O equipamento e as experiências descritas aqui foram financiados pelo Departamento de Cardiologia do Hospital Infantil de Boston e por doações filantrópicas da família Haseotes. Somos gratos a Drs. Frank McGowan e Huamei Ele por nos fornecer as primeiras experiências com este modelo, e Lindsay Thomson para obter ajuda com trabalhos de arte.

Este protocolo é realizada sob um protocolo atual em comissão de cuidados com os animais e a utilização da instituição. 1. Preparação para o Estudo <ol><li> Ligar o banho de água para aquecer o reservatório de tampão de Krebs-Henseleit (KHB) (definido como 42 ° C). </li><li> Preparar 16 litros de KHB contendo (em mM) 128 de NaCl, 5,7 de KCl, 1,3 MgSO4, 25 NaHCO3, 2,7 CaCl2, 0,53 de EDTA, 0,54 NaC 3 H 3 O 3, e 10,8 dextrose. 13 As massas de substrato são como se segue : 27,584 g de NaCl, 1,58 g de KCl, 0,578 g de MgSO4, 8,401 g de NaHCO3, 1,47 g de CaCl2, 0,744 g de EDTA, 0,22 g de NaC 3 H 3 O 3, e 7,208 g de dextrose. Nota: estes componentes podem ser armazenados em tubos cónicos na forma de pó para reconstituição no dia da experimentação. <ol><li> Filtro de 4 L de água desionizada através de um filtro de 0,22 micron. </li><li> Adicionar 3,7 L de água a esta de 4 Ltaça. Adicionar todos os componentes, excepto para CaCl2 à água. </li><li> Dissolve-se o CaCl2 nos restantes 300 ml de água utilizando um copo separado. </li><li> Oxigenar a solução com 95% de O2 / 5% de CO 2 a 1 L / min (LPM) durante 5 min. Isto corrige o pH para 7,40 e aumenta a dissolução do CaCI2. </li><li> Adicionar o CaCl 2 a parte restante do KHB. </li><li> Adicione o KHB concluído para um reservatório e circular por toda a tubulação para 30 min. Certifique-se de que o sistema está livre de bolhas macroscópicos. Oxigenado com 95% O2 / 5% de CO 2 a 0,5 LPM. NOTA: KHB pode ser armazenado durante a noite no frigorifico durante não mais do que 1 - 2 dias, trazida de volta para a temperatura ambiente e filtrou-se para re-utilização. Não reutilize KHB entre os experimentos. </li><li> Prepare 2 x 50 ml copos limpos com KHB gelada e coloque-os em um balde de gelo perto da estação de dissecção. Certifique-se de que a KHB é frio (e não refrigerados) antes de ex<html> plantando o coração. </li><li> Posicionar o cateter de micro pressão-volume (PV) numa seringa de 10 ml cheia com KHB filtrada durante 30 min antes da calibração, conforme as instruções do fabricante. NOTA: Temperatura de KHB usada para embeber o cateter PV deve ser o mais próximo de 37 ° C quanto possível. </li></ol></li><li> Preparar a anestesia e a estação de dissecação para o animal. <ol><li> Certifique-se de isoflurano adequada no reservatório. Elaborar 500 U de heparina numa seringa de 1 ml; colocar uma agulha de calibre 26 (1/2 &quot;) nesta seringa. Prepara-se uma máscara para anestesiar o animal. </li></ol></li><li> Ajuste a pressão bloco de perfusão aórtica 80 mmHg eo átrio esquerdo (AE) pressão bloco de perfusão 10 mmHg. tanto o bloco aórtica aberta e bloco de LA para permitir quente KHB a escorrer para fora. Quando estiver pronto para dissecar o animal, abrir o bloco aórtica para permitir um gotejamento lento constante de KHB fora. </li><li> Calibra-se o cateter fotovoltaico de acordo com as instruções dos fabricantes. </li></ol>&quot;&gt; 2. Preparação Animal e Dissection NOTA: Para obter melhores resultados, certifique-animal é entre 300 e 500 g; verificou-se que um peso do animal entre 425-450 g é ideal para o nosso sistema. <ol><li> Anestesiar o animal numa câmara de isoflurano utilizando (1 - 2%) até que o animal está inconsciente. Transferir o animal para a estação de dissecção e colocar a máscara de anestesia com isoflurano e oxigénio no animal. Execute toe pitada para avaliar o nível de sedação. Aplicar vet pomada nos olhos para evitar a secura e sob anestesia. </li><li> Injectar heparina, 500 unidades por via intraperitoneal na cavidade abdominal. Permitir 10 min para a heparina de forma a ser absorvido. Fixe os membros do animal com fita para melhorar a visualização do tórax. </li><li> A dissecção do coração. <ol><li> Depois de assegurar que não há resposta a um aperto do dedo do