Apoio da EB007279 subvenções e HL081273 dos EUA NIH é reconhecido agradecimento.

1. Descrição geral do protocolo de medição de oxigênio (Esta seção não tem nenhuma ação, mas é crucial para compreender o resto do papel. Pode ser filmado, por exemplo, como uma seqüência de slides um Ponto de alguns Power, acompanhada pela voz.) 1.1) A sonda é entregue para o meio de interesse, por exemplo, injetado no sangue ou líquido intersticial de um animal. 1.2) O objeto (superfície do tecido) é iluminado com a luz de comprimento de onda adequado a fim de promover a investigação sobre seu estado triplet animado. Tipicamente excitação ocorre através do mecanismo de um fóton. No entanto, no caso do especial de dois fótons avançada sondas, excitação pode ser feito através do mecanismo de dois fótons, que permite usar as sondas em aplicações de alta resolução da microscopia. Um fóton-excitação geralmente fornece uma resolução espacial menor, mais simples, mas requer instrumentação e pode ser usado em um único ponto medições com LED baseado em fibra óptica phosphorometers. 1,3 fosforescência) emitidos pela sonda se origina do estado triplete de vida longa. A molécula sonda deve ser especialmente concebido para dar rendimento quântico elevado do estado triplete e emitem fosforescência, em vez de fluorescência. Enquanto que no estado triplete, a sonda pode experimentar encontros colisão com as moléculas de oxigênio, que pode desactivar o estado triplete - &quot;. Quenching&quot; de um processo chamado Na ausência de oxigênio, a vida do estado triplete, e, portanto, a decadência fosforescência, é τ 0. Na presença de oxigênio, a vida de fosforescência (τ) é reduzido como resultado da extinção. Existe uma relação direta entre o tempo de vida do estado triplete e da quantidade de oxigênio no ambiente. Esta é a bem conhecida relação de Stern-Volmer, que liga a vida (τ) da fosforescência à concentração de oxigênio [O 2] (ou pressão parcial de oxigênio pO 2): <img src="/files/ftp_upload/1731/1731equation.jpg" alt="equação" /> Em sistemas biológicos, o oxigênio é de longe o mais eficaz quencher de fosforescência, o que torna o método de têmpera fosforescência muito seletivos ao oxigênio. 1.4) A fim de medir o tempo de vida t, os fótons emitidos fosforescente são binned no tempo. Por exemplo, após o pulso de excitação, 200 fótons podem ser coletadas nos primeiros 15 microssegundos, 150 fótons coletados nos próximos 15 microssegundos, e assim por diante, até que não os fótons são coletados. Os números nas caixas plotados contra o tempo dar o decaimento de fosforescência, que é analisado para produzir o tempo de vida τ. Na imagem, este procedimento é aplicado em cada pixel da imagem, resultando em mapas vida fosforescência. Medições de vidas são insensíveis ao heterogeneidades de distribuição sonda ao longo do objeto, que é comum para amostras biológicas. Assim, vidas relatório apenas em oxigênio. Vidas τ são convertidos em concentrações de oxigênio utilizando a relação de Stern-Volmer. 2. Construção de sondas fosforescente Sondas fosforescente para medições de oxigênio em sistemas biológicos consistem de cromóforos fosforescente (núcleos), encapsulados em gaiolas construídas de dendrímeros - altamente regular polímeros hiper [3]. Dendrímeros proteger os núcleos a partir de interações com o meio ambiente e controle da taxa de difusão de oxigênio para os núcleos, tornando possível para otimizar a sensibilidade ea faixa dinâmica das sondas (constante k q na relação Stern-Volmer). Términos do dendrímeros são modificados com polietileno glicol quimicamente inerte hidrofílico (PEG) grupos, fazendo com que as sondas altamente solúvel em água e impedindo a sua interação com macromoléculas biológicas. Núcleos fosforescente das sondas estão Pt ou Pd complexos de porfirinas e porfirinas π-extended. π-Extended porfirinas são porfirinas em que anéis de pirrol são fundidos com fragmentos aromáticos externo. Extensão-π permite o ajuste das propriedades sondas espectroscópicas para satisfazer as exigências de uma aplicação de imagem em particular (por exemplo, a tomografia de microscopia