This work was supported by National Institutes of Health Grants R00 HL112952 (to R. H.), R01 HL108618 (to J.P.G.), P01 HL051971, and P20 GM104357. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Detalhes do protocolo anterior e os métodos para quantificar simultaneamente o fluxo de substrato através da oxidação da glicose e oxidação dos ácidos graxos no coração isolado de rato de trabalho. As medições pode, então, ser sobreposta aos parâmetros funcionais cardíacas gravadas para determinar a relação entre os substratos e metabolismo trabalho cardíaco sob condições basais e de stress (mudança de carga de trabalho, por isquemia-reperfusão, etc ...). É também possível avaliar o modo como a relação metabolismo / contracção é afectada por condições pré-existentes, tais como insuficiência cardíaca e diabetes. Em adição, o coração de roedores geneticamente modificadas podem ser utilizadas para interrogar o efeito de uma proteína específica sobre o metabolismo e a função cardíaca. Por último, o efeito de drogas e de outros factores que circulam sobre estes parâmetros podem ser testados individualmente. Uma vez que o fluxo de glicose através da glicólise nem sempre se correlaciona com a taxa de oxidação da glucose, pode ser Informativa a seguir as taxas de fluxo de glicose através de ambas as vias em uma única configuração experimental. As taxas de glicólise pode ser determinada pela adição de [5- 3H] glicose para o tampão de perfusão, devido a libertação de 3 H2O é determinado pela actividade do passo de enolase da glicólise 20. Alternativamente [2- 3 H] glucose, o que leva à produção de três H2O no passo fosfoglucose isomerase da via glicolítica, pode ser utilizado para interrogar as taxas de captação de glicose pelo músculo cardíaco 16,17,21. A possibilidade de escolher entre vários marcadores marcados radioactivamente para investigar o destino de glicose, em diferentes níveis do seu catabolismo é um outro exemplo da versatilidade da técnica. No entanto, porque todas as medições de fluxo invocar a recuperação quantitativa de qualquer uma das 3 H 2 O ou CO 2 14 a partir do efluente coronário, apenas dois radiomarcadored marcadores (um H-3 marcado e o outro um marcado com 14 C) podem ser usados no tampão de perfusão de cada vez. considerações metodológicas Existem algumas limitações inerentes à medição do fluxo metabólico cardíaco e função usando esse protocolo. Embora a utilização de tampão de KH permite um controlo total sobre a composição da solução de perfusão, a relevância fisiológica da configuração experimental pode ser questionável. Em primeiro lugar, o uso de uma solução cristalóide sobre sangue é conhecido para afectar negativamente a hemodinâmica cardíaca e resistência à isquemia 22,23. Em segundo lugar, o tampão de perfusão descrevemos aqui carece de uma variedade de hormônios e nutrientes que podem modular diretamente o metabolismo cardíaco e, consequentemente, afetar a resposta do coração a uma condição de estresse simulado. Com efeito, o coração de mamífero é uma omnivore metabólica e pode, além de glucose e ácidos gordos, utilizar outros substratos para fulfill suas necessidades energéticas (lactato, piruvato, corpos cetônicos, aminoácidos de cadeia ramificada). Existe evidência crescente de que alguns destes substratos desempenham um importante papel na remodelação metabólica do coração doente 24,25. É perfeitamente possível para o investigador para adicionar estes substratos para o buffer de perfusão, para modular a sua concentração, a fim de imitar mais de perto diferentes condições fisiológicas (por exemplo, estado alimentado contra o estado de jejum) ou doença estados, e seguir as suas taxas de oxidação usando o marcadores radiomarcados adequadas 26,27. O metabolismo de triglicéridos podem também ser rastreados, e, nesse caso recomenda-se, para evitar a utilização de heparina antes da excisão do coração, pois isso irá induzir a libertação da lipoproteína lipase do endotélio e diminuir significativamente a extracção de triglicérido do tampão 28. Com uma selecção cuidadosa dos marcadores marcados radioactivamente, a incorporação de radioactividade no varmetabolitos de tecido USIO pode também ser medido após a perfusão para determinar parâmetros, tais como a síntese de novo de triglicéridos, o volume de glicogénio, ou as taxas de síntese de proteínas 18,29,30. Em outras palavras, o investigador pode trabalhar com uma ampla variedade de substratos / hormonas combinações e concentrações. A escolha da composição do tampão irá principalmente depender dos objectivos da experiência. Porque estas condições tampão controladas criar um modelo fisiológico &quot;simplificado&quot;, resulta da ex vivo coração de trabalho experimentos de perfusão devem ser interpretados com cautela e, se possível, os dados devem ainda ser validado in vivo. A escolha do anestésico O anestésico usado em ratos antes da excisão do coração devem ser cuidadosamente selecionados com base em seus efeitos conhecidos sobre a função cardiopulmonar e metabolismo para garantir que isso não irá interferir com a experiência de ser executarEd. Ambos anestésicos injetáveis e inalatórios induzir rapidamente hiperglicemia e graus variáveis de intolerância à glicose que podem afetar o metabolismo cardíaco durante a perfusão 31,32. Em comparação com outros agentes, os efeitos de curto prazo de barbitúricos (Pentobarbital e tiobutabarbital) na homeostase da glicose são relativamente insignificantes 31. No entanto, anestesia com pentobarbital por via intraperitoneal antes da excisão do coração tem sido demonstrado para diminuir o débito cardíaco, prejudicar a função do ventrículo esquerdo, e aumentar a libertação de lactato do miocárdio num protocolo ex vivo de isquemia-reperfusão 33. O efeito inotrópico negativo que o pentobarbital tem no coração isolado de rato é sugerido para ser causado pela acumulação de tecido do fármaco 34. Por outro lado o uso de anestésicos inalatórios, que são mais rapidamente lavados para fora do tecido cardíaco, está associada a uma melhor função contrátil ex vivo 33. Os anestésicos voláteis pode realmente fornecer cardioprotection durante a isquemia-reperfusão através de um mecanismo que envolve a abertura dos canais de K ATP mitocondriais e aumento da ligação da hexoquinase 32 para a mitocôndria. Em resumo, o tipo de anestésico usado em um trabalho protocolo de coração isolado de perfusão é uma variável importante na avaliação dos parâmetros funcionais e metabólicas que podem impactar diretamente os resultados do experimento. Portanto, o tipo ea dose de anestésico utilizada deve ser sempre apresentado na secção Métodos de um experimento, e estes parâmetros não devem ser alteradas entre os experimentos que se destinam a ser comparado. Radioisótopos na perfusão do coração Todas as medições de fluxo realizadas com o protocolo anterior são realizados no modo de não-recirculação, o que significa que o efluente coronário é descartada em vez de ser retornado para o reservatório tampão (Figura 1). O investigador pode, em vezescolher