This work was supported by National Institutes of Health Grants R00 HL112952 (to R. H.), R01 HL108618 (to J.P.G.), P01 HL051971, and P20 GM104357. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.

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The authors declare that they have no competing financial interests.

El protocolo anterior detalla los métodos para cuantificar simultáneamente el flujo de sustrato a través de la oxidación de la glucosa y la oxidación de ácidos grasos en el corazón de rata aislado de trabajo. Las mediciones se pueden superponer a los parámetros funcionales cardíacos registrados, para determinar la relación entre el metabolismo de los sustratos y el trabajo cardíaco en condiciones basales y de estrés (cambio en la carga de trabajo, por isquemia-reperfusión, etc ...). También es posible evaluar cómo la relación metabolismo / contracción se ve afectada por las condiciones preexistentes, tales como insuficiencia cardíaca y diabetes. Además, el corazón de roedores modificados genéticamente se puede usar para interrogar el efecto de una proteína específica en el metabolismo y la función cardíaca. Por último, el efecto de los fármacos y otros factores que circulan en estos parámetros se puede probar de forma individual. Debido a que el flujo de glucosa a través de la glucólisis no siempre se correlaciona con la tasa de oxidación de la glucosa, puede ser informaTIVE seguir las tasas de flujo de glucosa a través de ambas vías en un solo entorno experimental. Las tasas de glucólisis se pueden determinar mediante la adición de [5- 3 H] glucosa al tampón de perfusión, debido a que la liberación de 3 H 2 O está determinado por la actividad de la etapa enolasa de la glucólisis 20. Alternativamente [2- 3 H] glucosa, que lleva a la producción de 3 H 2 O en el paso de fosfoglucosa isomerasa de la vía glicolítica, puede ser utilizado para interrogar a las tasas de captación de glucosa por el músculo cardiaco 16,17,21. La posibilidad de elegir entre múltiples trazadores radiomarcados para investigar el destino de la glucosa en diferentes niveles de su catabolismo es otro ejemplo de la versatilidad de la técnica. Sin embargo, como todas las mediciones de flujo se basan en la recuperación cuantitativa de cualquiera de las 3 H 2 O o 14 CO 2 a partir del efluente coronario, sólo dos radiomarcadortrazadores ed (uno 3 H-etiquetados y el otro marcado con 14 C) se puede utilizar en el tampón de perfusión a la vez. consideraciones metodológicas Existen algunas limitaciones inherentes a la medición de flujo metabólico y la función cardíaca mediante este protocolo. Aunque el uso de tampón KH permite un control total sobre la composición de la perfusión, la relevancia fisiológica de esta configuración experimental puede ser cuestionable. En primer lugar, el uso de una solución cristaloide sobre sangre se conoce un impacto negativo en la hemodinámica cardíaca y la resistencia a la isquemia 22,23. En segundo lugar, el tampón de perfusión que describimos aquí carece de una variedad de hormonas y nutrientes que pueden modular directamente el metabolismo cardiaco y por consiguiente afectar a la respuesta del corazón a una condición de estrés simulado. De hecho, el corazón de los mamíferos es un omnívoro metabólica y puede, además de glucosa y ácidos grasos, utilizar otros sustratos a fulfill sus necesidades energéticas (lactato, piruvato, cuerpos cetónicos, de cadena ramificada aminoácidos). Hay una creciente evidencia de que algunos de estos sustratos juegan un papel importante en la remodelación metabólica del corazón enfermo 24,25. Es perfectamente posible que el investigador para agregar estos sustratos para el tampón de perfusión, para modular su concentración con el fin de imitar más de cerca las diferentes condiciones fisiológicas (por ejemplo, estado de alimentación frente ayunas) o estados de enfermedad, y seguir sus tasas de oxidación utilizando la trazadores radiomarcados adecuados 26,27. El metabolismo de los triglicéridos también se puede remontar, y en ese caso se recomienda evitar el uso de heparina antes de la escisión del corazón, ya que esto induce la liberación de la lipoproteína lipasa del endotelio y disminuir de manera significativa la extracción de triglicérido de la memoria intermedia 28. Con una cuidadosa selección de los trazadores radiomarcados, la incorporación de radiactividad en varmetabolitos de tejido pagarés también se pueden medir después de la perfusión para determinar los parámetros tales como la síntesis de novo de triglicéridos, la rotación de glucógeno, o las tasas de síntesis de proteínas 18,29,30. En otras palabras, el investigador puede trabajar con una amplia variedad de sustratos / hormonas combinaciones y concentraciones. La elección de la composición del tampón dependerá principalmente de los objetivos del experimento. Debido a estas condiciones de tampón controladas crean un modelo fisiológico &quot;simplificado&quot;, los resultados de los experimentos de perfusión ex vivo de corazón de trabajo deben ser interpretados con precaución y si es posible los datos deben ser validados en vivo. Elección del anestésico El anestésico utilizado en las ratas antes de la extirpación del corazón debe cuidadosamente seleccionados en base a sus conocidos efectos sobre el sistema cardiovascular y el metabolismo para garantizar que esto no va a interferir con el experimento que se realiceed. Tanto los anestésicos inhalatorios inyectables y rápidamente inducen la hiperglucemia y grados variables de intolerancia a la glucosa que pueden afectar el metabolismo cardiaco durante la perfusión 31,32. En comparación con otros agentes, los efectos a corto plazo de los barbitúricos (pentobarbital y tiobutabarbital) en homeostasis de la glucosa son relativamente insignificante 31. Sin embargo, la anestesia pentobarbital intraperitoneal antes de la escisión corazón se ha demostrado que disminuye el gasto cardíaco, deteriorar la función ventricular izquierda, y aumentar la liberación de lactato de miocardio en un protocolo ex vivo de isquemia-reperfusión 33. El efecto inotrópico negativo que pentobarbital tiene en el corazón de rata aislado Se sugiere que es causada por la acumulación de tejido de la droga 34. Por el contrario el uso de anestésicos inhalatorios, que se lavan más rápidamente fuera del tejido cardiaco, se asocia con una mejor función contráctil ex vivo 33. Los anestésicos volátiles pueden proveer a cardioprotection durante la isquemia-reperfusión a través de un mecanismo que implica la apertura de los canales de K ATP mitocondrial y el aumento de la unión de la hexoquinasa a las mitocondrias 32. En resumen, el tipo de anestésico utilizado en un protocolo de perfusión del corazón aislado de trabajo es una variable importante en la evaluación de los parámetros funcionales y metabólicas que pueden afectar directamente a los resultados del experimento. Por lo tanto, el tipo y la dosis de anestésico usado siempre se deberán presentar en la sección de métodos de un experimento, y estos parámetros no se deben cambiar entre los experimentos que están destinados a ser comparado. Los radioisótopos en la perfusión del corazón Todas las mediciones de flujo realizadas con el protocolo anterior se realizan en el modo de no recirculación, lo que significa que el efluente coronario se descarta en lugar de ser devuelto al depósito