vs). Como exemplo, descrevemos a síntese de tetaaryltetrabenzoporphyrins Pd (PdAr 4 TBP) [4]. PdAr 4 TBP têm bandas de absorção poderosa na parte extrema-vermelha do espectro de fosforescência e forte, adequado para medições de oxigênio biológico. A síntese de quatro PdAr TBP consiste das seguintes etapas: 2.1 Preparação) de tetraaryltetracyclohexenoporphyrins (Ar4TCHP) por Lindsey condensação [5] de tetrahydroisoindole com benzaldeídos substituídos. Para uma solução M de 0,01 tetrahydroisoindole (1 eq) em CH &lt;sub&gt; 2 CL 2 do aldeído aromático (1 eq) foi adicionado sob argônio. A mistura de reação foi agitada por 10 min no escuro a RT BF 3 XlT 2 O (0,2 eq) foi adicionado, ea mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por mais 2 h. DDQ (1 eq) foi adicionado, ea mistura foi deixada durante a noite, sob agitação contínua. A solução foi lavada com 10% aq Na 2 SO 3, 10% aq Na 2 CO 3, 5% HCl aq e finalmente com salmoura. A fase orgânica foi seca sobre Na 2 SO 4, então concentrada no vácuo. O resíduo foi recristalizado de CH 2 Cl 2 - terc-butil éter mistura para dar Ar 4 TCHP como pó verde. Rendimentos são cerca de 50%. 2,2) Inserção de Pd para obter PdAr 4 TCHPs. Livre-base porfirinas (1 eq) foram tratados com PdCl 2 ou Pd (OAc) 2 (1,2 eq) em CH 3 CN refluxo na presença de excesso de Et 3 N (20 eq). A conversão foi monitorada por espectroscopia UV-vis (CH 2 Cl 2 de solvente-ácido acético) e considerado completo após a banda Soret de ditado em 468-472 nm desapareceu. A mistura foi autorizado a arrefecer, diluída com CH 2 Cl 2 e filtrada através de uma fina camada de Celite para remover Pd (0). O solvente foi evaporado, eo resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel usando CH 2 Cl 2 como solvente. Fração vermelho escuro foi coletado, o solvente foi evaporado para dar alvo PdAr 4 TCHPs no rendimento de quase quantitativa. 2.3) PdAr 4 TBP foram preparados por oxidação de PdAr 4 TCHPs com o excesso de duas vezes maior de DDQ (16 eq) em THF refluído. Durante refluxo, a cor passou de vermelho-escuro para verde-escuro. O solvente foi evaporado, o resíduo foi diluído com CH 2 Cl 2, lavada com 10% aq Na 2 SO 3, água e salmoura. A fase orgânica foi seca sobre Na 2 SO 4 e concentrada no vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em gel de sílica (eluente CH 2 Cl 2). A fração de verde-escuro primeiro foi coletado, concentrado no vácuo para dar 85-90% de pó como o azul-verde do PdAr4TBP. 2.4) grupos éster periférica de Pd-tetrakis (3,5-dibutoxycarbonylphenyl)-tetrabenzoporphyrin (PdAr4TBP) foram hidrolisadas utilizando 10 vezes o excesso de KOH em 1% (v / v) de água / THF no rt. O solvente foi decantado do precipitado de sais de potássio formado de derivados do ácido carboxílico de PdAr4TBP é. Os sólidos foram dissolvidos em água, agitada por mais 2 h, acidificadas com conc. HCl para pH ~ 4-5. O precipitado obtido foi isolado por centrifugação, lavado com água e secas em vácuo. Proteger dendrons. Cada ramo individual do dendrímero é chamado dendron. Dendrons proteção são construídas de aril-glicina blocos (AG) de construção. Dendrons AG pode ser facilmente sintetizado a partir de matérias-primas baratas e isolados em alta pureza e rendimento por cromatografia em fase livre de métodos. Síntese de geração 2 (G2) AG dendron consiste das seguintes etapas: Síntese 2,4) dos blocos de construção, Boc-protegidos 3,5-dicarboxyphenyl glycineamide e 3,5-dibutoxycarbonylphenyl glycineamide, utilizando do método haloacyl Fischer haleto. 2.5) Acoplamento dos blocos de construção usando CDMT / química acoplamento NMM peptídeo. 2.6) desprotegerem o grupo focal amino agitando a solução do dendron G2 em TFA por 2 h à temperatura 2.7) Para a montagem do dendrons maior geração, acoplamento / desproteção etapas são repetidas. Dendrímero montagem é conseguida pelo acoplamento do dendrons deprotected para PdAr4TBP (ou porfirina outros) usando a química acoplamento HBTU / DIPEA. 