Yazarlar VS NIH / NINDS R01 NS069861 ve NJCBIR CBIR14IRG024 destek kabul etmek istiyorum

Elektrofizyoloji sırasında 1. Biocytin Dolum NOT: okuyucular burada üzerine özenli değil temel yama-kelepçe kayıt teknikleri ve enstrümantasyon 19-22, alternatif kaynaklara başvurabilirsiniz. Burada ayrıntılı adımlar yama-kelepçe kayıtları için ekipman ve prosedürler zaten kurulmuş olduğunu varsayalım ve açıklama biocytin doldurma ve post-hoc immün ilgili ayrıntılar ile sınırlı olacak. Bu yazıda belirtilen tüm deneyler fareler üzerinde gerçekleştirilmiştir. <ol><li> 350 um 23 - bir vibratome kullanarak, 300 bir kalınlıkta, arzu edilen bölgenin canlı beyin kesitler hazırlamak. </li><li> İç çözeltisi 6 1 ml biocytin 2 mg eklenerek% 0.2 biocytin içeren bir iç çözelti hazırlayın. biocytin tamamen eriyene kadar 15 dakika - En iyi sonuçlar için, 10 iç çözüm sonikasyon. Daha sonra, bir 0.2 ile donatılmış bir 1 ml şırınga içinde, iç çözüm yük# 160; mikron gözenek boyutu polipropilen filtre ucu Microloader bağlı. iç çözümü Mg-ATP ve Na-GTP istikrarı korumak için soğuk paketi üzerinde bu yükleme şırınga tutun. Not: bir iç çözelti içeren bir potasyum glukonat (126 mM K-glukonat, 4 mM KCI, 10 mM HEPES, 4 mM Mg-ATP, 0.3 mM Na-GTP, 10 mM fosfokreatin), bazı nöro-kimyasal işaretlerin geri kazanımı için uygun bir immün sırasında parvalbumin dahildir. bizim deneyim, Sezyum ve klorür bazlı iç çözümleri kullanarak belirli nörokimyasal belirteçler için immün kurtarmak için yeteneğini azaltır. Neurobiotin ya biocytin bir Alexa Fluorofor birleştiren bir hücre geçirgenliği olmayan, tamir edilebilir polar iz biocytin alternatif olarak kullanılabilir. </li><li> Kızılötesi diferansiyel girişim kontrast altında kayıt için uygun hücre görselleştirmek. akson kesintileri en aza indirmek için, &quot;yaklaşım&quot; f kullanarak ekseni boyunca pipet düşürerek hücre gövdesi yaklaşımEn Mikromanipülatörler mevcuttur unction. Patch-kelepçe fizyolojisi protokolleri 19-22 kullanarak kızılötesi diferansiyel girişim kontrast altında tam hücre kayıtları kurmak. NOT: kesik ucuna (Şekil 1&#39;de yeşil ok) bir bleb olarak görüntülenmiştir akson, sever gibi, varsayılan akson yönden hücreyi yaklaşan kaçının. Ayrıca, yüksek arka plan boyama neden olacaktır biocytin ve dökülme, en aza indirmek için hücreyi yaklaşırken kayıt pipet yüksek pozitif basınç uygulamaktan kaçının. </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54880/54880fig1.jpg" /> Şekil 1. Biocytin doldurur için Hücreleri yaklaşırken için Plane önerdi. Resim (594-konjuge streptavidin kullanılarak kırmızı), bir granül hücre (GC) biocytin ortaya çıkarmak için işlendikten kayıt sırasında biocytin dolgu göstermektedir. GC XY düzleminde odaklı olarak dendrit vardır. kopmuş granül hücre dikkatakson nedeniyle XY düzlemi boyunca pipet hareketine (yeşil ok). o XZ düzlemi boyunca bu nöron yaklaşım ideal olduğunu unutmayın. Ölçek çubuğu: 50 mikron. <ol start="4"><li> gerilim kelepçe yapılandırmada, küçük (5 mV) yanıt olarak tüm hücre kapasitans ve seri direnç, kısa (30 ms) gerilim belirlemek, bir elektrofizyoloji veri toplama ve analiz yazılımı banyo modunda membran testi işlevini kullanarak kullanarak adımlar. Bu biocytin-dolum sağlamak için tüm hücre kayıt koşullarına kurulmasını sağlayacaktır. </li><li> gerektiği gibi ya akım-veya voltaj-kelepçe modunda fizyolojik kayıtları yürütün. 34 ° C de&gt; 10 dk bir minimum kayıt süresi idealdir. NOT: Daha uzun kayıt süreleri, oda sıcaklığında gerçekleştirilen çalışmalar için gerekli olabilir. </li><li> Fizyolojik kayıtların tamamlanmasının ardından, yavaş yavaş (Z ekseni boyunca) yukarı alternatif, küçük adımlarla kayıt pipet hareket ettirerek yama-kelepçe yapılandırmasını yeniden kurmak vedışarı doğru voltaj-kelepçe modunda (X ekseni boyunca). </li><li> Eş zamanlı olarak hücrenin yeniden sızdırmazlık ve bir dış-çıkış kurulmasını gösteren kapasitif geçici kaybı ve düz bir çizgi mevcut yanıtların çöküşünü görselleştirmek için &quot;membran testi&quot; fonksiyonunu kullanarak kapasite ve giriş direnci izlemek pipet ucunda yama. bir depolarize potansiyeli (-40 mV) hücreyi Holding yeniden mühürleme işlemini kolaylaştıracaktır. NOT: Bir hücrenin uzaklaştırılması için Bu prosedür genellikle soma ve dendritler tam iyileşme sağlar. Bu işlem sırasında ya da pipetle hücreyi ayırarak kayıt sırasında pipet pozitif basınç uygulamayın. dilim kaydedilen hücrenin soma Görselleştirme başarılı ayrılmasını gösterir. Hücresel enkaz veya müstakil ucu sonunda bir zar yama varlığı genellikle soma çıkık gösterir ve tam hücresel morfoloji vermez. </li><li> kıçtaDistal dendritik ve aksonal süreçleri boya taşınmasını sağlamak için 5 dakika - hücreden pipet ayrılmakta er, 3 kayıt odasına dilim korur. </li><li> tespiti için% 4 PFA ihtiva eden bir 24-çukurlu plaka dilimleri aktarın. UYARI: PFA kanserojen ve eldiven ve yüz maskesi dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu donanımlar, olduğu, cilt tahrişine ve inhalasyon önlemek için kullanılmalıdır. PFA yanıcı ve yangın ulaşamayacağı tutulmalıdır. PFA drenaj bertaraf asla ve kimyasal atık olarak toplanan gerekir. PFA tespit transferi pipetler dahil fizyoloji kurulum kirlenmesini önlemek için canlı dilim hazırlanması için kullanılan alanlar, izole edilmelidir. </li><li> 24-48 saat PFA tespit sonrasında önce immün depolama için 0.1 M fosfat tamponlu tuz (PBS) dilim aktarın. NOT: İdeal olarak, kurtarma ve immün biocytin boyama per rağmen, kısa bir süre tespit sonrasında gerçekleştirilir en iyi zaman<html> sabitleme verimleri iyi sonuçlar 7 gün içerisinde kurdu. Bu nedenle ameliyat sonrası gün 90 üzerinde kadar gerçekleştirilen boyama için,% 0.05 sodyum azid - Dilimler 0.02 PBS içinde muhafaza edilebilir. PFA gece boyunca tespiti en antikorlar için iyi çalışmasına rağmen, sabitleyici inkübasyon süresi azalır bazı antikorlar, en iyi sonucu olasıdır. 48 st için PFA Tespit antijenlerin kullanılabilirliğini azaltır ve nörokimyasal belirteçler için başarılı ikincil immün şansını azaltmaktadır. DİKKAT: Sodyum azit son derece tehlikeli ve yenmesi veya inhalasyon cilt veya gözlerle veya üzerine temas halinde tahriş edicidir. Şiddetli aşırı maruz kalma ölümle sonuçlanabilir. bileşik kanserojenliği ve mutajenisite bilinmemektedir. eldiven, gözlük sıçrama, bir laboratuvar önlüğü ve toz solunum dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu donanımları kullanın. Sodyum azit drenaj bertaraf asla ve kimyasal atık olarak toplanan gerekir. </li></ol>Ana birincil antikor ve Biocytin arasında e_title &quot;&gt; 2. Boyama (1.gün) Not: Aşağıdaki immüno-boyama prosedüründe serbest yüzen bölümler için ve inkübasyon adımları için bir çalkalayıcı üzerinde düşük bir hızda (2 devir / dakika, rpm) sürekli bir şekilde çalkalanarak gerektirir. <ol><li> 0.1 M PBS (pH = 7.4) içinde 10 dakika her biri için, doku 3x yıkanır. Not: NaCl 8 g, KCI, 0.2 g, Na 2 HPO 4 1.44 g, ve KH 2 0.24 g PO4, 1: aşağıdaki şekilde, 0.1 M PBS, ticari olarak laboratuarda satın alınabilir ya da yapılabilir (1 L) yapar dH 2 0 L. Not: İstenilen nörokimyasal işaretçi biliniyorsa, bir protein için boyama / peptid biocytin boyama ile eş zamanlı olarak gerçekleştirilebilir (2.2 adım - 2.4). Sadece biocytin için boyama ise 2.5 adıma geçin. </li><li> İSTEĞE BAĞLI:% 10 serum engelleme Blok (bs, oda sıcaklığında 1 saat için PBS içinde% 0.3 Triton X-100 ile seyreltilmiş normal keçi serumu (NGS)). NOT: Her iyi olmalıçözeltinin aynı hacmi içerir; / Kuyu 500 