de regulación (figura 1). El investigador más bien puedeelegir utilizar el aparato de perfusión en el modo de recirculación, que tiene la ventaja de requerir un volumen mucho menor de tampón y por lo tanto la radiactividad de operar. Sin embargo, el reciclado del efluente coronario compromete la composición en estado estacionario del tampón de perfusión a través de la recuperación de los subproductos procedentes de la actividad metabólica del corazón (incluyendo lactato, sino también 3 H 2 O y H 14 CO3-), lo que complica la determinación de flujos metabólicos y puede incluso alterar la función cardíaca con el tiempo 35. Estos problemas se evitan en la modalidad sin recirculación. Debido a la cantidad de radioactividad y al gran volumen de tampón de perfusión utilizado en un solo experimento, el investigador debe poner especial cuidado cuando se utiliza el corazón de rata que trabaja en los análisis de flujo metabólico. Cuando se utiliza un aparato de perfusión, por primera vez, se recomienda llevar a cabo varios experimentos simulados con tampón no radiactivo para familiarizarse con ladiferentes etapas del protocolo y con los procedimientos de seguridad. El montaje del corazón en las cánulas es un paso particularmente sensible, ya que requiere el establecimiento de un contacto cercano con el aparato y porque tampón pueden tener fugas o disparar hacia fuera de uno de los vasos sanguíneos seccionados del corazón. El aparato de perfusión descrita por Taegtmeyer y colegas 11 tiene la ventaja de que incluye un depósito Langendorff que es totalmente independiente del resto del aparato de perfusión, y por lo tanto puede ser llenado con tampón KH no radiactivo para evitar derrames de material radiactivo durante la canulación del corazón . Independientemente del sistema utilizado, los experimentos deben realizarse en un área dedicada con acceso restringido. El cuarto debe incluir un lavabo y un suministro de agua ultrapura para llevar a cabo la preparación de amortiguación y limpieza de equipo contaminado en la misma zona. Los investigadores deben trabajar en estrecha colaboración con la oficina de la seguridad radiológica de su institución para establecer sESPECÍFICOS procedimientos de descontaminación de contención, control y comunicaciones. La limpieza del aparato de perfusión El puesto de limpieza experimental del aparato de perfusión es un paso crítico que demasiado a menudo se pasa por alto y, si no son cuidadosamente ejecutada, responsable de la mayor parte de las cuestiones relacionadas con la mala reproducibilidad experimental. El tampón de perfusión rica en nutrientes y la alta temperatura del sistema de perfusión ofrecen condiciones ideales para el crecimiento de bacterias y hongos. La utilización de proteínas (insulina, BSA) y los ácidos grasos en el tampón de perfusión añade otro grado de complejidad al procedimiento de limpieza debido a que estos compuestos se adhieren a la superficie de la tubería y cristalería, haciendo difícil para eliminar del aparato. El uso de radioisótopos también impondrá restricciones adicionales, tales como la creación de un área de contención dedicado en el laboratorio para la manipulación de los equipos y la eliminación de un sólido contaminadod residuos radiactivos líquidos. Por lo tanto, el procedimiento de limpieza adecuada en su mayoría dependerá tanto de la composición del tampón de perfusión y del tipo de aparato de perfusión usado. Si se utiliza un aparato comercial, consulte el sitio web del fabricante o póngase en contacto con el servicio al cliente para obtener información sobre cómo realizar la limpieza sin dañar ninguno de los componentes del aparato. En general, todas las partes de vidrio y de plástico se pueden lavar con una amplia gama de jabones. detergentes accionados por enzimas activas son particularmente útiles para eliminar los residuos de ácido graso-BSA. La mayoría de los contaminantes también serán eliminados mediante la ejecución de HCl 0,1 M o 0,1 M HNO 3 a través del aparato durante varias horas. Obtenemos resultados de limpieza satisfactorios por el lavado del sistema primero con HCl 0,1 M, luego con una fresca 1% (w: v) de detergente alimentado enzima activo preparado en agua caliente, y finalmente enjuagando el sistema con agua ultrapura. Cuando se utiliza un aparato de perfusión hecha a la medida como la que originalmente described por Taegtmeyer y colegas 11, puede ser más fácil y más eficaz de desmantelar completamente el aparato al final de cada día experimental. El material de vidrio se limpia mediante una inmersión 15 min en un baño concentrada de un ácido crómico y la mezcla de ácido sulfúrico. Las piezas de plástico y el tubo de PVC se pueden lavar con un detergente libre de residuos. Encontramos que es más rápido y más fiable para reemplazar por completo el tubo de PVC todos los días, ya que limita la manipulación de material contaminado por radioquímicos y porque impide que queden residuos de productos de limpieza atrás. En cualquier caso, el investigador debe aplicar las siguientes reglas: 1- Limpiar el aparato de perfusión y todo el equipo sucio inmediatamente después de completar el experimento de perfusión. Esperar sólo hará que la limpieza sea más difícil y requiere mucho tiempo. 2- Compruebe el baño circulante del sistema de camisa de agua regularmente por contaminaciones. El uso de un acondicionador de agua aumentará el intervalo entre cinclinándose del baño de agua. 3- Después de la limpieza, enjuague bien el material de vidrio y tubos con agua del grifo varias veces y terminar de enjuagar con agua ultrapura para eliminar los residuos de productos de limpieza. 4- Dos preparaciones de corazón consecutivamente no cuando la disección fue cuidadosamente ejecutado y el tampón de perfusión cuidadosamente preparada es probable que indicar una contaminación del aparato (ya sea por bacterias o por residuos de disolvente). Si esto sucede, el lavado y enjuague de los procedimientos deben ser enteramente repiten. Alineándose con el corazón del ratón Aunque el protocolo anterior se centra en la determinación de las tasas metabólicas en un corazón de rata aislado de trabajo, los mismos procedimientos se pueden aplicar a la corazón de ratón con algunas modificaciones al aparato de perfusión y de adquisición de datos 36 equipos. Debido a su tamaño más pequeño es el corazón aislado de ratón de trabajo es técnicamente más difícil, pero debido a su forma significativatasa de flujo inferior que tiene la ventaja de requerir un volumen mucho menor de tampón de perfusión. El gran número de modelos de ratones genéticamente modificados que ya están disponibles también hace que el corazón aislado de ratón de trabajo muy atractivo para estudiar la función de un único producto génico en metabólica cardíaca y remodelación funcional. Sin embargo, los recientes avances tecnológicos en la edición del genoma y un catálogo cada vez mayor de ratas transgénicas y knockout están cerrando rápidamente la brecha entre las dos especies de roedores. Por otra parte, la rata durante mucho tiempo ha sido elogiado como un modelo animal superior para investigar las enfermedades cardiovasculares debido a su fisiopatología imita las condiciones humanas 37. Por estas razones, creemos que el corazón de rata aislado de trabajo todavía tienen un lugar importante en la era moderna de la investigación cardiovascular.

