Os autores gostariam de agradecer o apoio do NIH / NINDS R01 NS069861 e NJCBIR CBIR14IRG024 para VS.

1. biocitina enchimento durante Eletrofisiologia NOTA: Os leitores podem se referir a fontes alternativas de técnicas básicas de patch-clamp gravação e instrumentação 19-22, que não são elaborados em cima aqui. As etapas detalhadas aqui supor que o equipamento e os procedimentos para as gravações de patch-clamp já estão estabelecidos, e a descrição será restrito aos detalhes relacionados com biocitina-enchimento e imunocoloração post-hoc. Todas as experiências descritas neste manuscrito foram realizadas em ratazanas. <ol><li> Usando um vibratome, preparar secções de cérebro vivo da região desejada, com uma espessura de 300-350 uM 23. </li><li> Prepara-se uma solução contendo 0,2% interna biocitina por adição de 2 mg de biocitina a 1 ml de solução interna 6. Para melhores resultados, sonicar a solução interno de 10 - 15 minutos até que a biocitina dissolve-se completamente. Em seguida, carregar a solução interna numa seringa de 1 ml, equipado com um 0,2 &amp;# 160; de poro ponta de filtro de tamanho de polipropileno ligado a um microloader. Manter esta seringa de carga em uma mala de frio para manter a estabilidade do Mg-ATP e GTP-Na na solução interna. NOTA: Uma gluconato de potássio solução interna contendo (mM de K-gluconato 126, KCl 4 mM, HEPES 10 mM, 4 mM de Mg-ATP, 0,3 mM de Na-GTP, e fosfocreatina 10 mM) é óptima para a recuperação de certos marcadores neuroquímicos, incluindo parvalbumina, durante imunomarcação. Na nossa experiência, utilizando cesium- e soluções internas à base de cloreto reduz a capacidade de recuperar a imunocoloração para determinados marcadores neuroquímicos. Neurobiotin ou um, fixável, traçador polar célula-impermeabilizante combinando um fluoróforo com Alexa biocitina pode ser usado como uma alternativa para biocitina. </li><li> De acordo com contraste de interferência diferencial de infravermelhos, visualizar a célula apropriado para gravação. Para minimizar qualquer interrupção do axônio, a abordagem do corpo celular, diminuindo a pipeta ao longo de seu eixo, utilizando o &quot;approach&quot; função disponível na maioria dos micromanipuladores. Estabelecer gravações de célula inteira sob contraste de interferência diferencial de infravermelho usando protocolos fisiologia de patch-clamp 19-22. NOTA: Evitar a aproximar-se da célula a partir da direcção do axónio putativo, uma vez que irá cortar o axónio, visualizado como uma vesícula na extremidade de corte (seta verde na Figura 1). Além disso, evitar a aplicação de alta pressão positiva para a pipeta de gravação, enquanto que se aproxima da célula para minimizar o derrame de biocitina, o que resultará na coloração de fundo elevado. </li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54880/54880fig1.jpg" /> Figura 1. Sugestão de avião para se aproximar de células para biocitina preenchimentos. A imagem ilustra um celular Granule (GC) encher com biocitina durante a gravação que foi processada para revelar biocitina (em vermelho usando estreptavidina 594 conjugado). O GC tem suas dendrites orientadas no plano XY. Observe a célula granular cortadaaxônio (seta verde) devido ao movimento da pipeta ao longo do plano XY. Note que é ideal para abordar este neurônio ao longo do plano XZ. Barra de escala: 50 ^ m. <ol start="4"><li> Na configuração de fixação de voltagem, determinar a capacitância de células inteiras e resistência em série, em resposta a pequenas (5 mV), breves (30 ms) tensão etapas usando o teste usando a função da membrana no modo de banho em uma aquisição de dados e software de análise de electrofisiologia. Isto irá assegurar o estabelecimento de condições de gravação de célula inteira para permitir biocitina-enchimento. </li><li> Realizar gravações fisiológicas no modo quer observação de correntes ou de tensão-clamp, conforme necessário. Um mínimo de tempo de gravação de&gt; 10 min a 34 ° C é ideal. NOTA: Longer tempos de gravação podem ser necessários para os exames realizados à temperatura ambiente. </li><li> Após a conclusão das gravações fisiológicas, re-estabelecer a configuração de patch-clamp, movendo-se lentamente a pipeta de gravação em pequenas etapas, alternadas para cima (ao longo do eixo Z) epara fora (ao longo do eixo X) no modo de voltagem-grampo. </li><li> Simultaneamente monitorar a capacitância e entrada de resistência utilizando a função &quot;membrana teste&quot; para visualizar a perda de transientes capacitivo eo colapso das respostas atuais para uma linha reta, indicando a re-vedação da célula e o estabelecimento de um fora-out- remendar na ponta da pipeta. Segurando o celular em um potencial despolarizado (-40 mV) facilitará o processo de vedação re-. NOTA: Este procedimento para a remoção de uma célula normalmente garante a recuperação completa do soma e dendritos. Não aplicar pressão positiva para a pipeta de gravação durante este processo ou durante a separar a célula a partir da pipeta. Visualização da soma da célula registrado na fatia indica desligamento bem sucedido. A presença de fragmentos celulares ou um remendo de membrana na extremidade da ponta individual geralmente indica o deslocamento do soma e não irá produzir a morfologia celular completa. </li><li> à réer separar da pipeta a partir da célula, reter a fatia na câmara de gravação para 3-5 min para garantir o transporte do corante para dendrítica distal e processos axonais. </li><li> Transferir as fatias para uma placa de 24 poços contendo PFA a 4% para a fixação. CUIDADO: PFA é cancerígeno, e equipamento de protecção individual adequado, incluindo luvas e uma máscara facial, deve ser usado para evitar a irritação da pele e inalação. PFA é inflamável e devem ser mantidos fora do alcance de fogo. PFA nunca é descartado no ralo e deve ser coletado como lixo químico. PFA fixação deve ser isolado a partir de superfícies utilizadas para a preparação fatia vivo para evitar a contaminação da instalação fisiologia, incluindo pipetas de transferência. </li><li> 24 - 48 h após a fixação PFA, transferir as fatias de 0,1 M de fosfato salino tamponado (PBS) para armazenamento antes da imunocoloração. NOTA: Idealmente, biocitina recuperação e imunocoloração são melhores quando realizada logo após a fixação, embora por coloração<html> formado dentro de 7 d de rendimentos de fixação bons resultados. As fatias podem ser mantidas em PBS com 0,02-0,05% de azida de sódio para a coloração e realizada até mais de 90 dias após a fixação. Embora a fixação durante a noite em PFA funciona bem para a maior parte dos anticorpos, é possível que alguns anticorpos funcionam melhor quando a duração da incubação no fixador é diminuído. Fixação em PFA durante mais 48 h reduz a disponibilidade de antigénios e diminui a probabilidade de sucesso para a imunocoloração secundário marcadores neuroquímicos. CUIDADO: A azida de sódio é extremamente perigoso e irritante em contacto com a pele ou com os olhos ou a ingestão ou inalação. Grave excesso de exposição pode resultar em morte. A carcinogenicidade e mutagenicidade do composto não são conhecidos. Use equipamento de protecção individual adequado, incluindo luvas, óculos contra respingos, um jaleco e um respirador de poeira. A azida de sódio nunca é descartado no ralo e deve ser coletado como lixo químico. </li></ol>e_title &quot;&gt; 2. A coloração do primeiro anticorpo primário e biocitina (Dia 1) NOTA: O seguinte procedimento é imunocoloração para secções de flutuação livre e requer agitação continua a uma velocidade baixa (2 revoluções / min, rpm) num agitador durante todas as etapas de incubação. <ol><li> Lavar o tecido 3x durante 10 minutos cada em PBS 0,1 M (pH = 7,4). NOTA: PBS 0,1 M podem ser comercialmente adquiridas ou feitas em laboratório, como se segue (faz 1 L): 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4, e 0,24 g de KH 2 PO 4 em 1 L de dH 2 0. NOTA: Se o marcador neuroquímica desejado é conhecido, a coloração por uma proteína / péptido pode ser realizada simultaneamente com coloração de biocitina (passos 2,2-2,4). Se coloração para biocitina somente, vá para o passo 2.5. </li><li> OPCIONAL: Bloco com 10% de soro de bloqueio (BS; soro normal de cabra (NGS) diluído em 0,3% de Triton X-100 em PBS durante 1 h à TA). NOTA: Cada poço devereceber o mesmo volume da solução; o volume recomendado é de entre 250-500 mL / poço. A selecção do soro de