usar o aparelho de perfusão no modo de recirculação, o que tem a vantagem de exigir um volume muito mais pequeno de tampão de radioactividade e, consequentemente, a operar. No entanto, a reciclagem do efluente coronário compromete a composição do estado estacionário do tampão de perfusão através da recuperação de subprodutos originados da actividade metabólica do coração (incluindo lactato, mas também 3 H 2 O e H 14 CO3-), o que complica a determinação de fluxos metabólicos e pode até mesmo alterar a função cardíaca ao longo do tempo 35. Estes problemas são evitados no modo não recirculante. Devido à quantidade de radioactividade e ao grande volume de tampão de perfusão utilizado numa única experiência, o investigador deve tomar cuidado especial quando se utiliza o coração de rato trabalhando em análises fluxo metabólico. Quando se utiliza um aparelho de perfusão, pela primeira vez, é recomendável realizar várias experiências simuladas com tampão não radioactivo para se tornar familiar com odiferentes etapas do protocolo e com os procedimentos de segurança. A montagem do coração nas cânulas é uma etapa particularmente sensível porque requer o estabelecimento de um contacto próximo com o aparelho e porque o buffer pode vazar ou atirar para fora de um dos vasos sanguíneos cortados do coração. O aparelho de perfusão descrito por Taegtmeyer e colegas 11 tem a vantagem de incluir um reservatório de Langendorff que é completamente independente do resto do aparelho de perfusão, e pode, portanto, ser preenchido com tampão de KH não radioactivo para evitar derrames de material radioactivo durante a canulação do coração . Independentemente de o sistema utilizado, as experiências devem ser executadas em uma área dedicada com acesso restrito. A sala deve incluir uma pia e um fornecimento de água ultrapura para executar a preparação tampão e limpeza de equipamentos contaminados na mesma área. Os investigadores devem trabalhar em estreita colaboração com o gabinete de segurança de radiação da sua instituição para estabelecer sESPECÍFICOS contenção, controle e processos de descontaminação. A limpeza do aparelho de perfusão O posto de limpeza experimental do aparelho de perfusão é um passo crítico que é muitas vezes esquecido e, se não for cuidadosamente executado, responsável pela maior parte das questões relacionadas com a má reprodutibilidade experimental. O tampão de perfusão rico em nutriente e a elevada temperatura do sistema de perfusão fornecem as condições ideais para o crescimento de bactérias e fungos. A utilização de proteínas (insulina, BSA) e ácidos gordos no tampão de perfusão adiciona um outro grau de complexidade para o procedimento de limpeza, porque estes compostos irão aderir à superfície do tubo e de objectos de vidro, tornando-os difíceis de expulsar do aparelho. A utilização de radioisótopos também vai impor restrições adicionais, tais como a criação de uma zona de confinamento dedicado no laboratório para manipulação do equipamento e a eliminação de um sólido contaminadod líquidos resíduos radioativos. Portanto, o procedimento de limpeza adequada irá principalmente depender tanto da composição do tampão de perfusão e o tipo de aparelho de perfusão utilizado. Se estiver usando um aparelho comercial, consulte o site do fabricante ou entre em contato com o serviço ao cliente para obter informações sobre como realizar a limpeza sem danificar qualquer um dos componentes do aparelho. Em geral, todas as partes de plástico e material de vidro pode ser lavada com uma vasta gama de sabonetes. detergentes movidos a enzima ativa são particularmente úteis para remover resíduos de ácidos gordos-BSA. A maior parte dos contaminantes também irá ser removido rodando H HCl 0,1 M ou 0,1 HNO 3 através do equipamento durante várias horas. Obtemos resultados satisfatórios limpeza por lavagem do sistema de primeira com HCl 0,1 M, em seguida, com um novo 1% (w: v) de solução de detergente alimentado enzima-activo, preparado em água quente, enxaguar e, finalmente, por o sistema com água ultrapura. Ao usar um aparelho de perfusão custom-built como aquele originalmente described por Taegtmeyer e colegas 11, pode ser mais fácil e mais eficaz para desmantelar completamente o aparelho no final de cada dia experimental. O material de vidro é limpo por um 15 minutos de imersão em um banho concentrado de uma mistura de ácido crómico e ácido sulfúrico. As peças de plástico e a tubagem de PVC pode ser lavado com um detergente sem resíduos. Descobrimos que é realmente mais rápido e mais confiável para substituir totalmente o tubo de PVC todos os dias, porque limita a manipulação de material contaminado por radiochemicals e porque impede deixando resíduos de agentes de limpeza para trás. Em qualquer caso, o investigador deve aplicar as seguintes regras: 1- Limpe o aparelho de perfusão e todos os equipamentos sujos imediatamente após a conclusão do experimento perfusão. Espera só vai fazer a limpeza mais difícil e demorado. 2- Verifique o banho de circulação do sistema de revestimento de água regularmente para contaminações. A utilização de um condicionador de água irá aumentar o intervalo entre Cinclinando-se do banho de água. 3- Após a limpeza, lavar abundantemente todos os vidros e os tubos com água da torneira várias vezes e terminar a lavagem com água ultrapura para remover os resíduos de agentes de limpeza. 4- Duas preparações de coração não consecutivamente quando a dissecção foi cuidadosamente executado e o tampão de perfusão cuidadosamente preparadas são susceptíveis de indicar uma contaminação do aparelho (quer por bactérias ou por resíduos de solventes). Se isso acontecer, a lavagem e procedimentos de lavagem deve ser inteiramente repetido. Dimensionamento para baixo para o coração de rato Embora o protocolo anterior foca-se na determinação das taxas metabólicas de um coração isolado de rato de trabalho, os mesmos procedimentos podem ser aplicados para o coração de rato com algumas modificações para o aparelho de perfusão e o equipamento de aquisição de dados 36. Devido ao seu tamanho menor o coração isolado de rato de trabalho é tecnicamente mais desafiador, mas por causa de sua significativamentetaxa de fluxo menor tem a vantagem de exigir um volume muito menor de tampão de perfusão. O grande número de modelos de ratinhos geneticamente modificados que já estão disponíveis também torna o coração isolado de rato de trabalho muito atractivo para o estudo da função de um produto de um único gene no metabólica cardíaca e remodelação funcional. No entanto, os recentes avanços tecnológicos na edição genoma e um catálogo crescente de ratos transgénicos e knockout estão fechando rapidamente a diferença entre as duas espécies de roedores. Além disso, o rato tem sido elogiado como um modelo animal superior a investigar a doença cardiovascular, pois sua fisiopatologia imita as condições humanas 37. Por estas razões, acreditamos que o coração isolado de rato trabalhando ainda têm um lugar importante na era moderna da investigação cardiovascular.