2.8) Em primeiro lugar, os grupos Boc-protetores são removidos do dendron. Por exemplo, Boc-protegidos dendron G3 (0,58 g) foi dissolvida em TFA (15 ml), ea mistura foi deixada para reagir à temperatura ambiente por 2h. O ácido foi removido por evaporação rotativa, produzindo a dendron como o TFA-sal. O resíduo foi dissolvido em NMP seco (10 ml) e algumas gotas de DIPEA foram adicionados, para extinguir os vestígios da TFA. 2.9) Antes de iniciar a reação de acoplamento, é fundamental para dissolver completamente o porfirina. Por exemplo, Pt tetracarboxyphenylporphyrin (0,061 g) foi dissolvida em NMP seco (65 ml), sob aquecimento a 140 ° C por 10 min, sob fluxo de nitrogênio. 2.10) A solução foi resfriada à temperatura ambiente, HBTU (0,211 g) foi adicionado, ea mistura foi agitada por 5 min. 2.11) DIPEA (0,35 ml) foi adicionado à mistura em uma parcela, imediatamente seguido por adição do solutina de TFA-sal da dendron em NMP (ver 2.8), ea mistura foi deixada sob agitação durante a noite. 2.12) A mistura foi vertida em aq 3%. NaCl (350 ml), sendo o precipitado resultante foi coletado por centrifugação e lavado com água, MeOH, e 2 Et O por suspensão repetitivos / centrifugação para produzir o alvo porfirina-dendrímero. 2.13) Para hidrolisar os grupos de éster de periféricos, o dendrímero foi tratado com NME 4 OH (~ 5 mM) em DMSO / MeOH mais de 20-60 min período, seguido de a remoção completa do solvente. Este procedimento nos permitiu gerar dendrímeros com número suficiente de grupos carboxilato dar solubilidade em água. Para completar a hidrólise, o dendrímero foi tratada com NaOH 0,1 N aquosa (overnight). Como resultado, pura porfirina-dendrímero ácidos carboxílicos podem ser isolados em rendimentos de 80-95%. Modificação da periferia dendrímero. Neste ponto, a partir da mesma porfirina-dendrímero, seja uma ou duas sondas de fótons podem ser sintetizados. No primeiro caso, todos os grupos carboxila periféricos são modificados com unidades PEG - uma metodologia conhecida como PEGylation. Neste último caso, vários grupos carboxila são primeiramente acoplado com cromóforos de dois fótons de antena (cumarina-343) modificados com etilenodiamina (EDA) linkers, seguido por PEGylation do carboxyls restantes [6]. Dendrímeros foram PEGylated usando monomethoxyoligoethyleneglycolamine (m-PEG-NH 2, Av. Prof. MW 1000) usando HBTU / DIPEA química acoplamento. 2.14) A uma solução do dendron em NMP (ou DMF) (1-10 mM) 1,25 vezes o excesso de HBTU foi adicionado, ea mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 10 min. Excesso de 6,25 vezes maior de DIPEA foi adicionado, seguido pela adição imediata de 1,25 vezes o excesso de m-PEG-NH2. A mistura de reação foi agitada por 2 dias a rt. Éter etílico foi adicionado à mistura de reação, o precipitado formado foi separado por centrifugação e re-precipitado de THF pela adição de éter etílico. 2,15) Final de purificação foi alcançado com o tamanho-exclusão por cromatografia a coleta da fase de primeira frente. PEGylated porfirina-dendrímero foi dissolvido em uma pequena quantidade de THF (~ 15 ml) e carregado no topo de uma coluna cromatográfica preenchida com poliestireno SEC fase (Biorad, Biobeads S-X1). A coluna foi eluída com THF puro, ea banda de cor escura se movendo com a frente foi coletado. 2.16) THF foi removido em um evaporador rotativo, eo material remanescente foi seco em vácuo. 3. Caracterização sonda Caracterização fotofísicas inclui medições de espectros a sonda de absorção e emissão, fosforescência vidas τ 0 e Stern-Volmer oxigênio quenching constantes k q em condições fisiológicas. 3.1) O espectro de absorção e emissão são obtidos sob condições de ambiente usando a instrumentação padrão (espectrofotômetro e fluorímetro estável). ~ 1 mM soluções da sonda é usada. 3.2) Em seguida, a curva de calibração Stern-Volmer é obtido. Esta é a medida mais importante, porque nos permite relacionar a vida útil da sonda para a concentração de oxigênio. 