rpm) em execução. </li><li> Para configurações etc para grossas fatias de cérebro de rato de 1 a 2 mm, use as seguintes configurações: atual (1,5 amp), temperatura (37 ° C), hora (2,0 h), a velocidade da bomba (30 rpm) em execução. </li></ol></li><li> transferência tele limpou amostra para um tubo cônico de 50 mL com 45 mL de 0,1 x PBS. Lavam-se as amostras compensadas várias vezes com 0,1X PBS até não há bolhas são vistas quando o tubo é agitado brevemente (para confirmar a remoção completa do SDS). </li></ol> 5. imunomarcação de tecidos processados-ACT <ol><li> Para toda rato cérebro: incubar a amostra num volume de 3 mL de solução de anticorpo contendo 1x PBS, 6% de albumina de soro bovino (BSA), 0,1% de Triton X-100, e 0,01% de azida de sódio (solução de diluição do anticorpo) com uma diluição fator de 1/500 para a tirosina hidroxilase anticorpo (TH) durante 4 dias a 37 ° C com agitação suave. Substituir a solução de anticorpo no final do dia 2. <ol><li> Lava-se a amostra num tubo cónico de 50 ml com 45 ml de 0,1 x PBS durante 3 - 5 h e mudar o tampão de cada hora. </li><li> Incubar a amostra num volume de 3 ml de solução de diluição do anticorpo com um factor de diluição de 1/500 para o anticorpo secundário de burro anti-coelho de 488 durante 4 dias a 37 ° C com agitação suave. Replace as soluções anticorpo diluído no dia 2. </li></ol></li><li> Para a espessura 1- tecido cerebral cortado 2 mm: incubar a amostra durante a noite ou até um máximo de um dia, num volume de 0,5 a 1 mL de uma solução de diluição de anticorpo com um factor de diluição de 1/500 para o anticorpo de colagénio do tipo IV a 37 ° C com agitação suave. <ol><li> Lava-se a amostra num tubo cónico de 15 mL com um volume de 12 ml de 0,1 x PBS durante 1-2 h. Alterar o buffer a cada hora. </li><li> Incubar a amostra num volume de 0,5 a 1 mL de uma solução de diluição de anticorpo com um factor de diluição de 1/500 para Cy3-conjugado de anticorpo secundário anti-coelho durante a noite ou até um máximo de 1 dia a 37 ° C com agitação suave. </li></ol></li><li> Lavar a amostra com 0,1 x PBS durante 3-5 h; mudar o tampão de cada hora. </li><li> Antes de imagiologia, incubar a amostra em uma quantidade adequada de solução de montagem cúbico por 1 h à temperatura ambiente com agitação suave. Substitua com uma solução CUBIC-mount fresco e incubar durante mais 1 h. NOTA: </b&gt; 76 Tipo de anticorpos funcionou bem no tecido processado-ACT rato, incluindo 31 anticorpos monoclonais 14. Pré-tecido marcado pode ser combinado com a imunomarcação de mais dois fluorocromos no tecido ACT-processados. </li></ol> 6. imunomarcação de densas tecidos (Presto) <ol><li> c-PRESTO NOTA: c-PRESTO é adequado para pequenos porte amostras, tais como testículo inteiro, rim inteiro, ou pequenas seções de órgãos maiores. <ol><li> Transferir a amostra para um tubo de 1,5 ml, adicionar 500 mL de uma solução de diluição de anticorpo com um factor de diluição de 1/500 para o anticorpo de colagénio tipo IV, e centrifuga-se o tubo a 600 × g durante 2 h. </li><li> Lava-se a amostra corada com 0,1 x PBS por centrifugação a 600 x g durante 30 min. </li><li> Adicionar 500 uL de solução de diluição do anticorpo com um factor de diluição de 1/500 para o anticorpo secundário anti-coelho conjugado com Cy3 e centrifugar a 600 x g durante 2 h. </li><li> Lavar a amostra corada com 0.1x PBS por centrifugação a 600 x g durante 30 min. </li></ol></li><li> s-PRESTO NOTA: s-PRESTO é adequado para tecidos maiores. <ol><li> Prepare uma seringa (volume de 30 mL) e conectá-lo a uma válvula de 3 vias (Figura 1A). Cole a válvula com uma pistola de cola para as condições de alta pressão (Figura 1B). </li><li> Transferir a amostra para a seringa conectada à válvula de 3 vias em a posição da válvula fechada. </li><li> Adicionar 5 - 7 ml de solução de diluição do anticorpo com um factor de diluição de 1/500 para o anticorpo de colagénio do tipo IV. Libertar a solução de anticorpo na amostra através da abertura da válvula. </li><li> Colocar o pistão da seringa para a posição de 17 mL para proporcionar espaço suficiente para o movimento infusão / retirada. Isto pode ser feito na posição da válvula aberta. Fechar a válvula de 3 vias, após a definição seringa está terminado. </li><li> Colocar a seringa que contém a amostra em uma bomba de seringa. Definir as condições de bomba de seringa a um volume de infusão / retirada de 10 ml / min e um 4-min tempo de pausa no modo de ciclo contínuo (Figura 1C). NOTA: A bomba infunde até atingir o volume alvo (10 ml), e, em seguida, a direção de fluxo de alterações após uma breve pausa (4 min). </li><li> Executar a bomba de seringa, durante 3 - 24 h à temperatura ambiente (Figura 1F). </li><li> Abra a válvula de 3 vias e substituir a solução com 0,1 x PBS. </li><li> Lava-se a amostra corada duas vezes com 0,1 x PBS, durante 1 h cada vez usando a bomba de seringa. </li><li> Mudar com solução de diluição do anticorpo contendo anticorpo secundário anti-coelho Cy3 conjugada (factor de diluição de 1/500) e executar a bomba de seringa para 3-24 h. </li><li> Abra a válvula de 3 vias e substituir a solução com 0,1 x PBS. </li></ol></li><li> Antes de imagiologia, incubar a amostra manchado em uma quantidade adequada de solução de montagem cúbico por 1 h à temperatura ambiente com agitação suave. Substitua com uma solução CUBIC-mount fresco e incubar durante mais 1 h. </li></ol> 7. Imaging <ol><li> Coloque o tecido marcado em um prato confocal e adicionar solução CUBIC de montagem até que o tecido é coberto. Coloque uma lamela sobre o tecido. Use um microscópio confocal para a imagem do tecido 14 sob a objetiva de 10X. </li></ol>

