This research was supported by the Brain Research Program through the National Research Foundation (NRF) funded by the Korean Ministry of Science, ICT, and Future Planning (NRF-2015M3C7A1028790).

Hayvan deneyleri ilgili tüm devlet ve kurumsal düzenlemelere uygun olmalıdır. Reaktiflerin 1. Hazırlık <ol><li> Hidrojel monomer çözeltisi (A4P0) için: 0.1X fosfat tamponlu tuz 450 mL (PBS) akrilamid 20 gr ekleyin ve 0.1x PBS ile 500 mL göre ayarlayın. DİKKAT: akrilamid monomerleri toksiktir. Bir yüz maskesi, bir laboratuvar ceket, eldiven ve kapalı parmak ayakkabılar dahil, kişisel koruyucu ekipman ile davlumbaz tüm prosedürleri uygulayın. <ol><li> Kullanmak davlumbaz altında 50 ml konik bir tüp içinde 2,2&#39;-azobis [2- (2-imidazolin-2-il) propan] hidrojel monomer çözeltisi 40 mL (A4P0) dihidroklorür, 100 mg eklemek için hemen önce . </li></ol></li><li> Elektroforetik doku temizleme (VB) tampon için: sodyum dodesil sülfat (SDS) ve deiyonize H2O (DH 2 O) 800 mL borik asit 12.37 g, 40 g ekleyin. NaOH ile 8.5 pH ayarlayın ve ses seviyesini ayarlamakEk DH 2 O. ile 1 L DİKKAT: SDS bir zararlı kimyasal olduğu; Bu nedenle, dikkatli bir şekilde taşıyın. </li><li> Kübik bağlama çözeltisi için: sükroz 250 g üre 125 g ve N, N, N, 125 g dH 2 O 150 mL &#39;, N&#39; -tetrakis (2-hidroksipropil) etilendiamin ekleyin ve hacmi getirmek dH 2 O 500 mL </li></ol> 2. Numune Hazırlama ve Fixation <ol><li> fare Ötenazi. <ol><li> Aynı şırıngada alfaksalondur (1 mg / kg) ve ksilazin (0.5 mg / kg) hazırlayın. </li><li> Intraperitoneal alfaksalondur ve ksilizin karışımı enjekte ve fare için 3 dakika baygın hale gelmesini sağlar. </li><li> anestezi fare artık devam etmeden önce, böyle bir kuyruk tutam gibi ağrılı uyaranlara, yanıt verene kadar bekleyin. DİKKAT: hayvanları işlenmesi için uygun kurumsal yönergeleri izleyin. </li></ol></li><li> Transcardially 100 mL% 0.9 NaCl (pH 7.4-7.5) çözümü ile fare serpmek1x PBS içinde% 4 paraformaldehid, 100 mL (PFA) (pH 7.4), 14, ardından (100 U / ml) asıl bulbus olfaktoryusları alındı için heparin ihtiva ederler. DİKKAT: PFA çözüm toksiktir. PFA çözüm ve sonraki tüm kullanım hazırlanması davlumbaz ve kişisel koruyucu ekipman ile yapılmalıdır. </li><li> Fare kafasını kesti cilt kadar açık ve küçük makas kullanarak gözler arasındaki kafatası kırmak. </li><li> küçük, kavisli forseps kullanarak kafatası parçalarını çıkartın. </li><li> beyin veya istenilen organları dışarı atın. </li><li> gece boyunca 4 ° C&#39;de post-düzeltme% 4 PFA çözeltisi içinde beyin ve organlar inkübe edin. NOT: Belirli bölge doku temizleme için, belirli bir bölgeyi incelemek veya doku tespit sonrasında doku kırpın. DİKKAT: PFA çözüm toksiktir. transcardial perfüzyon ve sonraki tüm fare kontrolü davlumbaz ve kişisel koruyucu ekipman ile yapılmalıdır. </li></ol> 3. Hidrojel Monomer İnfüzyon ve Polymerization <ol><li> hafifçe çalkalanarak, 12-24 saat boyunca 4 ° C &#39;de A4P0 hidrojel monomer çözeltisi içinde fikse edilmiş organlar inkübe edin. </li><li> Hidrojel doku polimerizasyonu monomer aşılamıştır. <ol><li> Hidrojel monomer çözeltisi 5 mL, 10 ml lik yuvarlak dipli tüp örnek aktarın. Parafilm ile yuvarlak alt tüp üst sarın. </li><li> 1 dakika boyunca sıvı içinden nitrojen kabarcıklanarak hidrojel infüzyon bütün fare beyin örneği içeren yuvarlak dipli tüp oksijeni uzaklaştırmak. Hızlı ve sıkıca örnek içeren tüp kapatın. </li></ol></li><li> 2 saat süre ile bir su banyosunda (37 ° C), tüp aktarın. </li><li> Fazla hidrojel çıkarmak için 0.1x PBS ile kısaca polimerize örnek yıkayın. DİKKAT: Hidrojel monomerler zehirlidir. Hidrojel monomer ile cilt temasından kaçınmak davlumbaz ve bir yüz maskesi, bir laboratuvar ceket ve eldiven gibi kişisel koruyucu ekipman ile tüm işlemleri gerçekleştirmek için. NOT: polimerize dokular4 ° C de en az 2 hafta boyunca 0,1 x PBS içeren sodyum azid saklanabilir. DİKKAT: Sodyum azit yüksek ve akut toksik değildir. Bir yüz maskesi, bir laboratuvar ceket ve eldiven gibi, davlumbaz ve kişisel koruyucu ekipman ile tüm prosedürleri uygulayın. </li></ol> 4. Elektroforetik Doku Takas (ETC) <ol><li> Bir doku kaba polimerize örnek aktarın ve ETC odasında doku kap yerleştirin. </li><li> peristatic pompası kullanılarak kullanıcıya tampon ile VB bölmesini doldurmak. </li><li> ETC koşullarını ayarlamak ve VS. çalıştırın Aşağıdaki ayarları kullanın. <ol><li> zaman (6.0 saat), pompa hızını (30 rpm) çalıştıran, (1.5 amp), sıcaklık (37 ° C): Bütün organlar için ETC ayarları için, aşağıdaki ayarları kullanın. </li><li> zaman (2.0 saat), pompa hızını (30 rpm) çalışan akımı (1.5 amp), sıcaklık (37 ° C): 1- 2 mm kalınlığında fare beyin dilimleri için ETC ayarları için, aşağıdaki ayarları kullanın. </li></ol></li><li> aktarım tO 0.1x PBS 45 mL bir 50 mL konik tüp örnek temizlenir. Tüp kısaca sarsıldığında hiçbir kabarcıklar görülür kadar 0.1x PBS ile temizlenir örnek birkaç kez yıkayın (SDS tamamen kaldırılmasını onaylamak için). </li></ol> ACT işlenmiş Dokuların 5. ile immün <ol><li> Fare tüm beyin için: 1 x PBS,% 6 sığır serum albümini (BSA) ihtiva eden bir antikor çözeltisi 3 ml hacminde örnek inkübe% 0.1 Triton X-100 ve% 0.01 sodyum azid (antikor seyreltme çözeltisi) seyreltme hafif çalkalama ile 37 ° C&#39;de 4 gün boyunca tirosin hidroksilaz (TH) antikor 1/500 faktörü. 