Relevancia clínica En el corazón de los mamíferos, hay una fuerte relación positiva entre el flujo de sustratos a través de las vías metabólicas oxidativas, la generación de ATP y el trabajo cardíaco 1. Durante las últimas dos décadas, la investigación de la intrincada relación entre el metabolismo y la función cardíaca se ha llevado a reconocer que las alteraciones en el metabolismo cardíaco son una causa para la disfunción contráctil y remodelación estructural posiblemente patológica en la fijación de diferentes tipos de enfermedades del corazón 2-4. por lo tanto, se espera que nuestra comprensión de los mecanismos que regulan la remodelación metabólica del corazón subrayado dará lugar a la identificación de dianas terapéuticas para la prevención o tratamiento de la insuficiencia cardíaca 5-7. La reciente publicación de una declaración científica de la American Heart Association sobre &quot;Evaluación de metabolismo cardíaco&quot;, subraya el creciente interés de la comunidad científica para tsu campo de investigación 8. Sin embargo, aunque los avances tecnológicos en imagen cardiaca ahora permiten una evaluación rápida y precisa de la morfología y la función cardíaca, el estudio in vivo del metabolismo cardiaco sigue siendo limitado y onerosa: la espectroscopia y resonancia magnética nuclear (RMN) Tomografía por Emisión de Positrones (TEP) puede se utiliza para seguir el metabolismo del fosfato de alta energía cardiaca y la actividad del ciclo de Krebs, pero estas técnicas se ven afectadas por los altos costos de operación y por su incapacidad para determinar la contribución de diversos sustratos para el metabolismo oxidativo en condiciones de estado estacionario 9 .Para esta fecha, el ex vivo trabajando preparación de corazón representa la sola y única técnica disponible para estudiar, de forma simultánea y en tiempo real, la función contráctil y el flujo de sustratos metabólicos oxidativos en las vías de 7,9. El siguiente protocolo tiene como objetivo proporcionar directrices para la preparación y utilización de los reactivos utilizados para determinar la rataes la utilización de sustratos en el corazón de rata aislado de trabajo. El aparato aislado del corazón de roedores de Trabajo Aunque la técnica es casi la mitad de un siglo de antigüedad, la preparación aislada de corazón de rata de trabajo sigue siendo un método de elección para la investigación cardiovascular. Al igual que con la preparación de corazón Langendorff, el corazón de roedores de trabajo ofrece una manera relativamente simple, fiable y de bajo costo para medir una amplia gama de parámetros cardíacos independientemente de los efectos de confusión de otros órganos, y otros factores neurohormonales circulantes. Pero en contraste con el corazón perfundido Langendorff, el corazón trabaja sigue llevando a cabo el trabajo cardíaco cercanas a las fisiológicas, un requisito previo para la generación de flujo metabólico oxidativo a niveles que son relevantes a las condiciones in vivo. Esto se logra mediante la entrega de la memoria intermedia de perfusión en el ventrículo izquierdo (VI) a través de una cánula conectada a la aurícula izquierda, y como el LV se llena y se contrae, latampón es expulsado a través de la línea aórtica frente a una presión hidrostática de la poscarga determinado. El diseño del aparato de perfusión descrito originalmente por Neely et al 10 fue mejorado posteriormente por Taegtmeyer, dobladillos y Krebs 11, pero ha cambiado muy poco desde entonces. Como se describe en el aparato original, la función contráctil se puede evaluar mediante la determinación del gasto cardíaco, utilizando no más de probetas graduadas y un cronómetro para medir los flujos aórtico y coronario 10,11. Varios vendedores ofrecen ahora sistemas completos de roedores de trabajo de perfusión del corazón. Estos aparatos disponibles en el mercado se puede adquirir con flowprobes, transductores de presión, un catéter de presión-volumen y todo el equipo necesario para la adquisición de datos de la función cardíaca y el análisis. Los proveedores ofrecen extensas sesiones de documentación y formación para familiarizar a los nuevos usuarios con sus equipos. Varios artículos de revisión también protocolos de detalle en el corazón trabaja instrumentación y en el uso de catéteres para medir la función cardiaca en los roedores 12-15. Por esta razón, sólo mencionaremos brevemente la configuración del aparato de perfusión y el aparato de control. El presente protocolo y no tiene por objeto complementar la información ya disponible con una descripción de los métodos que se pueden implementar para medir simultáneamente las tasas de glucosa y la oxidación de ácidos grasos de cadena larga, los dos principales sustratos energéticos que proporciona en el corazón normal. Describimos aquí todos los pasos implicados en el uso de sustratos de energía radiomarcados para la evaluación del metabolismo oxidativo del miocardio, de la preparación de los reactivos y tampones a la recuperación y procesamiento de las muestras, al análisis de datos. Principios del método Cardiomiocitos generan la mayor parte de su energía para la contracción de la fosforilación oxidativa de los ácidos grasos (ácidos grasos de cadena larga principalmente) y carbohidratos (Glucose y lactato). El corazón se ha muy limitada reservas energéticas y depende de un suministro constante de estos sustratos de energía que proporciona a partir de la circulación. El catabolismo de la glucosa a través de la vía glucolítica produce piruvato que después se descarboxila por el complejo piruvato deshidrogenasa de la membrana mitocondrial interna. ácidos grasos de cadena larga, extraídos de circulación de albúmina o lipoproteína de triglicéridos, se activan primero en moléculas de acil-CoA en el citosol y posteriormente transportados dentro de la matriz mitocondrial a través de la lanzadera de la carnitina para entrar en la vía de oxidación beta. Las moléculas de acetil-CoA