Relevância clínica No coração dos mamíferos, há uma forte correlação positiva entre o fluxo de substratos através de vias metabólicas oxidativas, geração de ATP e um trabalho cardíaco. Ao longo das últimas duas décadas, a investigação da relação entre o metabolismo intrincada e função cardíaca levou a reconhecer que as alterações no metabolismo cardíaco são uma causa para a disfunção contráctil e remodelação estrutural possivelmente patológica na definição de diferentes tipos de doenças cardíacas 2-4. Portanto, espera-se que a nossa compreensão dos mecanismos que regulam a remodelação metabólica do coração salientou irá levar à identificação de alvos terapêuticos para a prevenção ou tratamento de insuficiência cardíaca 5-7. A recente publicação de uma declaração científica da American Heart Association sobre &quot;Avaliação Cardiac Metabolism&quot;, enfatiza o crescente interesse da comunidade científica para tseu campo de pesquisa 8. Mas, enquanto os avanços tecnológicos na imagem cardíaca agora permitir uma avaliação rápida e precisa da morfologia e função cardíaca, o estudo in vivo do metabolismo cardíaco continua a ser limitado e oneroso: espectroscopia e ressonância magnética (NMR) nuclear Positron Emission Tomography de imagem (PET) pode ser usado para seguir cardíaca metabolismo do fosfato de alta energia e atividade do ciclo de Krebs, mas essas técnicas são atormentados por altos custos operacionais e pela sua incapacidade de determinar a contribuição dos vários substratos para o metabolismo oxidativo em condições de estado estacionário 9 .Para esta data, o ex vivo trabalhando preparação do coração representa a técnica única e exclusiva disponível para estudar, simultaneamente e em tempo real, a função contrátil e do fluxo dos substratos utilizados em vias metabólicas oxidativas 7,9. O protocolo seguinte tem como objetivo fornecer orientações na preparação e utilização de reagentes usados ​​para determinar o ratoes de utilização de substratos no coração isolado de rato de trabalho. O Aparelho coração isolado Rodent Trabalho Embora a técnica é quase meio século de idade, a preparação de trabalho isolado coração de rato continua a ser um método de escolha para a investigação cardiovascular. Tal como acontece com a preparação de coração de Langendorff, o funcionamento do coração roedor oferece uma maneira relativamente simples, fiável e barato para medir uma vasta gama de parâmetros cardíacos, independentemente dos efeitos de confusão de outros órgãos, e outros factores neuro-hormonais circulantes. Mas, em contraste com o coração de Langendorff-perfundidos, o funcionamento do coração continua a executar o trabalho cardíaco quase fisiológica, um pré-requisito para a geração de fluxo metabólico oxidativo para níveis que são relevantes para condições in vivo. Isto é conseguido através da entrega do tampão de perfusão para o ventrículo esquerdo (VE) através de uma cânula ligada ao átrio esquerdo, e como o LV e contratos enche, otampão é ejectado através da linha aórtica contra uma determinada pressão hidrostática pós-carga. O design do aparelho de perfusão originalmente descrito por Neely e colegas 10 foi posteriormente melhorado por Taegtmeyer, bainhas e Krebs 11, mas mudou muito pouco desde então. Conforme descrito no aparelho original, função contrátil pode ser avaliada através da determinação do débito cardíaco, usando não mais que os cilindros graduados e um cronômetro para medir aórtica e coronariana flui 10,11. Vários fornecedores oferecem agora sistemas completos de perfusão cardíaca de trabalho de roedores. Estes aparelhos disponíveis comercialmente podem ser adquiridos com flowprobes, transdutores de pressão, um cateter de pressão-volume e todo o equipamento necessário para a aquisição de dados e análise funcional cardíaca. Os fornecedores oferecem extensas sessões de documentação e de formação para dar a conhecer o novo usuário com o seu equipamento. Vários artigos de revisão também protocolos detalhes sobre o instrum coração a trabalharentação e sobre a utilização de cateteres para medir a função cardíaca em roedores 12-15. Por esta razão, vamos citar apenas brevemente o set-up do aparelho de perfusão e do equipamento de gravação. O presente protocolo tem a finalidade de complementar a informação já disponível com uma descrição dos métodos que podem ser utilizados para medir, simultaneamente, as taxas de glucose e oxidação de ácidos gordos de cadeia longa, os dois principais substratos energéticos proporcionando, no coração normal. Descrevemos aqui todos os passos envolvidos na a utilização de substratos de energia radiomarcados para o estudo do metabolismo oxidativo do miocárdio, a partir da preparação de reagentes e tampões para a extracção e processamento de amostras, para a análise de dados. Princípios do Método Cardiomiócitos gerar a maior parte de sua energia para a contração da fosforilação oxidativa de ácidos graxos (ácidos graxos de cadeia longa principalmente) e carboidratos (GlucosE e lactato). O coração tem muito limitado reservas energéticas e depende de um fornecimento constante desses substratos energéticos prestar a partir da circulação. O catabolismo da glicose através da via glicolítica produz piruvato que é então descarboxilado por o complexo piruvato desidrogenase da membrana mitocondrial interna. ácidos gordos de cadeia longa, extraídos a partir de albumina ou de circulação de lipoproteínas de triglicéridos, são em primeiro lugar activados em moléculas de acil-CoA no citosol e, posteriormente, transportados para dentro da matriz mitocondrial de transporte através da carnitina para entrar na via beta-oxidação. As moléculas de acetil-CoA produzidas pelo catabolismo da glicose e os ácidos gordos de combustível do ciclo de Krebs para gerar os equivalentes