2. günde sonunda antikor çözüm değiştirin. <ol><li> 3 45 mL 0.1x PBS ile bir 50 mL konik tüp içinde örnek yıkayın - 5 saat ve tampon her saat değiştirin. </li><li> Hafif çalkalama ile 37 ° C&#39;de 4 gün boyunca eşek anti-tavşan sekonder antikor 488 1/500 seyreltme faktörü ile antikor seyreltme çözeltisi 3 ml hacminde örnek inkübe edin. repl2 gün seyreltilmiş antikor çözümler ace. </li></ol></li><li> 2 mm kalınlığında dilimlenmiş beyin dokusu: 1-: gece boyunca ya da 1 gün için 37 ° kollajen tip IV antikor 1/500 seyreltme faktörü ile antikor seyreltme çözeltisi bir 0.5- 1 ml hacim olarak örnek inkübe hafif sallayarak ° C. <ol><li> 1-2 saat boyunca 0,1 x PBS, 12 ml hacme sahip 15 ml konik bir tüp içinde örnek yıkayın. bir tampon her saat değiştirin. </li><li> anti-tavşan sekonder antikor gece boyunca ya da hafif çalkalanarak 37 ° C&#39;de en fazla 1 gün için Cy3-konjüge edilmiş 1/500 seyreltme faktörü ile antikor seyreltme çözeltisi bir 0.5- 1 mL hacminde örnek inkübe edin. </li></ol></li><li> 3 0.1x PBS örnek yıkayın - 5 saat; bir tampon her saat değiştirin. </li><li> görüntüleme öncesi, hafifçe çalkalanarak oda sıcaklığında 1 st için kübik bağlama çözeltisi, uygun bir miktarda örnek inkübe edin. Taze kübik bağlama çözeltisi ile değiştirin ve ilave bir 1 saat daha inkübe edilir. NOT: </b&gt; Antikorların 76 tipi 31 monoklonal antikorlar 14 de dahil olmak üzere, fare ACT işlenmiş dokuda iyi çalıştı. Önceden etiketlenmiş doku ACT işlenmiş doku iki florokromların immunolabeling ile birleştirilebilir. </li></ol> Yoğun Dokuların 6. ile immün (PRESTO) <ol><li> Cı-PRESTO Not: C-SAYGINLIK gibi tüm testis, tüm böbrek ya da daha büyük bir organ küçük bölümler gibi küçük boyutlu örnekleri, için uygundur. <ol><li> Bir 1.5 ml tüp içine örnek aktarın kollajen tip IV antikor 1/500 seyreltme faktörü ile antikor seyreltme çözeltisi 500 ul ekle ve 2 saat boyunca 600 x g&#39;de santrifüj tüpü. </li><li> 30 dakika boyunca 600 x g&#39;da santrifüjleme ile 0.1x PBS ile lekelenmiş numunenin yıkayın. </li><li> 2 saat süre ile 600 x g &#39;de Cy3-konjüge edilmiş anti-tavşan sekonder antikor ve santrifüj için 1/500 seyreltme faktörü ile antikor seyreltme çözeltisi 500 ul ekle. </li><li> 0 ile boyandı örnek yıkayın.30 dakika süre ile 600 x g &#39;de santrifüj ile 1x PBS ile yıkandı. </li></ol></li><li> s-PRESTO Not: S-PRESTO büyük dokular için uygundur. <ol><li> Bir şırınga (30 ml hacim) hazırlayın ve 3 yollu vana (Şekil 1A) bağlayın. Yüksek basınç şartları (Şekil 1B) için bir tutkal tabancası ile vana Tutkal. </li><li> kapalı valf pozisyonunda 3-yollu vana bağlantılı şırınganın içine örnek aktarmak. </li><li> kolajen tip IV antikor 1/500 seyreltme faktörü ile antikor seyreltme çözeltisi 7 mL - 5 ekleyin. vanasını açarak numune içine antikor çözüm bırakın. </li><li> infüzyon / çekme hareketi için yeterli oda sağlamak için 17-ml pozisyonuna şırınga pistonu ayarlayın. Bu açık valf pozisyonunda yapılabilir. şırınga ayarı bittikten sonra 3 yollu vanasını kapatın. </li><li> Bir şırınga pompası örneğini içeren şırınga koyun. 10 mL / dak enfüzyon / çekme hacmi ve 4- şırıngayla koşulları ayarlamadk sürekli döngü modunda (Şekil 1C) üzerindeki duraklama süresi. NOT: Bu hedef hacmi (10 ml) ve daha sonra kısa bir duraklama (4 dk) sonra akış değişiklikleri yönünü ulaşıncaya kadar pompa aşılamaktadır. </li><li> Oda sıcaklığında (Şekil 1F) 24 saat - 3 için enjektör pompasını çalıştırır. </li><li> 3-yollu vanasını açın ve 0.1x PBS ile çözüm değiştirin. </li><li> şırınga pompası kullanılarak 1 saat boyunca 0,1 x PBS ile iki kez, her zaman lekeli örnek yıkayın. </li><li> Cy3-konjüge edilmiş anti-tavşan ikincil antikoru (1/500 seyreltme faktörü) ihtiva eden antikor seyreltme çözeltisi ile değiştirin ve 3 şırınga pompası çalıştırılır - 24 saat. </li><li> 3-yollu vanasını açın ve 0.1x PBS ile çözüm değiştirin. </li></ol></li><li> görüntüleme öncesi, hafifçe çalkalanarak oda sıcaklığında 1 st için kübik bağlama çözeltisi, uygun bir miktarda lekeli örnek inkübe edin. Taze kübik bağlama çözeltisi ile değiştirin ve ilave bir 1 saat daha inkübe edilir. </li></ol> 7. Benmaging <ol><li> Konfokal tabağına etiketli doku yerleştirin ve doku kaplıdır kadar CUBIC montaj çözüm ekleyin. doku üzerinde bir lamel yerleştirin. 10X objektif altında görüntüye doku 14 konfokal mikroskop kullanın. </li></ol>