producidos por el catabolismo de la glucosa y los ácidos grasos combustible el ciclo de Krebs para generar los equivalentes reductores (NADH y FADH 2) que son utilizados por la cadena de transporte de electrones para construir la fuerza protón-motriz través de la membrana mitocondrial interna y generar ATP a través de la actividad de la ATP sintasa. Agua y dióxido de carbono son los subproductos de extremo delas reacciones enzimáticas que tienen lugar dentro del ciclo de Krebs. El suministro de 14 C y 3 H- sustratos radiomarcados (como 14 C-glucosa radiomarcada y ácido oleico 3 H-radiomarcado) para el corazón aislado de trabajo será por consiguiente dar lugar a la producción de 14 CO 2 y 3 H 2 O que puede recuperar cuantitativamente a partir del efluente coronario. La colección de 14 CO 2 se lleva a cabo manteniendo el corazón aislado y perfundido en una cámara sellada y por la recuperación inmediatamente el efluente coronario a medida que sale del corazón. Una columna pequeña de intercambio aniónico se usa para separar y recuperar 3 H 2 O del efluente coronario. La radiactividad de las muestras procesadas se mide con un contador de centelleo líquido, y con el conocimiento de la actividad específica de los sustratos radiomarcados utilizado, entonces es posible cuantificar de forma individual el flujo de glucosa y ácido graso en lala oxidación vías 16,17.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4*7H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AG 1-X8 resin, chloride form, 100-200 dry mesh size, 500 g</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1401441</td>
			<td>This item can be replaced by purchasing directly the hydoxide form&#160; (see reference below), but this will cost almost 8 times more</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AG 1-X8 resin, hydroxide form, 100-200 dry mesh size, 100 g</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1432445</td>
			<td>Purchasing this item allows to bypass the conversion of the anion exchange resin from the chloride form to the hydroxide form (See section 1.2 of protocol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Microanalysis Vacuum Filter Holder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-753-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318</td>
			<td>Corrosive. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Dispersion Tube with Fritted Cylinder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-138B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>820027</td>
			<td>We recommend the use of a charcoal-defatted BSA, as other purification process such as cold ethanol fractionation may leave residues toxic for the heart.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Oleate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O7501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic Acid, [9,10-3H(N)]-</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NET289005MC</td>
			<td>Radioactive material. Follow your Institution&#39;s radiation safety office guidelines for ordering and handling.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane Tubing, 29 mm diameter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-667E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose, D-[14C(U)]-</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC042B005MC</td>
			<td>Radioactive material. Follow your Institution&#39;s radiation safety office guidelines for ordering and handling.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humulin R U-100</td>
			<td>Eli Lilly and Company</td>
			<td>NDC 0002-8215-01 (HI-210)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inactin Hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T133</td>
			<td>Controlled substance on USDEA Schedule III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 Silk Black Braid</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>SUT-15-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Hyamine Hydroxide</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6003005</td>
			<td>Highly toxic and causes severe burns. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL Glass Scintillation Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-341-25E</td>
			<td>Use glass vials for quantitative recovery of 14CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL HDPE Scintillation Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-23B</td>
			<td>Use HDPE vials for quantitative recovery of 3H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Rubber Sleeve Stoppers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-126DD</td>
			<td>Fit 20 mL scintillation vials; Reusable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle 23G x 40 mm</td>
			<td>BD</td>
			<td>305194</td>
			<td>Use to inject perchloric acid through the rubber sleeve stopper of the CO2 trap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perchloric Acid, 60%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A228</td>
			<td>Highly corrosive and may act as an oxidizer and/or cause an explosion hazard. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultima Gold, Scintillation Cocktail</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6013327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Wool</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC38606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decon Dri-Clean Detergent Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355</td>
			<td>For cleaning of glassware, plastic parts, and tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alconox Tergazyme Enzyme-Active Powered Detergent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-000-115</td>
			<td>For cleaning of &#34;hard to reach&#34; surfaces (tubing, glassware) contaminated by fatty acid-BSA residue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for the determination of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart

El corazón de los mamíferos es un gran consumidor de ATP y requiere un suministro constante de sustratos de energía para la contracción. No es sorprendente, alteraciones del metabolismo del miocardio se han relacionado con el desarrollo de la disfunción contráctil y la insuficiencia cardíaca. Por lo tanto, desentrañar la relación entre el metabolismo y la contracción debe arrojar luz sobre algunos de los mecanismos que regulan la adaptación cardiaca o mala adaptación en estados de enfermedad. La preparación de corazón de rata aislado de trabajo se puede utilizar para seguir, de forma simultánea y en tiempo real, la función contráctil cardiaca y el flujo de la energía proporcionando sustratos en las vías metabólicas oxidativas. El presente protocolo tiene como objetivo proporcionar una descripción detallada de los métodos utilizados en la preparación y la utilización de tampones para la medición cuantitativa de las tasas de oxidación de glucosa y los ácidos grasos, la energía principal que proporciona sustratos del corazón. También se discuten los métodos utilizados para el análisis de muestras y la interpretación de datos.En resumen, la técnica se basa en el suministro de 14 C-glucosa marcada radiactivamente y un ácido graso de cadena larga radiomarcado 3 H- a un corazón latiendo a través de la perfusión ex vivo cristaloides normotérmica. 14 CO 2 y 3 H 2 O, subproductos finales de las reacciones enzimáticas implicadas en la utilización de estos sustratos de energía que proporciona, a continuación, se recuperaron cuantitativamente a partir del efluente coronario. Con el conocimiento de la actividad específica de los sustratos radiomarcados usados, es entonces posible cuantificar de forma individual el flujo de glucosa y ácidos grasos en las vías de oxidación. la función contráctil del corazón aislado se puede determinar en paralelo con el equipo de grabación apropiada y directamente correlacionado con los valores de flujo metabólico. La técnica es muy útil para estudiar la relación metabolismo / contracción en respuesta a diversas condiciones de estrés, tales como alteraciones en pre y después de la carga y de la isquemia, un fármaco o una Circulafactor de ting, o después de la alteración en la expresión de un producto génico.