redutores (NADH e FADH2) que são usados pela cadeia de transporte de electrões para construir a força motriz protónica através da membrana mitocondrial interna e gerar ATP por meio da actividade da ATP sintase. Água e dióxido de carbono são os subprodutos finais deas reacções enzimáticas que ocorrem dentro do ciclo de Krebs. O fornecimento de 14 C e 3 H- substratos marcados radioactivamente (tais como 14 C-glicose e ácido oleico radiomarcado 3H-radiomarcado) para o coração isolado irá consequentemente levar à produção de 14 CO 2 e H 2 O 3 que pode ser quantitativamente recuperada a partir do efluente coronário. A recolha de 14 CO 2 é levada a cabo mantendo o coração perfundido isolado dentro de uma câmara selada e por imediatamente a recuperar o efluente coronário medida que sai do coração. Uma coluna de permuta aniónica pequena é usado para separar e recuperar 3 H2O a partir do efluente coronário. A radioactividade das amostras processadas é medido com um contador de cintilação líquida, e com o conhecimento da actividade específica dos substratos marcados radioactivamente utilizado, é então possível quantificar individualmente o fluxo de glicose e de ácido gordo nooxidação percursos 16,17.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4*7H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AG 1-X8 resin, chloride form, 100-200 dry mesh size, 500 g</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1401441</td>
			<td>This item can be replaced by purchasing directly the hydoxide form&#160; (see reference below), but this will cost almost 8 times more</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AG 1-X8 resin, hydroxide form, 100-200 dry mesh size, 100 g</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1432445</td>
			<td>Purchasing this item allows to bypass the conversion of the anion exchange resin from the chloride form to the hydroxide form (See section 1.2 of protocol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Microanalysis Vacuum Filter Holder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-753-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318</td>
			<td>Corrosive. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Dispersion Tube with Fritted Cylinder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-138B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>820027</td>
			<td>We recommend the use of a charcoal-defatted BSA, as other purification process such as cold ethanol fractionation may leave residues toxic for the heart.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Oleate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O7501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic Acid, [9,10-3H(N)]-</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NET289005MC</td>
			<td>Radioactive material. Follow your Institution&#39;s radiation safety office guidelines for ordering and handling.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane Tubing, 29 mm diameter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-667E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose, D-[14C(U)]-</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC042B005MC</td>
			<td>Radioactive material. Follow your Institution&#39;s radiation safety office guidelines for ordering and handling.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humulin R U-100</td>
			<td>Eli Lilly and Company</td>
			<td>NDC 0002-8215-01 (HI-210)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inactin Hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T133</td>
			<td>Controlled substance on USDEA Schedule III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 Silk Black Braid</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>SUT-15-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Hyamine Hydroxide</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6003005</td>
			<td>Highly toxic and causes severe burns. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL Glass Scintillation Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-341-25E</td>
			<td>Use glass vials for quantitative recovery of 14CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL HDPE Scintillation Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-23B</td>
			<td>Use HDPE vials for quantitative recovery of 3H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Rubber Sleeve Stoppers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-126DD</td>
			<td>Fit 20 mL scintillation vials; Reusable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle 23G x 40 mm</td>
			<td>BD</td>
			<td>305194</td>
			<td>Use to inject perchloric acid through the rubber sleeve stopper of the CO2 trap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perchloric Acid, 60%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A228</td>
			<td>Highly corrosive and may act as an oxidizer and/or cause an explosion hazard. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultima Gold, Scintillation Cocktail</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6013327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Wool</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC38606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decon Dri-Clean Detergent Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355</td>
			<td>For cleaning of glassware, plastic parts, and tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alconox Tergazyme Enzyme-Active Powered Detergent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-000-115</td>
			<td>For cleaning of &#34;hard to reach&#34; surfaces (tubing, glassware) contaminated by fatty acid-BSA residue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for the determination of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart

O coração dos mamíferos é um grande consumidor de ATP e necessita de um fornecimento constante de substratos de energia para contracção. Não surpreendentemente, alterações do metabolismo do miocárdio têm sido associados ao desenvolvimento de disfunção contráctil e insuficiência cardíaca. Portanto, desvendar a relação entre o metabolismo e contração deve lançar luz sobre alguns dos mecanismos que regem a adaptação cardíaca ou má adaptação em estados de doença. A preparação trabalhar isolado coração de rato pode ser utilizado a seguir, simultaneamente e em tempo real, a função contrátil cardíaca e fluxo de energia fornecendo substratos em vias metabólicas oxidativas. O presente protocolo tem como objectivo proporcionar uma descrição detalhada dos métodos utilizados para a preparação e a utilização de tampões para a medição quantitativa das taxas de oxidação de glucose e ácidos gordos, a principal energia fornecendo substratos do coração. Também são discutidos os métodos utilizados para a análise da amostra e interpretação de dados.Em resumo, a técnica é baseada no fornecimento de 14C-glucose radiomarcada e um ácido gordo de cadeia longa 3 H- radiomarcado a um coração a bater ex vivo através de perfusão de cristalóide normotérmica. 14 CO 2 e 3 H 2 O, derivados finais de as reacções enzimáticas envolvidas na utilização destes substratos de energia fornecendo, são então quantitativamente recuperada a partir do efluente coronário. Com o conhecimento da actividade específica dos substratos radiomarcados utilizados, é então possível quantificar individualmente o fluxo de glicose e de ácido gordo nas vias de oxidação. função contráctil do coração isolado pode ser determinado em paralelo com o aparelho de controlo apropriado e correlacionado directamente com os valores de fluxo metabólico. A técnica é extremamente útil para estudar a relação metabolismo / contracção em resposta a várias condições de estresse, tais como alterações no pré e pós carga e isquemia, uma droga ou um Circulafactor de Ting, ou após a alteração na expressão de um produto génico.

