Os autores gostaria fizeram instalações de microscopia Jenkins na Universidade de Wyoming para a ajuda deles e os membros do laboratório Bushman, Kelly Roballo, Hayden True, Wupu Osimanjiang e Dhunghana eleomar, para assistência em cuidados com animais. Esta publicação foi tornada possível através de um prêmio de desenvolvimento institucional (ideia) do Instituto Nacional de General Medical Ciências, do institutos nacionais da saúde sob Grant # 2P20GM103432.

Utilizaram-se ratos Sprague Dawley adulto neste projeto e todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de uso e cuidados com animais institucional Universidade de Wyoming.
1. cirurgia e na fixação de nervo Vivo
Nota: Informações do fornecedor para todos os materiais e equipamentos utilizados no presente protocolo são listados na Tabela de materiais.
Nota: Fixação do nervo na vivo é usada para preservar o tecido e reduzir a degradação estrutural que pode ocorrer entre o momento da morte e a coleção dos nervos. Fixação de tecidos in vivo é uma prática padrão para a preparação do tecido do sistema nervoso para histologia, onde a perfusão geralmente é um precursor para isto. A colocação e o tamanho dos nervos periféricos permitido para fixação in situ. Não recomendamos coleção e fixação do tecido após a eutanásia devido à possibilidade de degradação de tecidos.
<ol><li>Preparar o rato para anestesia geral, colocando-o em uma câmara de indução com 2-3% de isoflurano, em seguida, coloque o rato anestesiado de bruços em cima de uma esteira de dissecação e mantenha 1-2% de isoflurano através do cone de nariz anestésica. Para garantir a adequada profundidade da anestesia, teste de animais para a retirada de pedal para as patas e verificar a ausência de reflexos palpebrais os olhos tocando o canto medial do olho. Nota: Injeção Intraperitoneal de cetamina é uma alternativa comumente usada para isoflurano inalado.</li>
	<li>Para expor o nervo ciático, raspar o cabelo da hind limb(s) e limpar as áreas depiladas com etanol a 70%. Com um bisturi ou tesoura, faça uma incisão de 2-3 cm na pele ao longo do membro posterior do joelho até o trocanter maior, onde a palpação do fêmur com o bisturi estéril para assegurar a localização adequada da incisão. O fêmur situa-se imediatamente proximal ao segmento mais acessível do nervo ciático. Mesmo que esta é uma cirurgia não-sobrevivência, manter técnicas estéreis.</li>
	<li>Depois de fazer a incisão da pele, localizar o avião entre os músculos bíceps femoral e o músculo glúteo máximo e usando uma tesoura microdissection separados da fáscia subjacente e expor 2-3cm do nervo ciático de sublinhado. Para expor uma clara secção do nervo ciático, use um afastador para alargar o fosso entre os dois músculos (figura 1A). Com pinça fina e tesoura de íris, separe com cuidado o nervo do tecido conjuntivo, tomando muito cuidado para não comprimir ou cortado o nervo circundante.</li>
	<li>Adicione o fixador do Trump suficientes (formol 4%, 1% de glutaraldeído em 1X PBS (solução salina tamponada fosfato) com 1,16 g de NaH2PO4· H2O, por 100 mL) na cavidade que contém o nervo exposto, para cobrir a lata e deixe descansar por 10 min. Se necessário, lugar de gaze sob o hind perna melhorar o ângulo para que mais fixador pode ser adicionado na cavidade. Retire o fixador após 10 min e repita mais duas vezes.</li>
	<li>Usando um microscópio de dissecação, cortou o nervo de ambos os lados com uma tesoura bem dissecação, certificando-se não esticar ou beliscar o nervo ciático e imediatamente colocar as seções de nervo em tubos de 15 mL contendo fixador do Trump a 4 ° C, durante uma semana, alterando o fixador a cada 48 h.</li>
	<li>Não abandone animais durante qualquer parte do procedimento cirúrgico. Após a remoção do nervo, eutanásia em animais por deslocamento cervical sob anestesia.</li>
</ol>2. tratamento tetróxido de ósmio e a incorporação de resina
<ol><li>Fixação de postar, cuidadosamente remover qualquer gordura restante e tecidos conjuntivos do nervo e usar um bisturi afiado para cortar o nervo em segmentos de aproximadamente 5 mm de comprimento (nervo segmentos podem ser separados e etiquetados em tubos de diferentes). Tetróxido de ósmio fresco 2% diluído em solução fixador do Trump de preparar e manter em um tubo de vidro. Mergulhe os segmentos nervosos em tetróxido de ósmio de 2% por 2 h, que pode ser em tubos de plástico para este curto período de tempo. Nota: Alguns tubos de plástico reagem com tetróxido de ósmio, causando um escurecimento da solução, por armazenamento prolongado de tetróxido de ósmio em tubos de plástico não é recomendado.</li>
	<li>Usando um kit de médio a incorporação de epóxi, prepare a fórmula final de incorporação:<ol>
<li>Misture a cola epoxy incorporação médio com solução DDSA (anidrido dodecenylsuccinic; mistura A) e misture o epóxi incorporação médio com solução NMA (anidrido methylnadic; mistura B). Deixe ambas as misturas A e B misturam pelo menos 20 min por agitação com um agitador magnético.</li>