uL - tavsiye hacmi 250 arasındadır. Engelleme serum seçimi ikincil antikorlar (örneğin, NGS boya-konjüge edilmiş keçi anti (ilgili primer antikor türleri) için kullanılır) yetiştirilir olan türlere dayanmaktadır. başlıkların immunostain farklı türlerde ortaya sekonder antikor kullanımı ortaya çıkarsa, adım (2) bloke etmek üzere, her normal serum% 10 ve birincil ve ikincil antikor inkübasyon adımları için, her normal serum% 3 arasındadır. </li><li> (İSTEĞE BAĞLI) primer antikor bölümleri inkübe RT O / N 0.1 M PBS içinde% 0.3 Triton X-100 ve% 3 BS CB1 R (poliklonal hamster). CB1 R kanabinoid reseptör tip 1 ekspresyonunu tespit etmek için kullanılır. NOT: Bu adım isteğe bağlıdır ve biocytin dolum ortaya çıkarmak için gerekli değildir. Şekil 2, ilk boyama işlemi sırasında biocytin ve CB 1 R etiketli bir bölümü göstermektedir. O / N incuOda sıcaklığında Bation birincil antikor çok için yeterlidir; inkübasyon 5 d - ancak, CB 1 R dahil olmak üzere bazı birincil antikorlar, 3 gerektirir. İnkübasyon daha uzun 1 D olması gerekir, Triton X-100 dilimleri geçirgenliği ve oda sıcaklığında uzun süreli inkübasyon sırasında doku tahrip olmasına yol açmaktadır, çünkü 4 ° C&#39;de inkübe etmek önerilir. İkinci antikorun, belli bir kontrol olarak deney, her dizi için, en az bir bölümünde primer antikor içermeyen bir negatif kontrol içerir. Negatif kontroller için ilk antikor ihmal edilir ancak% 0.3 Triton 0.1 M PBS içinde X-100 ve BS eklenir. </li></ol><img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54880/54880fig2.jpg" /> Şekil 2. Başarılı CCK Boyama Biocytin Boyama ve C Kurtarma ardından 1 Hafta Reseptör Tip 1 (CB 1 R) annabinoid - &lt;strong&gt; etiketleme. (A - C) ok ile gösterilen biocytin doldurulmuş nöron (A) ve CB1 R immünoreaktivitesi (B) gösteren 60X konfokal ve görüntüler. Aynı bölümü 1 hafta (C), sonra, CCK immün işlenmiştir. Görüntü bindirme D &#39;de gösterilmiştir. CCK immunreaktivitesine uzak-kırmızı kullanılarak ortaya çıktı ve camgöbeği pseudo-boyandı. (E) biocytin ve CB 1 R boyama hatta ikinci CCK immün sonra belirgin olduğu A. Not biocytin dolu hücrenin morfolojik yeniden yapılanma. Ayrıca CB 1 R ve CCK immün desen beklenen dağılımı not edin. (F - H) A olarak hücreden akson Büyütülmüş görüntü, biocytin gösterisi yakın işbirliği yerelleştirme ve akson CB 1 R (ok başları). Ölçek çizgisi: 50 um (A - D), 100 um (E) ve 10 um ( <strong&gt; F - H). Görüntüler Yu ve ark çoğaltılamaz edilir. 2015 9. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54880/54880fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> (2. gün) <ol start="4"><li> 0.1 M PBS (pH = 7.4) bölümler 10 dakika her biri için 3x beyin yıkayın. </li><li> streptavidin kırmızı boya birleşmişi &#39;bölümleri inkübe (konsantrasyon: 1: 1000, eksitasyon: görünür tayfta emisyon 594 nm)&#39; de, 4 ° CO 0.1 M PBS içinde% 0.3 Triton X-100 ve% 3 BS / K koyu (alüminyum folyo ile sarılmış) biocytin ortaya çıkarmak için. Aşama 2.3 isteğe bağlı primer inkübasyonun ardından yukarıdaki inkübasyon: (yeşil 488 nm ve emisyon uyarım 500: 1 konsantrasyon): İsteğe ikincil antikor, keçi anti-kobay içerir. Not: İkincil antikor isteğe bağlı birinci antikor, boyama (2.3 aşama) yerine getirilmesi durumunda gerekli olacaktır. Bir stre biocytin görselleştirmek içino (- 3 Şekil 1) detaylı ve daha iyi kontrasta sahip ince aksonlar görselleştirmek için yardımcı olarak kırmızı bir emisyon spektrumu ile ptavidin-flüorofor konjuge tavsiye edilir. iki ya da üç immün sırasında birbirleri ile sekonder antikorların çapraz reaktivite önlemek için, seri bir şekilde (antikorlar seri eklemeler arasında 2 saat aralığı yeterlidir) peş sekonder antikorlar, bir ekleyin. Şekil 3A, isteğe bağlı birinci antikor boyama işlenip rezeksiyon önce görüntülü bir biocytin dolu bir hücreyi göstermektedir. </li></ol><img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54880/54880fig3.jpg" /> Şekil 3. Biocytin Morfoloji ve rezeksiyon ve Kurtarma aşağıdaki Başarılı İkinci immün. Bir biocytin dolu hücrenin dendritik morfoloji kurtarma gösteren 300 mikron dilim (A1) Konfokal görüntü. (&lt;500 ve -100 pA akım enjeksiyonları cevaben nöron strong&gt; A2) Membran gerilim izleri. Montaj ve görüntüleme sonrası (A1) 300 mikron bölüm rezeksiyon sonrası elde edilen 50 mikron bölümünde biocytin dolu soma (B) Kurtarma. (B2) ince bölümün sonraki immün CCK (orta panel) ile biocytin dolu soma (sağ panel) ko saptandı. Birleştirilen görüntü sağ panelde gösterilmektedir. Ölçek çubuğu: 50 mikron. Panel A2 Yu ve ark izni ile yeniden üretilir. Basın 25. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54880/54880fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> (Gün 3) <ol start="6"><li> Yıkama beyin kesitleri 0,1 M PBS (pH = 7.4) içinde 10 dakika her biri için 3 kat. </li><li> floresan korumak ve gelecekte yeniden boyama kolaylaştırmak için, sek montajSu esaslı bir montaj ortamı içinde sonuçlarını ve şeffaf tırnak cilası ile lamel kenarlarını kapatırlar. NOT: nedeniyle cam slayt montaj orta kaçak slayt, kalıp istila ve doku dehidratasyon oje kaldırarak zorluklar önlemek için mümkün olduğunca erken bölümleri restain en iyisidir. Mikrobiyal kirlenme PBS içinde% 0.02 sodyum azid ile önlenebilir. DİKKAT: su ile temas halinde olduğunda, sodyum azid oldukça toksik ve yanıcı değildir. Tehlikeli kimyasalların taşınması ve bertarafı için standart işletim prosedürlerine bakınız. (Gün 4-7) </li><li> 594 ve 488 nm ve yeşil, kırmızı ve nöro-kimyasal işaretlerin (CB1 R) &#39;de biocytin doldurulmuş nöronlar ortaya çıkarmak için 20X ya 40X bir büyütmede eksitasyonla confocal görüntüleme gerçekleştirin. (Şekil 2) colabeling değerlendirin. </li><li> photobleaching ve obta önlemek için en az 100 ms Kamera pozu ayarlamakTüm nöronun akson ve dendritik milleri konfokal görüntü yığınlar. Kullanım konfokal görüntü yığınları ve nöron izleme yazılım paketleri nöronal morfoloji yeniden. </li></ol> İkinci primer antikor 3. boyanması NOT: İkinci immün adımı ilk boyandıktan sonra 90 d yapılabilir iken ikinci primer antikor boyama 7 içinde yapılırsa, optimum boyama elde edilir - 10 d. (7 Sonra - 90 d) <ol><li> Bir pamuklu çubukla için aseton uygulayın ve cam slayt kapalı oje şerit. </li><li> ince uçlu forseps kullanılarak dikkatlice lamel çıkarın ve bölümlerde 0.1 M PBS birkaç damlacıklar koydu. </li><li> Dikkatle ince bir boya fırçası kullanarak slayt bölümleri çıkarmak ve 24 için 0.1 M PBS içinde yıkayın - 4 o C&#39;de düşük ışıkta alüminyum folyo kaplı bir çalkalayıcı üzerinde 48 saat NOT: bir ile bölümleri kapsayacak şekilde önemlidirluminum folyo photobleaching önlemek için. </li><li> 10 dakika her biri için 0.1 M PBS ertesi günü 2x - montaj orta tümüyle kaldırılmasını sağlamak için, bölümlerinin 1 yıkayın. </li><li> Ikinci birincil antikor inkübasyon ile devam (örneğin, kolesistokinin, belirli bir GABAerjik internöronlar (CCK bulunan bir nöropeptid, konsantrasyon: 1: 1,000; fare monoklonal antikoru)) 1 gün (Şekil 2) dir. NOT: Bu işlem 2.3 adıma benzer ama farklı antikor kullanılır. Ayrıca, engelleme adımı yeniden boyama esnasında göz ardı edilir. </li><li> 0.1 M PBS (pH = 7.4) içinde 10 dakika için her beyin kesitlerinde üç kez yıkayın. </li><li> fluorofor-konjuge sekonder antikor keçi anti-fare ile Leke (konsantrasyon: 1: 500; dalgaboyu: 647 nm), ikincil antikor uyarma-emisyon spektrumları streptavidin (konsantrasyon ile örtüşmeyen emin: 1: 1.000; eksitasyon dalga boyu: 594 nm) ve önceden immünofloresanlekeleri. </li><li> Sulu montaj ortamında bölümleri monte edin ve şeffaf tırnak cilası ile kapak kayma kenarları mühür. Not: floresan korumak için opak muhafaza kutusu içinde 4 ° C&#39;de bölümleri saklayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Garcia-Lopez, P., Garcia-Marin, V., Freire, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histological+slides+and+drawings+of+cajal.">The histological slides and drawings of cajal.