bloqueio baseia-se nas espécies em que os anticorpos secundários são levantadas (por exemplo, NGS é usado para anti-cabra conjugado com corante (respectivas espécies de anticorpo primário)). Se surgir a necessidade de utilizar anticorpos secundários criados em diferentes espécies de imunocoloração secções, incluem 10% de cada soro normal no bloqueio de fase (2) e 3% de cada soro normal para os passos de incubação do anticorpo primário e secundário. </li><li> (OPCIONAL) Incubar as secções em anticorpo primário, CB 1 R (policlonal, cobaia) com 0,3% de Triton X-100, e 3% de BS em PBS a 0,1 M, à TA S / N. CB R 1 é utilizado para identificar o tipo de receptor canabinóide uma expressão. NOTA: Este passo é opcional e não é necessário para revelar o recheio biocitina. A Figura 2 ilustra uma secção marcada por biocitina e CB 1 R durante o primeiro processo de coloração. O / N incubation à TA é suficiente para a maioria dos anticorpos primários; no entanto, certos anticorpos primários, incluindo CB 1 R, requerem 3-5 d de incubação. Se a incubação precisa ser mais longo do que 1 d, recomenda-se a incubar a 4 ° C por causa de Triton X-100 pode permeabilizar fatias e pode conduzir à desintegração do tecido durante a incubação prolongada à temperatura ambiente. Incluir um controlo negativo a que falta o anticorpo primário em, pelo menos, uma secção para cada série de experiências como controlo para a especificidade do anticorpo secundário. Para controlos negativos, o anticorpo primário é omitido, mas a 0,3% de Triton X-100 em PBS a 0,1 M e são adicionados BS. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54880/54880fig2.jpg" /> Figura 2. sucedida CCK Coloração 1 semana após a recuperação de biocitina Coloração e C annabinoid Receptor tipo 1 (CB1 R) - &lt;strong&gt; rotulagem. (A - C) As imagens confocais a 60X mostrando o neurónio encheu-biocitina (A) e CB 1 R imunorreactividade (B), indicado pela seta. A mesma secção foi processada para a imunocoloração CCK após 1 semana (C). A sobreposição de imagens é mostrado na D. CCK imunorreatividade foi revelado usando far-vermelho e foi pseudo-colorido em ciano. (E) a reconstrução morfológica da célula-cheia biocitina em A. Observe que a biocitina e CB 1 R coloração são evidentes mesmo após a segunda imunocoloração CCK. Observe também a distribuição esperada de CB 1 R e padrões de positividade CCK. (F - H) imagem ampliada do axônio da célula, como em A, show de perto co-localização de biocitina e CB 1 R nos axônios (cabeças de seta). Barra de escala: 50 um (A - D), 100 um (E), e 10 uM ( <strong&gt; M - H). As imagens são reproduzidos a partir de Yu et al. 2015 9. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54880/54880fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> (Dia 2) <ol start="4"><li> Lava-se a secções do cérebro 3x durante 10 minutos cada em PBS 0,1 M (pH = 7,4). </li><li> Incubam-se as secções em estreptavidina conjugado de corante vermelho (concentração: 1: 1000; excitação: 594 nm com emissão no espectro vermelho visível) com 0,3% de Triton X-100 e 3% de BS em PBS a 0,1 M a 4 ° CO / N na escuro (embrulhados em papel alumínio) para revelar o biocitina. Opcional: inclua um anticorpo secundário, cabra porco anti-guiné (concentração: 1: 500; excitação: 488 nm e emissão em verde), com a incubação acima, se após a primeira incubação opcional na etapa 2.3. NOTA: anticorpo secundário será apenas necessário se a coloração de anticorpo primário opcional (passo 2.3) é executada. Para visualizar biocitina, um streconjugado ptavidin-fluoróforo com um espectro de emissão em vermelho é recomendado, uma vez que ajuda a visualizar os axônios mais finas em detalhe e com melhor contraste (Figuras 1 - 3). Durante a imunocoloração dupla ou tripla, a fim de evitar a reactividade cruzada de anticorpos secundários uns com os outros, anticorpos secundários adicionar uma após a outra em série (2 h de intervalo entre adições de série dos anticorpos é suficiente). A Figura 3A ilustra uma célula cheia de biocitina processadas sem o anticorpo primário coloração opcional e fotografada antes da ressecção. </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54880/54880fig3.jpg" /> Figura 3. sucesso Segundo imunocoloração após a recuperação de biocitina Morfologia e ressecção. (A1) confocal imagem de uma fatia de 300 mm que mostra a recuperação da morfologia dendrítica de uma célula cheia de biocitina. (&lt;strong&gt; A2) traços de tensão membrana do neurônio em resposta a +500 e -100 pA injeções atuais. (B) A recuperação da soma cheio de biocitina em uma seção 50 mm obtido após ressecção da secção 300 mm (na A1) após a montagem e imagem. (B2) imunocoloração subsequente da seção fina revelou co-localização da soma cheio de biocitina (painel à direita) com CCK (painel do meio). A imagem mesclada é ilustrado no painel da direita. Barra de escala: 50 ^ m. Painel A2 é reproduzido com permissão de Yu et al. , No prelo 25. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54880/54880fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> (Dia 3) <ol start="6"><li> secções cerebrais Lavar 3x durante 10 minutos cada em PBS 0,1 M (pH = 7,4). </li><li> Para proteger a fluorescência e para facilitar a re-coloração no futuro, montar o segções em um meio de montagem de base aquosa e selar as bordas da lamela com unhas polonês claro. NOTA: É melhor restain seções o mais cedo possível para evitar dificuldades na remoção da unha polonês a partir do slide, infestação de fungos, e desidratação do tecido devido à fuga do meio de montagem da lâmina de vidro. A contaminação microbiana pode ser prevenida utilizando 0,02% de azida de sódio em PBS. CUIDADO: A azida de sódio é altamente tóxico e inflamável quando está em contacto com a água. Por favor, consulte os procedimentos operacionais padrão para o manuseio e descarte de produtos químicos perigosos. (Dias 4 - 7) </li><li> Realizar imagem confocal com excitação a 594 e 488 nm e com uma ampliação de 20X ou 40X para revelar neurônios cheio de biocitina em marcadores vermelhos e neuroquímicas (CB 1 R) em verde. Avaliar colabeling (Figura 2). </li><li> Definir a exposição da câmera para menos de 100 ms para evitar a fotodegradação e obtaem pilhas de imagens confocal dos mandris axonais e dendríticas de todo o neurônio. Use pilhas de imagens confocal e pacotes de software de rastreamento de neurônios para reconstruir a morfologia neuronal. </li></ol> 3. Coloração de o segundo anticorpo primário Nota: Embora o segundo passo pode ser realizado imunocoloração 90 d após a primeira coloração, coloração óptima é conseguida, se a segunda coloração de anticorpo primário é realizada dentro de 7-10 d. (Depois de 7-90 d) <ol><li> Aplicar acetona para um cotonete e tira a unha polonês fora da lâmina de vidro. </li><li> Retirar as lamelas com cuidado usando uma pinça de ponta fina e coloque algumas gotas de 0,1 M PBS nas seções. </li><li> Remova cuidadosamente as seções do slide usando um pincel fino e lavá-los em 0,1 M PBS durante 24 - 48 h num agitador coberto de folha de alumínio com pouca luz a 4 o C. NOTA: É crucial para cobrir seções com umfolha luminum para evitar a fotodegradação. </li><li> Para assegurar a remoção completa do meio de montagem, lavar as secções 1 - 2x no dia seguinte em PBS a 0,1 M durante 10 min cada. </li><li> Prosseguir com incubação no segundo anticorpo primário (por exemplo, a colecistocinina, um neuropeptídeo encontrado em certos interneurónios sensíveis a GABA (CCK; concentração: 1: 1000; anticorpo monoclonal de ratinho)) para um d (Figura 2). NOTA: Este procedimento é semelhante para a etapa 2.3, mas utiliza um anticorpo diferente. Além disso, o passo de bloqueio for omitido durante a re-coloração. </li><li> Lavam-se as secções de cérebro três vezes durante 10 minutos cada em PBS 0,1 M (pH = 7,4). </li><li> Mancha com o secundário anticorpo de cabra anti-ratinho fluoróforo-conjugado (concentração: 1: 500; de excitação comprimento de onda: 647 nm), certificando-se que os espectros de excitação das emissões do anticorpo secundário não se sobrepõem com estreptavidina (concentração: 1: 1000; comprimento de onda de excitação: 594 nm) e imunofluorescência préviamanchas. </li><li> Montar as seções no meio de montagem aquoso e selar as bordas da lamínula com unhas polonês claro. Nota: Armazenar as secções a 4 ° C numa caixa de armazenamento de opaco para proteger a fluorescência. </li></ol>