pé, levantar a pele para longe da cavidade abdominal com uma pinça e, em seguida, utilizar tesouras de incisão da cavidade peritoneal, a seguir a curva de tele diafragma volta ao ângulo posterior das costelas. </li><li> Uma vez que o diafragma é visível, utilizando uma tesoura pequena, cortados ao longo da superfície anterior do diafragma seguindo a direcção dos cortes anteriores para permitir a entrada no tórax. Estender cada corte ao longo da linha axilar bilateral para a axila. NOTA: Os próximos passos devem ser realizados de forma eficiente uma vez que a ventilação será comprometida uma vez que o diafragma é incisão. </li><li> Retrair a caixa torácica anterior do processo xifóide usando uma pinça. Inciso pericárdio e pleura. </li><li> Identificar a veia cava inferior (VCI) e aorta logo acima do diafragma e retraem-los em bloco anterior usando uma pinça sem corte. </li><li> Usando grandes, tesoura curva, rapidamente fazer uma incisão através da VCI e aorta, puxando o coração e os pulmões para fora do peito em bloco. Corte as esófago, traqueia, artérias e veias braquiocefálicas cefálica para remover o coração e os pulmões do tórax. Extirpar o teutecido mic com este bloco de tecido. Tome cuidado para não cortar a porção proximal da aorta ascendente. </li><li> imediatamente mergulhe o coração e os pulmões em KHB gelada e passar para o aparelho de Langendorff, previamente configurado conforme descrito na etapa 1. </li></ol></li></ol> 3. aórtica Canulação <ol style="margin-left: 40px;"><li> Colocar o complexo de coração-pulmão de um prato liso e orientar o coração com o timo e grandes vasos de frente para o experimentador e do aspecto posterior dos pulmões de frente para a mesa. Separar os dois lóbulos do timo e identificar a decolagem das artérias braquiocefálicas da aorta. <ol><li> Armar a aorta ao longo da borda do prato e transecto da aorta usando uma tesoura pequena aproximadamente 5 mm acima da válvula aórtica, apenas proximal à decolagem da artéria subclávia direita. NOTA: A incisão deve render um círculo limpo - a aorta na secção transversal. Se estiver desligado angular (ou seja, uma grande oval)ou incompleta, repetir o corte para atingir o resultado desejado. Isso irá facilitar o uso da aorta eficiente. </li></ol></li><li> Usando 2 pares de pinças curvas em ambos os lados da aorta, orientar a aorta através da cânula aórtica (que deve ser gotejando lentamente com KHB). A válvula aórtica deve sentar-se 1 - 2 mm abaixo da ponta da cânula. <ol><li> Após punção aorta, reposicionar a pinça perpendicularmente ao longo da aorta para segurar a aorta no lugar. Alternativamente, coloque uma pequena braçadeira do outro lado da aorta para manter o complexo de pulmão coração no lugar, permitindo que um único experimentador para completar este modelo. </li></ol></li><li> Ter um assistente passar um fio de seda 4-0 logo abaixo do fórceps e gravata no lugar, looping em torno da cânula e amarrando várias vezes, tanto na frente e atrás do coração. Abra a cânula totalmente para começar fluxo aórtico retrógrada completo. Observe o coração bater vigorosamente. NOTA: Se o coração não começa a bater rapidamente (~ 200 BPM) e vigorosamente, oamarrar ou cânula podem ser ocluir uma ou de ambas as artérias coronárias. Se esse é suspeito, remova o empate e reposicioná-lo longe das artérias coronárias. Se o coração distende e não bater, a cânula pode ser através da válvula aórtica. Em caso de vazamento da artéria coronária (sprays KHB a partir da raiz da aorta), o avanço da cânula mais perto da válvula aórtica (este fenómeno pode ocorrer se a artéria inominada é canular no lugar da aorta ascendente). </li></ol> 4. Veia Pulmonar Oclusão e Preparação da artéria pulmonar para Canulação NOTA: O objectivo deste passo é o de criar um sistema do átrio esquerdo fechado para assegurar que todo o volume e a pressão a partir do bloco átrio esquerdo é transmitida para as estruturas do coração esquerdo. Fracasso para ocluir completamente as veias pulmonares pode resultar em deficiência de pré-carga e pode falsificar resultados ou criar uma preparação de coração de trabalho instável. <ol><li> Remover