</a> Front Neuroanat. 4, 9 (2010).</li><li>Klausberger, T., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+diversity+and+temporal+dynamics:+the+unity+of+hippocampal+circuit+operations.">Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations.</a> Science. 321 (5885), 53-57 (2008).</li><li>Petilla Interneuron Nomenclature, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Petilla+terminology:+nomenclature+of+features+of+GABAergic+interneurons+of+the+cerebral+cortex.">Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).</li><li>Armstrong, C., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basket+cell+dichotomy+in+microcircuit+function.">Basket cell dichotomy in microcircuit function.</a> J Physiol. 590 (4), 683-694 (2012).</li><li>Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+heterogeneity+of+fast-spiking+interneurons:+chandelier+versus+basket+cells.">Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells.</a> PLoS One. 8 (8), e70553 (2013).</li><li>Gupta, A., Elgammal, F. S., Proddutur, A., Shah, S., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decrease+in+tonic+inhibition+contributes+to+increase+in+dentate+semilunar+granule+cell+excitability+after+brain+injury.">Decrease in tonic inhibition contributes to increase in dentate semilunar granule cell excitability after brain injury.</a> J Neurosci. 32 (7), 2523-2537 (2012).</li><li>Fish, K. N., Hoftman, G. D., Sheikh, W., Kitchens, M., Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvalbumin-containing+chandelier+and+basket+cell+boutons+have+distinctive+modes+of+maturation+in+monkey+prefrontal+cortex.">Parvalbumin-containing chandelier and basket cell boutons have distinctive modes of maturation in monkey prefrontal cortex.</a> J Neurosci. 33 (19), 8352-8358 (2013).</li><li>Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dentate+cannabinoid-sensitive+interneurons+undergo+unique+and+selective+strengthening+of+mutual+synaptic+inhibition+in+experimental+epilepsy.">Dentate cannabinoid-sensitive interneurons undergo unique and selective strengthening of mutual synaptic inhibition in experimental epilepsy.</a> Neurobiol Dis. 89, 23-35 (2016).</li><li>Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dentate+total+molecular+layer+interneurons+mediate+cannabinoid-sensitive+inhibition.">Dentate total molecular layer interneurons mediate cannabinoid-sensitive inhibition.</a> Hippocampus. 25 (8), 884-889 (2015).</li><li>Varga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+fission+of+parvalbumin+interneuron+classes+during+fast+network+events.">Functional fission of parvalbumin interneuron classes during fast network events.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+era+for+functional+labeling+of+neurons:+activity-dependent+promoters+have+come+of+age.">A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age.</a> Neural Circuits Revealed. , 109 (2015).</li><li>Krook-Magnuson, E., Luu, L., Lee, S. H., Varga, C., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ivy+and+neurogliaform+interneurons+are+a+major+target+of+mu-opioid+receptor+modulation.">Ivy and neurogliaform interneurons are a major target of mu-opioid receptor modulation.</a> J Neurosci. 31 (42), 14861-14870 (2011).</li><li>Szabadics, J., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+specificity+of+mossy+fiber+innervation+of+GABAergic+cells+in+the+hippocampus.">Functional specificity of mossy fiber innervation of GABAergic cells in the hippocampus.</a> J Neurosci. 29 (13), 4239-4251 (2009).</li><li>Iball, J., Ali, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoid+Release+Modulates+Electrical+Coupling+between+CCK+Cells+Connected+via+Chemical+and+Electrical+Synapses+in+CA1.">Endocannabinoid Release Modulates Electrical Coupling between CCK Cells Connected via Chemical and Electrical Synapses in CA1.</a> Front Neural Circuits. 5, 17 (2011).</li><li>Chen, X., Cho, D. -. B., Yang, P. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+staining+immunohistochemistry.">Double staining immunohistochemistry.</a> N Am J Med Sci. 2 (5), 241-245 (2010).</li><li>Ranjan, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+detection+of+multiple+antigens+at+single+cell+resolution+using+antibodies+generated+from+the+same+species.">Cellular detection of multiple antigens at single cell resolution using antibodies generated from the same species.</a> Journal of immunological. 379 (1), 42-47 (2012).</li><li>Fuccillo, D. A., Sever, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Concepts in Viral Pathogenesis II. , 324-330 (1986).</li><li>Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolor+fluorescence+immunostaining+technique+for+simultaneous+antigen+targeting.">A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting.</a> Acta Histochem. 107 (2), 143-148 (2005).</li><li>Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+and+morphological+characterization+of+neuronal+microcircuits+in+acute+brain+slices+using+paired+patch-clamp+recordings.">Electrophysiological and morphological characterization of neuronal microcircuits in acute brain slices using paired patch-clamp recordings.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments. (95), e52358 (2015).</li><li>Walz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Patch-clamp analysis : advanced techniques. 2nd edn. , (2007).</li><li>Molnar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Patch-clamp methods and protocols. 403, (2007).</li><li>Martina, M., Taverna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Patch-clamp methods and protocols. , (2014).</li><li>Booker, S. A., Song, J., Vida, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+patch-clamp+recordings+from+morphologically-+and+neurochemically-identified+hippocampal+interneurons).">Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons).</a> J Vis Exp. (91), e51706 (2014).</li><li>Jinno, S., Kosaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+characterization+of+hippocamposeptal+projecting+GABAergic+nonprincipal+neurons+in+the+mouse+brain:+a+retrograde+labeling+study.">Immunocytochemical characterization of hippocamposeptal projecting GABAergic nonprincipal neurons in the mouse brain: a retrograde labeling study.</a> Brain research. 945 (2), 219-231 (2002).</li><li>Yu, J., Proddutur, A., Swietek, B., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Reduction+in+Cannabinoid-Sensitive+Heterotypic+Inhibition+of+Dentate+Basket+Cells+in+Epilepsy:+Impact+on+Network+Rhythms.">Functional Reduction in Cannabinoid-Sensitive Heterotypic Inhibition of Dentate Basket Cells in Epilepsy: Impact on Network Rhythms.</a> Cereb Cortex. , (2015).</li><li>Proddutur, A., Yu, J., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seizure-induced+alterations+in+fast-spiking+basket+cell+GABA+currents+modulate+frequency+and+coherence+of+gamma+oscillation+in+network+simulations.">Seizure-induced alterations in fast-spiking basket cell GABA currents modulate frequency and coherence of gamma oscillation in network simulations.