Duas experiências representativas estão descritas nas figuras abaixo. Em ambos os casos, o centro de um 16 semanas de idade do sexo masculino Sprague Dawley foi isolado e perfundido no modo de funcionamento com tampão de KH preparado de acordo com o protocolo anterior. Em cada experimento, o coração foi submetido a uma condição de tensão de afectar o trabalho cardíaco. função contráctil cardíaca foi avaliada por registo contínuo da pressão de pulso através da inserção de um transdutor de pressão na linha aórtica e por determinação da potência cardíaca. As consequências de cada condição de tensão sobre a utilização de substratos de energia fornecendo simultaneamente foram determinadas por medição das taxas de glucose e oxidação oleato. No primeiro experimento, um aumento agudo da carga de trabalho foi simulada após 20 min de perfusão de carga de trabalho quase fisiológica através do aumento da pós-carga em 40% (realizado por manualmenteelevar a câmara de transbordo aórtica) e por adição de epinefrina (1 pmol / L) para o tampão de perfusão (Figura 3A). A frequência cardíaca, o que pode ser determinado medindo o intervalo entre os valores de pico da pressão sistólica no traçado da pressão de pulso, aumentou imediatamente por mais de 50% no momento da indução workjump (Figura 3B). Poder cardíaco aumentou em mais de 40% em workjump, que foi acompanhado por um aumento em ambas as taxas de glucose e oxidação oleato (Figura 3C). Os resultados mostram que, sob o stress de um aumento agudo da carga de trabalho, o coração se adapta rapidamente para aumentar a geração de energia para a contração de glicose e oxidação de ácidos graxos. No entanto, o aumento relativo da velocidade de oxidação era mais importante para a glicose (~ 2,8 vezes) do que foi para o oleato (~ 1,3 vezes). Dependência crescente de oxidação de carboidratos para lidar com a carga de trabalho extra é uma característica típica do coração de mamíferos com sobrecarga de pressão 18 </sup&gt;. Na segunda experiência, o coração foi perfundido sob condições da linha de base durante 20 min seguido de 15 min total, isquémia normotérmica global (induzida através do fecho tanto a fibrilação e linhas da aorta) e 30 min de reperfusão (Figura 4A). Sob estas condições experimentais, a pressão de pulso quase normal foi restaurado entre 2 e 3 minutos após o início da reperfusão (Figura 4B). Poder cardíaca aumentou rapidamente acima dos valores pré-isquemia durante os primeiros 10 minutos de reperfusão, antes de cair de volta para valores próximos a linha de base (Figura 4C). Comparado à linha de base, a taxa de oxidação oleato aumentada durante a reperfusão, enquanto que a oxidação da glicose devolvido rapidamente aos níveis pré-isquémicos. Ao medir simultaneamente a função contrátil e ambas as taxas de oxidação de substrato se pode claramente perceber que, nas presentes condições experimentais, a variação nas taxas de óxido de ácidos graxosção é o principal determinante para mudanças na quantidade de trabalho gerados na reperfusão. Quanto maior interruptor para utilização de ácidos gordos de pós isquemia é uma característica bem estalished do coração reperfundido 19. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54497/54497fig1.jpg" /> Figura 1:. Esquema simplificado do coração isolado de rato de Trabalho Aparelho O tampão de Krebs-Henseleit suplementado com a solução de ácido gordo-BSA é oxigenado por passagem através de um oxigenador de membrana. valores de pré-carga e pós-carga cardíaca típicas para um coração de rato perfundido em condições próximas das condições fisiológicas são indicados. As configurações podem ser modificadas por ajustamento das alturas do reservatório atrial e câmara de transbordo aórtica. Os tubos de seringas graduadas foram colocados por baixo da câmara do coração e a câmara de transbordo da aorta, a fim de medir o fluxo coronário e fluxo aórtico, respectivamente. O fluxo detampão pode ser parado (quando a medição dos fluxos aórticos e coronários) ou reencaminhadas (quando se muda de Langendorff para o modo de funcionamento), através da utilização de válvulas de bloqueio de três vias. As setas vermelhas indicam o posicionamento ideal para a in-line microlelectrodes de oxigênio para determinar a diferença de oxigênio &quot;arteriovenosa&quot;. Na linha de sondas de fluxo e transdutores de pressão pode ser colocado nas linhas de pré-carga e pós-carga para medir as taxas de fluxo atrial e aórtico e pressões (setas verdes). pressões ventriculares volumes esquerdo e também podem ser gravadas com um cateter inserido através de PV a ponta do ventrículo esquerdo. Não é mostrado na figura é a camisa de água em torno de todos os elementos de vidro e o tubo de perfusão na cor azul escuro. Estes elementos jaqueta de água estão todos ligados em série através de tubos para um banho de água circulante fixada em 37 ºC. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54497/54497fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão ampliada da t</a>sua figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54497/54497fig2.jpg" /> Figura 2:. A representação de diferentes etapas envolvidas no programa de configuração do Armadilha CO 2 (A) Adicionar 1 ml de 10x hidróxido concentrada de hiamina. (B) Adicionar uma amostra de 0,5 ml continha, em um tubo sem tampa. (C) Sele o frasco. (D) Injectar 200 mL de ácido perclórico (60% w: w%). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54497/54497fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54497/54497fig3.jpg" /> Figura 3: Os resultados representativos de uma experiência Workjump (A) de gravação contínua da pressão de pulso.. (B) de curta distância naTERVAL gravação que descreve a mudança na pressão de pulso, no momento da iniciação workjump. (C) As taxas cardíacas de oxidação da glucose (rastreio vermelho com círculos) e oleato de oxidação (traço azul com quadrados) foram determinadas por análise do efluente coronário em um intervalo de 5 minutos. Poder cardíaca (traço preto com triângulos) foi determinada por medição do débito cardíaco, ao mesmo tempo, as amostras de efluentes coronárias foram recuperados. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54497/54497fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54497/54497fig4.jpg" /> Figura 4: Os resultados representativos de um experimento de isquemia-reperfusão (A) de gravação contínua da pressão de pulso.. (B) de gravação intervalo curto que descreve a recuperação da função contrátil dutocar os primeiros 5 min da reperfusão. (C) As taxas cardíacas de oxidação de glicose (traço vermelho com círculos) e de oxidação oleato (traço azul com quadrados) foram determinadas por análise do efluente coronário em um intervalo de 5 min, excepto durante os primeiros 5 min de reperfusão, em que as análises foram realizadas em um intervalo de 1 min. Poder cardíaca (traço preto com triângulos) foi determinada por medição do débito cardíaco, ao mesmo tempo, as amostras de efluentes coronárias foram recuperados. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54497/54497fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.