		<li>Imediatamente antes do uso, misture a mistura A e B e adicione o acelerador do DPM-30 (2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol) na proporção de 1,5 a 2,0% do volume total da mistura. Observe que a solução do DPM-30 deve ser medida precisamente para impedir que o bloco se tornando escuro na cor e quebradiços. Todos os produtos químicos de resina são tóxicos; Tome cuidado extra para evitar o contacto com a pele ou por inalação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando tubos de 1,5 mL, lavar segmentos nervosos com PBS e iniciar o processo de desidratação, colocando os segmentos nervosos em acetona/destilada diferentes passagens de água: 30%, 60%, 90%, as concentrações de 10 min cada e, em seguida, em 100% de acetona por 10 min cada por 3 vezes.  Observe que o etanol pode ser usado no lugar da acetona.</li>
	<li>Para a infiltração de resina, coloque os segmentos nervosos em uma mistura de 1 parte de mistura de incorporação final e 1 parte 100% acetona por 30 min, em seguida, em uma mistura de 2 partes de mistura de incorporação final e 1 parte 100% acetona por 30 min , e finalmente o lugar do nervo segmentos na final incorporação mistura por 30 min.</li>
	<li>Colocar os segmentos nervosos em borracha de silicone, moldes de incorporação (tenho usado o comprimento de 106 mm x 71 mm de largura x 7 mm de profundidade; bloquear tamanho 11 mm de comprimento x 6 mm de largura x 3 mm de profundidade). Adicione delicadamente a resina em cima dos nervos, certificando-se de cobrir os segmentos todo nervo e evitar bolhas de ar. Deixe o molde contendo segmentos nervosos com a resina para polimerizar a 60 ° C durante a noite.</li>
</ol>3. corte por Ultramicrotome
<ol><li>Facas de vidro usando uma máquina de faca de vidro (figura 1B) de preparar e fazer facas de vidro com barcos (Figura 1), que são usados para recolher seções de nervo que flutua na água destilada.</li>
	<li>Resina de lugar incorporado bloqueios no porta-ultramicrotome com a trapezoidal virados para cima. Usando o escopo de ultramicrotome, apare qualquer excesso de resina ao redor do tecido nervoso e fazer com que o bloco de enfrentar uma forma trapezoidal e quanto perto da superfície longitudinal do nervo possível usando uma único-lamina, como uma lâmina de barbear. Não penetram a superfície longitudinal do segmento do nervo, que é reconhecido por sua coloração escura por tetróxido de ósmio. Nota: Remoção de excesso de resina irá reduzir a área de resina para ser seccionado e melhorar o desempenho da lâmina e corte em etapas subsequentes.</li>
	<li>Usando o ultramicrotome, fazer várias seções de cruz suficientes para expor uma superfície uniforme de seção transversal do tecido nervoso usando uma faca de vidro liso. Depois disso, alterne para uma faca de vidro cujo barco é preenchido com água destilada à temperatura ambiente e ajustar o ultramicrotome para 1-2 μm para cortar seções finas.</li>
	<li>Transferi flutuantes seções finas do barco de faca de vidro para uma gota de água deionizada na lâmina de vidro usando metal loop (Figura 1). Secar slides contendo seções passando várias vezes sobre uma chama por alguns segundos, certificando-se de não superaquecer as seções. Mancha secadas seções imediatamente com toluidina azul ou armazenar à temperatura ambiente durante vários dias antes da coloração. Nota: As seções podem também ser secadas usando um prato quente a 60 ° C por 15 min. Um processo de secagem lento faz com que as seções suave.</li>
</ol>4. azul de toluidina coloração
<ol><li>Preparar a solução de azul de toluidina 1% pela dissolução de 2 g de borato de sódio em 100 mL de água desionizada, em seguida, adicionar 1 g de azul de toluidina e mexa até dissolver. Filtrar a solução usando papel de filtro (reduz o tamanho dos poros: 11 µm) e manter a solução em um frasco opaco em temperatura ambiente por até duas semanas.</li>
	<li>Utilizando uma pipeta plástica ou micro pipeta, adicione uma gota de solução de azul de toluidina no topo as seções de nervo e deixar por 20-30 s.</li>
	<li>Enxaguar com solução de azul de toluidina todo excesso mergulhando suavemente as lâminas em frasco de água desionizada e repita 3 - 4 vezes até seções são claras. Seque o slides pelo menos 15 min a 60 ° C, ou durante a noite à temperatura ambiente e em seguida, cubra as seções com uma lamela utilizando o meio de montagem regular. Examinar os slides montados imediatamente ou armazenar à temperatura ambiente.</li>
	<li>Examine sob um microscópio de luz. Uma lente de imersão de óleo X 100 é recomendado para imagens detalhadas, usadas para calcular índices de g.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zacchigna, S., Ruiz de Almodovar, C., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarities+between+angiogenesis+and+neural+development:+What+small+animal+models+can+tell+us.">Similarities between angiogenesis and neural development: What small animal models can tell us.</a> Current Topics in Developmental Biology. 80, 1-55 (2008).</li><li>Grinsell, D., Keating, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve+reconstruction+after+injury:+A+review+of+clinical+and+experimental+therapies.">Peripheral nerve reconstruction after injury: A review of clinical and experimental therapies.</a> BioMed Research International. 2014, 1-13 (2014).</li><li>Chen, M. B., Zhang, F., Lineaweaver, W. 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Os autores declaram que têm não há conflitos de interesse.