</a> Chaos. 23 (4), 046109 (2013).</li><li>Scharfman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+rat+dentate+neurons+by+morphology+and+electrophysiology+in+hippocampal+slices:+granule+cells,+spiny+hilar+cells+and+aspiny+'fast-spiking'+cells.">Differentiation of rat dentate neurons by morphology and electrophysiology in hippocampal slices: granule cells, spiny hilar cells and aspiny 'fast-spiking' cells.</a> Epilepsy Res Suppl. 7, 93-109 (1992).</li><li>Tasker, J. G., Hoffman, N. W., Dudek, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+intracellular+markers+for+combined+electrophysiological,+morphological+and+immunohistochemical+analyses.">Comparison of three intracellular markers for combined electrophysiological, morphological and immunohistochemical analyses.</a> J Neurosci Methods. 38 (2-3), 129-143 (1991).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Protokol çerçevesinde kritik adımlar biocytin ile yamalı hücreyi Dolum morfoloji tam iyileşme sağlamak için en önemli adımdır. Hücrenin tam iyileşme için, dilimleme sırasında süreçlerin kopardığınızı en aza indirmek için en uygun dilim yönünü seçmek için esastır. Bu yönelim, inceleme altındaki devre ve hücre tipine bağlı olarak farklılık gösterebilir. Daha sonra, biocytin dendrit ve akson yayılmaya için yeterli zaman tanımak esastır. Böyle neurobiotin gibi bazı boyalar, aynı zamanda gap junction aracılığıyla kaydedilmiş hücreye bağlanmış nöronlar nüfuz edebilir. pipet boyutu da soma açılış büyük ve pipet çok küçük olduğunda biocytin yükleme tehlikeye zaman dışarı çekilebilir eğilimi, optimize edilmesi gerekmektedir. Ayrıca, uygun prosedürler tam hücreli modundan avara ederken soma kurtarmak için gereklidir. 24 saat süre ile, kayıt enkübasyondan sonra,PBS, ardından% 4 PFA dilimlerinin dokuların çapraz bağlama immünohistokimya için de önemli olan, düşürülmesini sağlar. 4 ° C&#39;de dilim depolanması da dilim bütünlüğünü korumak için çok önemlidir. Ancak, PFA uzun süreli depolama antikor etiketleme prosedürleri ile nihai başarısını azaltmaktadır. Kalın dokuda uygun penetrasyon için kuluçkalama 5 gün - bu bireysel antikorlar için farklı olacaktır ve bazı antikorlar, 3 isteyebilir primer antikor inkübasyon konsantrasyonu ve süresi optimize etmek önemlidir. Dilimler primer antikor boyama önce hasarsız olduğundan emin olmak için, yeterli bakım kapak kayma çıkarılması sırasında ihtiyaç vardır. Değişiklikler ve Sorun Giderme Biz birinci ve ikinci leke arasında hiçbir set süresi olduğunu gözlemledik. Bölümler aynı doku üzerinde birden fazla boya ile tekrar boyanmış ay sonra olmuştur. İçindeBizim son çalışmalar, biz bu kullanılarak standart immün protokolleri ile yeniden boyama yöntemi kullanılarak işlenir bölümleri karşılaştırıldı ve boyanma veya biocytin sağlamlığı 6,9,25,26 doldurur hiçbir belirgin fark. Bu, test edilecek devam ederken, yeniden boyama doku bütünlüğü tekrar kullanım için sınırlayıcı bir faktör olmak üzere birden fazla kez gerçekleştirilebilir mümkündür. ayrık fluorophores kullanılabilirliği de görüntülenebilir antijenler sayısı için bir sınır teşkil etmektedir. Bu nedenle, doku dikkat kullanımı tavsiye edilir. test edilecek kalır ek bir işlem (yüzey reseptörleri için) antijen kurtarma protokolleri kullanılarak tekrar boyama olduğunu. doku bütünlüğü kapak kayma çıkarıldıktan sonra korunur, biz prosedürü de antijen-kurtarma tavsiye protokolleri boyama çalışması gerektiğini bekliyoruz. Bu bağlamda, fizyolojik kayıtları genellikle bilinen nöro-kimyasal işaretlerin hücreleri elde <sup&gt; 6,9. Burada ayrıntılı prosedürler biocytin immün dayalı morfoloji geri kazanımı için izin verir. Nörokimyasal kimliği bilindiği mümkün olmasa da, olası belirteçler için yeniden boyama morfolojisi ve elektriksel özellikleri temelinde tarif edilmiştir nöronlar için belirteçlerin tanımlanmasını kolaylaştırabilir. Tekniğin Sınırlamalar kalınlığında kesitler üzerinde immunohistokimyasal boyama performans ile ilişkili bir sınırlama özellikle primer antikor standart bir gecede inkübasyon ile, bölümün tam kalınlığı boyunca antikorun yetersiz penetrasyon olduğunu. Ayrıca, biocytin ortaya çıkarmak için kullanılan farklı antikorlar ve streptavidin, diferansiyel doku penetrasyonu olabilir. Nedenle, deneme çalışır antikor penetrasyon derinliğini değerlendirmek ve inkübasyon süreleri, sıcaklıkları değiştirmek için yapılır ve antikor ve Triton &amp; # tavsiye edilir160; amacıyla X-100 konsantrasyonları, her bir antikor için uygun kesit nüfuz etme ve boyama elde etmek. Aynı zamanda, bir antikor ya da streptavidin biocytin ile başarılı markalama bir ikinci antikor bölümü aynı derinliğe kadar nüfuz edeceği anlamına gelmez unutulmamalıdır. Bu nedenle, bakım biocytin-etiketli hücre süreçleri nörokimyasal işaretleyici ile eş-lokalizasyonu için incelenir hangi düzeyine her bir antikorun nüfuz doğrulamak için dikkat edilmelidir. penetrasyon yetersiz ise, dilim immün için &lt;60 mikron yeniden kesitli olabilir. dilim zaten biocytin için işlendi çünkü, hücrenin morfolojisi yeniden kesit sırasında anatomik Olası veri kaybını ortadan kaldırmak ve nöronal yeniden kolaylaştırmak için konfokal görüntüleme ile yakalanan olabilir ki, unutmayın. yaş ve hayvan türleri antikor penetrasyon derecesini değiştirebilir olabilir mümkün olsa da, başarıyla 30- sıçan dokusundaki bu prosedürleri kullandıkgündüz ve 60 günlük fareler üzerinde ve farelerde. İkinci bir kısıtlama biocytin doğal floresan değildir ve kayıt sırasında canlı görüntüleme ve gerçek zamanlı morfolojik karakterizasyonu için kullanılamaz olmasıdır. Alternatif konjüge edilmemiş fluorophores ve Lucifer Yellow hücreleri 27 canlı görüntüleme için kullanılmıştır. Bunlar kalıcı değildir ve kaydedilen nöronun post-hoc nörokimyasal tanımlama için bu pratik hale fiksasyon üzerine floresan kaybedersiniz. Son zamanlarda, biocytin sahip flüoroforlar, bu sınırlamayı aşmak için burada ayrıntılı olarak, canlı görüntüleme için yanı sıra, çift ya da üçlü-etiketleme post-hoc işlem için kullanılabilir tanıtılmıştır. Lucifer Yellow 28 ile karşılaştırıldığında İlginç bir şekilde, şimdiye kadar, biocytin dolgular Birleştirilen elektrofizyolojik ve anatomik çalışmalar için daha iyi elektriksel ve boyama özellikleri ile sonuçlanmıştır. Mevcut Göre Tekniği Önemi /alternatif Yöntemler Burada ayrıntılı protokol kullanmanın önemli avantajları rezeksiyon aksine, biocytin dolu hücre yapısı ve süreçleri değişmeden kalır ve doku kalıcı kaybına yol açmaz, ne birden bölümden zahmetli rekonstrüksiyon için bir ihtiyaç, vardır. Bu nedenle, immunositokimya ve ardından tek hücreli bir dolgu morfolojik yeniden yapılanma ve belirli bir nöro-kimyasal işaretlerin belirlenmesine yardımcı olabilir. Bu Tekniği Mastering sonra gelecek Uygulamalar veya Tarifi Toplamda, biz morfolojisi ve sonrası-hoc çift ve elektrofizyolojik kayıtlar aşağıdaki nöronların üçlü immunolabeling kurtarma için yeni bir pratik bir yaklaşım sunmak. işlem bilgisi geliştikçe, daha önce doldurulmuş görselleştirilebilir ve görüntülenmiştir yeniden değerlendirilmesi nöronlar, yeni işaretleri bulmak için özellikle avantajlıdır. Bu T için özellikle avantajlıdır,O İmmünhistokimya doku ve antikorlar tasarruf hatta aylar sonra hafta gerçekleştirilen veya yapılabilir. yöntem, herhangi bir özel kimyasallar gerektirmez ve güvenli bir şekilde herhangi bir laboratuvarda yapılabilir.