Os métodos para a determinação das taxas de glicose e ácido gordo oxidação no coração isolado de rato de Trabalho

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

methods-for-determination-rates-glucose-fatty-acid-oxidation-isolated

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.6K visualizações.  University of Mississippi Medical Center. The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.

Vídeo: Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in common laboratory rats or mice and these quite frequently serve as an intermediate step between bench-top experiments and large animal testing or human trials. Given that rodents provide an established, cost-effective, and physiologically-relevant model system in which to test novel combinations of scaffolding materials and cells, they are particularly well-suited for cardiovascular tissue engineering studies. Presently, we describe an open-heart surgical procedure to implant engineered tissue containing myogenic progenitor cells in the atrioventricular (AV) groove of a rat heart. These implants are intended to create an electrical conduit between the right atrium and right ventricle with the ultimate goal of providing an alternative treatment to conventional pacemaker implantation in pediatric patients with complete heart block[1]. The engineered tissue is implanted in the AV-groove by means of a thoracotomy. For our purposes, Lewis rats are anesthetized and invasively ventilated to maintain positive airway pressure during the sterile surgical procedure. The approach to the heart is performed by a right thoracotomy through an antero-lateral incision at the 5th intercostal space. The tissue construct is fixed in the AV groove using a single 7-0 Prolene suture and positioned between the right ventricle and atrium at the ventral portion of the heart. The epicardium is partially removed to allow direct contact between the recipient myocardial cells and those contained in the engineered tissue. Following implantation, the chest wall is closed in layers, any pneumothorax is evacuated, and the animal is extubated and treated with analgesic.

Here, we describe a cardiac surgical procedure to implant engineered tissue in the atrioventricular (AV)-groove of an adult Lewis rat.

Implantação de engenharia de tecidos no coração de ratos

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

Biologia

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

Visualizar o coração batendo no Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoproteomics quantitativa em ácidos graxos estimulada Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Measures of Heart and Ventilatory Rates in Freely Moving Crayfish

The fear, flight or fight response serves as the fundamental physiological basis for examining an organism's awareness of its environment under an impending predator attack.  Although it is not known whether invertebrates posses an autonomic nervous system identical to that of vertebrates, evidence shows invertebrates have a  sympathetic-like  response to regulate the internal environment and ready the organism to act behaviorally to a given stimuli.  Furthermore, this physiological response can be feasibly measured and it acts as a biological index for the animal's internal state.  Measurements of the physiological response can be directly related to internal and external stressors through changes in the central nervous system controlled coordination of the cardio-vascular and respiratory systems.   More specifically, monitoring heart and ventilation rates provide quantifiable measures of the stress response not always behaviorally observed. Crayfish are good model organisms for heart and ventilatory rate measurements due to the feasibility of recording, as well as the rich history known of the morphology of the crayfish, dating back to Huxley in 1888, and the well-studied typical behaviors.

Invertebrates show an autonomic sympathetic-like response similar to that described for vertebrates. The coordination of the cardio-vascular and ventilatory systems allows for measurement of a biological index in which to assess an organism internal state.