o timo para melhorar a exposição de the artéria pulmonar (AP). </li><li> rodar manualmente a cânula da aorta de modo a que o aspecto posterior do coração está de frente para o operador. Dissecar os vasos principais para o pulmão direito. Suspender o tecido pulmonar direita usando uma pinça para delinear mais destes navios. Usando grampos cirúrgicos de médio-grande (ou sutura), oclusão da artéria pulmonar direita e veia e brônquios com um único clipe. Ressecar o distal pulmão direito ao clipe. NOTA: Devido a dificuldade de dissecção da artéria pulmonar livre, a nossa prática é a oclusão das veias pulmonares para a distensão da artéria pulmonar, tornando mais fácil para inciso sem prejudicar as estruturas vizinhas em um modelo de coração batendo. </li><li> Repita o passo 4,2 no pulmão esquerdo. NOTA: armadilhas potenciais e resolução de problemas: Uma vez que ambas as artérias pulmonares são ocluído, o átrio direito visivelmente distender e o coração pode tornar-se bradicardia. Isto é porque o ventrículo direito fica pressurizado. Se isto não ocorre, é provável que o pulmveias onary não são completamente obstruída, e a pré-carga que irá ser insuficiente para trabalhar o modo de coração. Se o coração não é capaz de manter o débito cardíaco após atrial esquerdo (AE) canulação e tentativa de transição para o coração (veja abaixo) de trabalho, considerar a colocação de clipes adicionais ou um laço ao redor dos troncos das veias pulmonares para ocluir qualquer vazamento residual. Uma vez que os APs são ocluídas, no entanto, Passo 5 deve ser efectuada imediatamente para minimizar a isquemia do miocárdio. Note-se que alguns investigadores incisão na artéria pulmonar antes da ligação das veias pulmonares para evitar a pressurização do ventrículo direito. </li><li> incisão arterial pulmonar <ol><li> Girar a cânula da aorta de modo a que o aspecto anterior do coração está de frente para o operador. Identificar a artéria pulmonar. Mais uma vez, esta artéria pode ser distendido. Com uma tesoura pequena fazer uma incisão transversal aproximadamente 3 mm acima da válvula pulmonar. NOTA: Este será imediatamente aliviar a pressão ea frequência cardíaca pode aumentar. Estarcausar esta cânula é fácil para desalojar, canular a artéria pulmonar após canulação do átrio esquerdo é completa. </li></ol></li></ol> 5. Atrial Esquerdo Canulação <ol><li> Girar a cânula da aorta de modo a que o átrio esquerdo está de frente para o operador. Usando as pequenas tesouras, fazer um 2 - mm incisão 3 na parte superior do corpo do átrio esquerdo, cerca de 3 mm acima do sulco atrioventricular. <ol><li> Posicione a cânula atrial esquerda perpendicular ao plano da válvula mitral e apontou para o septo atrial. </li><li> Abra a cânula LA KHB até que flui. Certifique-se de que a KHB é quente ao toque (fica frio rapidamente quando sentado em qualquer tubo não revestido), a fim de evitar a disfunção miocárdica devido à hipotermia seguinte transição para o modo de funcionamento. Transição para uma taxa de gotejamento durante a punção. </li></ol></li><li> Utilizando uma pinça para segurar contra-tração, insira a cânula atrial para o corpo do átrio esquerdo, tomando cuidado para não usar excessive força, que pode rasgar o átrio. NOTA: O LA cânula deve ser posicionado de modo que fica no meio do átrio sem qualquer tensão na parede atrial. </li><li> Passe uma sutura de seda 4-0 ao redor do corpo do átrio esquerdo e dê um nó para criar um selo do átrio ao redor da cânula. Ter o cuidado de assegurar que a face posterior do átrio esquerdo está incluído na sutura. Adicionar suturas adicionais, conforme necessário. Uma vez selado, puxar a cânula para trás 1 - 2 mm, de modo que fica no meio do átrio e não contra o septo auricular. NOTA: O motivo mais comum que o coração se torna malperfused na transição para trabalhar modo de coração é que a cânula LA confina com o septo atrial, que obstrui entrada do átrio esquerdo. O traçado LA muitas vezes muda de demonstrar uma adequada uma onda de onda e v quando a cânula é na posição correta (veja a Figura 2E). </li><li> Abrir a válvula de LA cânula para administrar inteiramente