3.3) A solução da sonda em tampão PBS (pH 7,2) é colocado em uma cubeta cilíndrica especial, que é posicionado dentro da câmara de temperatura controlada, localizado dentro de uma gaiola de luz impermeável com portas para excitação e emissão de fibras ópticas. As fibras são colocados em contato próximo com a cubeta dentro da câmara na geometria de ângulo reto. 3.4) A cuvete é fechado com uma tampa, no qual um eletrodo de oxigênio altamente sensíveis do tipo Clark (CK-eletrodo de oxigênio) é inserido. A rolha também contém duas portas agulha para entrada e saída de argônio. O eletrodo é imerso na solução, enquanto que as agulhas apenas prever o fluxo de fluxo de gás acima da superfície da solução. Na primeira, o argônio não está conectado à entrada. 3.5) A temperatura é definida para o valor desejado (tipicamente 36-37 ° C) ea solução é deixada sob agitação de equilíbrio. 3.6) A fibra de excitação é conectado à porta de excitação de um phosphorometer digital, operada por um PC. A fonte de luz na phosphorometer é um LED de alta potência, cuja produção é controlada por um 333 kHz D / A bordo. A fibra de emissão é ligado a outra porta óptica do phosphorometer, que é acoplado a um APD altamente sensível ao infravermelho (fotodiodo avalanche). A saída do diodo é amplificado e alimentado no canal A / D da placa de controle mesmo, o que permite a sincronização entre a excitação e os canais de emissão. 3.7) O controle de software albaixos geração de pulsos de excitação de qualquer comprimento desejado (por exemplo, 5 ou 10 ms), seguido da coleta de decaimento de fosforescência durante qualquer período arbitrário escolhido (tipicamente 2-3 ms). Tempo necessário para uma medição única vida é tipicamente 0,5-1 s, no entanto, as medições podem ser obtidas tão rapidamente quanto 10-20 por segundo. 3.8) A saída do eletrodo de oxigênio é amplificada e direcionada para outro A / D bordo no mesmo PC. Esta é uma placa de baixa freqüência (1 kHz máx), que é usado para gravar o eletrodo de corrente em períodos de tempo selecionado. O programa para gravar os dados do eletrodo é executado simultaneamente com o software phosphorometer. 3.9) Uma vez que a temperatura da solução é equilibrada, tanto phosphorometer o eletrodo e os programas são inicializados ao mesmo tempo para realizar as medições a cada 10 s. Suas saídas são registradas de forma síncrona em dois arquivos separados. Depois disso, o argônio é conectado à porta de entrada sobre a rolha cuvete. 3.10) Como argônio flui sobre a superfície da solução agitada, gradualmente substitui o oxigênio. Isso resulta em uma diminuição da corrente de eletrodo e um aumento no tempo de vida de fosforescência, que é medido pelo phosphorometer. Normalmente, o oxigênio é deslocado formar a solução totalmente após cerca de 2 h, durante o qual os dados são totalmente desconectado automaticamente em arquivos. 3.11) Após o final da corrida de titulação, os dados do eletrodo e as vidas fosforescência são importados para um programa de análise padrão (Origem Miocrocal por exemplo). A corrente do eletrodo depende linearmente da concentração de oxigênio, e para o eletrodo usado é praticamente zero em oxigênio zero. À pressão atmosférica, pO 2 é conhecido (cerca de 150 mm Hg). Assim, os dados do eletrodo podem ser diretamente convertidos para a escala de oxigênio, eo enredo da vida de fosforescência inversa x pO 2 pode ser construído. Este lote está equipado com uma linha reta pelo método dos mínimos quadrados para dar a têmpera kq de oxigênio constante como sua inclinação. Tempo de vida de fosforescência t0 é obtido a partir do encaixe mesmo (como o inverso do intercepto) ou diretamente a partir da medição em zero oxigênio. 3.12) Se necessário, a titulação é repetido utilizando uma solução da sonda na presença de albumina - uma proteína presente no plasma sanguíneo em altas concentrações, - a fim de imitar as condições reunidas no sistema real experimental (sangue de um animal in vivo). A obtenção de Stern-Volmer parcelas devem ser idênticas, se o dendrímero está protegendo o sensor de medição e grupos PEG isolar a sonda a partir dos contatos com a albumina. Caso contrário, a sonda e as proteínas no sangue irá interagir, e que levará a uma trama Stern-Volmer alteradas, causando ambigüidade nas medições de oxigênio. Constantes de calibração assim obtidos são usados ​​em experimentos com imagens em que as concentrações de oxigênio são um desconhecido a priori.