Exames das estruturas morfológicas da lesão de nervo periférico e regeneração são temas frequentes de estudo13. Este protocolo, descreveremos os passos para obter imagens de alta qualidade para quantificações dados histológicos utilizando tecido de nervo ciático rato incorporado em blocos de resina e corados com azul de toluidina. Esta técnica fornece uma imagem da morfologia do nervo em que a regeneração do nervo pode ser quantificada através da medição do número de axônios, grau de mielinização, presença de tecido fibrótico infiltrativa e os nervos de saúde. Enquanto as imagens mostram o seccionamento e transformação dos nervos ilesos como amostras, o mesmos passos e materiais são aplicáveis aos nervos feridos e nervos regenerados com conduítes ou tecido enxertos, desde que a fixação do tecido é adequado20, 21.
Enquanto todas as etapas do protocolo são essenciais, alguns destes passos são mais propensos a levar a seções de má qualidade ou imagens. Desidratação de tecido insuficiente pode provocar furos nas seções de nervo (Figura 5B). Uma possível explicação é a rugosidade da resina com água, e o excesso de água no tecido impede que resina infiltrando o tecido. Portanto, permitir tempo suficiente e o uso de acetona absoluto é essencial para assegurar a etapa de desidratação adequada. Embora usamos acetona no presente protocolo, o etanol também pode ser usado. Muitas resinas, no entanto, não são reativas com etanol, para que o tecido deve ser tratado com óxido de propileno para servir como uma transição entre a desidratação do etanol e a incorporação de resina.
Devido a magreza das seções, a transferência de seções de nervo da faca de vidro para a lâmina de vidro deve ser feito com muito cuidado (Figura 5). 1-2 μm seções são muito frágeis, e indevida transferência da seção poderia causar a seção quebrar. Se a seção é captada na porção central da seção com uma agulha, a seção é propensa à dobra-se si mesmo e muitas vezes será difícil desdobrar quando transferido para o slide. Diferentes ferramentas podem ser usadas para a transferência de seção para a lâmina de vidro, incluindo agulhas e loops, e cada um deve ser testado para o usuário específico determinar que renderá a transferência de melhor resultados. Para os nossos propósitos, usando um loop que pode abranger toda a seção muito reduzida a dobradura das seções quando eles foram transferidos para a faca de vidro para o slide de microscópio (Figura 1).
Em geral, manuseio adequado dos nervos é essencial, como compressão dos nervos pode causar rachaduras que ocorrem nas seções de nervo (Figura 5A). Compressão de tecido do nervo pode acontecer durante a transferência de segmentos nervosos nos processos de exposição no animal, fixação, desidratação e incorporação de resina. Para evitar a compressão do tecido de nervo, segmentos nervosos devem ser transferidos por pinça fina e pegou em uma das extremidades do segmento idealmente por apenas a camada epineurial, então a lata inteira não será afectada. A presença de rachaduras e linhas (marcas de faca) nas seções do nervo também pode ocorrer devido a facas de vidro fosco ou em demasia. Para garantir o corte ideal, recomendamos fazer facas de vidro fresco e mudando a faca de vidro que cada 25-30 cortes, menos se corte através do nervo envolvido dentro de um eletroduto.
Resinas pode ser relativamente caras, não são suficientes quando seções longitudinais do nervo são necessárias e podem exigir ferramentas caras como um ultramicrotome e uma máquina de faca de vidro. Apesar dessas limitações, seções de toluidina azul coloração de resina incorporada periférica nervo ainda é considerada o padrão-ouro para visualização das seções transversais de nervo periférico morfometria4,5. Seções longitudinais também pode revelar características importantes de nervos periféricos, tais como continuidade axonal e nós de Ranvier, mas é mais útil com imuno-histoquímica. Em tais casos é a prática geral para processar diferencialmente duas seções do mesmo nervo, um para toluidina azul seções transversais e outro para imuno-histoquímica longitudinal. Devido à maior incidência de trauma de nervos periféricos e lesões e as necessidades de uma maneira melhor de avaliar estruturas morfológicas do nervo, esse método pode continuar a ser aplicada como uma ferramenta essencial para obter dados histológicos de dano do nervo e regeneração.