Beyin bireysel nöronal elementlerin yapısal ve işlevsel özellikleri çeşitlilik için bilinir. beyin fonksiyonu ve patoloji farklı nöron tiplerinin rolleri anlamak karakterizasyonu ve nöronların kesin kimlik gerektirir. aksonal arborization desen potansiyel postsinaptik hedefleri tanımlar iken Yapısal, somato-dendritik yere göre tanımlanan morfolojik özellikleri, belirli bir nöron alır potansiyel girişleri belirler. Nöronların yapısal çeşitlilik Ramon y Cajal seminal histolojik çalışmalar 1 günlerinden beri takdir edilmiştir. Tek hücreli kayıt tekniklerinin ortaya çıkışı, yapısal olarak farklı nöron ayrıca fırınlama desen ve sinaptik karakteristikleri bakımından farklılıklar gösterir ortaya koymuştur. Yapı ve fizyolojisi çeşitlilik GABAerjik inhibitör nöronlar 2,3 özellikle belirgindir. Buna ek olarak, bu structurall giderek daha açık hale gelmiştiry benzer nöronlar işlevsel farklılıkları 4 gelen farklı nörokimyasal işaretleri ve gösteri ifade edebilir. Benzer şekilde, aynı nörokimyasal işaretleri ile nöronlar farklı yapılar ve fonksiyonları 5-10 olabilir. Dolayısıyla, uygulamada, ağ nöronların işlev özelliklerinin analizi ve rolü, hem morfolojik ve nörokimyasal kimlik tanımlama gerektirmektedir. Hatta belirli nörokimyasal belirteçleri hedefleyen raportör fare hatları gelişine, o immünohistoloji 11 dayalı morfoloji ve alt tipi kimliğini belirlemek için genellikle gereklidir. akut beyin dilimleri kaydedilen hücreleri karakterize etmek için kullanılan standart yöntem, kayıt sırasında biocytin veya neurobiotin ile doldurun kayıtları aşağıdaki paraformaldehid bölümleri (PFA) düzeltmek ve morfolojisi ve sinir kimyasını ortaya çıkarmak için immünhistokimya kullanmaktır. dilim fizyolojisi için bölümlerin kalınlığı bu yana 300 mikron tipik olarakBir çok antikor bu derinlik tüm yol boyunca nüfuz başarısız daha çünkü veya dilimler biocytin ve nöro-kimyasal işaretlerin 12-14 için eş zamanlı olarak immün izin vermek için 60 um ya da daha az yeniden kesitli olması gerekir. Ne yazık ki, rezeksiyon zahmetlidir; Kesit sırasında doku kaybı riskini; ve morfolojik rekonstrüksiyon komplike doku farklı büzülmeden yol açabilir. Ayrıca, morfoloji ön bilgi hücreleri tarafından ifade edilmesi muhtemeldir aday işaretlerini daraltmak yardımcı olabilir. Biz ilk morfoloji geri kazanımı için ve daha sonra olası nörokimyasal belirteçlerin tanımlanması için bölümlerin seri işleme izin vermek standart biocytin immünohistolojisi protokolleri değiştirdiniz. İmmünohistokimya dokular ya da hücrelerin antijen dağılımının çalışmadır ve bir enzim, floresan etiketler, radyoaktif elementler, veya altın kolloid partiküller 15 ile görselleştirilebilir. prosedür Iözel olarak görselleştirme için birincil antikor hedefleme, ışıltılı ikincil antikorlar kullanılarak, ardından bir veya daha fazla spesifik antijenler, etiket ve yükseltmek için primer antikorlar kullanılarak nvolves. çakışma olmadan her bir ikincil antikorun flüoresans spektrumunu ayırt ihtiyacı nedeniyle, antijenlerin, sadece sınırlı sayıda eş zamanlı olarak kontrol edilebilir. Böylece, morfolojisi ön bilgi hücre sınıflandırma için aday nörokimyasal belirteçleri seçiminde yararlı olabilir. Kavramsal olarak, daha önce lekeli bölümlerinin seri işleme arkasındaki mantık, bir protein veya peptid için immün bir yapısal olarak bağımsız peptid 16 antijenite ve daha sonra immunolabeling engel olmamalıdır prensibine dayalıdır. müdahalenin olmaması, bir antijen üzerindeki belirli bir protein epitopa antikorların bağlanma nedeniyle ve bu nedenle aynı dokuda birden fazla antijene eşzamanlı boyama sağlar. antijenlerin sayısı revealeimmün D floresan ikincil antikor örtüşmeyen spektrumları için olan ihtiyaç ile çapraz reaktivite 17,18 ortadan kaldırmak için, farklı türlerde antikorlarla bağımsız antijenleri hedeflemek için ihtiyaç tarafından sınırlıdır. Bu monte bölümlerde bir veya birden fazla antijenler için immunolabeling tamamlandıktan sonra rapor edilmemiştir ikinci bir antijen için immün, bildiğimiz kadarıyla, etkileşebilir iki ayrı antikorlar ile seri ziyade eş zamanlı etiketleme arkasındaki mantık iken. Burada, daha önce boyanmış ve monte edilmiş bölümlerinin seri immün için bir yöntem tarif eder. detaylardaki kalınlığında kesitler protein / peptid belirteçleri için boyanarak, ardından morfolojisinin geri kazanımı için bir seri immün prosedürü için bu işlemi yaparken, aynı işlemler ince histolojik kesitler de bir standart olarak kullanılabilir. Buna ek olarak, biocytin ve çıkarmak için işlem ile kaydedilen nöronların doldurmak için pratik bir yaklaşım tarifBizim son çalışma 6,8 sunulduğu gibi kayıtların tamamlanmasından sonra hücreden elektrot, akson ve nöronların dendritik milleri doldurulmasını optimize etmek. Burada anlatılan prosedürün en önemli avantajı kaydedilen hücrenin morfolojisi tamamen iyileşti ve rezeksiyon veya dilimler immunostain çalışmadan önce görüntülü olabilir olmasıdır. Bazı antikorların penetrasyonu ile ilgili sorunlar ikincil immün için rezeksiyon dilimleri gerekli hale olsa da, burada ayrıntılı prosedürler birden fazla bölüm karmaşık nöronlar yeniden ihtiyacını ortadan kaldıracaktır ve yeniden tehlikeye hangi doku kaybı ve diferansiyel büzülmesine bağlı sorunları önleyeceğini geriden kestirmeye et. Bir avantajı süreci immün ve biocytin dolu nöronlar kurtarıldı edildiği dilimleri yeniden kesit sınırlayarak maliyet, zaman, çaba ve pahalı antikorların azaltılması olacaktır. En pratik yönü reklamdırYukarıda belirtilen teknik kullanılarak daha önce kesitler lekeli ay yapılabilir ditional immün. Özellikle, morfoloji kurtarma ölçüde hücrelerden fizyolojik veriler nedeniyle hücre tipi bir temel morfolojik karakterizasyon elde etmek için bir yetersizlik atılır bu potansiyeli azaltacaktır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="898">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">NaCl&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:203px;">&#160;S7653</td>
			<td style="width:151px;">Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCL&#160;</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60129</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Na2HPO4&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">KH2PO4&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>229806</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guinea pig anti CB1&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Af530-1</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mouse anti CCK</td>
			<td>CURE, UCLA</td>
			<td>courtesy of G. Ohning</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rabbit anti Parvalbumin</td>
			<td>Swant</td>
			<td>PV27</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptavidin, Alexa Fluor conjugate</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S11227</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Normal goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vectashield&#160;</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibodies</td>
			<td>Invitogen Molecular probes</td>
			<td>Alexa Fluor conjugated dyes</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Labnet orbit low speed shaker</td>
			<td>Bioexpress</td>
			<td>S-2030-LS</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11231-30</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Slide folders</td>
			<td>EMS</td>
			<td>71520</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vibratome VT 1200 S</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14048142066</td>
			<td>Electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multiclamp 700B amplifier</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>Multiclamp 700B</td>
			<td>Electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pCLAMP 10 Software</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>pCLAMP 10&#160;</td>
			<td>Electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Digidata 1440 digitizer</td>
			<td>Electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter tips</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>171-0020</td>
			<td>Electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-335-100</td>
			<td>Electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microloaders</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td>Electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biocytin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4261</td>
			<td>Electrophysiology</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunostaining of biocytin-filled and processed sections for neurochemical markers