<ol>
	<li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li><li>Dodt, H. -. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat Methods. 4, 331-336 (2007).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> NATURE. 497, 332-337 (2013).</li><li>Ke, M. -. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li><li>Ert&amp;#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159, 896-910 (2014).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158, 945-958 (2014).</li><li>Kim, S. -. Y., Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+mapping+of+connections+in+the+intact+brain.">Light microscopy mapping of connections in the intact brain.</a> Trends Cogn Sci. 17, 596-599 (2013).</li><li>Yushchenko, D. A., Schultz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+for+optical+anatomy.">Tissue clearing for optical anatomy.</a> Angew Chem Int Edit. 52, 10949-10951 (2013).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).</li><li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACT-PRESTO:+Rapid+and+consistent+tissue+clearing+and+labeling+method+for+3-dimensional+(3D)+imaging.">ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging.</a> Sci Rep. 6, 18631 (2016).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+Proteomic+Imaging+for+High-Dimensional+Profiling+of+Intact+Systems.">Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems.</a> Cell. 163, 1500-1514 (2015).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

dokulara yoksul tespit veya hidrojel daldırma proteinlerin kaybı ve doku temizleme işlemi sırasında doku bozulmalarına neden olabilir. hafifçe çalkalanarak 18 saat - tüm yetişkin fare beyni 12 hidrojel monomer çözeltisi 20 ml minimum hacimde daldırma izledi, bir gece boyunca 4% paraformaldehid inkübe edilmelidir. beyin dilimleri ve omurilik gibi insan dokusu da dahil olmak üzere geniş bir doku için, gerekli olan hidrojel monomer çözeltisi içinde ıslatma süresinden genişletilmiş. doku fiksasyon ve polimer infüzyon adımlar ayrılır çünkü ACT protokolü sabit dokuların temizlenmesi kolayca uygulanabilir. Doku temizleme sonrasında insan dokuları çeşitli antikorlar ile iyi boyandı. ACT temizleme tekniği, etanol ve metanol gibi alkollü sabitleyicilerle, uyumlu olmadığını not edin. Doku hidrojel polimerizasyon aşaması, temizleme işleminin ardından iyi kalitede kâğıt temizlik ürünü üretmek için çok önemlidir. ÇünküOksijen akrilamidin polimerizasyonuyla inhibe eden bir azot gazı infüzyon sistemi altında doku içeren solüsyonun gazı ile çıkarılmalıdır. Seçenek olarak ise, de-oksijenasyonu 23 saat süreyle bir ısı bloğu ile bir vakum odası kullanılarak yürütülebilir. Takas oranı Çoğu yetişkin fare dokular gecede ETC silinebilir vs. Organ boyutu, lipidler veya ECM lifli proteinler içeriğinin, tespitin durumunun da dahil olmak üzere birçok faktöre bağlıdır. Bununla birlikte, bir riski vardır gereksiz aşırı temizleme ve doku şişme; Bu şekilde, temizleme süresi farklar önemli göz vardır. Doku temizleme koşullar ampirik olarak belirlenmelidir. Önemlisi, ECM içeriği temizlenir dokusunun görünümünü etkileyebilir. ACT yoğun protein lifleri silmez çünkü dokuların rengi, hatta ETC tamponunda ACT sonra, beyaz veya opak kalır. Bununla birlikte, ne bu organların, RI uygun çözeltisine daldırıldı,y şeffaf hale geldi. Doku şişme oranı yoğun organlar daha büyük bir şişme oranı gösteren, ECM dokuların içeriği ve beyin gibi yumuşak bir organ, bağlı olduğu görülmektedir. artan doku doku temizleme işlemi yardımcı olacaktır şişlik nedeniyle ACT rutin çoğu durumda su bazlı tampon distile kullanmaktadır. Doku şişme veya geçici şekil bozukluğu gibi embriyolar gibi istenen bir durum değildir, bazı durumlarda, bir tampon içeren 0,1 x PBS yüksek çözünürlüklü görüntüleme için uygulanabilir. Ayrıca, tampon maddesi içinde daha yüksek tuz konsantrasyonları, dokuların daralmasına neden olabilir dikkat edilmelidir. ACT yöntemi bir fare 14 tüm organ ve hatta tüm vücudu açıklayabilir. Ancak, şeffaf doku derin doku görüntüleme özel mikroskoplar ve hedefleri gerektirir. Bu nedenle, kalın bir beyin dokusu 1 ila 2 mm, geleneksel bir konfokal mikroskop ile görüntüleme için çok etkilidir. Etiketin Bizim ellerde, kaldırmaACT işlenmiş dokulardan ed antikorlar, antikora bağımlı ve farklı antikor etiketleme tur tavsiye edilmez. Böyle TH ve GFAP gibi bazı antikorlar, tüm beyin 14 immün özellikle iyi çalıştı. Diğer yandan, Tuj1 ya map2 gibi bazı antikorlar, çoğu zaman doku sadece yüzey etiketli. Bu, anahtar 15 gibi diğer yöntemler ile daha iyi olabilir. Bir diğer potansiyel sınırlama nedeniyle doku doku temizleme adımı sırasında şişme ve büzülme ACT işlenmiş dokuda ince protein yapılarını korumak zor olabilir olmasıdır. PRESTO tekniği doku etiketleme teknikleri çeşitli uygulanabilir. Örneğin, bu tür SeeDB 4 ile iDISCO 7 gibi, önceden etiketlenmiş doku kullanılarak doku saydam yöntemleri, yoğun doku immün gün ila birkaç hafta daha uzun kuluçka dönemleri gerektirmektedir. Bununla birlikte, SAYGINLIK birkaç saat inkübasyon süresi kısaltabilir, örneğin1 mm kalınlığında yoğun doku ile bir gün içinde tüm sürecin tamamlanmasını nabling. PRESTO kalın derin etiketleme, yoğun dokularda, hatta un temizlenmiş kalın dokuların etkinliğini artırabilir. PRESTO bir masa üstü santrifüj veya şırınga pompası kullanan ve herhangi bir özel ekipman gerektirmez, çünkü rutin laboratuvar işlemleri ile bu tekniği uygulamak için nispeten kolaydır.