Dos experimentos representativos se describen en las siguientes figuras. En ambos casos, se aisló el corazón de un 16 semanas de edad macho Sprague Dawley de rata perfundido y en el modo de trabajo con tampón KH preparado de acuerdo con el protocolo anterior. En cada experimento, el corazón se sometió a una condición de estrés para afectar el trabajo cardíaco. la función contráctil cardiaca se evaluó por registro continuo de la presión de pulso a través de la inserción de un transductor de presión en la línea aórtica y por la determinación de la energía cardiaca. Las consecuencias de cada condición de estrés en la utilización de sustratos de energía proporcionando al mismo tiempo se determinaron por medición de las tasas de glucosa y la oxidación de oleato. En el primer experimento, un aumento agudo de la carga de trabajo se simuló después de 20 min de perfusión en la carga de trabajo cercana a la fisiológica mediante el aumento de la poscarga por 40% (consigue manualmenteel aumento de la cámara de desbordamiento aórtica) y mediante la adición de epinefrina (1 mol / L) al tampón de perfusión (Figura 3A). La frecuencia cardíaca, que puede ser determinado midiendo el intervalo entre los valores de pico de presión sistólica en la traza de la presión de pulso, aumentó inmediatamente por más de 50% después de la inducción workjump (Figura 3B). Potencia cardiaca aumentó en más de un 40% a workjump, que fue acompañado por un aumento en las tasas de glucosa y la oxidación de oleato (Figura 3C). Los resultados muestran que, bajo la presión de un aumento agudo en la carga de trabajo, el corazón se adapta rápidamente a aumentar la generación de energía para la contracción de la glucosa y la oxidación de ácidos grasos. Sin embargo, el aumento relativo de la velocidad de oxidación era más importante para la glucosa (~ 2,8 veces) lo que era para oleato (~ 1,3 veces). El aumento de la dependencia de la oxidación de hidratos de carbono para hacer frente a la carga de trabajo adicional es una característica típica del corazón de los mamíferos sobrecarga de presión-18 </sup&gt;. En el segundo experimento, el corazón se perfundió en condiciones basales durante 20 min seguido de 15 min,, isquemia normotérmica mundial (inducido por el cierre tanto de la fibrilación y las líneas de la aorta) y 30 min de reperfusión (Figura 4A). En estas condiciones experimentales, una presión de pulso casi normal fue restaurado entre 2 y 3 min después del comienzo de la reperfusión (Figura 4B). Potencia cardiaca aumentó rápidamente por encima de los valores anteriores a la isquemia durante los primeros 10 minutos de la reperfusión antes de caer de nuevo a los valores cercanos a la línea de base (Figura 4C). En comparación con la línea de base, la velocidad de oxidación de oleato se incrementó durante la reperfusión, mientras que la oxidación de glucosa rápidamente vuelto a los niveles pre isquémicos. Al medir simultáneamente la función contráctil y las tasas de oxidación de sustratos uno puede apreciar claramente que, en las presentes condiciones experimentales, la variación en las tasas de óxido de ácidos grasosación es el principal determinante de los cambios en la cantidad de trabajo generados en la reperfusión. El interruptor de alta hacia la utilización de ácidos grasos de post isquemia es una característica bien estalished-reperfundido del corazón 19. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54497/54497fig1.jpg" /> Figura 1:. Simplificado Esquema del aislado Aparato corazón de rata de Trabajo El tampón de Krebs-Henseleit complementado con la solución de ácido graso-BSA se oxigena mediante el paso a través de un oxigenador de membrana. valores de precarga y poscarga cardíacas típicas para un corazón de rata perfundido en condiciones cercanas a las fisiológicas se indican. Los ajustes se pueden modificar mediante el ajuste de la altura del embalse auricular y cámara de desagüe aórtica. Los tubos de jeringas graduadas se han colocado debajo de la cámara del corazón y la cámara de desbordamiento de la aorta con el fin de medir el flujo coronario y el flujo aórtico, respectivamente. El flujo detampón puede ser detenido (cuando la medición de los flujos aórticos y coronarios) o desviado (cuando se cambia de la Langendorff para el modo de trabajo) mediante el uso de llaves de paso de tres vías. Las flechas rojas indican el posicionamiento óptimo para conexión en línea microlelectrodes de oxígeno para determinar la diferencia de oxígeno &quot;arteriovenosa&quot;. En la línea de sondas de flujo y transductores de presión se pueden colocar en las líneas de precarga y la poscarga para medir las tasas de flujo auricular y la aorta y las presiones (flechas verdes). presiones y volúmenes del ventrículo izquierdo también se pueden grabar con un catéter PV insertado a través del vértice del ventrículo izquierdo. No se muestra en la figura es la camisa de agua que rodea todos los elementos de cristalería y el tubo de perfusión en el color azul oscuro. Estos elementos con camisa de agua están todos conectados en serie mediante un tubo a un baño de agua circulante a 37 ºC. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54497/54497fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de t</a>su figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54497/54497fig2.jpg" /> Figura 2:. La representación de los diferentes pasos en la configuración del CO 2 Trampa (A) Añadir 1 ml de 10x concentrada de hidróxido de hiamina. (B) Añadir una muestra de 0,5 ml contenida en un tubo sin tapón. (C) sellar el vial. (D) Inyectar 200 l de ácido perclórico (60% w: w%). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54497/54497fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54497/54497fig3.jpg" /> Figura 3: Los resultados representativos de un experimento Workjump (A) registro continuo de la presión del pulso.. (B) Breve engrabación valo que representa el cambio en la presión del pulso en el momento de la iniciación workjump. (C) las tasas cardíacas de oxidación de la glucosa (trazo rojo con círculos) y la oxidación de oleato (trazo azul con cuadrados) se determinaron mediante análisis del efluente coronario en un intervalo de 5 min. Potencia cardiaca (trazo negro con triángulos) se determina mediante la medición del gasto cardiaco al mismo tiempo, se recuperaron las muestras de los efluentes coronarios. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54497/54497fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54497/54497fig4.jpg" /> Figura 4: Los resultados representativos de un experimento por isquemia-reperfusión (A) registro continuo de la presión del pulso.. (B) la grabación de intervalo corto que representa la recuperación de la función contráctil dusonar los primeros 5 minutos de la reperfusión. (C) las tasas cardiacas de oxidación de la glucosa (trazo rojo con círculos) y la oxidación de oleato (trazo azul con cuadrados) se determinaron mediante análisis del efluente coronario en un intervalo de 5 minutos, excepto durante los primeros 5 minutos de la reperfusión, donde se realizaron análisis en un intervalo de 1 min. Potencia cardiaca (trazo negro con triángulos) se determina mediante la medición del gasto cardiaco al mismo tiempo, se recuperaron las muestras de los efluentes coronarios. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54497/54497fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.