<ol>
	<li>Garcia-Lopez, P., Garcia-Marin, V., Freire, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histological+slides+and+drawings+of+cajal.">The histological slides and drawings of cajal.</a> Front Neuroanat. 4, 9 (2010).</li><li>Klausberger, T., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+diversity+and+temporal+dynamics:+the+unity+of+hippocampal+circuit+operations.">Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations.</a> Science. 321 (5885), 53-57 (2008).</li><li>Petilla Interneuron Nomenclature, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Petilla+terminology:+nomenclature+of+features+of+GABAergic+interneurons+of+the+cerebral+cortex.">Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).</li><li>Armstrong, C., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basket+cell+dichotomy+in+microcircuit+function.">Basket cell dichotomy in microcircuit function.</a> J Physiol. 590 (4), 683-694 (2012).</li><li>Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+heterogeneity+of+fast-spiking+interneurons:+chandelier+versus+basket+cells.">Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells.</a> PLoS One. 8 (8), e70553 (2013).</li><li>Gupta, A., Elgammal, F. S., Proddutur, A., Shah, S., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decrease+in+tonic+inhibition+contributes+to+increase+in+dentate+semilunar+granule+cell+excitability+after+brain+injury.">Decrease in tonic inhibition contributes to increase in dentate semilunar granule cell excitability after brain injury.</a> J Neurosci. 32 (7), 2523-2537 (2012).</li><li>Fish, K. N., Hoftman, G. D., Sheikh, W., Kitchens, M., Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvalbumin-containing+chandelier+and+basket+cell+boutons+have+distinctive+modes+of+maturation+in+monkey+prefrontal+cortex.">Parvalbumin-containing chandelier and basket cell boutons have distinctive modes of maturation in monkey prefrontal cortex.</a> J Neurosci. 33 (19), 8352-8358 (2013).</li><li>Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dentate+cannabinoid-sensitive+interneurons+undergo+unique+and+selective+strengthening+of+mutual+synaptic+inhibition+in+experimental+epilepsy.">Dentate cannabinoid-sensitive interneurons undergo unique and selective strengthening of mutual synaptic inhibition in experimental epilepsy.</a> Neurobiol Dis. 89, 23-35 (2016).</li><li>Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dentate+total+molecular+layer+interneurons+mediate+cannabinoid-sensitive+inhibition.">Dentate total molecular layer interneurons mediate cannabinoid-sensitive inhibition.</a> Hippocampus. 25 (8), 884-889 (2015).</li><li>Varga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+fission+of+parvalbumin+interneuron+classes+during+fast+network+events.">Functional fission of parvalbumin interneuron classes during fast network events.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+era+for+functional+labeling+of+neurons:+activity-dependent+promoters+have+come+of+age.">A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age.</a> Neural Circuits Revealed. , 109 (2015).</li><li>Krook-Magnuson, E., Luu, L., Lee, S. H., Varga, C., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ivy+and+neurogliaform+interneurons+are+a+major+target+of+mu-opioid+receptor+modulation.">Ivy and neurogliaform interneurons are a major target of mu-opioid receptor modulation.</a> J Neurosci. 31 (42), 14861-14870 (2011).</li><li>Szabadics, J., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+specificity+of+mossy+fiber+innervation+of+GABAergic+cells+in+the+hippocampus.">Functional specificity of mossy fiber innervation of GABAergic cells in the hippocampus.</a> J Neurosci. 29 (13), 4239-4251 (2009).</li><li>Iball, J., Ali, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoid+Release+Modulates+Electrical+Coupling+between+CCK+Cells+Connected+via+Chemical+and+Electrical+Synapses+in+CA1.">Endocannabinoid Release Modulates Electrical Coupling between CCK Cells Connected via Chemical and Electrical Synapses in CA1.</a> Front Neural Circuits. 5, 17 (2011).</li><li>Chen, X., Cho, D. -. B., Yang, P. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+staining+immunohistochemistry.">Double staining immunohistochemistry.</a> N Am J Med Sci. 2 (5), 241-245 (2010).</li><li>Ranjan, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+detection+of+multiple+antigens+at+single+cell+resolution+using+antibodies+generated+from+the+same+species.">Cellular detection of multiple antigens at single cell resolution using antibodies generated from the same species.</a> Journal of immunological. 379 (1), 42-47 (2012).</li><li>Fuccillo, D. A., Sever, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Concepts in Viral Pathogenesis II. , 324-330 (1986).</li><li>Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolor+fluorescence+immunostaining+technique+for+simultaneous+antigen+targeting.">A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting.</a> Acta Histochem. 107 (2), 143-148 (2005).</li><li>Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+and+morphological+characterization+of+neuronal+microcircuits+in+acute+brain+slices+using+paired+patch-clamp+recordings.">Electrophysiological and morphological characterization of neuronal microcircuits in acute brain slices using paired patch-clamp recordings.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments. (95), e52358 (2015).</li><li>Walz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Patch-clamp analysis : advanced techniques. 2nd edn. , (2007).</li><li>Molnar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Patch-clamp methods and protocols. 403, (2007).</li><li>Martina, M., Taverna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Patch-clamp methods and protocols. , (2014).</li><li>Booker, S. A., Song, J., Vida, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+patch-clamp+recordings+from+morphologically-+and+neurochemically-identified+hippocampal+interneurons).">Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons).</a> J Vis Exp. (91), e51706 (2014).</li><li>Jinno, S., Kosaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+characterization+of+hippocamposeptal+projecting+GABAergic+nonprincipal+neurons+in+the+mouse+brain:+a+retrograde+labeling+study.">Immunocytochemical characterization of hippocamposeptal projecting GABAergic nonprincipal neurons in the mouse brain: a retrograde labeling study.</a> Brain research. 945 (2), 219-231 (2002).</li><li>Yu, J., Proddutur, A., Swietek, B., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Reduction+in+Cannabinoid-Sensitive+Heterotypic+Inhibition+of+Dentate+Basket+Cells+in+Epilepsy:+Impact+on+Network+Rhythms.">Functional Reduction in Cannabinoid-Sensitive Heterotypic Inhibition of Dentate Basket Cells in Epilepsy: Impact on Network Rhythms.</a> Cereb Cortex. , (2015).</li><li>Proddutur, A., Yu, J., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seizure-induced+alterations+in+fast-spiking+basket+cell+GABA+currents+modulate+frequency+and+coherence+of+gamma+oscillation+in+network+simulations.">Seizure-induced alterations in fast-spiking basket cell GABA currents modulate frequency and coherence of gamma oscillation in network simulations.</a> Chaos. 23 (4), 046109 (2013).</li><li>Scharfman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+rat+dentate+neurons+by+morphology+and+electrophysiology+in+hippocampal+slices:+granule+cells,+spiny+hilar+cells+and+aspiny+'fast-spiking'+cells.">Differentiation of rat dentate neurons by morphology and electrophysiology in hippocampal slices: granule cells, spiny hilar cells and aspiny 'fast-spiking' cells.</a> Epilepsy Res Suppl. 7, 93-109 (1992).