<ol>
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<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"&gt;<tr<td<strong&gt; Abreviatura</strong<strong</strong</td&gt;<td<strong&gt; Nome completo</strong<strong</strong</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; NMP</td&gt;<td&gt; N-methylpyrrolidinone</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; TFA</td&gt;<td&gt; Ácido trifluoroacético</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; DIPEA</td&gt;<td&gt; Diisopropylethylamine</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; HBTU</td&gt;<td&gt; 2 - (1H-benzotriazol-1-il) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorofosfato</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; DMSO</td&gt;<td&gt; Dimetilsulfóxido</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; CDMT</td&gt;<td&gt; CDMT = 1-cloro-3 ,5-dimethoxytriazine</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; NMM</td&gt;<td&gt; NMM = N-methylmorfoline</td&gt;</tr&gt;</table

synthesis and calibration of phosphorescent nanoprobes for oxygen imaging in biological systems

Medição de oxigênio por quenching fosforescência [1, 2] consiste das seguintes etapas: 1) a sonda seja entregue para o meio de interesse (por exemplo, sangue ou líquido intersticial), 2) o objeto é iluminado com luz de comprimento de onda adequado a fim de excitar a sonda em seu estado triplet, 3) a fosforescência emitido é coletado, e respectiva evolução no tempo é analisado para produzir o tempo de vida de fosforescência, que é convertido para a concentração de oxigênio (ou pressão parcial, pO<sub&gt; 2</sub&gt;). A sonda não deve interagir com o ambiente biológico e em alguns casos a ser 4) excretado do meio após a conclusão da medição. Cada uma dessas etapas impõe exigências de projeto molecular das sondas fosforescentes, que constituem o único componente invasivo do protocolo de medição. Aqui nós revemos o projeto de dendríticas nanosensores fosforescente para medições de oxigênio em sistemas biológicos. As sondas consistem em Pt ou Pd porfirina baseado polyarylglycine (AG) dendrímeros, modificado perifericamente com polietileno glicol (PEG de) resíduos. Para a excitação de dois fótons eficaz, términos do dendrímeros podem ser modificados com dois fótons cromóforos antena, que captam a energia de excitação e canalizá-los para os núcleos triplet das sondas via intramolecular FRET (Förster Resonance Energy Transfer). Descrevemos as propriedades fotofísicas chave das sondas e apresentar protocolos de calibração detalhado.

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Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Apresentamos os princípios de medições de oxigênio por quenching fosforescência e da revisão do projeto porfirina baseado nanosensores dendríticas para geração de imagens de oxigênio em sistemas biológicos.