Sinirbilimdeki zorluklardan biri nöronal devre kablolama ve bozulmamış beyin dokusu içinde tek tek hücrelerin görselleştirme olduğunu. Yakın zamana kadar, bu şekilde nöronlar arasındaki bağlantıları gösteren dokuların 1) seri bölümlendirilmeleri gerekli; Bu tür akson veya protein gibi spesifik hedefler, 2) Moleküler etiketleme; hesaplamalı diğer kayıtların veya 2D seri görüntülerin 1 uyum yoluyla tüm beyin 3D rekonstrüksiyon ile ve 3) görselleştirme. Bu adımlar, zahmetli olan zaman büyük bir ihtiyaç ve nöronal ağ haritalama son derece zor hale kesit ve etiketleme sırasında bilgi kaybetmek yükümlüdür. Ancak, kesit olmadan sağlam doku görünüm için izin birçok yöntem geliştirilmiştir. Biyolojik dokuların doku temizleme teknikleri 2-10 optik olarak saydam hale getirilebilir. önemli yöntemlerden biri sağlam doku ve sırayla daldırma solüsyonu arasında refraktif indeks farklılıkları azaltmak içinböylece şeffaf doku oluşturma ve derin yapıların gözlem sağlayan sağlam doku ışık saçılmasını azaltmak için. Daldırma çözeltiler bazı tipleri dehidrasyon işlemi sırasında, hızlı fluoresan su verme neden hidrofobik özelliklere sahiptir. Bu nedenle, bu yöntemler zaman 11,12 uzun bir süre boyunca flüoresan görüntüleme ile uyumlu değildir. Yerine hidrofobik reaktiflerin, diğer yöntemler, biyolojik doku 4,6,8 yapısal bilgi ve floresan korumak gibi SeeDB 4 ve Sca l e 6 olarak doku temizleme için hidrofil reaktifleri, kullanın. Bununla birlikte, makro moleküller, antikorlar da dahil olmak üzere, tek başına difüzyon ile sağlam doku çekirdeğini ulaşamaz. Bu nedenle, yoğun dolu dokuların derin bölgelerde hedef moleküllerin ön etiketleme, teknik açıdan zor. Son zamanlarda geliştirilen doku temizleme yönteminde, berraklık 3, bir hidrojel gömülü biyolojik doku Iakrilamid ile oluşturulan S ve lipidler, sodyum dodesil sülfat (SDS) içeren çözeltiye altında elektroforez ile ayrılmıştır. Numune daha sonra ışık 3 saçılma azaltmak için uygun yansıtıcı indeks ile bir çözelti içine daldırılmaktadır. Lipid temizleme sistemi, daha sonra ileri CLARITY 13 ve PACT (pasif berraklık tekniği) 10 modifiye edildi. Polimerizasyondan sonra, akrilamid zincirleri hidrojel doku oluşturucu, proteinler ile çapraz bağlanır. Akrilamid ile çapraz bağ olamaz lipid bileşenleri; Bu nedenle, lipidler, SDS-ihtiva eden tampon altında elektroforez ile ortadan kaldırılabilir. Lipidlerin aktif ortadan kaldırılması yoluyla, beyin dokusu belirgin şeffaflık 9 artar. Bununla birlikte, bu yöntemler, serbest difüzyonu ile derin etiketleme imkansızlığını ele alınmamaktadır. Bu sınırlamayı aşmak için, kalın dokuların derin bölüme reaktiflerin aktif ulaşım teknikleri gereklidir. AÇIKLIK doku takas ve derin doku izin versegörselleştirme, kolay bir veya hızlı bir işlem değildir. Bu bütün bir fare beyin 7,14 temizlemek için birkaç hafta sürebilir. dokuların hızlı temizleme yaşam bilim araştırma veya birim teşhisi için, bazik ya da klinik laboratuar ayarlarına gibi yöntemlerin uygulanması için gereklidir. Mevcut protokolü basınç destekli uygulama immüno-lekeleme ile, biyolojik doku temizleme ve daha sonra da protein tespiti için basitleştirilmiş bir işlem sağlar. Bu görüntüleme yöntemleri ile kombinasyonu ile açılan büyük ve 3D veri işleme sistemlerinin yüksek çözünürlüklü ses görüntüleme için uygundur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="813">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">4% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:175px;">Lugen SCI&#160;</td>
			<td style="width:201px;">LGB-1175-4B</td>
			<td style="width:191px;">sample fixation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Acrylamide</td>
			<td style="width:175px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:201px;">75820</td>
			<td style="width:191px;">Hydrogel monomer solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">2,2&#8217;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride</td>
			<td style="width:175px;">Wako Pure Chemical Industries&#160;&#160;</td>
			<td style="width:201px;">VA-044</td>
			<td style="width:191px;">Hydrogel monomer solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Boric acid</td>
			<td style="width:175px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:201px;">76324</td>
			<td>ETC buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:175px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:201px;">18220</td>
			<td>ETC buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sodium hydroxide pellets</td>
			<td style="width:175px;">Junsei chemical</td>
			<td style="width:201px;">1310-73-2</td>
			<td>ETC buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:175px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:201px;">sc-2323A</td>
			<td>Immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:201px;">T8787</td>
			<td>Immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:201px;">S2002</td>
			<td>Immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Collagen type &#8547;</td>
			<td style="width:175px;">Abcam</td>
			<td style="width:201px;">AB6586</td>
			<td>Antibody/immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tyrosine hydroxylase (TH)</td>
			<td style="width:175px;">Millipore</td>
			<td style="width:201px;">AB152</td>
			<td>Antibody/immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Alexa Fluor Cy3 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:201px;">711-165-152</td>
			<td style="width:191px;">Secondary antibody/ immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies - Molecular Probes</td>
			<td>A21206</td>
			<td style="width:191px;">Secondary antibody/ immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Confocal dish</td>
			<td style="width:175px;">SPL lifesciences</td>
			<td style="width:201px;">101350</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:175px;">Leica</td>
			<td style="width:201px;">SP8</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sucrose</td>
			<td style="width:175px;">Junsei chemical</td>
			<td style="width:201px;">31365-0301</td>
			<td>CUBIC-mount solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Urea</td>
			<td style="width:175px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:201px;">23036</td>
			<td>CUBIC-mount solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:201px;">122262</td>
			<td>CUBIC-mount solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:247px;">ECT chamber</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C10101</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">ECT chamber controller</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C10201</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Temperature probe</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12101</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Peristatic pump</td>
			<td style="width:175px;">Baoding longer precision pump Co., Ltd</td>
			<td style="width:201px;">YZ1515X</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Buffer reservoir</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C10401</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Tissue container&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12001</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Container holder for 1 tissue container</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12002</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Mouse brain slice holder</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12004</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Whole rat brain holder</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12007</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Peristaltic pump tubing</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12104</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Tabletop-centrifuge</td>
			<td style="width:175px;">Hanil science industrial Co., Ltd</td>
			<td style="width:201px;">MICRO 12</td>
			<td>c-PRESTO</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:175px;">Baoding longer precision pump Co., Ltd</td>
			<td style="width:201px;">LSP02-1B</td>
			<td>s-PRESTO</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Syringe (20 ml)</td>
			<td style="width:175px;">Korea vaccine Co., Ltd.</td>
			<td style="width:201px;">KV-S20</td>
			<td>s-PRESTO</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">3-way stopcock</td>
			<td style="width:175px;">Hyupsung medical Co.,Ltd.</td>
			<td style="width:201px;">HS-T-01N</td>
			<td>s-PRESTO</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