</li><li>Tasker, J. G., Hoffman, N. W., Dudek, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+intracellular+markers+for+combined+electrophysiological,+morphological+and+immunohistochemical+analyses.">Comparison of three intracellular markers for combined electrophysiological, morphological and immunohistochemical analyses.</a> J Neurosci Methods. 38 (2-3), 129-143 (1991).</li></ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Passos críticos dentro do Protocolo Encher a célula remendado com biocitina é o passo mais crucial para garantir a recuperação completa da morfologia. Para a completa recuperação da célula, é essencial para seleccionar uma orientação fatia ideal para minimizar o rompimento de processos durante o corte. Esta orientação pode variar de acordo com o tipo de circuito e celular em exame. Em seguida, é essencial para que haja tempo suficiente para o biocitina para difundir os dendritos e axônios. Alguns corantes, tais como neurobiotin, também pode penetrar neurônios acoplados à célula gravada através de junções. O tamanho da ponta da pipeta, também necessita de ser optimizada, como a soma tende a ser puxado para fora quando a abertura é grande e carregamento biocitina fica comprometida quando a ponta de pipeta é muito pequeno. Além disso, os procedimentos adequados, de desengate a partir do modo de células inteiras são essenciais para recuperar a soma. Depois de gravar durante 24 h, a incubação subsequentedas fatias em PFA a 4%, seguido de PBS que assegura a ligação cruzada dos tecidos seja reduzido, que é fundamental para imuno-histoquímica. Armazenamento das fatias a 4 ° C também é crucial para manter a integridade da fatia. No entanto, o armazenamento prolongado em PFA reduz eventual sucesso com os procedimentos de rotulagem de anticorpos. Optimizar a concentração e a duração da incubação do anticorpo primário é importante, uma vez que estes serão diferentes para os anticorpos individuais, e alguns anticorpos podem requerer 3-5 d de incubação para a melhor penetração no tecido grosso. Para garantir que as fatias não estão danificados antes da coloração do anticorpo primário e secundário, o tratamento adequado é necessário durante a remoção da tampa de deslizamento. Modificações e resolução de problemas Temos observado que não há tempo definido entre a primeira ea segunda mancha. As secções foram re-corados meses mais tarde, no mesmo tecido e com mais do que um corante. Dentronossas obras recentes, em comparação secções processadas utilizando o método de re-coloração com aqueles que utilizam protocolos imunocoloração padrão e não encontrar nenhuma diferença óbvia nos padrões de coloração ou a robustez do biocitina enche 6,9,25,26. Enquanto ele continua a ser testado, é possível que volte a coloração pode ser realizada mais de uma vez, com a integridade do tecido ser um fator limitante para o tratamento repetido. A disponibilidade de fluoróforos discretos também coloca um limite para o número de antigénios que podem ser visualizados. Portanto, um tratamento cuidadoso do tecido é aconselhada. Um processo adicional de que continua a ser testado é restaining usando protocolos de recuperação de antigénios (por receptores de superfície). Desde a integridade do tecido é mantida após a remoção da lâmina de cobertura, esperamos que o procedimento também deve trabalhar na coloração de protocolos que recomendam antígeno-recuperação. A este respeito, as gravações fisiológicas, muitas vezes produzir células sem marcadores neuroquímicos conhecidos <sup&gt; 6,9. Os procedimentos detalhados aqui permitir a recuperação da sua morfologia com base em imunocoloração biocitina. Embora a identidade neuroquímica não podem ser conhecidas a priori, re-coloração para marcadores potenciais poderia facilitar a identificação de marcadores para os neurónios que foram descritos com base na morfologia e propriedades eléctricas. Limitações da técnica Uma limitação associada a realização de coloração imuno-histoquímica em secções de espessura, é a penetração insuficiente do anticorpo através da espessura total da secção, especialmente com incubação durante a noite padrão no anticorpo primário. Além disso, diferentes anticorpos e estreptavidina, utilizados para revelar biocitina, pode ter a penetração nos tecidos diferencial. Assim, recomenda-se que períodos de experiência são realizados para avaliar a profundidade de penetração do anticorpo e para modificar os tempos de incubação, as temperaturas, e anticorpo e Triton &amp; #160; X-100 em concentrações de forma a conseguir uma penetração óptima da fatia e a coloração para cada anticorpo. Deve também ser notado que a rotulagem sucesso com um anticorpo ou com estreptavidina-biocitina não implica que um segundo anticorpo vai penetrar para a mesma profundidade da secção. Portanto, deve ser tomado cuidado para verificar a penetração de cada anticorpo ao nível em que os processos celulares marcados com biocitina são examinados para a co-localização com o marcador neuroquímica. Se a penetração é insuficiente, a fatia pode ser re-seccionados a &lt;60 uM para a imunocoloração. Note-se, no entanto, que desde que as fatias já foram processados ​​para biocitina, a morfologia da célula pode ser capturado por imagem confocal para eliminar a possibilidade de perda de dados durante a re-anatómicas de seccionamento e de facilitar a reconstrução neuronal. Embora seja possível que as espécies de animais e em geral podem alterar o grau de penetração do anticorpo, temos utilizado com sucesso estes procedimentos em tecidos de rato a partir de 30-dia- e sobre ratos de 60 dias de idade e em ratinhos. Uma segunda limitação é que biocitina não é inerentemente fluorescente e não pode ser usado para geração de imagens ao vivo e caracterização morfológica em tempo real durante a gravação. Fluoróforos não conjugados alternativos e amarelo Lucifer têm sido utilizados para geração de imagens ao vivo das células 27. Eles não são permanentes e perder fluorescência mediante a fixação, tornando-se impraticável para identificação post-hoc neuroquímica do neurônio gravado. Recentemente, fluoróforos com biocitina foram introduzidas para superar esta limitação e podem ser utilizadas para imagens ao vivo, bem como para o processamento pós-hoc em-marcação tripla ou dupla, como detalhado aqui. Curiosamente, até à data, preenchimentos biocitina resultaram em melhores propriedades elétricas e de coloração para estudos eletrofisiológicos e anatômicos combinados quando comparado com Lucifer amarelo 28. Importância da Técnica em Matéria de Existente /Métodos alternativos As vantagens principais de usar o protocolo detalhado aqui é que, ao contrário de ressecção, a estrutura de célula cheia de biocitina e processos permanecem intactas e não conduzem à perda permanente de tecidos, nem a necessidade de uma reconstruções laboriosas de múltiplas secções. Assim, um enchimento de uma única célula seguido por imunocitoquímica pode ajudar na reconstrução morfológica e identificação de marcadores neuroquímicos específicos. Aplicações futuras ou chegar depois de dominar esta técnica Ao todo, nós apresentamos uma abordagem prática da novela para a recuperação da morfologia e post-hoc duplo e triplo-imunomarcação de neurônios seguinte registros eletrofisiológicos. O processo é particularmente vantajoso para encontrar novos marcadores como o conhecimento evolui, os neurônios reavaliar que foram previamente preenchidos, visualizadas e fotografadas. É particularmente vantajoso porque tele imunohistoquímica pode ser realizada semanas ou mesmo meses mais tarde, poupando tecidos e anticorpos. O método não requer quaisquer produtos químicos especiais e com segurança pode ser realizado em qualquer laboratório.