Nervos periféricos se estendem por todo o corpo, que inervam tecidos-alvo com axônios sensoriais ou motor1. Nervo periférico defeitos causados por doenças e trauma representam uma preocupação de saúde pública e tem grandes impactos econômicos2,3. Apesar dos progressos em avaliar os resultados de lesões nervosas periféricas e entendendo a regeneração do nervo, métodos tradicionais como nervo histologia e técnicas de coloração são ferramentas essenciais para qualitativa e quantitativamente avaliar saúde do nervo como uma medida de resultado terminal em modelos animais ou tecidos humanos extirpado. Isto frequentemente é emparelhado com medições eletrofisiológicas da função do nervo periférico, onde a morfometria pode revelar por regeneração nervosa funcional fez ou não ocorreu.
Azul de toluidina a coloração das seções de nervo periférico semi fina de resina incorporada é um método especializado para as fibras nervosas mielinizadas, proporcionando alta qualidade de imagem e claro imagens detalhadas de nervo estruturas4,5,6 . Azul de toluidina é uma mancha metachromatic acidófilo, descoberta por William Henry Perkin em 1856,7e tem sido utilizada em várias aplicações médicas8. Seções de nervo periférico manchadas de azul de toluidina obtidas de segmentos nervosos resina-incorporado permite a clara visualização das estruturas nervosas. Visualização da bainha de mielina estrutura pode ser reforçada pelo uso de tetróxido de ósmio pós-fixação4,9. Tetróxido de ósmio é um oxidante e lipídios fixador agente tóxico que interage com as ligações duplas em lipídios, resultando em bainhas de mielina rica em lipídios starkly definidos10. No entanto, tetróxido de ósmio é tóxico, caro, exige uma maior incubação de segmentos nervosos e não é sempre usado.
Métodos alternativos de processamento e coloração foram desenvolvidos para visualização da morfologia do nervo periférico; Parafina, criogênico de corte e seccionamento de nervo incorporado de resina epóxi seguiram de coloração com azul de toluidina ou fenilenodiamina solução tem sido usada para quantificar as alterações morfológicas da regeneração de nervo periférico 11,12 . Esses métodos têm suas vantagens e rendimento dados essenciais sobre o número de axônios, espessura da mielina, diâmetro do axônio e diâmetro do axônio para fibras mielinizadas diâmetro (g-ratio) 11,13,14,15 .
A principal distinção de resina-incorporação neste protocolo é que facilita a obtenção de secções de espessura 1-2 μm devido a dureza da resina, mantendo as qualidades histológicas do nervo. Estas seções finas, em oposição as 4-5 μm seções de espessura obtidas de parafina de incorporação, fornecem seções de nervo periférico com maior resolução, permitindo uma quantificação mais precisa de mielinização axônio, tais como o g-relação, que não pode ser Obtido a partir de secções mais espessas16. Enquanto criogênico de corte pode ser usado para obter seções de 1-2 µm, tem sido nossa experiência que é mais difícil obter seções sem numerosas fissuras grandes. Tais seções rachadas podem causar impreciso contagem do número de axônios e aspectos da mielinização.
Além do azul de toluidina coloração17, uma prata coloração método18 e de coloração tricromo de Masson4 também pode ser usada para mostrar os axônios do nervo. No entanto, usar resina incorporação das seções do nervo mediano de rato corados com hematoxilina e eosina ou de Masson tricromo mostrou fracas bainhas de mielina e estruturas não reconhecidas, Considerando que a coloração azul de toluidina mostrou imagem clara da bainha de mielina e pode facilmente ser quantificados4. Apesar de algumas limitações, nervos de toluidina azul coloração de resina incorporada periférica é uma valiosa técnica que pode ser usada quando as imagens de alta resolução da morfologia do nervo são necessárias.
A principal desvantagem para a incorporação de resina é que é demorado e não permite a imunocoloração do mesmo tecido devido à dificuldade de recuperação do antígeno quando comparado com parafina e congelados incorporado seções técnicas. Assim, não é geralmente possível utilizar o mesmo tecido para immunostaining é processado através de incorporação de resina para coloração de azul de toluidina. Embora não usado aqui, se é desejado a imuno-histoquímica em resina seções incorporadas, a utilização de resinas de incorporação de metacrilato de glicol permite imuno-histoquímica ser executada em cortes de tecido, mas é relativamente caro19. Isto pode ser um pouco atenuado pelo corte do nervo periférico em segmentos separados, alguns para a incorporação de resina e outros por imunocoloração diretamente após a fixação.
O processo de coloração de azul de toluidina de resina incorporado os nervos periféricos, como com análise histopatológica mais, pode ser dividido em cinco etapas, incluindo fixação, desidratação, incorporação, corte e coloração20. Pretendemos fornecer um protocolo e orientação prática para usar resina seções do nervo ciático de rato incorporado com imagens de alta qualidade de toluidina azul para adquirir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1092">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffer Saline</td>
			<td style="width:216px;">Gibco</td>
			<td style="width:137px;">14200-075</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Glutaraldehyde Solution</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">G6257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Toluidine Blue O</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Sodium Tetraborate Decahydrate</td>
			<td style="width:216px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:137px;">205950010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:216px;">Piramal</td>
			<td style="width:137px;">NDC 66794-013-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Epoxy Embedding Medium Kit</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">45359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Sodium Hydroxide Solution</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">72068</td>
			<td>To adjust Trump&#39;s fixative pH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Acetone</td>
			<td style="width:216px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:137px;">170942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Osmium Tetroxide Solution</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">75632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">VWR Micro Slides, Superfrost Plus</td>
			<td style="width:216px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Microscope Cover Glass</td>
			<td style="width:216px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12545102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Pelco Embedding Cast</td>
			<td style="width:216px;">Fisher Scientific</td>
			<td>NC9671811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Glass Knife Maker</td>
			<td style="width:216px;">RMC Products</td>
			<td style="width:137px;">GKM-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Ultramicrotome</td>
			<td style="width:216px;">RMC Products</td>
			<td style="width:137px;">MT-XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">15 mL Conical Tube</td>
			<td style="width:216px;">Falcon</td>
			<td>ISO 9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">4 mL Glass Vial</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>854190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:355px;">Razor Blades</td>
			<td style="width:216px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">55411-050</td>
			<td>For trimming resin block</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:355px;">Perfect Loop</td>
			<td style="width:216px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:137px;">70944</td>
			<td>For picking up thin resin sections</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm</td>
			<td style="width:216px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:137px;">71012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">100 Watt Oven</td>
			<td style="width:216px;">Millipore&#160;</td>
			<td style="width:137px;">6350115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Whatman Filter Paper</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">3 mL plastic pipette</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">Z331740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Micro-surgical Kit</td>
			<td style="width:216px;">World precision instruments</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Olympus fluorescence microscope</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toluidine blue staining of resin-embedded sections for evaluation of peripheral nerve morphology