Síntese e calibração de nanossondas Phosphorescent for Imaging Oxigênio em Sistemas Biológicos

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

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Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

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Usando Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) para desenvolver ferramentas de diagnóstico

Biologia

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental biology and gene expression studies. The technique renders biological sample optically transparent by first dehydrating them and then placing in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution). The technique renders biological samples optically transparent by first dehydrating them in graded ethanol solutions then placing them in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution) to clear. After the clearing process the scattering contribution in the sample can be greatly reduced and made almost negligible while the absorption contribution cannot be eliminated completely. When trying to reconstruct the fluorescence distribution within the sample under investigation, this contribution affects the reconstructions and leads, inevitably, to image artifacts and quantification errors.. While absorption could be reduced further with a permanence of weeks or months in the clearing media, this will lead to progressive loss of fluorescence and to an unrealistically long sample processing time. This is true when reconstructing both exogenous contrast agents (molecular contrast agents) as well as endogenous contrast (e.g. reconstructions of genetically expressed fluorescent proteins).

We suggest a Born normalized approach for Optical Projection Tomography (BnOPT) that accounts for the absorption properties of imaged samples to obtain accurate and quantitative fluorescence tomographic reconstructions. We use the proposed algorithm to reconstruct the fluorescence molecular probe distribution within small animal organs.

Normalização nascido para Tomografia Projeção de fluorescência óptica para imagens de todo o coração

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscópica de fluorescência para Tomografia In-vivo Imaging de desenvolvimento Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Preparação de Desenvolvimento e Adultos Drosophila Brains e retina de imagens ao vivo

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment of live cells with micron-scale resolution1. Oxygen is one of the most important molecules in the cycle of life. It serves as the terminal electron acceptor of oxidative phosphorylation in the mitochondria and is used in the production of reactive oxygen species. Measurements of oxygen are important for the study of mitochondrial and metabolic functions, signaling pathways, effects of various stimuli, membrane permeability, and disease differentiation. Oxygen consumption is therefore an informative marker of cellular metabolism, which is broadly applicable to various biological systems from mitochondria to cells to whole organisms. Due to its importance, many methods have been developed for the measurements of oxygen in live systems. Current attempts to provide high-resolution oxygen imaging are based mainly on optical fluorescence and phosphorescence methods that fail to provide satisfactory results as they employ probes with high photo-toxicity and low oxygen sensitivity. ESR, which measures the signal from exogenous paramagnetic probes in the sample, is known to provide very accurate measurements of oxygen concentration. In a typical case, ESR measurements map the probe's lineshape broadening and/or relaxation-time shortening that are linked directly to the local oxygen concentration. (Oxygen is paramagnetic; therefore, when colliding with the exogenous paramagnetic probe, it shortness its relaxation times.) Traditionally, these types of experiments are carried out with low resolution, millimeter-scale ESR for small animals imaging. Here we show how ESR imaging can also be carried out in the micron-scale for the examination of small live samples. ESR micro-imaging is a relatively new methodology that enables the acquisition of spatially-resolved ESR signals with a resolution approaching 1 micron at room temperature2. The main aim of this protocol-paper is to show how this new method, along with newly developed oxygen-sensitive probes, can be applied to the mapping of oxygen levels in small live samples. A spatial resolution of ~30 x 30 x 100 &mu;m is demonstrated, with near-micromolar oxygen concentration sensitivity and sub-femtomole absolute oxygen sensitivity per voxel. The use of ESR micro-imaging for oxygen mapping near cells complements the currently available techniques based on micro-electrodes or fluorescence/phosphorescence. Furthermore, with the proper paramagnetic probe, it will also be readily applicable for intracellular oxygen micro-imaging, a capability which other methods find very difficult to achieve.

This protocol describes a method for micron-scale three-dimensional imaging of oxygen concentration in the immediate environment of live cells by electron spin resonance microscopy.