<ol>
	<li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li><li>Dodt, H. -. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158, 945-958 (2014).</li><li>Kim, S. -. 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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Má fixação ou a imersão do hidrogel em tecidos pode causar a perda de proteínas e a distorção do tecido durante o processo de limpeza do tecido. Todo o cérebro do rato adulto deve ser incubada em paraformaldeído a 4% durante a noite, seguido por imersão num volume mínimo de 20 mL de solução de monómero de hidrogel para 12 - 18 h com agitação suave. Para grandes tecidos, incluindo tecidos de origem humana, tais como fatias de cérebro e medula espinal, estendido imersão tempo na solução de monómero de hidrogel é necessária. O protocolo ACT é facilmente aplicável à limpeza de tecidos fixos porque os passos de fixação de tecido e de infusão de polímero são separados. Depois de limpa de tecido, tecidos humanos foram bem coradas com vários anticorpos. Note-se que a técnica ACT compensação não é compatível com fixadores álcool, tal como etanol e metanol. A etapa de polimerização tecido-hidrogel também é fundamental para a produção de tecidos de boa qualidade no seguimento do processo de compensação. Porqueo oxigénio inibe a polimerização de acrilamida, que deve ser removido por desgaseificação a solução contendo o tecido sob um sistema de infusão de azoto gasoso. Alternativamente, DE-oxigenação pode ser executado usando uma câmara de vácuo com um bloco de aquecimento durante 23 h. A taxa de compensação é dependente de vários fatores, incluindo o tamanho do órgão, o conteúdo de lipídios ou proteínas fibrosas ECM, a condição de fixação, etc. A maioria dos tecidos do rato adulto pode ser afastada pelo ETC durante a noite. No entanto, há um risco desnecessário de sobre-compensação e inchaço dos tecidos; Assim, as diferenças de tempo de compensação são de consideração importante. condições tecido de limpeza deve ser determinada empiricamente. Mais importante, o conteúdo da ECM podem afectar a aparência do tecido limpo. A cor dos tecidos permanece branca ou opaca, mesmo após a ACT em tampão ETC, porque ACT não limpa fibras de proteína densas. No entanto, quando estes órgãos foram imersos em solução correspondente RI, oy se tornou transparente. A taxa de inchamento dos tecidos parece ser dependente do conteúdo de ECM os tecidos e órgãos moles, tais como o cérebro, exibem uma proporção de inchaço superior a órgãos densas. Porque o aumento do inchaço dos tecidos vai ajudar o processo de tecido-clearing, ACT rotineiramente utiliza destilada tampão à base de água na maioria dos casos. Em alguns casos, quando o inchaço dos tecidos ou deformidade transitória não é desejável, tais como em embriões, tampão contendo 0,1 x PBS pode ser aplicada para imagens de alta resolução. Deve-se também notar-se que as concentrações mais elevadas de sal no tampão poderia causar o encolhimento dos tecidos. O método ACT pode esclarecer órgãos inteiros e até mesmo todo o corpo de um rato 14. No entanto, processamento de imagem de tecidos profundos de tecido transparente exige microscópios e objetivos especiais. Assim, o tecido cerebral de 1 a 2 mm de espessura é mais eficaz para imagiologia com um microscópio confocal convencional. Nas nossas mãos, a remoção da etiquetaanticorpos ed dos tecidos processados-ACT é dependente de anticorpos, e rodadas de rotulagem anticorpo diferente não são recomendados. Vários anticorpos, como TH e GFAP, trabalhou especialmente bem para todo o cérebro immunolabeling 14. Por outro lado, alguns anticorpos, tais como TuJ1 ou Map2, frequentemente marcado apenas a superfície dos tecidos. Isto pode ser melhorado por outros métodos, tais como o interruptor 15. Outra limitação potencial é que pode ser difícil para preservar estruturas de proteínas finas no tecido processado-ACT devido ao inchaço dos tecidos e encolhimento durante a etapa de remoção de tecido. A técnica presto é aplicável a uma grande variedade de técnicas de rotulagem tecido. Por exemplo, em métodos de tecido transparente usando tecido pré-marcada, como SeeDB 4 e 7 iDISCO, imunomarcação de tecido denso requer períodos de incubação mais longos do que alguns dias a semanas. No entanto, Presto pode encurtar o tempo de incubação a várias horas, enabling a realização de todo o processo dentro de um dia, com 1 mm de espessura de tecido denso. PRESTO pode melhorar a eficácia de deep-rotulagem de espessura, tecidos densos, ou tecidos grossos mesmo un-desmatadas. Porque Presto utiliza uma centrífuga de mesa ou bomba de seringa e não requer qualquer equipamento especial, é relativamente fácil de implementar esta técnica com os procedimentos laboratoriais de rotina.