Nervos periféricos se estendem por todo o corpo, que inervam tecidos-alvo com axônios motor ou sensoriais. Devido à ampla distribuição, nervos periféricos são frequentemente danificados devido a trauma ou doença. Como métodos e estratégias foram desenvolvidas para avaliar lesão de nervo periférico em modelos animais, função e regeneração, analisando a morfometria do nervo periférico tornou-se uma medida de resultado terminal essencial. Seções de toluidina azul coloração do nervo Cruz obtidas de seções de nervo resina incorporada é um método reprodutível para avaliações qualitativas e quantitativas dos nervos periféricos, permitindo a visualização do número de morfologia de axônios e grau de mielinização. Esta técnica, tal como acontece com muitos outros métodos histológicos, pode ser difícil de aprender e dominar usando protocolos padrão de escrita. A intenção desta publicação é, portanto acentuar a protocolos escritos para toluidina azul coloração de nervos periféricos com Videografia do método, usando os nervos ciático de ratos colhidos. Neste protocolo, descrevemos na vivo fixação de nervo periférico e coleta do tecido e pós-fixação com 2% de tetróxido de ósmio, incorporação de nervos em resina epóxi e ultramicrotome de seccionamento dos nervos a espessura de 1-2μm. Seções do nervo, em seguida, transferido para uma lâmina de vidro e corados com azul de toluidina, após o qual são quantitativamente e qualitativamente avaliados. São mostrados exemplos dos problemas mais comuns, bem como medidas para atenuar esses problemas.