act-presto: biological tissue clearing and immunolabeling methods for volume imaging

kimlik ve organların veya hücresel düzeyde tüm vücut detaylı örgüt keşif biyolojisinde temel sorunlardır. Geçici yöntemler sürecinin her adımında bilgi kaybına üreten önemli bir zaman ve 3D görüntü elde etmek için çaba miktarını ve sağlam dokuyu kesit immunolabeling dahil ve görüntüleme seri-kesitli doku gerektirir. bozulmamış dokusu içinde yüksek çözünürlüklü görüntüleme için yeni geliştirilen yaklaşımlar, moleküler karakterizasyon proteinlerin etiketleme sınırlı olmuştur. Ancak organ temizlenmesi için mevcut protokoller zor laboratuarda doku temizleme teknikleri uygulamak için yapım, oldukça uzun bir süreç süresi gerektirir. Biz son zamanlarda hızlı ve yüksek tekrarlanabilir bir protokol ACT-PRESTO adlandırılan kurulmuş (bir ctive c rağbet görürdü t echnique- hava basıncı r e fficient ve s masa t ransfer sevinçliBirkaç saat içinde doku temizlenmeye izin verir O rgans) içine makro moleküllerin. Ayrıca, ACT-PRESTO geleneksel yöntemlerle hızlı immün sağlayan ve basıncı veya konveksiyon akımını uygulayarak yoğun oluşturulmuş, kalın örneklerin derin tabakası içine antikor penetrasyonu hızlandırır. Biz elektroforezi kullanılarak lipid kaldırılması suretiyle temizlemek nasıl dokuları, nasıl hazırlanacağını açıklayan ve nasıl bir basınç destekli teslimat bağışıklığı leke. Protokolün hızlılığı ve tutarlılık 3D histolojik araştırma ve hacim bazlı tanıların performansını hızlandırmak olacaktır.