Um dos desafios da neurociência é a visualização de fiação do circuito neuronal e as células individuais dentro do tecido cerebral intacto. Até recentemente, demonstrando as conexões entre os neurônios desta forma necessária 1) cortes seriados de tecidos; 2) rotulagem molecular de alvos específicos, como axônios ou proteínas; e 3) a visualização de reconstrução 3D de todo o cérebro através de registro computacional ou o alinhamento das imagens em série 2D 1. Estes passos são trabalhoso, requer uma grande quantidade de tempo, e são susceptíveis de perder informações durante o corte e rotulagem, fazendo o mapeamento de rede neuronal extremamente difícil. No entanto, muitos métodos que permitem a visualização de tecido intacto, sem corte têm sido desenvolvidos. Os tecidos biológicos pode ser feita opticamente transparente por meio de técnicas de limpeza de tecido 2-10. Um dos principais métodos é reduzir as diferenças do índice de refracção entre o tecido intacto e a solução de imersão em ordempara reduzir a dispersão da luz no tecido intacto, tornando assim o tecido transparente e permitindo a observação de estruturas profundas. Alguns tipos de soluções de imersão tem propriedades hidrofóbicas, o que resulta na rápida paragem da fluorescência durante o processo de desidratação. Por conseguinte, estes métodos não são compatíveis com imagens fluorescentes ao longo de um longo período de tempo de 11,12. Em vez de reagentes hidrofóbicas, outros métodos utilizam reagentes hidrofílicos para limpeza de tecidos, tais como SeeDB 4 e Sca l e 6, que mantêm a informação estrutural e de fluorescência do 4,6,8 tecido biológico. Contudo, macromoléculas, incluindo anticorpos, podem não alcançar o núcleo de tecido intacto por difusão por si só. Portanto, a pré-marcação de moléculas alvo em áreas profundas de tecidos densamente-embalados é tecnicamente desafiador. Num método tecido desobstrução-recentemente desenvolvidos, Clareza 3, um i de tecido biológico embebido em hidrogels formados com acrilamida, e os lípidos são removidos por electroforese sob sulfato de dodecilo de sódio (SDS) a solução molecular contendo. A amostra é então imerso numa solução com um índice de reflexão correspondente para reduzir a luz de espalhamento 3. O sistema de remoção de lípidos foi posteriormente modificada em clareza avançada 13 e PACT (técnica de clareza passiva) 10. Após a polimerização, as cadeias de ligação cruzada com proteínas de acrilamida, formando hidrogel-tecido. componentes lipídicos pode não reticulam com acrilamida; Assim, os lípidos podem ser eliminados por electroforese sob o tampão contendo SDS. Através da eliminação ativa de lipídios, o tecido cerebral aumenta acentuadamente em transparência 9. No entanto, estes métodos não abordam a impossibilidade de deep-rotulagem por difusão livre. Para superar essa limitação, técnicas para o transporte ativo de reagentes para as partes mais profundas de tecidos grossos são necessários. Embora CLAREZA permite compensação de tecido e tecido-fundovisualização, não é um processo fácil ou rápido. Ele pode levar várias semanas para limpar a 7,14 cérebro do rato inteiro. compensação rápida dos tecidos é essencial para a aplicação de tais métodos para definições básicas ou clínicas laboratoriais para pesquisa de ciências biológicas ou diagnóstico volume. O protocolo atual fornece um processo simplificado para apuramento tecido biológico e detecção da proteína subsequente mediante a entrega de imuno-coloração assistida por pressão. É apropriado para a formação de imagens espaciais de alta resolução de sistemas de processamento de dados arquivados grandes e 3D através da combinação com métodos de imagem.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="813">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">4% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:175px;">Lugen SCI&#160;</td>
			<td style="width:201px;">LGB-1175-4B</td>
			<td style="width:191px;">sample fixation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Acrylamide</td>
			<td style="width:175px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:201px;">75820</td>
			<td style="width:191px;">Hydrogel monomer solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">2,2&#8217;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride</td>
			<td style="width:175px;">Wako Pure Chemical Industries&#160;&#160;</td>
			<td style="width:201px;">VA-044</td>
			<td style="width:191px;">Hydrogel monomer solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Boric acid</td>
			<td style="width:175px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:201px;">76324</td>
			<td>ETC buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:175px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:201px;">18220</td>
			<td>ETC buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sodium hydroxide pellets</td>
			<td style="width:175px;">Junsei chemical</td>
			<td style="width:201px;">1310-73-2</td>
			<td>ETC buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:175px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:201px;">sc-2323A</td>
			<td>Immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:201px;">T8787</td>
			<td>Immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:201px;">S2002</td>
			<td>Immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Collagen type &#8547;</td>
			<td style="width:175px;">Abcam</td>
			<td style="width:201px;">AB6586</td>
			<td>Antibody/immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tyrosine hydroxylase (TH)</td>
			<td style="width:175px;">Millipore</td>
			<td style="width:201px;">AB152</td>
			<td>Antibody/immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Alexa Fluor Cy3 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:201px;">711-165-152</td>
			<td style="width:191px;">Secondary antibody/ immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies - Molecular Probes</td>
			<td>A21206</td>
			<td style="width:191px;">Secondary antibody/ immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Confocal dish</td>
			<td style="width:175px;">SPL lifesciences</td>
			<td style="width:201px;">101350</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:175px;">Leica</td>
			<td style="width:201px;">SP8</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sucrose</td>
			<td style="width:175px;">Junsei chemical</td>
			<td style="width:201px;">31365-0301</td>
			<td>CUBIC-mount solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Urea</td>
			<td style="width:175px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:201px;">23036</td>
			<td>CUBIC-mount solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:201px;">122262</td>
			<td>CUBIC-mount solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:247px;">ECT chamber</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C10101</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">ECT chamber controller</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C10201</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Temperature probe</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12101</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Peristatic pump</td>
			<td style="width:175px;">Baoding longer precision pump Co., Ltd</td>
			<td style="width:201px;">YZ1515X</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Buffer reservoir</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C10401</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Tissue container&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12001</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Container holder for 1 tissue container</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12002</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Mouse brain slice holder</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12004</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Whole rat brain holder</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12007</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Peristaltic pump tubing</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12104</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Tabletop-centrifuge</td>
			<td style="width:175px;">Hanil science industrial Co., Ltd</td>
			<td style="width:201px;">MICRO 12</td>
			<td>c-PRESTO</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:175px;">Baoding longer precision pump Co., Ltd</td>
			<td style="width:201px;">LSP02-1B</td>
			<td>s-PRESTO</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Syringe (20 ml)</td>
			<td style="width:175px;">Korea vaccine Co., Ltd.</td>
			<td style="width:201px;">KV-S20</td>
			<td>s-PRESTO</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">3-way stopcock</td>
			<td style="width:175px;">Hyupsung medical Co.,Ltd.</td>
			<td style="width:201px;">HS-T-01N</td>
			<td>s-PRESTO</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