Ressonância paramagnética eletrônica Micro-imagem das Espécies ao vivo para o Mapeamento de oxigênio

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly understood. Here assays are described to monitor the ability and kinetics of healing of cultured cells following localized injury. The first protocol describes an end point based approach to simultaneously assess cell membrane repair ability of hundreds of cells. The second protocol describes a real time imaging approach to monitor the kinetics of cell membrane repair in individual cells following localized injury with a pulsed laser. As healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of injury, the third protocol describes the use of above end point based approach to assess one such trafficking event (lysosomal exocytosis) in hundreds of cells injured simultaneously and the last protocol describes the use of pulsed laser injury together with TIRF microscopy to monitor the dynamics of individual subcellular compartments in injured cells at high spatial and temporal resolution. While the protocols here describe the use of these approaches to study the link between cell membrane repair and lysosomal exocytosis in cultured muscle cells, they can be applied as such for any other adherent cultured cell and subcellular compartment of choice.

The process of healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of cell membrane injury. This protocol describes assays to monitor these processes.

Imagens de células Lesão de Membrana e Processos Subcelulares envolvidas no reparo

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Medição dos Níveis de heme em células de mamíferos Síntese

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is the challenge of identifying suitable vaccine candidates. Malarial proteins expressed using prokaryotic and eukaryotic cell based expression systems are poorly glycosylated, generally insoluble and undergo improper folding leading to reduced immunogenicity. The wheat germ, rabbit reticulocyte lysate and Escherichia coli lysate cell free expression systems are currently used for expression of malarial proteins. However, the length of expression time and improper glycosylation of proteins still remains a challenge. We demonstrate expression of Plasmodium proteins in vitro using HeLa based cell free expression systems, termed &#8220;in vitro human cell free expression systems&#8221;. The 2 HeLa based cell free expression systems transcribe mRNA in 75 min and 3 &#181;l of transcribed mRNA is sufficient to translate proteins in 90 min. The 1-step expression system is a transcription and translation coupled expression system; the transcription and co-translation occurs in 3 hr. The process can also be extended for 6 hr by providing additional energy. In the 2-step expression system, mRNA is first transcribed and then added to the translation mix for protein expression. We describe how to express malaria proteins; a hydrophobic PF3D7_0114100 Maurer&#8217;s Cleft &#8211; 2 transmembrane (PfMC-2TM) protein, a hydrophilic PF3D7_0925900 protein and an armadillo repeats containing protein PF3D7_1361800, using the HeLa based cell free expression system. The proteins are expressed in micro volumes employing 2-step and 1-step expression strategies. An affinity purification method to purify 25 &#181;l of proteins expressed using the in vitro human cell free expression system is also described. Protein yield is determined by Bradford&#8217;s assay and the expressed and purified proteins can be confirmed by western blotting analysis. Expressed recombinant proteins can be used for immunizations, immunoassays and protein sequencing.

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Expression of malarial proteins in cell based systems remains challenging. We demonstrate two step and one step IVT (in vitro translation) cell free expression systems for expressing malarial recombinant rhoptry proteins from HeLa cells. We use a Ni-resin affinity based purification system to purify the rhoptry proteins.

Sistemas HeLa celular Com base livre expressão para a expressão de<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteínas

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

De alta resolução de imagem Time-lapse e análise automatizada de microtúbulos Dynamics em Viver umbilical humano Células Endoteliais da Veia

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in biology. Transitional methods require a substantial amount of time and effort to obtain a 3D image and including sectioning the intact tissue, immunolabeling, and imaging serially-sectioned tissue, which produces a loss of information at each step of the process. In recently developed approaches for high-resolution imaging within intact tissue, molecular characterization has been restricted to the labeling of proteins. However, currently available protocols for organ clearing require a considerably long process time, making it difficult to implement tissue clearing techniques in the lab. We recently established a rapid and highly-reproducible protocol termed ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs), which allows for tissue clearance within several hours. Moreover, ACT-PRESTO enables rapid immunolabeling with conventional methods and accelerates antibody penetration into the deep layer of densely-formed, thick specimens by applying pressure or convection flow. We describe how to prepare tissues, how to clear by lipid removal using electrophoresis, and how to immuno-stain by a pressure-assisted delivery. The rapidity and consistency of the protocol will expedite the performance of 3D histological research and volume-based diagnoses.

ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs) enables rapid, efficient, but inexpensive tissue clearing and rapid antibody penetration into cleared tissues by passive diffusion or pressure-assisted delivery. Using this method, a wide range of tissues can be cleared, immunolabeled by multiple antibodies, and volume-imaged.