Resina incorporado seções manchadas de toluidina azuis permitem quantificações dados histológicos precisos de nervo periférico. Uma visão geral do processo é mostrada na (Figura 2). Seções de nervos ciático incorporado no meio de resina e corados com azul de toluidina mostrou clara imagens com resolução ideal (figuras 3). Dano do nervo pode causar muitas alterações no nervo estruturas morfológicas, por exemplo, mudanças nas fibras nervosas, diâmetro do axônio e espessura da bainha de mielina. Esse método pode preservar a estrutura do nervo em sua forma natural, o que facilita a medição de vários parâmetros tais como a relação do diâmetro do axônio para o diâmetro de fibra total (o g-relação; A Figura 4). Uma variedade de fatores pode levar a seções abaixo do ideal de nervo periférico, incluindo a presença de rachaduras (Figura 5A) na seção devido à manipulação imprópria do nervo. Buracos também podem ocorrer na seção (Figura 5B) devido à desidratação insuficiente. Outro possível erro no procedimento é dobradura das seções (Figura 5), que podem ser remediadas usando Inoculando laços para transferência da seção da lâmina de vidro.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58031/58031fig1.jpg"> Figura 1: cirurgia e seccionamento. (A) nervo ciático de ratos durante a fixação na vivo . (B) vidro faca fabricante (C) vidro facas com barco. (D) Loops de metal usados para transferir flutuaram seções finas das facas de vidro para uma gota de água deionizada na lâmina de vidro. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58031/58031fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58031/58031fig2.jpg"> Figura 2: esquema do método utilizado no presente protocolo. (A) adulto Sprague Dawley rato é anestesiado, seguido por na vivo nervo fixação (B) nervo coleção e (C). O próximo passo é pós-fixação com 2% de tetróxido de ósmio (D) e (E)a incorporação de resina. Nervo incorporado seções são então cortadas (F) e seccionado (G) , usando um ultramicrotome de resina. Finalmente, o nervo seções sobre lâmina de vidro estão manchadas de toluidina azul (H). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58031/58031fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58031/58031fig3.jpg"> Figura 3: seção transversal de um nervo ciático de ratos manchada de toluidina azul. Mostra seções sob diferentes ampliações (10x, 20x, 40x e 60 X) de uma imagem nítida com ótima resolução. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58031/58031fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58031/58031fig4.jpg"> Figura 4: seção transversal de um nervo ciático de ratos manchada de toluidina azul. Esta imagem de alta resolução (100 X) pode ser usada para medir a relação do diâmetro do axônio para o diâmetro de fibra total (o g-ratio). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58031/58031fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58031/58031fig5.jpg"> Figura 5: secções transversais de um nervo ciático de ratos manchada de toluidina azuis sob diferentes ampliações. Mostrado algumaspessoas dos problemas que podem surgir durante a execução do presente protocolo. (A) e (B). A presença de rachaduras e buracos no interior do nervo causada pelo manuseio inadequado da seção e insuficiente desidratação do tecido, respectivamente. (C). dobradura das seções, que podem acontecer durante a transferência de seções das facas de vidro para o slide. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58031/58031fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology

Aqui nós apresentamos um protocolo para visualizar belas estruturas de nervos periféricos obtendo e seções de 1-2 µm com toluidina a coloração azul

Azul de toluidina mancha de resina-incorporado seções para avaliação da morfologia do nervo periférico

Peripheral nerves extend throughout the body, innervating target tissues with motor or sensory axons. Due to widespread distribution, peripheral nerves ...

toluidine-blue-staining-resin-embedded-sections-for-evaluation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.7K visualizações.  University of Wyoming. Aqui nós apresentamos um protocolo para visualizar belas estruturas de nervos periféricos obtendo e seções de 1-2 µm com toluidina a coloração azul

Vídeo: Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Laser Microdissecção Captura de Drosophila Neurônios periféricos

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Neurociência

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in which the enhanced version of the green fluorescent protein (EGFP) is exclusively expressed in all neurons of the developing central and peripheral nervous system1, allowing the possibility to both film the innervation of the forelimb and to manipulate this process with pharmacological and genetic techniques2. The most critical parameter in the successful cultivation of such slice cultures is the method by which the slices are prepared. After extensive testing of a variety of methods, we have found that a vibratome is the best possible device to slice the embryos such that they routinely result in a culture that demonstrates viability over a period of several days, and most importantly, develops in an age-specific manner. For mid-gestation embryos, this includes the normal outgrowth of spinal nerves from the spinal cord and the dorsal root ganglia to their targets in the periphery and the proper determination of skeletal and muscle tissue. 
In this work, we present a method for processing whole embryos of embryonic day (E) E10 to E12 into 300 - 400 micrometer slices for cultivation in a standard tissue culture incubator, which can be studied for up to two days after slice preparation. Critical for the success of this approach is the use of a vibratome to slice each agarose-embedded embryo. This is followed by the cultivation of the slices upon Millicell culture membrane inserts placed upon a small volume of medium, resulting in an interface culture technique. One litter with an average of 7 embryos routinely produces at least 14 slices (2-3 slices of the forelimb region per embryo), which varies slightly due to the age of the embryos as well as to the thickness of the slices. About 80% of the cultured slices show nerve outgrowth, which can be measured througout the culturing period2. Representative results using the tauGFP mouse line are demonstrated.