act-presto: biological tissue clearing and immunolabeling methods for volume imaging

A identificação e exploração da organização detalhada de órgãos ou de todo o corpo no nível celular são desafios fundamentais da biologia. métodos de transição requerem uma quantidade substancial de tempo e esforço para obter uma imagem 3D e incluindo o seccionamento do tecido intacto, imunomarcação e imagiologia do tecido em série em corte, o que produz uma perda de informação em cada passo do processo. Em abordagens recentemente desenvolvidas para imagens de alta resolução dentro do tecido intacto, caracterização molecular foi restringido à rotulagem de proteínas. No entanto, os protocolos disponíveis atualmente para compensação de órgãos exigem um tempo de processo consideravelmente longo, tornando-se difícil de implementar técnicas de limpeza de tecidos em laboratório. Recentemente, estabeleceu um protocolo rápido e altamente reprodutível denominado ACT-PRESTO (a ctive c laridade t echnique- p ressão r exultante e ficiente e s tabela t ransferênciade macromoléculas para o rgans), o que permite o afastamento do tecido dentro de várias horas. Além disso, ACT-PRESTO permite imunomarcação rápida com os métodos convencionais e acelera a penetração de anticorpos na camada profunda da densamente formados espécimes, de espessura através da aplicação de fluxo de pressão ou convecção. Nós descrevem como preparar tecidos, como limpar pela remoção de lipídios usando eletroforese, e como imuno-mancha por um parto assistido à pressão. A rapidez e consistência do protocolo irá acelerar o desempenho da investigação histológica 3D e diagnósticos baseados no volume.