a pré-carga completa ao átrio esquerdo. monitorar otaxa de gotejamento do coração (que vem de efluentes coronária). Certifique-se de que a taxa de gotejamento não muda quando a cânula LA está aberta. Se isso acontecer, retie o átrio em torno da cânula, como descrito no passo 6.4, como tal representa uma fuga no sistema. </li></ol> 6. A canulação da artéria pulmonar e Transição para Trabalho Modo Coração <ol><li> Se a medição do consumo de oxigênio pelo miocárdio (ou outras substâncias em efluentes coronária, tais como os níveis da droga ou citocinas), insira 1/32 &quot;tubo flexível dentro da incisão antes na artéria pulmonar. NOTA: O consumo de oxigênio é medido como a diferença no teor de oxigénio entre perfusato atrial esquerda e efluentes artéria pulmonar 2. <ol><li> Para a medição contínua do consumo de oxigênio pelo miocárdio, usar um eletrodo de oxigênio in-line para comparar atrial esquerda e efluente do seio coronário. </li><li> Recolha efluente do seio coronário (tanto da artéria pulmonar e pingando do coração) em um cil formouinder para quantificação temporizada de fluxo coronário. </li><li> Calcule o consumo de oxigênio pelo miocárdio, como descrito anteriormente. 2 </li></ol></li><li> A transição para o trabalho modo de coração, desligando a bomba retrógrada da aorta. NOTA: Quando isto é feito, a pressão torna-se LA a pressão de pré-carga e o resistor que foi anteriormente proporcionando resistência à bomba retrógrada no modo de Langendorff proporciona agora resistência ao débito cardíaco, a criação de uma pressão arterial média. Se a pressão arterial média declina abaixo ~ 80 mmHg, a causa provavelmente está relacionado a qualquer pré-carga ou a função miocárdica. O problema mais provável é a cânula atrial esquerdo, que deve ser ajustada depois de reiniciar a bomba retrógrada. </li></ol> 7. Inserção do Ventrículo Esquerdo Cateter Volume Pressão NOTA: O cateter PV pode ser colocado quer retrógrada (através da válvula aórtica) ou através de punção apical. O benefício de retrógrada é que pOSIÇÃO é mais consistente e que obvia a necessidade de punção apical e os riscos concomitantes de lesão coronária ou perda de pré-carga. No entanto, a colocação retrógrada às vezes pode ser muito desafiador, por isso, descrevem ambas as técnicas aqui. <ol><li> Anexar um cateter 1,4 pressão-volume francês para o sistema de circuito de volume pressão. Calibrar o sistema em KHB quente de acordo com as instruções do fabricante. Assegurar a forma de onda é visível em tempo real. Traga o cateter e cabos perto da superfície do VE, de modo a não deslocar-lo após a colocação. </li><li> Para a colocação retrógrada, abra a válvula ajustável e alimentar o cateter PV gentilmente através da válvula aórtica até a pressão estável e forma de onda de volume são identificados. Evite o uso excessivo da força, que pode danificar a válvula aórtica ou perfurar o ápice ventricular. NOTA: Nós descobrimos que é importante para minimizar o comprimento da tubulação e número de voltas que o cateter PV deve navegar para abordar o AV. istopode ser útil para reduzir a tubagem que vem com o sistema. </li><li> Para a colocação apical, use um 24 G angio-cateter para criar uma punção apical no VE. Certifique-se de evitar a artéria descendente anterior coronária. Aponte a agulha na direcção da válvula aórtica do ápice ventricular. Avançar o cateter de pressão-volume no corpo da LV. Pare o avanço do cateter, logo que a pressão e o volume da forma de onda do LV é identificado. </li><li> Uma vez que o cateter de pressão-volume está no lugar, movimentar a camisa de água em posição à volta do coração. Fixar o cateter para a parede da camisa de água com um pequeno pedaço de fita adesiva. </li><li> Certifique-se de, pelo menos, um período de 30 min da estabilidade antes de iniciar quaisquer medidas ou intervenções. </li></ol> 8. A infusão de medicação <ol><li> (Opcional) infundir medicamentos (por exemplo, dopamina) para o bloco do átrio esquerdo, utilizando uma bomba de medicação padrão. NOTA: Temos medicamentos dosados ​​de acordo com o whole peso do corpo do animal desde que o fluxo equivalente a um