We present a method to prepare organotypic slices of mid-gestation mouse embryos for the cultivation and time-lapse imaging of peripheral nerve outgrowth.

Cultura Slice organotípicas de GFP-expressando embriões de camundongos para imagens em tempo real de crescimento dos nervos periféricos

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Análise imuno-histoquímica no sistema nervoso central e periférico Rat linfonodo Tissue Secções

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory system is characterized by its ability to give rise to new neurons even in adult animals. This particular ability is partly due to the presence of OECs which create a favorable microenvironment for neurogenesis. This property of OECs has been used for cellular transplantation such as in spinal cord injury models. Although the peripheral nervous system has a greater capacity to regenerate after nerve injury than the central nervous system, complete sections induce misrouting during axonal regrowth in particular after facial of laryngeal nerve transection. Specifically, full sectioning of the recurrent laryngeal nerve (RLN) induces aberrant axonal regrowth resulting in synkinesis of the vocal cords. In this specific model, we showed that OECs transplantation efficiently increases axonal regrowth.
OECs are constituted of several subpopulations present in both the olfactory mucosa (OM-OECs) and the olfactory bulbs (OB-OECs). We present here a model of cellular transplantation based on the use of these different subpopulations of OECs in a RLN injury model. Using this paradigm, primary cultures of OB-OECs and OM-OECs were transplanted in Matrigel after section and anastomosis of the RLN. Two months after surgery, we evaluated transplanted animals by complementary analyses based on videolaryngoscopy, electromyography (EMG), and histological studies. First, videolaryngoscopy allowed us to evaluate laryngeal functions, in particular muscular cocontractions phenomena. Then, EMG analyses demonstrated richness and synchronization of muscular activities. Finally, histological studies based on toluidine blue staining allowed the quantification of the number and profile of myelinated fibers.
All together, we describe here how to isolate, culture, identify and transplant OECs from OM and OB after RLN section-anastomosis and how to evaluate and analyze the efficiency of these transplanted cells on axonal regrowth and laryngeal functions.

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth of the primary olfactory neurons. This specific property can be used for cellular transplantation. We present here a model of cellular transplantation based on the use of OECs in a laryngeal nerve injury model.

Transplante de células olfativas Ensheathing para avaliar a recuperação funcional após a lesão do nervo periférico

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile stimulation is a positive early experience that mimics maternal licking and grooming in the rat. Exposing rat pups to this positive experience can be completed easily and cost-effectively by using highly accessible materials such as a household duster. Using a cross-litter design, pups are either stroked or left undisturbed, for 15 min, three times per day throughout the perinatal period. To measure the neuroplastic changes related to this positive early experience, Golgi-Cox staining of brain tissue is utilized. Owing to the fact that Golgi-Cox impregnation stains a discrete number of neurons rather than all of the cells, staining of the rodent brain with Golgi-Cox solution permits the visualization of entire neuronal elements, including the cell body, dendrites, axons, and dendritic spines. The staining procedure is carried out over several days and requires that the researcher pay close attention to detail. However, once staining is completed, the entire brain has been impregnated and can be preserved indefinitely for ongoing analysis. Therefore, Golgi-Cox staining is a valuable resource for studying experience-dependent plasticity.

This paper describes the procedures for tactile stimulation of rat pups and subsequent Golgi-Cox staining of neuronal morphology. Tactile stimulation is a positive experience that is administered in the perinatal period by stroking pups with a household duster. Golgi-cox staining is a reliable procedure permitting the visualization of entire neurons.

Visualizar os Efeitos de uma experiência precoce positiva, Tátil Estimulação, em dendríticas Morfologia e Synaptic conectividade com Golgi-Cox Coloração

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

A indireta Neuron-astrócitos Coculture Ensaio: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up para a investigação detalhada da Relação Neuron-glia

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the diagnosis still relies only on clinical signs of motor involvement that appear later on in the disease course, when most of the dopaminergic neurons are already lost. Hence, there is a strong need for a biomarker that can identify patients at the beginning of disease or at the risk of developing it. Over the last few years, skin biopsy has proved to be an excellent research and diagnostic tool for peripheral nerve diseases such as small fiber neuropathy. Interestingly, a small fiber neuropathy and alpha synuclein (&#945;Syn) neural deposits have been shown by skin biopsy in PD patients. Indeed, skin biopsy has the great advantage of being an easily accessible, minimally invasive and painless procedure that allows the analysis of peripheral nervous tissue prone to the pathology. Moreover, the possibility of repeating the skin biopsy in the course of the follow-up of the same patient allows studying the longitudinal correlation with the disease progression. We set up a standardized reliable protocol to investigate the presence of &#945;Syn aggregates in skin nerve fibers of the PD patient. This protocol involves few short fixation steps, a cryotome sectioning and then a free-floating immunofluorescence double-staining with two specific antibodies: anti Protein Gene Product 9.5 (PGP9.5) to mark the cutaneous nerve fibers and anti 5G4 for detecting &#945;Syn aggregates. It is a versatile, sensitive and easy to perform protocol that can also be applied for targeting other proteins of interest in skin nerves. The ability to mark &#945;Syn aggregates is another step forward to the use of skin biopsy as a tool for establishing a pre-mortem histopathological diagnosis of PD.