Los métodos para la determinación de las tasas de glucosa y la oxidación de ácidos grasos en el corazón de rata aislado de Trabajo

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

methods-for-determination-rates-glucose-fatty-acid-oxidation-isolated

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.6K vistas.  University of Mississippi Medical Center. The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.

Video: Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in common laboratory rats or mice and these quite frequently serve as an intermediate step between bench-top experiments and large animal testing or human trials. Given that rodents provide an established, cost-effective, and physiologically-relevant model system in which to test novel combinations of scaffolding materials and cells, they are particularly well-suited for cardiovascular tissue engineering studies. Presently, we describe an open-heart surgical procedure to implant engineered tissue containing myogenic progenitor cells in the atrioventricular (AV) groove of a rat heart. These implants are intended to create an electrical conduit between the right atrium and right ventricle with the ultimate goal of providing an alternative treatment to conventional pacemaker implantation in pediatric patients with complete heart block[1]. The engineered tissue is implanted in the AV-groove by means of a thoracotomy. For our purposes, Lewis rats are anesthetized and invasively ventilated to maintain positive airway pressure during the sterile surgical procedure. The approach to the heart is performed by a right thoracotomy through an antero-lateral incision at the 5th intercostal space. The tissue construct is fixed in the AV groove using a single 7-0 Prolene suture and positioned between the right ventricle and atrium at the ventral portion of the heart. The epicardium is partially removed to allow direct contact between the recipient myocardial cells and those contained in the engineered tissue. Following implantation, the chest wall is closed in layers, any pneumothorax is evacuated, and the animal is extubated and treated with analgesic.

Here, we describe a cardiac surgical procedure to implant engineered tissue in the atrioventricular (AV)-groove of an adult Lewis rat.

Implantación de la ingeniería tisular en el corazón de rata

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

Investigación

Biología

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

Visualizar el corazón latiendo en Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoproteomics cuantitativo de ácidos grasos estimulada Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Measures of Heart and Ventilatory Rates in Freely Moving Crayfish

The fear, flight or fight response serves as the fundamental physiological basis for examining an organism's awareness of its environment under an impending predator attack.  Although it is not known whether invertebrates posses an autonomic nervous system identical to that of vertebrates, evidence shows invertebrates have a  sympathetic-like  response to regulate the internal environment and ready the organism to act behaviorally to a given stimuli.  Furthermore, this physiological response can be feasibly measured and it acts as a biological index for the animal's internal state.  Measurements of the physiological response can be directly related to internal and external stressors through changes in the central nervous system controlled coordination of the cardio-vascular and respiratory systems.   More specifically, monitoring heart and ventilation rates provide quantifiable measures of the stress response not always behaviorally observed. Crayfish are good model organisms for heart and ventilatory rate measurements due to the feasibility of recording, as well as the rich history known of the morphology of the crayfish, dating back to Huxley in 1888, and the well-studied typical behaviors.

Invertebrates show an autonomic sympathetic-like response similar to that described for vertebrates. The coordination of the cardio-vascular and ventilatory systems allows for measurement of a biological index in which to assess an organism internal state.