Medidas de freqüência cardíaca e ventilatória em se movimentar livremente Crayfish

The fear, flight or fight response serves as the fundamental physiological basis for examining an organism's awareness of its environment under an ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Preparação de embriões de Microscopia Eletrônica do Drosophila Tubo cardíaco embrionário

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

Quantificação de γH2AX Focos em resposta à radiação ionizante

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone H2AX1,2. This phosphorylation of H2AX is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)3. The phosphorylated form of H2AX, referred to as &gamma;H2AX, spreads to adjacent regions of chromatin from the site of the DSB, forming discrete foci, which are easily visualized by immunofluorecence microscopy3. Analysis and quantitation of &gamma;H2AX foci has been widely used to evaluate DSB formation and repair, particularly in response to ionizing radiation and for evaluating the efficacy of various radiation modifying compounds and cytotoxic compounds4.
Given the exquisite specificity and sensitivity of this de novo marker of DSBs, it has provided new insights into the processes of DNA damage and repair in the context of chromatin. For example, in radiation biology the central paradigm is that the nuclear DNA is the critical target with respect to radiation sensitivity. Indeed, the general consensus in the field has largely been to view chromatin as a homogeneous template for DNA damage and repair. However, with the use of &gamma;H2AX as molecular marker of DSBs, a disparity in &gamma;-irradiation-induced &gamma;H2AX foci formation in euchromatin and heterochromatin has been observed5-7. Recently, we used a panel of antibodies to either mono-, di- or tri- methylated histone H3 at lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) which are epigenetic imprints of constitutive heterochromatin and transcriptional silencing and lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), which are tightly correlated actively transcribing euchromatic regions, to investigate the spatial distribution of &gamma;H2AX following ionizing radiation8. In accordance with the prevailing ideas regarding chromatin biology, our findings indicated a close correlation between &gamma;H2AX formation and active transcription9. Here we demonstrate our immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in non-adherent cells, with a particular focus on co-localization with other epigenetic markers, image analysis and 3D-modeling.

Evaluation of the Spatial Distribution of &#947;H2AX following Ionizing Radiation

Microscopic analysis of &gamma;H2AX foci, which form following the phosphorylation of H2AX at Ser-139 in response to DNA double-strand breaks, has become an invaluable tool in radiation biology. Here we used an antibody to mono-methylated histone H3 at lysine 4 as an epigenetic marker of actively transcribing euchromatin, to evaluate the spatial distribution of radiation-induced &gamma;H2AX formation within the nucleus.

Avaliação da Distribuição Espacial da γH2AX seguintes Radiação Ionizante

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

Quantificar Único microvasos Permeabilidade em perfusão isolada-Sangue Rat Lung Preparação

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid oxidation, or alternatively, synthesize new lipid via de novo lipogenesis. The net sum of these pathways is dictated by a number of factors, which in certain disease states leads to fatty liver disease. Excess hepatic lipid accumulation is associated with whole body insulin resistance and coronary heart disease. Tools to study lipid metabolism in hepatocytes are useful to understand the role of hepatic lipid metabolism in certain metabolic disorders.
In the liver, hepatocytes regulate the breakdown and synthesis of fatty acids via &#946;-fatty oxidation and de novo lipogenesis, respectively. Quantifying metabolism in these pathways provides insight into hepatic lipid handling. Unlike in vitro quantification, using primary hepatocytes, making measurements in vivo is technically challenging and resource intensive. Hence, quantifying &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis in cultured mouse hepatocytes provides a straight forward method to assess hepatocyte lipid handling. 
Here we describe a method for the isolation of primary mouse hepatocytes, and we demonstrate quantification of &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled substrates.

De novo lipogenesis and &#946;-fatty acid oxidation constitute key metabolic pathways in hepatocyte, pathways that are perturbed in several metabolic disorders, including fatty liver disease. Here we demonstrate isolation of mouse primary hepatocytes and describe quantification of &#946;-fatty acid oxidation and lipogenesis.

Determinação da oxidação de ácidos gordos e Lipogênese em Rato Os hepatócitos primária

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways that cannot be accomplished in vivo. For example, inotropic medications commonly also affect preload and afterload, precluding load-independent assessments of their myocardial effects in vivo. Additionally, this model allows for sampling of coronary sinus effluent without contamination from systemic venous return, permitting assessment of myocardial oxygen consumption. Further, the advent of miniaturized pressure-volume catheters has allowed for the precise quantification of markers of both systolic and diastolic performance. We describe a model in which the left ventricle can be studied while performing both volume and pressure work under controlled conditions. 
In this technique, the heart and lungs of a Sprague-Dawley rat (weight 300-500 g) are removed en bloc under general anesthesia. The aorta is dissected free and cannulated for retrograde perfusion with oxygenated Krebs buffer. The pulmonary arteries and veins are ligated and the lungs removed from the preparation. The left atrium is then incised and cannulated using a separate venous cannula, attached to a preload block. Once this is determined to be leak-free, the left heart is loaded and retrograde perfusion stopped, creating the working heart model. The pulmonary artery is incised and cannulated for collection of coronary effluent and determination of myocardial oxygen consumption. A pressure-volume catheter is placed into the left ventricle either retrograde or through apical puncture. If desired, atrial pacing wires can be placed for more precise control of heart rate. This model allows for precise control of preload (using a left atrial pressure block), afterload (using an afterload block), heart rate (using pacing wires) and oxygen tension (using oxygen mixtures within the perfusate).

Isolated working heart models can be used to measure the effect of loading conditions, heart rate, and medications on myocardial performance and oxygen consumption. We describe methods for preparation of a rodent left heart working model that permits study of systolic and diastolic performance and oxygen consumption under various conditions.

Roedor Trabalho Modelo do coração para o estudo do desempenho do miocárdio eo consumo de oxigênio

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...