débito cardíaco inteira passa através do bloco de fibrilação; apenas uma pequena porção desta passa através da circulação coronária, como faz in vivo. Alternativamente, um segundo conjunto de perfusato pode ser criada com uma concentração predefinida de medicação e utilizada para perfundir o coração. NOTA: Em nosso protocolo, nós infundir medicamentos ao longo de um período de 12 min, a coleta de dados fisiológicos durante a final de 10 minutos de cada infusão e comparando-o a um imediatamente anterior 10 min de base. </li></ol> 9. Manipulações fisiológicas <ol><li> Frequência cardíaca <ol><li> (Opcional) sutura dois fios de estimulação na parede do átrio direito e anexar a um dispositivo temporário de estimulação. NOTA: Este permite um controlo preciso da taxa cardíaca (acima da taxa sinusal nativa) e uma compreensão da relação entre a frequência cardíaca e da contractilidade independente de um medicamento cardiotónico. </li></ol></li><li> preload <ol><li> variar apré-carga (definido como o volume diastólico final do ventrículo esquerdo), variando a altura da coluna de alimentação do bloco átrio esquerdo. </li></ol></li><li> Pressão sanguínea <ol><li> Manipular a pressão arterial (o principal determinante da pós-carga neste modelo) usando as válvulas de pressão na IH-51. </li></ol></li><li> teor de oxigénio coronária <ol><li> Realizar vários graus de hipóxia miocárdica por perfusão do coração com KHB saturado em várias misturas de gases. Faça isso usando reservatórios encamisados ​​separados (cada um com a sua própria mistura de gás) para assegurar o equilíbrio entre o gás e KHB. </li><li> Realizar isquemia coronária por meio de sutura ligar uma artéria coronária distal. NOTA: A ligadura das artérias coronárias proximais no modo de coração de trabalho pode resultar em disfunção miocárdica letal. </li><li> Induzir isquemia coronária mundial, interrompendo ou retardando perfusão retrógrada por um período de tempo definido. </li></ol></li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

Este modelo de coração de trabalho permite a avaliação do desempenho ventricular com controle total da pré-carga ventricular e pós-carga, tensão de oxigênio do perfusato, bem como a frequência cardíaca. Entre outros fatores, que permite a avaliação dos efeitos do miocárdio intrínsecas de medicamentos inotrópicos independentes da pós-carga e pré-carga, que maneiras que não são possíveis utilizando um modelo in vivo. Porque este modelo utiliza um perfusato cristalóide, que permite a avaliação do miocárdio sem interferência da hemoglobina, o que simplifica a análise espectroscópica de estados de energia do miocárdio, por exemplo. 14 Neste modelo, o átrio direito não é canulada como parte de nossa instrumentação, embora seja possível ao fazê-lo. Nós intencionalmente escolheu não fazê-lo, a fim de facilitar a amostragem de fluxo seio coronário para a avaliação do consumo de oxigênio pelo miocárdio. Importante, porém, o coração direito ainda executa o trabalho pressão e volume neste modelo, uma vez que as bombas de cosinus coronário fluir para dentro da cânula da artéria pulmonar. Fornecendo algum pré-carga do ventrículo direito melhora o posicionamento do septo ventricular e melhora o desempenho do ventrículo esquerdo, e é um componente importante deste modelo. 15 Existem várias armadilhas experimentais de mencionar. A primeira é a canulação retrógrada inicial, a qual deve ser executada de modo expedito (isto é, em menos de 2 min) para minimizar o período de isquemia. A habilidade mais importante mestre é o isolamento eficiente, preparação e manipulação da aorta ascendente. É importante que o coto aórtico não ser cortado excessivamente curto, deixando espaço suficiente para a canulação por cima da válvula da aorta. No entanto, também é importante que o coto aórtico não ser demasiado longo, o que pode causar torqueing da aorta em torno da cânula. Também é importante que a cânula da aorta e da raiz da aorta ser apropriadamente escolhidos de tamanho. Um excessivamente grande aorta em uma pequena cânula também podelevar a torqueing da raiz da aorta na cânula. A artéria subclávia direita