O cérebro é conhecido pela diversidade das características estruturais e funcionais dos seus elementos neuronais individuais. Compreender os papéis de tipos neuronais distintas na função cerebral e patologia exige caracterização e identificação inequívoca dos neurônios. Estruturalmente, as características morfológicas definidos pela localização somato-dendrítica determinar as potenciais entradas que um determinado neurônio recebe, enquanto o padrão de arborização axonal identifica alvos potenciais pós-sinápticos. A diversidade estrutural dos neurônios tem sido apreciado desde os dias de estudos histológicos seminais do Ramón y Cajal 1. O advento das técnicas de gravação de uma única célula revelou que os neurônios estruturalmente distintos também mostram diferenças nos padrões de disparo e características sinápticas. A diversidade na estrutura e fisiologia é particularmente evidente em GABAérgicos neurónios inibitórios 2,3. Além disso, tornou-se cada vez mais evidente que structurallneurônios semelhantes y podem expressar diferentes marcadores neuroquímicos e mostrar correspondentes diferenças funcionais 4. Da mesma forma, os neurónios com os mesmos marcadores neuroquímicos podem ter estruturas e funções distintas 5-10. Assim, na prática, a análise das características funcionais de neurónios e o seu papel na rede requer a definição ambas as identidades morfológicas e neuroquímicas. Mesmo com o advento de linhas de ratinhos repórter segmentação marcadores neuroquímicos específicos, muitas vezes é necessário para determinar a morfologia e a identidade subtipo baseado em 11 imunohistologia. O método padrão utilizado para caracterizar células registrados em fatias cerebrais agudas é para os encher biocitina ou neurobiotin durante a gravação, corrigir as seções de paraformaldeído (PFA), seguindo as gravações, e usar a imunohistoquímica para revelar a morfologia e neuroquímica. Uma vez que a espessura das secções para a fisiologia fatia são tipicamente 300 mmou mais, e porque a maioria dos anticorpos não conseguem penetrar todo o caminho através do que a profundidade, as fatias devem ser re-seccionados a 60 um ou menos, para permitir a imunocoloração simultânea para biocitina e marcadores neuroquímicos 12-14. Infelizmente, é trabalhoso ressecção; corre o risco de perda de tecido durante o corte; e pode conduzir a diferenças de encolhimento do tecido, o que complica reconstruções morfológicas. Além disso, o conhecimento prévio da morfologia poderia ajudar a diminuir os marcadores candidatos que são susceptíveis de ser expressa pelas células. Temos modificado os protocolos imunohistologia biocitina padrão para permitir o processamento em série de secções em primeiro lugar para a recuperação de morfologia e, em seguida, para a identificação de potenciais marcadores neuroquímicos. A imuno-histoquímica é o estudo de distribuição de antigénio em células ou tecidos e pode ser visualizada utilizando uma enzima, marcadores fluorescentes, elementos radioactivos, ou partículas coloidais de ouro 15. O procedimento involves usando anticorpos primários para marcar especificamente e amplificar um ou mais antigénios específicos, seguido pela utilização de anticorpos secundários fluorescentes segmentação do anticorpo primário para visualização. Devido à necessidade de diferenciar os espectros de fluorescência de cada anticorpo secundário sem sobreposição, apenas um número limitado de antigénios podem ser examinados simultaneamente. Assim, o conhecimento prévio da morfologia poderiam ser úteis para seleccionar os marcadores neuroquímicos candidatos para a classificação de células. Conceptualmente, a razão de processamento em série de secções coradas já baseia-se na premissa de que imunomarcação para uma proteína ou péptido não deve interferir com a antigenicidade e imunomarcação subsequente para um péptido estruturalmente independente 16. Esta falta de interferência é devido à ligação dos anticorpos para um epítopo da proteína específica num antigénio e, portanto, permite a coloração simultânea de múltiplos antigénios no mesmo tecido. O número de antigénios revealed por imunocoloração é limitada pela necessidade de espectros de não sobreposição dos anticorpos secundários fluorescentes e pela necessidade de direccionar antigénios individuais com anticorpos criados em diferentes espécies de modo a eliminar a reactividade cruzada 17,18. Enquanto este é o raciocínio por trás de rotulagem de série em vez de em simultâneo com dois anticorpos diferentes que podem interagir, a nosso conhecimento, imunocoloração para um segundo antigénio não foi relatado após a conclusão da imunomarcação para um ou mais antígenos em seções montadas. Aqui, descrevemos um método para imuno série de secções previamente coradas e montadas. Embora pormenor este processo para um processo de imunomarcação de série para a recuperação da morfologia seguido por coloração para marcadores de proteína / péptido em secções espessas, os mesmos procedimentos podem ser usados ​​no padrão, secções histológicas finas bem. Além disso, descreve-se uma abordagem prática para encher neurónios gravados com biocitina e o processo para desalojar oeléctrodo da célula após a conclusão de gravações para optimizar o enchimento do axonal e mandris dendríticas de neurónios, tal como apresentado na nossa recente 6,8 trabalho. A vantagem mais importante do processo aqui descrito é que a morfologia da célula gravado pode ser totalmente recuperado e fotografada antes de tentar a ressecção ou imunocoloração das fatias. Embora os problemas com a penetração de determinados anticorpos podem tornar necessária a fatias de ressecção para imunocoloração secundário, os procedimentos detalhados aqui iria eliminar a necessidade de reconstruir neurónios complexos de múltiplas secções e evitar problemas devido à perda de tecido e o encolhimento diferencial, o que pode comprometer a reconstrução seguinte ressecção. Uma vantagem adicional é que o processo irá reduzir custos, tempo, esforço e anticorpos caros, limitando imunocoloração e re-corte às fatias em que os neurônios-cheia biocitina são recuperados. O aspecto mais prático é o anúncioimunocoloração nal que pode ser realizada em secções coradas meses antes de usar a técnica acima mencionada. Em particular, a recuperação da morfologia reduziria consideravelmente o potencial que os dados fisiológicos das células é rejeitado devido a uma incapacidade para obter uma caracterização morfológica básica do tipo de célula.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="898">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">NaCl&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:203px;">&#160;S7653</td>
			<td style="width:151px;">Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCL&#160;</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60129</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Na2HPO4&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">KH2PO4&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>229806</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guinea pig anti CB1&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Af530-1</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mouse anti CCK</td>
			<td>CURE, UCLA</td>
			<td>courtesy of G. Ohning</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rabbit anti Parvalbumin</td>
			<td>Swant</td>
			<td>PV27</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptavidin, Alexa Fluor conjugate</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S11227</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Normal goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vectashield&#160;</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibodies</td>
			<td>Invitogen Molecular probes</td>
			<td>Alexa Fluor conjugated dyes</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Labnet orbit low speed shaker</td>
			<td>Bioexpress</td>
			<td>S-2030-LS</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11231-30</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Slide folders</td>
			<td>EMS</td>
			<td>71520</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vibratome VT 1200 S</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14048142066</td>
			<td>Electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multiclamp 700B amplifier</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>Multiclamp 700B</td>
			<td>Electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pCLAMP 10 Software</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>pCLAMP 10&#160;</td>
			<td>Electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Digidata 1440 digitizer</td>
			<td>Electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter tips</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>171-0020</td>
			<td>Electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-335-100</td>
			<td>Electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microloaders</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td>Electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biocytin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4261</td>
			<td>Electrophysiology</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunostaining of biocytin-filled and processed sections for neurochemical markers