ACT doku Clearing Doku temizleme etkileyen önemli bir faktör doku tespit olduğunu. PFA fiksasyon ve akrilamid infüzyon bu protokol ayrı adımlardır. doku aşılanmış hidrojeller çapraz bağlanmış endojen makromoleküller olmasına rağmen dokuya hidrojel polimerizasyon adımından sonra, serbest A4P0 çözeltisi polimerize değildir. Bu nedenle, herhangi bir jel dokular (Şekil 2A) dışında oluşturmalıdır. proteinler ve akrilamid arasında daha az çapraz bağlama ACT prosedürü sonuçları AÇIKLIK protokolüne göre. Bu duruma göre, doku hidrojel örnek için gözeneklidir. Bu özellik, lipid hızlı çıkarma ve makro moleküllerin difüzyon sağlar. 2 saat (Şekil 2B) ve 5 - - fare beyin 1 yeteri 1 içinde temizlendi kalın ila 2 mm kesitleri ETC 6 saat c için yeterliBütün Fare beyinleri (Şekil 2C) learance. Hidrojel aracılı doku temizleme ETC aşamasından sonra doku genişleme kaynaklı, ancak doku yansıtıcı endeksi eşleştirilmiş çözelti içinde özgün boyutuna geri döndü. ACT prosedüründe oluşan doku hidrojel örneği oldukça gözeneklidir ve dolayısıyla küçük bileşiklerin ve makromoleküllerin verimli bir şekilde nüfuz olabilir ve kolay bir şekilde (Şekil 3) yayılır. Tirosin hidroksilaz (TH) ve kollajen tip IV antikoru ile 1 mm beyin kesitleri olan bir 2-saatlik inkübasyondan sonra, ikinci bir antikor ile ardışık 2-saat inkübasyon 500 um derinliğinde dopaminerjik nöronlar etiket için yeterli idi (Şekil 3) . Presto-Doku ile immün Yoğun organları genellikle dokulara antikorların nüfuz etki ECM liflerin yüksek konsantrasyonlarda mevcuttur. Dolayısıyla, antikorlar PENETinkübasyondan 12 saat sonra, sadece 20-30 um böbrek dokusu gibi yoğun dokularda bir derinliğe kadar. Bu sınırlamayı aşmak için, biz derin dokulara reaktiflerin teslimat, yani PRESTO (organlara makromoleküllerin etkin ve istikrarlı transferi ile ilgili basınç) (Şekil 4) etkinleştirmek aktif makromolekül penetrasyon yöntemleri tasarlanmış. Antikor çözümleri, bir masa üstü santrifüj ile merkezkaç kuvvetleri (600 xg) uygulaması (merkezkaç PRESTO, c-PRESTO) büyük ölçüde derin dokuya antikor teslim geliştirilmiş (Şekil 5) ile ACT işlenmiş böbrek dokusunun statik inkübasyon ile karşılaştırıldığında. Bu yoğun dokulara Cı-PRESTO prosedür uygulandığında, inkübasyon 3H 300 mikron derin yapıları 250 etiket için yeterliydi. önemli doku zarar vermeden doku bozulmasını geliştirmek için, biz de bir şırınga pompası (şırınga PRESTO, s-PRESTO) ile konveksiyon akımını sağlayan bir makine tasarladı. Bu işlem, benzer şekilde, antikor pe geliştirilmişyonunun pasif difüzyon (Şekil 5) göre. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig1.jpg" /> S-PRESTO cihazının Şekil 1 hazırlanması. C. bir şırınga (30 mi) ve üç yollu musluk. B. üç yollu musluk bağlı ve şırınga yapıştırılmış. Numune, ve antikor çözeltisi ihtiva eden bir şırınga ve şırınga pompa üzerine yerleştirilecek bir şırınga. D. şırınga pompası ve çalışma koşulu kurulumu. E. pompası örnek olarak etiketleme ayıraçları ihtiva eden bir çözelti aşılar. belirlenen hacim, pompalama yön değişikliklerini ulaştı ve zaman belirli bir süre sonra çözümü çeker olduğunda. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54904/54904fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Fare beyninin Şekil 2. ACT doku temizleme. Polimerizasyon sonra A., ücretsiz A4P0 çözümleri polimerize değildir; doku aşılanmış hidrojeller endojen makromoleküller ile çapraz bağlanma ile jelleştirilebilmektedir edilir. 2 mm kalınlığında beyin dilimleri B. 1- 1 temizlendi - 2 saat ve yansıtıcı endeksi genişleme ve boyut kurtarma ölçüde (RI) -matching çözüm kaydedildi. Tamamen açık beyin için yeterli ETC 6 saat oldu - C. bütün fare beyninin kalınlığı yaklaşık 0,8 cm ve 5&#39;tir. ETC 3 saat sonra olmayan temizlenmiş doku önemli miktarda oluştu. ETC 6 saat ile, ancak, tüm beyin takas ortaya çıkmıştı. ETC tamponunda ACT sonra dokuların rengi beyaz ya da opak. RI ayarı ile, dokular, şeffaf olur. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54904/54904fig2large.jpg" target="_blank">Onu tıklayınız</a>E bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54904/54904fig3.jpg" /> ACT temizlenmiş fare beyin dokusunda Şekil 3 ile immün. kolajen tip IV ve bir antikor ile boyanmış orta beyin parçası için bir antikor ile boyandı fare beyin korteks gösteren ACT işlenmiş 1 mm fare beyni dilimleri Çıkan hidroksilaz (TH) tirozin. Ölçek çubuğu, 100 mikron. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54904/54904fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54904/54904fig4.jpg" /> Şekil 4. PRESTO immün yöntemleri. Antikorlar difüzyon ile yoğun dokulara nüfuz edemez. PRESTO immün yöntemleri aktif makromoleküller demlenmeye ve içine reaktifler sunmak için tasarlanmıştır edildiyoğun dokular. Standart bir masa üstü santrifüj (merkezkaç PRESTO, c-PRESTO) kullanılarak merkezkaç kuvvetinin uygulanması belirgin antikorların teslim kolaylaştırdı. Antikor penetrasyonu gelişmiş bir şırınga pompası (şırınga PRESTO, s-PRESTO) ile konveksiyon akımını dozajda. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54904/54904fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54904/54904fig5.jpg" /> ACT-temizlenmiş yoğun doku 5. PRESTO immün rakam. Cı-Presto, dokular, primer ve sekonder antikor nüfuz hızlandırmak için standart bir masa üstü santrifüj kullanılarak 3 st için 600 x g&#39;de santrifüjlendi. s-Presto, bir şırınga pompası antikorları sağlamak için kullanılmıştır. , böbrekler ve karaciğer gibi fare organ, kollajen tip IV ile etiketlenmiştir. geleneksel yöntemler, 3 saat ile karşılaştırıldığındaC ya da s-SAYGINLIK belirgin markalama derinliğini artırır. 50 um (sol) - Kontrol numuneleri yalnızca 40 derinlikte etiketlenirken, PRESTO örnekleri (sağ) 350 um ya da daha derin - böbrek ve karaciğerde, Z ekseni derinliği 300 ulaşır. 3D yeniden görüntü konfokal mikroskop ile elde edilmiştir. Ölçek çubuğu, 100 mikron. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54904/54904fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging at JoVE.com