Clearing ACT-tecidos Um fator importante que afeta a compensação de tecidos é a fixação do tecido. PFA fixação e infusão de acrilamida são etapas separadas neste protocolo. Depois do passo de polimerização do tecido de hidrogel, a solução A4P0 livre não é polimerizado, apesar de infusão de tecido hidrogéis são reticulados com macromoléculas endógenas. Portanto, não deve formar gel de fora do tecido (Figura 2A). O procedimento ACT resulta em menos reticulação entre as proteínas e acrilamida em comparação com o protocolo de clareza. Assim, a amostra de tecido de hidrogel é mais porosa. Este recurso permite a extração rápida de lipídios e a difusão de macromoléculas. As secções de cérebro de rato de 1 a 2 mm de espessura foram suficientemente afastada dentro de 1 - 2 horas (Figura 2B), e 5-6 h de etc foi suficiente para Clearance de cérebros inteiros de rato (Figura 2C). compensação de tecido mediada por Hidrogel induziu a expansão do tecido depois do passo etc, mas o tecido devolvido ao seu tamanho original, em solução pareados por índice de reflexão. A amostra de tecido de hidrogel formado no procedimento ACT é altamente porosa, e, assim, compostos pequenos e macromoléculas poderia penetrar eficientemente e difundir facilmente (Figura 3). Após 2 h de incubação de fatias de cérebro de 1 mm com tirosina-hidroxilase (TH) e o anticorpo de tipo IV do colagénio, uma subsequente de 2 horas de incubação com um anticorpo secundário era suficiente para rotular os neurónios dopaminérgicos, a uma profundidade de 500 um (Figura 3) . Imunomarcação PRESTO-tecidos órgãos densas têm, geralmente, concentrações elevadas de fibras de ECM, que afecta a penetração dos anticorpos para os tecidos. Assim, os anticorpos Penetavaliaram a uma profundidade de apenas 20-30 uM em tecidos densos, tais como o tecido renal, após 12 h de incubação. Para superar esta limitação, desenvolvemos métodos de penetração de macromoléculas activas que permitem a entrega de reagentes para os tecidos profundos, isto é, presto (pressão relacionada com a transmissão estável e eficiente de macromoléculas para os órgãos) (Figura 4). Em comparação com a incubação estática de tecido renal processado-ACT com soluções de anticorpos, a aplicação de forças centrífugas (600 xg) com uma centrífuga de mesa (PRESTO centrífuga, c-PRESTO) melhorou muito a entrega de anticorpos no tecido profundo (Figura 5). Quando aplicamos o procedimento c-PRESTO aos tecidos densos, 3 h de incubação foi suficiente para rotular 250 para estruturas profundas 300 mícrons. Para melhorar a distorção do tecido, sem dano tecidual significativa, que também projetou uma máquina que fornece fluxo de convecção com uma bomba de seringa (PRESTO seringa, s-PRESTO). Este processo igualmente melhorada pe de anticorposnetration comparada à difusão passiva (Figura 5). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig1.jpg" /> Figura 1. Preparação do aparelho s-presto. A. Uma seringa (30 mL) e torneira de três vias. B. A torneira de três vias conectada e colada à seringa. C. A seringa contendo a solução de amostra e o anticorpo, e a seringa colocada sobre a bomba de seringa. D. A bomba de seringa e configuração de condição de trabalho. E. A bomba de infusão de um solução contendo os reagentes de marcação para o espécime. Quando o volume designado é atingido, as mudanças de direcção de bombagem e se retira a solução após um período de tempo designado. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54904/54904fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 2. ACT compensação tecido do cérebro de rato. A. Após a polimerização, as soluções A4P0 livres não são polimerizados; hidrogeles infusão de tecido são gelificado por reticulação com macromoléculas endógenas. B. 1 a fatias de cérebro de espessura de 2 mm foram apuradas para 1 - 2 h, e o grau de expansão e recuperação de tamanho em índice de reflexão (RI) solução -Correspondência foram registrados. C. A espessura de todo o cérebro do rato é de cerca de 0,8 cm e 5-6 h da ETC foi suficiente para limpar completamente o cérebro. Após 3 h de ETC, houve uma quantidade significativa de tecido não apagada. Por 6 h de ETC, no entanto, havia ocorrido compensação de todo o cérebro. A cor dos tecidos após ACT no buffer ETC é branca ou opaca. Pelo ajuste RI, os tecidos tornam-se transparentes. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54904/54904fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique dela</a>e para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig3.jpg" /> Figura 3. imunomarcação com tecido cerebral do rato limpou-ACT. Imagens de 1 mm fatias processadas-ACT cérebro do rato mostrando córtex cerebral do rato corado com um anticorpo para colágeno tipo IV e parte do mesencéfalo coradas com um anticorpo para tirosina hidroxilase (TH). barra de escala, 100 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54904/54904fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig4.jpg" /> Figura métodos imunomarcação 4. PRESTO. Os anticorpos não conseguem penetrar em tecidos densos por difusão. métodos PRESTO imunomarcação foram projetados para infundir ativamente macromoléculas e entregar reagentes paratecidos densos. A aplicação de forças centrífugas, usando uma centrífuga de bancada padrão (Presto centrífuga, c-Presto) nitidamente facilitada a entrega de anticorpos. A aplicação de fluxo de convecção com uma bomba de seringa (PRESTO seringa, s-PRESTO) melhorou a penetração do anticorpo. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54904/54904fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig5.jpg" /> Figura 5. PRESTO imunomarcação de tecido denso limpou-ACT. Para C-Presto, os tecidos foram centrifugadas a 600 xg durante 3 h, usando uma centrífuga de bancada padrão, a fim de acelerar a penetração dos anticorpos primários e secundários. Para S-Presto, uma bomba de seringa foi utilizado para entregar os anticorpos. órgãos do rato, tais como os rins e do fígado, foram marcadas com colagénio de tipo IV. Comparado com os métodos convencionais, 3 h deC ou S-PRESTO marcadamente aumenta a profundidade rotulagem. No rim e fígado, a profundidade do eixo Z atinge 300-350 uM ou mais profundo em amostras presto (à direita), enquanto as amostras de controlo são rotulados a uma profundidade de apenas 40 - 50 | iM (esquerda). A imagem reconstruída 3D foi obtida com um microscópio confocal. barra de escala, 100 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54904/54904fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

ACT-PRESTO (clareza técnica de pressão ativo relacionado transferência eficiente e estável de macromoléculas em órgãos) permite o rápido e eficiente, mas barato compensação tecido e penetração anticorpo rápida nos tecidos foi afastada pelo difusão passiva ou parto assistido à pressão. Usando este método, uma vasta gama de tecidos pode ser apagada, por immunolabeled anticorpos múltiplos, e o volume-fotografada.

ACT-PRESTO: Clearing tecido biológico e Métodos imunomarcação for Imaging Volume

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

act-presto-biological-tissue-clearing-immunolabeling-methods-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

12.0K visualizações.  Korea University College of Medicine.  ACT-PRESTO (clareza técnica de pressão ativo relacionado transferência eficiente e estável de macromoléculas em órgãos) permite o rápido e eficiente, mas barato compensação tecido e penetração anticorpo rápida nos tecidos foi afastada pelo difusão passiva ou parto assistido à pressão. Usando este método, uma vasta gama de tecidos pode ser apagada, por immunolabeled anticorpos múltiplos, e o volume-fotografada. 