registos electrofisiolicos de células utilizando a técnica de fixação de membranas permitiram a identificação de diferentes tipos neuronais com base em padrões de disparo. A inclusão de biocitina / neurobiotin no eletrodo de gravação permite a recuperação post-hoc de detalhes morfológicos, que são necessários para determinar a arborização dendrítica e as regiões abrangidas pelos axônios dos neurônios registrados. No entanto, dada a presença de neurônios morfologicamente semelhantes com identidades distintas neuroquímicos e funções, coloração imuno-histoquímica de proteínas específicas de células-type-é essencial para identificar definitivamente neurônios. Para manter a conectividade de rede, secções do cérebro para gravações fisiológicas são preparadas com uma espessura de 300 nm ou mais. No entanto, esta espessura muitas vezes dificulta pós-processamento imuno devido a problemas com a penetração de anticorpos, sendo necessária a ressecção do tecido. Ressecção de fatias é uma arte difícil, muitas vezes ResulTing na perda de tecido e morfologia das células a partir do qual foi obtido dados electrofisiológico, tornando os dados inutilizável. Uma vez que a recuperação da morfologia iria limitar a perda de dados e guia na selecção de marcadores neuronais, adoptámos uma estratégia de recuperar a morfologia celular em primeiro lugar, seguido de imunocoloração secundário. Nós introduzimos uma abordagem prática para biocitina enchimento durante as gravações fisiológicas e subsequente imunocoloração de série para a recuperação da morfologia, seguido pelo restaining de secções para determinar a identidade neuroquímica. Relatamos que as secções que foram preenchidos com biocitina, fixadas com paraformaldeído (PFA), coradas, e lamínulas pode ser removida e corada novamente com um segundo anticorpo primário dias posteriores. Este restaining envolve a remoção da lamela, a lavagem das secções em uma solução tampão, e a incubação de anticorpos primários e secundários para revelar a identidade neuroquímica. O método é vantajoso para eliminar DATuma perda devido a uma incapacidade de recuperar morfologia e para estreitar os marcadores neuroquímicos a ser testados com base na morfologia.