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

ACT-PRESTO (organlara makromoleküllerin aktif netlik tekniği basınçlı ilgili verimli ve istikrarlı transfer) pasif difüzyon veya basınç destekli teslimat temizlenir dokulara hızlı, verimli, ama ucuz doku takas ve hızlı antikor penetrasyon sağlar. Bu yöntemi kullanarak, dokuların geniş bir yelpazede, temizlenmiş birden antikorlar tarafından immunolabeled ve hacim-görüntülü olabilir.

ACT-PRESTO: Biyolojik Doku Takas ve Hacim Görüntüleme için ile immün Yöntemleri

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

act-presto-biological-tissue-clearing-immunolabeling-methods-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

12.0K Görüntüleme.  Korea University College of Medicine.  ACT-PRESTO (organlara makromoleküllerin aktif netlik tekniği basınçlı ilgili verimli ve istikrarlı transfer) pasif difüzyon veya basınç destekli teslimat temizlenir dokulara hızlı, verimli, ama ucuz doku takas ve hızlı antikor penetrasyon sağlar. Bu yöntemi kullanarak, dokuların geniş bir yelpazede, temizlenmiş birden antikorlar tarafından immunolabeled ve hacim-görüntülü olabilir. 

Video: ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians. The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal pair and a longer maxillary pair. Barbel tissue contains cells of ectodermal, mesodermal and neural crest origin, including skin cells, glands, taste buds, melanocytes, circulatory vessels and sensory nerves. Unlike most adult tissue, the maxillary barbel is optically clear, allowing us to visualize the development and maintenance of these tissue types throughout the life cycle. 
This video shows early development of the maxillary barbel (beginning approximately one month post-fertilization) and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration in the adult appendage (&gt;3 months post-fertilization). Briefly, the left maxillary barbel of an anesthetized fish is elevated with sterile forceps just distal to the caudal edge of the maxilla. A fine, sterile spring scissors is positioned against the forceps to cut the barbel shaft at this level, establishing an anatomical landmark for the amputation plane. Regenerative growth can be measured with respect to this plane, and in comparison to the contralateral barbel. Barbel tissue regenerates rapidly, reaching maximal regrowth within 2 weeks of injury.
Techniques for analyzing the regenerated barbel include dissecting and embedding matched pairs of barbels (regenerate and control) in the wells of a standard DNA electrophoresis gel. Embedded specimens are conveniently photographed under a stereomicroscope for gross morphology and morphometry, and can be stored for weeks prior to downstream applications such as paraffin histology, cryosectioning, and/or whole mount immunohistochemistry. These methods establish the maxillary barbel as a novel in vivo tissue system for studying the regenerative capacity of multiple cell types within the genetic context of zebrafish.

The zebrafish maxillary barbel is an integumentary sense organ containing ectodermal, mesodermal and neural crest derivatives. Importantly, the adult barbel can regenerate after proximal amputation. This video introduces maxillary barbel development and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration, followed by collection, embedding and downstream imaging of barbel specimens.

Zebra balığı Maksiller Bärbel Çalışma Yöntemleri

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians.  The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal ...

Biyoloji

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

Biyolojik Sistemleri Oksijen Görüntüleme Fosforlu Nanoprobes sentezi ve Kalibrasyon

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS)

Coherent Raman imaging techniques have seen a dramatic increase in activity over the past decade due to their promise to enable label-free optical imaging with high molecular specificity 1. The sensitivity of these techniques, however, is many orders of magnitude weaker than fluorescence, requiring milli-molar molecular concentrations 1,2. Here, we describe a technique that can enable the detection of weak or low concentrations of Raman-active molecules by amplifying their signal with that obtained from strong or abundant Raman scatterers. The interaction of short pulsed lasers in a biological sample generates a variety of coherent Raman scattering signals, each of which carry unique chemical information about the sample. Typically, only one of these signals, e.g. Coherent Anti-stokes Raman scattering (CARS), is used to generate an image while the others are discarded. However, when these other signals, including 3-color CARS and four-wave mixing (FWM), are collected and compared to the CARS signal, otherwise difficult to detect information can be extracted 3. For example, doubly-resonant CARS (DR-CARS) is the result of the constructive interference between two resonant signals 4. We demonstrate how tuning of the three lasers required to produce DR-CARS signals to the 2845 cm-1 CH stretch vibration in lipids and the 2120 cm-1 CD stretching vibration of a deuterated molecule (e.g. deuterated sugars, fatty acids, etc.) can be utilized to probe both Raman resonances simultaneously. Under these conditions, in addition to CARS signals from each resonance, a combined DR-CARS signal probing both is also generated. We demonstrate how detecting the difference between the DR-CARS signal and the amplifying signal from an abundant molecule's vibration can be used to enhance the sensitivity for the weaker signal. We further demonstrate that this approach even extends to applications where both signals are generated from different molecules, such that e.g. using the strong Raman signal of a solvent can enhance the weak Raman signal of a dilute solute.