Vídeo: ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians. The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal pair and a longer maxillary pair. Barbel tissue contains cells of ectodermal, mesodermal and neural crest origin, including skin cells, glands, taste buds, melanocytes, circulatory vessels and sensory nerves. Unlike most adult tissue, the maxillary barbel is optically clear, allowing us to visualize the development and maintenance of these tissue types throughout the life cycle. 
This video shows early development of the maxillary barbel (beginning approximately one month post-fertilization) and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration in the adult appendage (&gt;3 months post-fertilization). Briefly, the left maxillary barbel of an anesthetized fish is elevated with sterile forceps just distal to the caudal edge of the maxilla. A fine, sterile spring scissors is positioned against the forceps to cut the barbel shaft at this level, establishing an anatomical landmark for the amputation plane. Regenerative growth can be measured with respect to this plane, and in comparison to the contralateral barbel. Barbel tissue regenerates rapidly, reaching maximal regrowth within 2 weeks of injury.
Techniques for analyzing the regenerated barbel include dissecting and embedding matched pairs of barbels (regenerate and control) in the wells of a standard DNA electrophoresis gel. Embedded specimens are conveniently photographed under a stereomicroscope for gross morphology and morphometry, and can be stored for weeks prior to downstream applications such as paraffin histology, cryosectioning, and/or whole mount immunohistochemistry. These methods establish the maxillary barbel as a novel in vivo tissue system for studying the regenerative capacity of multiple cell types within the genetic context of zebrafish.

The zebrafish maxillary barbel is an integumentary sense organ containing ectodermal, mesodermal and neural crest derivatives. Importantly, the adult barbel can regenerate after proximal amputation. This video introduces maxillary barbel development and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration, followed by collection, embedding and downstream imaging of barbel specimens.

Métodos para o Estudo do maxilar Zebrafish Barbel

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians.  The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal ...

Biologia

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

Síntese e calibração de nanossondas Phosphorescent for Imaging Oxigênio em Sistemas Biológicos

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS)

Coherent Raman imaging techniques have seen a dramatic increase in activity over the past decade due to their promise to enable label-free optical imaging with high molecular specificity 1. The sensitivity of these techniques, however, is many orders of magnitude weaker than fluorescence, requiring milli-molar molecular concentrations 1,2. Here, we describe a technique that can enable the detection of weak or low concentrations of Raman-active molecules by amplifying their signal with that obtained from strong or abundant Raman scatterers. The interaction of short pulsed lasers in a biological sample generates a variety of coherent Raman scattering signals, each of which carry unique chemical information about the sample. Typically, only one of these signals, e.g. Coherent Anti-stokes Raman scattering (CARS), is used to generate an image while the others are discarded. However, when these other signals, including 3-color CARS and four-wave mixing (FWM), are collected and compared to the CARS signal, otherwise difficult to detect information can be extracted 3. For example, doubly-resonant CARS (DR-CARS) is the result of the constructive interference between two resonant signals 4. We demonstrate how tuning of the three lasers required to produce DR-CARS signals to the 2845 cm-1 CH stretch vibration in lipids and the 2120 cm-1 CD stretching vibration of a deuterated molecule (e.g. deuterated sugars, fatty acids, etc.) can be utilized to probe both Raman resonances simultaneously. Under these conditions, in addition to CARS signals from each resonance, a combined DR-CARS signal probing both is also generated. We demonstrate how detecting the difference between the DR-CARS signal and the amplifying signal from an abundant molecule's vibration can be used to enhance the sensitivity for the weaker signal. We further demonstrate that this approach even extends to applications where both signals are generated from different molecules, such that e.g. using the strong Raman signal of a solvent can enhance the weak Raman signal of a dilute solute.

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering CARS

A combination of three single wavelength short-pulsed lasers is used to generate coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) and doubly-resonant CARS (DR-CARS). The difference between these signals provides enhanced sensitivity for otherwise difficult to detect coherent Raman signals, enabling imaging of weak Raman scatterers.

Imagem diferencial de estruturas biológicas com Duplamente-ressonante Scattering Anti-Stokes Raman coerente (CARS)

Coherent Raman imaging techniques have seen a dramatic increase in activity over the past decade due to their promise to enable label-free optical imaging ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Simultânea Multicolor Imagem de Estruturas Biológicas com fluorescência Fotoativação Localização Microscopia

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Métodos para a pele ferimento e Ensaios para Responses ferida no<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS (Super-region Volume Segmentation) Workbench