Após a conclusão, as secções mantêm o preenchimento biocitina e a imunomarcação realizado no Passo 2 e pode ser fotografada usando confocal ou microscopia de epifluorescência. Além disso, as secções processadas também vai mostrar a imunocoloração para o antigénio marcado durante o processamento subsequente na etapa 3. Na secção ilustrada na Figura 2, a morfologia de um neurónio encheu-biocitina numa secção grossa (300 um) foi revelada utilizando estreptavidina visualizado em vermelho e a primeira primária (CB 1 R) visualizados em verde. O primeiro imunocoloração foi realizada dentro de 7 d de PFA fixação. A fatia foi montado num meio de montagem aquoso, fotografada usando um microscópio confocal, e armazenado por um período de dois meses antes da re-coloração com anticorpo para a CCK. Note-se a morfologia do neurónio gravado, incluindo mandris axonais (Figura 2E), foi reconstruída a partir das imagens confocais Sbtained após o primeiro processo de coloração. Co-localização do axônio com CB 1 R imunorreatividade (Figura 2 F - H) era esperado com base em estudos fisiológicos. A segunda coloração para CCK foi realizada em secções de dois meses após o primeiro processo de coloração. CCK foi fotografada na distante vermelho e foi pseudo-colorido em ciano para visualização. Da mesma forma, a Figura 3 ilustra um exemplo de uma célula na qual biocitina-marcação foi revelado e fotografada em uma secção de espessura (Figura 3A1). A fisiologia intrínseca do neurónio é ilustrado na Figura 3A2. A fatia foi re-seccionados a 50 mm e, embora algumas seções que contêm processos dendríticos foram perdidos, a seção que contém a soma recuperado (Figura 3B1). Subsequente imunocoloração CCK da seção fina mostraram expressão CCK em verde na soma marcado com biocitina. Montando a grossa fatia em meio aquoso impede eencolhimento do tecido xcessive. Em média, as secções 300 mícrons montado utilizando o meio aquoso redução de cerca de 25,67 ± 3,14% (n = 5 fatias) quando medida uma semana após a montagem. Assim, as secções espessas montado utilizando o meio aquoso são ~ 225 uM, permitindo a ressecção. Em vários estudos de controlo, verificou-se que o processo de imunomarcação para o segundo tempo não levou a marcação não-específica pelo anticorpo. Por exemplo, sabe-se que a parvalbumina (PV) e a imunorreactividade de CCK são mutuamente exclusivos em neurónios do hipocampo. Controlos em que o primeiro passo de imunomarcação (2) para biocitina (vermelho) e CCK (verde) foi seguido pelo segundo rotulagem para parvalbumina (com excitação a 405 nm e emissão a azul) mostraram padrões de expressão não-sobrepostas (Figura 4). Além disso, os padrões de coloração laminar axonal distintivas dos neurônios que expressam marcadores neuroquímicos específicos (PV, CCK, CB 1 R) não foram alterados pelo seriaprocedimentos l re-coloração (Figuras 2 - 4). Além disso, a coloração revelou consistentemente secundária co-marcação dos neurónios encheu-biocitina com os marcadores neuroquímicos esperados com base das gravações fisiológicas. Assim, estamos confiantes de que o procedimento restaining não levar à perda de especificidade na rotulagem. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54880/54880fig4.jpg" /> Figura 4. Falta de sobreposição entre os marcadores mutuamente exclusivas sobre a Segunda Imunomarcação Seguindo Imunomarcação Antes e montagem das secções. (A - C) As imagens confocais a 10X mostrando um neurónio encheu-biocitina (A) no vermelho, indicado por uma ponta de seta, e a imunorreactividade de CCK em verde (B), indicado pela seta. Note-se a falta de sobreposição. A mesma secção foi processada para parvalbumina (PV) imunocoloração em azul depois de mais de 2 meses (C). o OVerlay de imagens é mostrado na D. Note-se que os axónios PV são distribuídas na camada de células granulares, com CCK na camada molecular do padrão não sobrepostas esperado. Observe também a falta de co-localização dos dois marcadores em somata neuronal. As imagens ampliadas à direita ilustram que o neurônio marcado com biocitina expressa PV (seta) e não CCK (seta). Barra de escala: 100? M (A - D), 20 uM (painéis à direita). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54880/54880fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Uma razão comum para biocitina sub-óptima preenche é o rompimento acidental dos processos neuronais com a pipeta de gravação quando se aproxima da célula. Um apêndice perdido da célula aparece como uma bolha de biocitina no final de um axónio, como ilustrado na Figura 1 (seta verde). Axonal bolhas umare muitas vezes visualizada quando remendar células superficiais, cujos axônios podem ser cortados durante os procedimentos de corte. No entanto, a optimização do plano de corte e de conhecimento do padrão de distribuição axonal de a classe de células alvo pode auxiliar em evitar que se aproxima o soma a partir da direcção do axónio putativo, que também pode cortar o axónio, resultando no aparecimento de uma bolha axonal . Na maioria dos tipos de células, é preferível a aproximar-se do corpo da célula ao longo do eixo Z (seta branca com ponto). A segunda questão diz respeito à aplicação de pressão positiva excessiva para a pipeta enquanto se aproximava da célula. Isto pode não só danificar a célula e as suas ligações, mas também faz com que a solução contendo biocitina interno para derramar em torno da célula, levando a alta fluorescência de fundo. Coloração de fundo, também aumenta quando o tempo necessário para se aproximar da célula é prolongada ou quando a qualidade de fatia não é óptima, o que pode comprometer a capacidade de definir a morfologia celular (Figura 5A). É possível puxar para fora o soma enquanto desalojar a pipeta. Isto irá resultar numa falta de morfologia somática (Figura 5B). Para evitar puxando para fora da célula, mover a pipeta cima e para fora em pequenas etapas, usando as configurações de movimento &quot;fino&quot; do manipulador. Se a célula parece estar ligado a pipeta através de uma extensão de comprimento da membrana, da torneira / movimento do manipulador suavemente para desalojar a pipeta a partir da célula. Evite usar as configurações do manipulador grosseiros até que a célula esteja completamente desalojado. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54880/54880fig5.jpg" /> Figura 5. Imagens ilustram mal sucedidas Fills biocitina. (A) Imagem que mostra a alta fluorescência de fundo devido à excessiva pressão positiva na pipeta de gravação, resultando em visibilidade celular pobres. estruturas mais finas de processos neuronais, incluindo os axônios, são visualizados além da região de the derrame. Além disso, observe que a soma tenha sido puxado para fora. (B) Um neurônio com a soma tirou durante descolamento pipeta. As setas mostram preenchimentos de sucesso do axônio e dendritos, enquanto que a soma e apêndices proximal às flechas não foram recuperados. (C) Uma célula de patched em uma camada superficial da fatia (&lt;50 mm a partir da superfície) resulta em células que exibem cheios axónio cortado e dendrites (setas). Observe o beading (setas) dos dendritos das células de grânulos, indicando a saúde das células pobres (C). Barra de escala: 50 ^ m. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54880/54880fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Finalmente, a fim de recuperar a morfologia celular completo sem axônios ou dendritos cortadas, é melhor a célula alvo&gt; 50 mm de profundidade para a superfície da fatia. células superficiais podem ter processos que têmforam cortados e podem não ter o complemento normal de entradas sinápticas. As armadilhas mais comuns nos procedimentos restaining estão associados com a remoção da lamela e a recuperação da secção, sem danificar o tecido. A segunda questão diz respeito a penetração de anticorpos no tecido grosso, especialmente quando incubadas durante a noite. Em vários casos, uma melhor penetração foi conseguido por incubação em anticorpo primário durante até 72 h a 4 ° C num agitador orbital colocados numa sala fria. Embora re-seccionamento do tecido é o processo mais eficaz para assegurar uma penetração anticorpo, prolongando a duração da incubação em anticorpo primário ou aumentando a concentração de detergente a 0,5 - 1% de Triton-X100 também podem auxiliar a penetração do anticorpo 24. Uma vez que a maioria dos neurónios gravadas estão localizados dentro de 50 - 100 | iM a partir da superfície da secção, descobrimos que a coloração de secções de espessura é adequada para etiquetar biocitinasomata -filled ou processos a este nível. No entanto, recomenda-se que a extensão da rotulagem anticorpo é verificado em cada seção antes de interpretar os resultados co-localização negativos.

Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers at JoVE.com

Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers

Este protocolo apresenta um método para a recuperação morfológica dos neurónios durante patched registos electrofisiolicos utilizando biocitina de enchimento e de pós-processamento subsequente imuno-histoquímica. Mostramos que as seções encheu-biocitina grossas que estavam manchados e lamínulas pode ser restained com um segundo dia de anticorpos primários ou meses mais tarde.

Imunocoramento Secções biocitina-preenchidos e processados ​​para neuroquímicos Markers

Electrophysiological recordings of cells using the patch clamp technique have allowed for the identification of different neuronal types based on firing ...

immunostaining-biocytin-filled-processed-sections-for-neurochemical

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

22.9K visualizações.  Rutgers New Jersey Medical School.  Este protocolo apresenta um método para a recuperação morfológica dos neurónios durante patched registos electrofisiolicos utilizando biocitina de enchimento e de pós-processamento subsequente imuno-histoquímica. Mostramos que as seções encheu-biocitina grossas que estavam manchados e lamínulas pode ser restained com um segundo dia de anticorpos primários ou meses mais tarde. 

Vídeo: Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

Fluorescência dupla In situ Hibridação nas Seções cérebro fresco

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Neurociência

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor functions. Most investigations of sensorimotor mechanisms rely on either examination of neurons while an animal is static1,2 or record extracellular neuronal activity during a movement.3,4 While these studies have provided the fundamental background for sensorimotor function, they either do not evaluate functional information which occurs during a movement or are limited in their ability to fully characterize the anatomy, physiology and neurochemical phenotype of the neuron. A technique is shown here which allows extensive characterization of individual neurons during an in vivo movement. This technique can be used not only to study primary afferent neurons but also to characterize motoneurons and sensorimotor interneurons. Initially the response of a single neuron is recorded using electrophysiological methods during various movements of the mandible followed by determination of the receptive field for the neuron. A neuronal tracer is then intracellularly injected into the neuron and the brain is processed so that the neuron can be visualized with light, electron or confocal microscopy (Fig. 1). The detailed morphology of the characterized neuron is then reconstructed so that neuronal morphology can be correlated with the physiological response of the neuron (Figs. 2,3). In this communication important key details and tips for successful implementation of this technique are provided. Valuable additional information can be determined for the neuron under study by combining this method with other techniques. Retrograde neuronal labeling can be used to determine neurons with which the labeled neuron synapses; thus allowing detailed determination of neuronal circuitry. Immunocytochemistry can be combined with this method to examine neurotransmitters within the labeled neuron and to determine the chemical phenotypes of neurons with which the labeled neuron synapses. The labeled neuron can also be processed for electron microscopy to determine the ultrastructural features and microcircuitry of the labeled neuron. Overall this technique is a powerful method to thoroughly characterize neurons during in vivo movement thus allowing substantial insight into the role of the neuron in sensorimotor function.

A technique is described to quantify the in vivo physiological response of mammalian neurons during movement and correlate the physiology of the neuron with neuronal morphology, neurochemical phenotype and synaptic microcircuitry.

Caracterização fisiológica, morfológica e neuroquímicos de Neurônios Modulada por Movimento

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the retinal ganglion cell layer (RGCL) in rat models with N-methyl-D-aspartate (NMDA)&#x2013;induced excitotoxicity1, retinal ischemia-reperfusion injury2 and glaucoma3. Reduction of INL and inner plexiform layer (IPL) thicknesses were reversed with citicoline treatment in rats' eyes subjected to kainic acid-mediated glutamate excitotoxicity4. Alteration of RGC density and soma sizes were observed with different drug treatments in eyes with elevated intraocular pressure3,5,6. Therefore, having objective methods of analyzing the retinal morphometries may be of great significance in evaluating retinal pathologies and the effectiveness of therapeutic strategies.
The retinal structure is multi-layers and several different kinds of neurons exist in the retina. The morphometric parameters of retina such as cell number, cell size and thickness of different layers are more complex than the cell culture system. Early on, these parameters can be detected using other commercial imaging software. The values are normally of relative value, and changing to the precise value may need further accurate calculation. Also, the tracing of the cell size and morphology may not be accurate and sensitive enough for statistic analysis, especially in the chronic glaucoma model. The measurements used in this protocol provided a more precise and easy way. And the absolute length of the line and size of the cell can be reported directly and easy to be copied to other files. For example, we traced the margin of the inner and outer most nuclei in the INL and formed a line then using the software to draw a 90 degree angle to measure the thickness. While without the help of the software, the line maybe oblique and the changing of retinal thickness may not be repeatable among individual observers. In addition, the number and density of RGCs can also be quantified. This protocol successfully decreases the variability in quantitating features of the retina, increases the sensitivity in detecting minimal changes.
 	This video will demonstrate three types of morphometric analyses of the retinal sections. They include measuring the INL thickness, quantifying the number of RGCs and measuring the sizes of RGCs in absolute value. These three analyses are carried out with Stereo Investigator (MBF Bioscience &mdash; MicroBrightField, Inc.). The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

This video demonstrates three types of morphometric analyses of the retina, which include measuring the inner nuclear layer thickness, quantifying the number of retinal ganglion cells (RGCs) and measuring the sizes of RGCs. The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

Análises morfométricas de secções da retina

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

Preparação do tecido e imunocoloração de Fibras nervosas sensoriais que inervam rato da Pele e Ossos Limb

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Análise imuno-histoquímica no sistema nervoso central e periférico Rat linfonodo Tissue Secções

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

Avaliando Neurogênese Primária em<em&gt; Xenopus</em&gt; Os embriões Usando Imunomarcação

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Imunossinção Quadruple da Lâmpada Olfativa para Visualização de Códigos de Identidade Molecular de Axon Sensorial Olfativo

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology

Peripheral nerves extend throughout the body, innervating target tissues with motor or sensory axons. Due to widespread distribution, peripheral nerves are frequently damaged because of trauma or disease. As methods and strategies have been developed to assess peripheral nerve injury in animal models, function and regeneration, analyzing the morphometry of the peripheral nerve has become an essential terminal outcome measurement. Toluidine blue staining of nerve cross sections obtained from resin embedded nerve sections is a reproducible method for qualitative and quantitative assessments of peripheral nerves, enabling visualization of morphology number of axons and degree of myelination. This technique, as with many other histological methods, can be difficult to learn and master using standard written protocols. The intent of this publication is therefore to accentuate written protocols for toluidine blue staining of peripheral nerves with videography of the method, using sciatic nerves harvested from rats. In this protocol, we describe in vivo peripheral nerve fixation and collection of the tissue, and post-fixation with 2% osmium tetroxide, embedding of nerves in epoxy resin, and ultramicrotome sectioning of nerves to 1-2&#956;m thickness. Nerve sections then transferred to a glass slide and stained with toluidine blue, after which they are quantitatively and qualitatively assessed. Examples of the most common problems are shown, as well as steps for mitigating these issues.

Here we present a protocol to visualize fine structures of peripheral nerves by obtaining and staining 1-2 &#181;m sections with toluidine blue

Azul de toluidina mancha de resina-incorporado seções para avaliação da morfologia do nervo periférico

Peripheral nerves extend throughout the body, innervating target tissues with motor or sensory axons. Due to widespread distribution, peripheral nerves ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

Identificando marcadores de superfície celular da haste neural primária e células progenitoras por rotulagem metabólica de Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical conduction. Myelin alteration has been shown to occur in various neurological diseases, where it is associated with functional deficits. Here, we provide a detailed description of an ex vivo model consisting of mouse organotypic cerebellar slices, which can be maintained in culture for several weeks and further be labeled to visualize myelin.

Here we present a method to prepare organotypic slice cultures from mouse cerebellum and myelin sheath staining by immunohistochemistry suitable for investigating mechanisms of myelination and remyelination in the central nervous system.

Preparação e imunocoloração de culturas de fatia cerebelar microambiental Organotypic

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Imunocoramento Secções biocitina-preenchidos e processados ​​para neuroquímicos Markers

Imunocoramento Secções biocitina-preenchidos e processados para neuroquímicos Markers