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering CARS

A combination of three single wavelength short-pulsed lasers is used to generate coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) and doubly-resonant CARS (DR-CARS). The difference between these signals provides enhanced sensitivity for otherwise difficult to detect coherent Raman signals, enabling imaging of weak Raman scatterers.

Çifte rezonans Tutarlı Anti-Stokes Raman saçılımı (CARS) Biyolojik Yapıların Diferansiyel Görüntüleme

Coherent Raman imaging techniques have seen a dramatic increase in activity over the past decade due to their promise to enable label-free optical imaging ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Içinde Yara Yanıtları Cilt yaralayarak Yöntemleri ve Testler<em&gt; ° C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS (Super-region Volume Segmentation) Workbench

Segmentation is the process of isolating specific regions or objects within an imaged volume, so that further study can be undertaken on these areas of interest. When considering the analysis of complex biological systems, the segmentation of three-dimensional image data is a time consuming and labor intensive step. With the increased availability of many imaging modalities and with automated data collection schemes, this poses an increased challenge for the modern experimental biologist to move from data to knowledge. This publication describes the use of SuRVoS Workbench, a program designed to address these issues by providing methods to semi-automatically segment complex biological volumetric data. Three datasets of differing magnification and imaging modalities are presented here, each highlighting different strategies of segmenting with SuRVoS. Phase contrast X-ray tomography (microCT) of the fruiting body of a plant is used to demonstrate segmentation using model training, cryo electron tomography (cryoET) of human platelets is used to demonstrate segmentation using super- and megavoxels, and cryo soft X-ray tomography (cryoSXT) of a mammalian cell line is used to demonstrate the label splitting tools. Strategies and parameters for each datatype are also presented. By blending a selection of semi-automatic processes into a single interactive tool, SuRVoS provides several benefits. Overall time to segment volumetric data is reduced by a factor of five when compared to manual segmentation, a mainstay in many image processing fields. This is a significant savings when full manual segmentation can take weeks of effort. Additionally, subjectivity is addressed through the use of computationally identified boundaries, and splitting complex collections of objects by their calculated properties rather than on a case-by-case basis.

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS Super-region Volume Segmentation Workbench

Segmentation of three-dimensional data from many imaging techniques is a major bottleneck in analysis of complex biological systems. Here, we describe the use of SuRVoS Workbench to semi-automatically segment volumetric data at various length-scales using example datasets from cryo-electron tomography, cryo soft X-ray tomography, and phase contrast X-ray tomography techniques.

Birim segmentasyon ve SuRVoS (süper bölge birim segmentasyon) tezgah kullanarak biyolojik malzemelerin analizi

Segmentation is the process of isolating specific regions or objects within an imaged volume, so that further study can be undertaken on these areas of ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-Clear: Bir doku Yöntem yağ dokusu üç boyutlu görüntüleme için temizlenmesi

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Yüksek basınç dondurucu, mikrodalga destekli kontrast geliştirme ve en az reçine birim görüntüleme için katıştırma tarafından biyolojik örnek hazırlama

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity is characterized by an increase in adipose tissue (AT) mass due to adipocyte hyperplasia and/or hypertrophia, leading to profound remodeling of its three-dimensional structure. Indeed, the maximal capacity of AT to expand during obesity is pivotal to the development of obesity-associated pathologies. This AT expansion is an important homeostatic mechanism to enable adaptation to an excess of energy intake and to avoid deleterious lipid spillover to other metabolic organs, such as muscle and liver. Therefore, understanding the structural remodeling that leads to the failure of AT expansion is a fundamental question with high clinical applicability. In this article, we describe a simple and fast clearing method that is routinely used in our laboratory to explore the morphology of mouse and human white adipose tissue by fluorescent imaging. This optimized AT clearing method is easily performed in any standard laboratory equipped with a chemical hood, a temperature-controlled orbital shaker and a fluorescent microscope. Moreover, the chemical compounds used are readily available. Importantly, this method allows one to resolve the 3D AT structure by staining various markers to specifically visualize the adipocytes, the neuronal and vascular networks, and the innate and adaptive immune cells distribution.

Here, we describe a simple, inexpensive and fast clearing method to resolve the 3D structure of both mouse and human white adipose tissue using a combination of markers to visualize vasculature, nuclei, immune cells, neurons, and lipid-droplet coat proteins by fluorescent imaging.

Metiyatisilin Temizleme ve 3D Görüntüleme ile Yağ Dokusu Yapısının Araştırılması

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

Traditionally used for bulk biochemical assays, Xenopus laevis egg extracts have emerged as a powerful imaging-based tool for studying cytoplasmic phenomena, such as cytokinesis, mitotic spindle formation and assembly of the nucleus. Building upon early methods that imaged fixed extracts sampled at sparse time points, recent approaches image live extracts using time-lapse microscopy, revealing more dynamical features with enhanced temporal resolution. These methods usually require sophisticated surface treatments of the imaging vessel. Here we introduce an alternative method for live imaging of egg extracts that require no chemical surface treatment. It is simple to implement and utilizes mass-produced laboratory consumables for imaging. We describe a system that can be used for both wide-field and confocal microscopy. It is designed for imaging extracts in a 2-dimensional (2D) field, but can be easily extended to imaging in 3D. It is well-suited for studying spatial pattern formation within the cytoplasm. With representative data, we demonstrate the typical dynamic organization of microtubules, nuclei and mitochondria in interphase extracts prepared using this method. These image data can provide quantitative information on cytoplasmic dynamics and spatial organization.

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

We describe a method for the preparation and live imaging of undiluted cytoplasmic extracts from Xenopus laevis eggs.