Medidas de las frecuencias cardíaca y respiratoria en movimiento libre del cangrejo de río

The fear, flight or fight response serves as the fundamental physiological basis for examining an organism's awareness of its environment under an ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Preparación de embriones para Microscopía Electrónica de la Drosophila Tubo cardíaco embrionario

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

La cuantificación de γH2AX focos en respuesta a la radiación ionizante

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone H2AX1,2. This phosphorylation of H2AX is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)3. The phosphorylated form of H2AX, referred to as &gamma;H2AX, spreads to adjacent regions of chromatin from the site of the DSB, forming discrete foci, which are easily visualized by immunofluorecence microscopy3. Analysis and quantitation of &gamma;H2AX foci has been widely used to evaluate DSB formation and repair, particularly in response to ionizing radiation and for evaluating the efficacy of various radiation modifying compounds and cytotoxic compounds4.
Given the exquisite specificity and sensitivity of this de novo marker of DSBs, it has provided new insights into the processes of DNA damage and repair in the context of chromatin. For example, in radiation biology the central paradigm is that the nuclear DNA is the critical target with respect to radiation sensitivity. Indeed, the general consensus in the field has largely been to view chromatin as a homogeneous template for DNA damage and repair. However, with the use of &gamma;H2AX as molecular marker of DSBs, a disparity in &gamma;-irradiation-induced &gamma;H2AX foci formation in euchromatin and heterochromatin has been observed5-7. Recently, we used a panel of antibodies to either mono-, di- or tri- methylated histone H3 at lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) which are epigenetic imprints of constitutive heterochromatin and transcriptional silencing and lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), which are tightly correlated actively transcribing euchromatic regions, to investigate the spatial distribution of &gamma;H2AX following ionizing radiation8. In accordance with the prevailing ideas regarding chromatin biology, our findings indicated a close correlation between &gamma;H2AX formation and active transcription9. Here we demonstrate our immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in non-adherent cells, with a particular focus on co-localization with other epigenetic markers, image analysis and 3D-modeling.

Evaluation of the Spatial Distribution of &#947;H2AX following Ionizing Radiation

Microscopic analysis of &gamma;H2AX foci, which form following the phosphorylation of H2AX at Ser-139 in response to DNA double-strand breaks, has become an invaluable tool in radiation biology. Here we used an antibody to mono-methylated histone H3 at lysine 4 as an epigenetic marker of actively transcribing euchromatin, to evaluate the spatial distribution of radiation-induced &gamma;H2AX formation within the nucleus.

Evaluación de la distribución espacial de la radiación ionizante γH2AX siguientes

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

La cuantificación individual Microvessel Permeabilidad en aislado de rata Blood-perfundido Preparación de pulmón

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid oxidation, or alternatively, synthesize new lipid via de novo lipogenesis. The net sum of these pathways is dictated by a number of factors, which in certain disease states leads to fatty liver disease. Excess hepatic lipid accumulation is associated with whole body insulin resistance and coronary heart disease. Tools to study lipid metabolism in hepatocytes are useful to understand the role of hepatic lipid metabolism in certain metabolic disorders.
In the liver, hepatocytes regulate the breakdown and synthesis of fatty acids via &#946;-fatty oxidation and de novo lipogenesis, respectively. Quantifying metabolism in these pathways provides insight into hepatic lipid handling. Unlike in vitro quantification, using primary hepatocytes, making measurements in vivo is technically challenging and resource intensive. Hence, quantifying &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis in cultured mouse hepatocytes provides a straight forward method to assess hepatocyte lipid handling. 
Here we describe a method for the isolation of primary mouse hepatocytes, and we demonstrate quantification of &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled substrates.

De novo lipogenesis and &#946;-fatty acid oxidation constitute key metabolic pathways in hepatocyte, pathways that are perturbed in several metabolic disorders, including fatty liver disease. Here we demonstrate isolation of mouse primary hepatocytes and describe quantification of &#946;-fatty acid oxidation and lipogenesis.

Determinación de la oxidación de ácidos grasos y la lipogénesis en el ratón hepatocitos primarios

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways that cannot be accomplished in vivo. For example, inotropic medications commonly also affect preload and afterload, precluding load-independent assessments of their myocardial effects in vivo. Additionally, this model allows for sampling of coronary sinus effluent without contamination from systemic venous return, permitting assessment of myocardial oxygen consumption. Further, the advent of miniaturized pressure-volume catheters has allowed for the precise quantification of markers of both systolic and diastolic performance. We describe a model in which the left ventricle can be studied while performing both volume and pressure work under controlled conditions. 
In this technique, the heart and lungs of a Sprague-Dawley rat (weight 300-500 g) are removed en bloc under general anesthesia. The aorta is dissected free and cannulated for retrograde perfusion with oxygenated Krebs buffer. The pulmonary arteries and veins are ligated and the lungs removed from the preparation. The left atrium is then incised and cannulated using a separate venous cannula, attached to a preload block. Once this is determined to be leak-free, the left heart is loaded and retrograde perfusion stopped, creating the working heart model. The pulmonary artery is incised and cannulated for collection of coronary effluent and determination of myocardial oxygen consumption. A pressure-volume catheter is placed into the left ventricle either retrograde or through apical puncture. If desired, atrial pacing wires can be placed for more precise control of heart rate. This model allows for precise control of preload (using a left atrial pressure block), afterload (using an afterload block), heart rate (using pacing wires) and oxygen tension (using oxygen mixtures within the perfusate).

Isolated working heart models can be used to measure the effect of loading conditions, heart rate, and medications on myocardial performance and oxygen consumption. We describe methods for preparation of a rodent left heart working model that permits study of systolic and diastolic performance and oxygen consumption under various conditions.

Roedor de Trabajo Modelo del corazón para el estudio sobre los resultados de miocardio y el consumo de oxígeno

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...