yama kelepçe tekniğiyle hücreleri elektrofizyolojik kayıtları ateş şekillerine göre, farklı nöronal türlerinin tanımlanması için mümkün hale gelmiştir. Kayıt elektrot biocytin / neurobiotin dahil dendritik arborization ve kaydedilen nöronların akson hedef bölgeleri belirlemek için gerekli olan morfolojik detaylar, post-hoc kurtarma izin verir. Bununla birlikte, farklı bir nörokimyasal kimlikleri ve işlevleri, hücre tipi özel proteinler için immünohistokimyasal boyama ile morfolojik olarak benzer nöronların varlığı göz önüne alındığında kesin nöronlar tespit etmek şarttır. Ağ bağlantısı sağlamak için, fizyolojik kayıtlar için beyin kesitleri 300 um ya da daha büyük bir kalınlıkta hazırlanır. Ancak, bu kalınlık genellikle doku geriden kestirmeye gerektiren nedeniyle antikor penetrasyon ile ilgili sorunlar immünohistolojik postprocessing engellemektedir. dilim rezeksiyon genellikle resul, zorlu bir sanattırdoku ve hücre morfolojisi kaybına ting başka elektroifzyolojik veriler gereksiz verilerin işleme elde edilmiştir. nöronal belirteçlerin seçiminde veri kaybı ve rehber sınırlayacak morfoloji kurtarma yana, ikincil immün tarafından takip ilk hücre morfolojisi kurtarma stratejisini, kabul ettiler. Biz fizyolojik kayıtları ve nörokimyasal kimliğini belirlemek için bölümlerin restaining ardından morfoloji geri kazanılması için daha sonraki seri immün sırasında dolum biocytin için pratik bir yaklaşım getirmektedir. Biz, (PFA) paraformaldehid ile sabitlendi, koyulaştınldı ve kaplandı biocytin ile doldurulmuştur bölümleri ayrılmış ve daha sonra, ikinci bir birincil antikor gün ile tekrar boyanmış olabilir bildirmektedir. Bu restaining lamel kaldırılmasını, bir tampon çözelti içinde bölümlerin yıkama ve nörokimyasal kimlik ortaya çıkarmak için birincil ve ikincil antikorlar kuluçka içerir. yöntem, DAT ortadan kaldırmak için avantajlıdırmorfolojisi kurtarmak için bir yetersizlik nedeniyle ve nörokimyasal belirteçlerinin daraltarak için bir kayıp morfolojiye göre test edilecek.