Here, we present a protocol for a free-floating indirect immunofluorescence assay on skin biopsy sections that allows for the identification of disease specific conformation variants of alpha synuclein involved in Parkinson disease and multiple proteins of the peripheral nervous system.

Segmentação de agregados Alpha synuclein em fibras nervosas periféricas cutâneas por ensaio de imunofluorescência livre-flutuante

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Análise Cinética 3D para a Avaliação Funcional no modelo de rat da lesão ciática de esmagamento nervoso

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Preparation of Peripheral Nerve Stimulation Electrodes for Chronic Implantation in Rats

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. Several recent studies have demonstrated the effectiveness of chronic VNS in enhancing central nervous system plasticity to improve motor rehabilitation, extinction learning, and sensory discrimination. Construction of chronically implantable devices for use in such studies is challenging due to rats&#8217; small size, and typical protocols require extensive training of personnel and time-consuming microfabrication methods. Alternatively, commercially available implantable cuff electrodes can be purchased at a significantly higher cost. In this protocol, we present a simple, low-cost method for construction of small, chronically implantable peripheral nerve cuff electrodes for use in rats. We validate the short and long-term reliability of our cuff electrodes by demonstrating that VNS in ketamine/xylazine anesthetized rats produces decreases in breathing rate consistent with activation of the Hering-Breuer reflex, both at the time of implantation and up to 10 weeks after device implantation. We further demonstrate the suitability of the cuff electrodes for use in chronic stimulation studies by pairing VNS with skilled lever press performance to induce motor cortical map plasticity.

Existing approaches for constructing chronically implantable peripheral nerve cuff electrodes for use in small rodents often require specialized equipment and/or highly trained personnel. In this protocol we demonstrate a simple, low-cost approach for fabricating chronically implantable cuff electrodes, and demonstrate their effectiveness for vagus nerve stimulation (VNS) in rats.

Preparação de Eletrodos de Estimulação Nervosa Periférica para Implantação Crônica em Ratos

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. ...

Automated Gait Analysis to Assess Functional Recovery in Rodents with Peripheral Nerve or Spinal Cord Contusion Injury

Peripheral and central nerve injuries are mostly studied in rodents, especially rats, given the fact that these animal models are both cost-effective and a lot of comparative data has been published in the literature. This includes a multitude of assessment methods to study functional recovery following nerve injury and repair. Besides evaluation of nerve regeneration by means of histology, electrophysiology, and other in vivo and in vitro assessment techniques, functional recovery is the most important criterion to determine the degree of neural regeneration. Automated gait analysis allows recording of a vast quantity of gait-related parameters such as Paw Print Area and Paw Swing Speed as well as measures of inter-limb coordination. Additionally, the method provides digital data of the rats&#8217; paws after neuronal damage and during nerve regeneration, adding to our understanding of how peripheral and central nervous injuries affect their locomotor behavior. Besides the predominantly used sciatic nerve injury model, other models of peripheral nerve injury such as the femoral nerve can be studied by means of this method. In addition to injuries of the peripheral nervous systems, lesions of the central nervous system, e.g., spinal cord contusion can be evaluated. Valid and reproducible data assessment is strongly dependent on meticulous adjustment of the hard- and software settings prior to data acquisition. Additionally, proper training of the experimental animals is of crucial importance. This work aims to illustrate the use of computerized automated gait analysis to assess functional recovery in different animal models of peripheral nerve injury as well as spinal cord contusion injury. It also emphasizes the method&#8217;s limitations, e.g., evaluation of nerve regeneration in rats with sciatic nerve neurotmesis due to limited functional recovery. Therefore, this protocol is thought to help researchers interested in peripheral and central nervous injuries to assess functional recovery in rodent models.

Automated gait analysis is a feasible tool to evaluate functional recovery in rodent models of peripheral nerve injury and spinal cord contusion injury. While it requires only one setup to assess locomotor function in various experimental models, meticulous hard- and soft-ware adjustment and training of the animals is highly important.

Análise automatizada da marcha para avaliar a recuperação funcional em roedores com lesão de contusão do nervo periférico ou da medula espinhal

Peripheral and central nerve injuries are mostly studied in rodents, especially rats, given the fact that these animal models are both cost-effective and ...