Segmentation is the process of isolating specific regions or objects within an imaged volume, so that further study can be undertaken on these areas of interest. When considering the analysis of complex biological systems, the segmentation of three-dimensional image data is a time consuming and labor intensive step. With the increased availability of many imaging modalities and with automated data collection schemes, this poses an increased challenge for the modern experimental biologist to move from data to knowledge. This publication describes the use of SuRVoS Workbench, a program designed to address these issues by providing methods to semi-automatically segment complex biological volumetric data. Three datasets of differing magnification and imaging modalities are presented here, each highlighting different strategies of segmenting with SuRVoS. Phase contrast X-ray tomography (microCT) of the fruiting body of a plant is used to demonstrate segmentation using model training, cryo electron tomography (cryoET) of human platelets is used to demonstrate segmentation using super- and megavoxels, and cryo soft X-ray tomography (cryoSXT) of a mammalian cell line is used to demonstrate the label splitting tools. Strategies and parameters for each datatype are also presented. By blending a selection of semi-automatic processes into a single interactive tool, SuRVoS provides several benefits. Overall time to segment volumetric data is reduced by a factor of five when compared to manual segmentation, a mainstay in many image processing fields. This is a significant savings when full manual segmentation can take weeks of effort. Additionally, subjectivity is addressed through the use of computationally identified boundaries, and splitting complex collections of objects by their calculated properties rather than on a case-by-case basis.

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS Super-region Volume Segmentation Workbench

Segmentation of three-dimensional data from many imaging techniques is a major bottleneck in analysis of complex biological systems. Here, we describe the use of SuRVoS Workbench to semi-automatically segment volumetric data at various length-scales using example datasets from cryo-electron tomography, cryo soft X-ray tomography, and phase contrast X-ray tomography techniques.

Volume de segmentação e análise de materiais biológicos, usando a bancada de trabalho de SuRVoS (região super Volume segmentação)

Segmentation is the process of isolating specific regions or objects within an imaged volume, so that further study can be undertaken on these areas of ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-Clear: Um método de compensação por imagem tridimensional do tecido adiposo tecido

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Preparação de amostras biológicas por congelamento de alta pressão, realce de contraste assistida por microondas e resina mínima incorporação para a imagem latente de Volume

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity is characterized by an increase in adipose tissue (AT) mass due to adipocyte hyperplasia and/or hypertrophia, leading to profound remodeling of its three-dimensional structure. Indeed, the maximal capacity of AT to expand during obesity is pivotal to the development of obesity-associated pathologies. This AT expansion is an important homeostatic mechanism to enable adaptation to an excess of energy intake and to avoid deleterious lipid spillover to other metabolic organs, such as muscle and liver. Therefore, understanding the structural remodeling that leads to the failure of AT expansion is a fundamental question with high clinical applicability. In this article, we describe a simple and fast clearing method that is routinely used in our laboratory to explore the morphology of mouse and human white adipose tissue by fluorescent imaging. This optimized AT clearing method is easily performed in any standard laboratory equipped with a chemical hood, a temperature-controlled orbital shaker and a fluorescent microscope. Moreover, the chemical compounds used are readily available. Importantly, this method allows one to resolve the 3D AT structure by staining various markers to specifically visualize the adipocytes, the neuronal and vascular networks, and the innate and adaptive immune cells distribution.

Here, we describe a simple, inexpensive and fast clearing method to resolve the 3D structure of both mouse and human white adipose tissue using a combination of markers to visualize vasculature, nuclei, immune cells, neurons, and lipid-droplet coat proteins by fluorescent imaging.

Explorando estrutura tecidual adiposa por limpeza de metilsalicylate e imagem 3D

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

Traditionally used for bulk biochemical assays, Xenopus laevis egg extracts have emerged as a powerful imaging-based tool for studying cytoplasmic phenomena, such as cytokinesis, mitotic spindle formation and assembly of the nucleus. Building upon early methods that imaged fixed extracts sampled at sparse time points, recent approaches image live extracts using time-lapse microscopy, revealing more dynamical features with enhanced temporal resolution. These methods usually require sophisticated surface treatments of the imaging vessel. Here we introduce an alternative method for live imaging of egg extracts that require no chemical surface treatment. It is simple to implement and utilizes mass-produced laboratory consumables for imaging. We describe a system that can be used for both wide-field and confocal microscopy. It is designed for imaging extracts in a 2-dimensional (2D) field, but can be easily extended to imaging in 3D. It is well-suited for studying spatial pattern formation within the cytoplasm. With representative data, we demonstrate the typical dynamic organization of microtubules, nuclei and mitochondria in interphase extracts prepared using this method. These image data can provide quantitative information on cytoplasmic dynamics and spatial organization.

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

We describe a method for the preparation and live imaging of undiluted cytoplasmic extracts from Xenopus laevis eggs.