başarı ile tamamlayan bölümler biocytin dolgu ve immün 2. adımda gerçekleştirilen ve konfokal veya Epifloresans mikroskopi kullanılarak görüntülü olabilir korur. Buna ek olarak, işleme bölümleri de Şekil 2&#39;de gösterilen bölümde 3. adımda takip eden işlemler sırasında etiketli antijen için immün gösterir, kalın bir bölüm (300 um) bir biocytin doldurulmuş nöron morfolojisi streptavidin kullanılarak ortaya çıkarılmıştır kırmızı ve ilk birincil (CB 1 R) görüntülenmiştir yeşil görüntülendi. İlk immün PFA fiksasyon 7 gün içerisinde gerçekleştirildi. Dilim CCK antikor yeniden boyama önce konfokal mikroskop kullanılarak ve iki aylık bir süre için saklanabilir sulu yapıştırma vasatı içerisinde monte edilmiştir. Aksonal milleri (Şekil 2E) de dahil olmak üzere kaydedilen nöron morfolojisi, Not, konfokal görüntüleri o yeniden inşa edildiİlk boyama işleminden sonra btained. CB 1 R immünoreaktivitesinde ile akson ko (Şekil 2 F - H) fizyolojik çalışmalara dayanan bekleniyordu. CCK ikinci boyama iki ay ilk boyama işlemi sonrasında bölümlerinde gerçekleştirilmiştir. CCK uzak-kırmızı görüntülenmiştir ve görselleştirme için mavi pseudo-boyandı. Benzer şekilde, Şekil 3, (Şekil 3A1) biocytin-etiketleme ortaya çıktı ve kalın bölümdeki görüntülenmiş olan bir hücrenin bir örneğini göstermektedir. Nöronun iç kaynaklı fizyolojisi Şekil 3A2 de gösterilmiştir. Dilim dendritik süreçleri içeren bazı bölümleri kayıp olmasına rağmen, soma içeren bölüm (Şekil 3B1) kurtarıldı, 50 mikron yeniden kesitli edildi ve. İnce bölümün sonraki CCK immün biocytin etiketli soma yeşil CCK ifadesi gösterdi. sulu bir ortamda, kalın dilim Montaj e önlerxcessive doku büzülme. Ortalama olarak, 300 um&#39;lik kesitler, montajdan sonra bir hafta ölçüldüğünde sulu ortam yaklaşık 25.67 ±% 3.14 (n = 5 dilim) küçülecek kullanılarak monte edilebilir. Böylece, kalın kesitler sulu ortam kullanılarak monte rezeksiyon için izin ~ 225 mikron. Birkaç kontrol çalışmalarda, ikinci kez immunolabeling süreci antikor non-spesifik etiketleme yol olmadığını teyit edilmiştir. Örneğin, parvalbumin (SV) CCK immünoreaktivitesi hipokampal nöronlar birbirinden bağımsız olduğu bilinmektedir. Biocytin (kırmızı) ve CCK (yeşil) ilk immün basamak (2) (mavi 405 nm&#39;de ve emisyon eksitasyon) parvalbumin ikinci etiketleme ve ardından edildiği Kontroller örtüşmeyen ekspresyon modelleri (Şekil 4). Buna ek olarak, belirli nörokimyasal belirteçler ifade nöronlar ayırt edici laminer aksonal boyanma (PV, CCK, CB 1 R) seria tarafından değiştirilmiş değill yeniden boyama işlemleri (Şekil 2-4). Üstelik, ikinci boyama, sürekli fizyolojik kayıtları temelinde beklenen nöro-kimyasal işaretlerin ile biocytin doldurulmuş nöronların eş etiketleme saptandı. Böylece, restaining işlemi etiketleme özgüllük kaybına yol değildir inanıyoruz. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54880/54880fig4.jpg" /> Şekil önce immün boyamayı izleyen ve Bölüm montajı İkinci immün boyanma üzerinde karşılıklı olarak özel Belirteçleri arasında Overlap 4. eksikliği. (A - C) okla gösterilen yeşil (B) &#39;de bir ok ve CCK immunoreaktivitesi ile belirtilen kırmızı bir biocytin doldurulmuş nöron (A) gösteren 10X konfokal ve görüntüler. üst üste binme olmaması dikkat edin. Aynı bölüm 2 aydan fazla (C) sonra mavi immün parvalbumin (PV) için işlendi. ovgörüntülerin erlay D &#39;de gösterilmiştir. PV aksonlar beklenen örtüşmeyen desen molekül tabakasında CCK ile tanecik hücre katmanlarında dağıtılır unutmayın. Ayrıca nöron somata her iki işaretleyicinin bir yardımcı sınırlama olmaması not edin. sağa Yakınlaştırılmış görüntüler biocytin etiketli nöron PV (ok başı) ve CCK (ok) ifade ettiğini göstermektedir. Ölçek çubuğu: 100 mikron (A - D), 20 mikron (sağ paneller). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54880/54880fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> doldurur sub-optimal biocytin için yaygın bir nedeni hücre yaklaşırken kayıt pipet ile nöronal süreçlerin yanlışlıkla kesilmesi olduğunu. Şekil 1 (yeşil ok) &#39;de gösterildiği gibi bir hücrenin bir kayıp uzantısı, bir akson sonunda biocytin bir kabarcığın olarak görünür. Aksonal bleb birkimin aksonlar dilimleme işlemleri sırasında kopmuş olabilir yüzeysel hücreler, yama çoğu zaman görüntülenmiştir yeniden. Ancak, dilimleme ve hedeflenen hücre sınıfının aksonal dağılım paterni bilgisi uçağın optimizasyonu bir akson bleb görünümü elde, ayrıca akson sever olabilir varsayılan akson, yönünden soma yaklaşan kaçınarak yardımcı olabilir . çoğu hücre tiplerinde, Z ekseni (işareti beyaz ok) boyunca hücre gövdesi yaklaşım tercih edilir. hücreyi yaklaşırken ikinci bir konu pipet aşırı pozitif basınç uygulanmasını ilgilidir. Bu sadece hücre ve bağlantılarını zarar değil, aynı zamanda yüksek eşiğe yol açan hücrenin çevresindeki dökmek için biocytin içeren iç çözümü neden olamaz. Hücreyi yaklaşım için harcanan zaman uzun veya arka plan boyama da artar dilim kalitesi hücresel morfoloji (Şekil 5A tanımlama yeteneği tehlikeye hangi optimal olmadığında). Pipet yerinden oynatmamaya ederken soma çekin mümkündür. Bu somatik morfoloji eksikliği (Şekil 5B) neden olur. hücreyi çekerek önlemek için, manipülatör &quot;iyi&quot; hareket ayarlarını kullanarak küçük adımlarla yukarı ve dışarı pipet hareket ettirin. Hücre uzun bir membran uzantısı, musluk / fiske ile pipet manipülatör bağlı görünüyorsa yavaşça hücreden pipet çıkarmak için. Hücre tamamen yerinden kadar kaba manipülatör ayarlarını kullanmaktan kaçının. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54880/54880fig5.jpg" /> Şekil 5. Görüntüler Başarısız Biocytin doldurur Illustrate. Zayıf hücre görüş sonuçlanan kayıt pipet aşırı pozitif basınç, yüksek arka plan floresan gösteren (A) Görüntü. aksonlar dahil nöronal süreçlerin, ince yapıları, inci bölge ötesinde canlandırırlare dökülme. Ayrıca, soma çekti olmuştur dikkat edin. Soma ile (B) nöron pipet dekolmanı sırasında çıkardı. Oklar soma ise, akson ve dendritler başarılı dolguları göstermek ve oklar yakın kurtarıldı değil uzantıları. (C) dilim yüzeysel tabakasında yamalı bir hücre (yüzeyden &lt;50 mikron) kesim akson ve dendrit (ok başları) sergileyen dolu hücrelerde sonuçları. Kötü hücre sağlığı (C) gösteren granül hücre dendritlerinin boncuk (oklar) dikkat edin. Ölçek çubuğu: 50 mikron. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54880/54880fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Son olarak, kopmuş akson veya dendritler olmadan hücresel morfoloji kurtarmak için, o dilim yüzeyine derin hücre&gt; 50 mikron hedef en iyisidir. Yüzeysel hücreler olan süreçleri olabilirkesilmiş ve sinaptik girdilerin normal tamamlayıcı olmayabilir. tekrar boyama işlemlerinde en çok tuzaklar lamel çıkarılması ve dokuya zarar vermeden bölümün geri kazanımı ile ilgilidir. gece boyunca inkübe zaman ikinci bir konu, özellikle, kalın dokuya antikor penetrasyonu ile ilgilidir. Pek çok durumda, iyi nüfuz soğuk bir odaya yerleştirilmiş bir orbital çalkalayıcı üzerinde 4 ° C de en fazla 72 saat için primer antikor, inkübasyon yolu ile elde edilmiştir. 24 nüfuz da antikor yardımcı olabilir% 1 Triton-X100 - Her ne kadar primer antikor inkübasyon süresi uzatan ya da 0.5 deterjan konsantrasyonunu arttırarak, doku antikor penetrasyon sağlamak için en etkili yöntemdir yeniden kesit. En kaydedilen nöronlar 50 içinde yer almaktadır beri - bölümün yüzeyinden 100 um, biz kalın kesitlerin boyanması biocytin etiketlemek için yeterli olduğunu bulmakBu seviyede -filled SOMATA veya işlemler. Ancak, antikor etiketleme ölçüde olumsuz ko-lokalizasyon sonuçları yorumlama önce her bölümde kontrol edilmesi tavsiye edilir.

Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers at JoVE.com

Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers

Bu protokol, biocytin doldurma ve sonraki immünohistokimyasal Postprocess kullanılarak elektrofizyolojik kayıtları sırasında yamalı nöronların morfolojik geri kazanılması için bir yöntem sunulur. Biz, lekeli ve kaplandı kalınlığında biocytin dolu bölümler, daha sonra ikinci bir birincil antikor gün ya da ay ile tekrar boyanmış edilebileceğini göstermektedir.

Nörokimyasal markerleri Biocytin dolu ve İşlenmiş Bölümler immün

Electrophysiological recordings of cells using the patch clamp technique have allowed for the identification of different neuronal types based on firing ...

immunostaining-biocytin-filled-processed-sections-for-neurochemical

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

22.9K Görüntüleme.  Rutgers New Jersey Medical School.  Bu protokol, biocytin doldurma ve sonraki immünohistokimyasal Postprocess kullanılarak elektrofizyolojik kayıtları sırasında yamalı nöronların morfolojik geri kazanılması için bir yöntem sunulur. Biz, lekeli ve kaplandı kalınlığında biocytin dolu bölümler, daha sonra ikinci bir birincil antikor gün ya da ay ile tekrar boyanmış edilebileceğini göstermektedir. 

Video: Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

Çift Floresans In situ Taze Beyin Bölüm Hibridizasyon

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Nörobilim

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor functions. Most investigations of sensorimotor mechanisms rely on either examination of neurons while an animal is static1,2 or record extracellular neuronal activity during a movement.3,4 While these studies have provided the fundamental background for sensorimotor function, they either do not evaluate functional information which occurs during a movement or are limited in their ability to fully characterize the anatomy, physiology and neurochemical phenotype of the neuron. A technique is shown here which allows extensive characterization of individual neurons during an in vivo movement. This technique can be used not only to study primary afferent neurons but also to characterize motoneurons and sensorimotor interneurons. Initially the response of a single neuron is recorded using electrophysiological methods during various movements of the mandible followed by determination of the receptive field for the neuron. A neuronal tracer is then intracellularly injected into the neuron and the brain is processed so that the neuron can be visualized with light, electron or confocal microscopy (Fig. 1). The detailed morphology of the characterized neuron is then reconstructed so that neuronal morphology can be correlated with the physiological response of the neuron (Figs. 2,3). In this communication important key details and tips for successful implementation of this technique are provided. Valuable additional information can be determined for the neuron under study by combining this method with other techniques. Retrograde neuronal labeling can be used to determine neurons with which the labeled neuron synapses; thus allowing detailed determination of neuronal circuitry. Immunocytochemistry can be combined with this method to examine neurotransmitters within the labeled neuron and to determine the chemical phenotypes of neurons with which the labeled neuron synapses. The labeled neuron can also be processed for electron microscopy to determine the ultrastructural features and microcircuitry of the labeled neuron. Overall this technique is a powerful method to thoroughly characterize neurons during in vivo movement thus allowing substantial insight into the role of the neuron in sensorimotor function.

A technique is described to quantify the in vivo physiological response of mammalian neurons during movement and correlate the physiology of the neuron with neuronal morphology, neurochemical phenotype and synaptic microcircuitry.

Hareketi tarafından Modülasyonlu Nöronlar Fizyolojik, Morfolojik ve nörokimyasal Karakterizasyonu

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the retinal ganglion cell layer (RGCL) in rat models with N-methyl-D-aspartate (NMDA)&#x2013;induced excitotoxicity1, retinal ischemia-reperfusion injury2 and glaucoma3. Reduction of INL and inner plexiform layer (IPL) thicknesses were reversed with citicoline treatment in rats' eyes subjected to kainic acid-mediated glutamate excitotoxicity4. Alteration of RGC density and soma sizes were observed with different drug treatments in eyes with elevated intraocular pressure3,5,6. Therefore, having objective methods of analyzing the retinal morphometries may be of great significance in evaluating retinal pathologies and the effectiveness of therapeutic strategies.
The retinal structure is multi-layers and several different kinds of neurons exist in the retina. The morphometric parameters of retina such as cell number, cell size and thickness of different layers are more complex than the cell culture system. Early on, these parameters can be detected using other commercial imaging software. The values are normally of relative value, and changing to the precise value may need further accurate calculation. Also, the tracing of the cell size and morphology may not be accurate and sensitive enough for statistic analysis, especially in the chronic glaucoma model. The measurements used in this protocol provided a more precise and easy way. And the absolute length of the line and size of the cell can be reported directly and easy to be copied to other files. For example, we traced the margin of the inner and outer most nuclei in the INL and formed a line then using the software to draw a 90 degree angle to measure the thickness. While without the help of the software, the line maybe oblique and the changing of retinal thickness may not be repeatable among individual observers. In addition, the number and density of RGCs can also be quantified. This protocol successfully decreases the variability in quantitating features of the retina, increases the sensitivity in detecting minimal changes.
 	This video will demonstrate three types of morphometric analyses of the retinal sections. They include measuring the INL thickness, quantifying the number of RGCs and measuring the sizes of RGCs in absolute value. These three analyses are carried out with Stereo Investigator (MBF Bioscience &mdash; MicroBrightField, Inc.). The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

This video demonstrates three types of morphometric analyses of the retina, which include measuring the inner nuclear layer thickness, quantifying the number of retinal ganglion cells (RGCs) and measuring the sizes of RGCs. The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

Retina Bölüm morfometrik Analizleri

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

Deri ve Kol ve bacak kemikleri innerve Fare Duyusal Sinir Lif doku hazırlanması ve immün

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Sıçan Santral Sinir Sistemi immunohistokimyasal Analizi ve Çevresel lenf nodu Doku Bölümler

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

İlköğretim nöron değerlendirilmesi<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyolar kullanarak immün

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Koku Meşfatının Olfaktör Duyusal Akson Moleküler Kimlik Kodlarının Görselleştirilmesi İçin Dörtlü İmmün Sulanması

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology

Peripheral nerves extend throughout the body, innervating target tissues with motor or sensory axons. Due to widespread distribution, peripheral nerves are frequently damaged because of trauma or disease. As methods and strategies have been developed to assess peripheral nerve injury in animal models, function and regeneration, analyzing the morphometry of the peripheral nerve has become an essential terminal outcome measurement. Toluidine blue staining of nerve cross sections obtained from resin embedded nerve sections is a reproducible method for qualitative and quantitative assessments of peripheral nerves, enabling visualization of morphology number of axons and degree of myelination. This technique, as with many other histological methods, can be difficult to learn and master using standard written protocols. The intent of this publication is therefore to accentuate written protocols for toluidine blue staining of peripheral nerves with videography of the method, using sciatic nerves harvested from rats. In this protocol, we describe in vivo peripheral nerve fixation and collection of the tissue, and post-fixation with 2% osmium tetroxide, embedding of nerves in epoxy resin, and ultramicrotome sectioning of nerves to 1-2&#956;m thickness. Nerve sections then transferred to a glass slide and stained with toluidine blue, after which they are quantitatively and qualitatively assessed. Examples of the most common problems are shown, as well as steps for mitigating these issues.

Here we present a protocol to visualize fine structures of peripheral nerves by obtaining and staining 1-2 &#181;m sections with toluidine blue

Toluidin Blue reçine gömülü bölümlerini periferik sinirleri morfoloji değerlendirme için boyama

Peripheral nerves extend throughout the body, innervating target tissues with motor or sensory axons. Due to widespread distribution, peripheral nerves ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

Primer Nöral Kök ve Progenitor Hücrelerinin Hücre Yüzey Belirteçlerinin Sialoglycan'ın Metabolik Etiketlemesi ile Belirlenmesi

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical conduction. Myelin alteration has been shown to occur in various neurological diseases, where it is associated with functional deficits. Here, we provide a detailed description of an ex vivo model consisting of mouse organotypic cerebellar slices, which can be maintained in culture for several weeks and further be labeled to visualize myelin.

Here we present a method to prepare organotypic slice cultures from mouse cerebellum and myelin sheath staining by immunohistochemistry suitable for investigating mechanisms of myelination and remyelination in the central nervous system.

Hazırlık ve Immunostaining Myelinating Organotypic serebellar dilim kültürlerin

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...