normalmente tira da aorta ascendente aproximadamente 7 mm acima da válvula aórtica. Identificar os vasos braquiocefálicos (cerca de 1 mm de diâmetro) durante a dissecção e corte da aorta servem como marcos importantes para a incisão aórtica transversal. Aparar a aorta logo abaixo da decolagem do primeiro artéria inominada é aconselhável. A inclusão deste navio na raiz da aorta aparado geralmente leva a um vazamento de KHB e perda de pressão da raiz da aorta após a transição para o modo de funcionamento do coração. Outro aspecto tecnicamente desafiador de canulação é a canulação do átrio esquerdo. Embora seja possível para canular o apêndice atrial esquerdo, verificou-se que a cânula frequentemente fica preso dentro do apêndice, e não passar facilmente para dentro do corpo do átrio esquerdo. Assim, prefere-se fazer a incisão no corpo do átrio esquerdo, aproximadamente2 mm superior ao sulco atrioventricular. É importante para posicionar a cânula da auricula esquerda no plano correcto antes da inserção, a fim de evitar que se rasgue o átrio parede fina ao fixar a cânula. Verificou-se que o tamanho ideal da incisão átrio esquerdo foi de aproximadamente 3 mm. Criando muito pequena de uma incisão também pode fazer a colocação da cânula da auricula esquerda mais difícil, e pode levar à ruptura do átrio esquerdo. Nós usamos um 8 mm, peça reta, chanfrada do tubo de oxigênio-impermeável (diâmetro interno 2,9 mm) no bloco do átrio esquerdo. Verificou-se que utilizando este, em vez de uma cânula com um bordo chanfrado, leva a canulação fibrilação mais consistente e facilita o processo de fixação do bloco átrio esquerdo. Independentemente da tubagem utilizada, é importante para garantir que a extremidade do tubo não é obstruída pelo septo atrial ou a válvula mitral (como acima descrito, verificou-se que o traçado da pressão atrial esquerda foi útil neste Regard), como até mesmo sutil movimento da cânula atrial pode alterar significativamente a pré-carga do ventrículo esquerdo e medidas hemodinâmicas resultantes. Pela mesma razão, é importante para garantir que o átrio esquerdo não vaza seguinte após a abertura do bloco átrio esquerdo. É importante, independentemente do tipo de tubo utilizado para assegurar que o tubo dentro deste sistema é impermeável ao oxigénio para garantir a entrega de oxigénio adequado ao coração. Outro aspecto um desafio técnico do processo foi a colocação do cateter de pressão-volume (PV). Nós inicialmente favoreceu uma colocação retrógrada do cateter através do bloco da aorta. Embora tecnicamente viável, que encontramos a ser muito mais simples e conveniente para colocar o cateter PV através de punção transapical. Deve ser tomado cuidado para monitorizar a posição do cateter ao longo da duração da experiência, como por vezes o cateter pode mover-se dentro ou para fora do ventrículo esquerdo. Isto pode ser feito através da monitorização do pressuRe e traçados de volume ao longo do tempo. Finalmente, os cuidados devem ser tomados para garantir que a solução KHB é criado fresco para cada experimento. É possível pesar os constituintes de KHB e armazená-los em tubos cônicos em forma de pó antes do tempo. No dia da experimentação, estes podem ser misturados com água estéril, filtrada, dióxido de carbono / oxigénio, e, em seguida, adição de cálcio à mistura. É também importante para lavar o sistema com um detergente em pó activo da enzima, tais como Tergazyme (ou semelhante) e substituir o filtro perfusato regularmente. Vários limitações desta preparação experimental, devem ser observadas. Primeiro, semelhante a todas as preparações de Langendorff perfundido-cristalóides, KHB e outras perfusatos asanguinous têm um oxigênio diminuiu significativamente a capacidade de carga em relação ao sangue. Embora esta é parcialmente compensada através da vasodilatação coronária e fluxo coronário suprafisiológica, a preparação não é inteiramente physiologiC por esta razão. Em segundo lugar, devido à conformidade quase infinita da câmara Windkessel utilizado no presente instrumento, as pressões sistólica e diastólica são apenas minimamente separada (ver Figura 2A) e, assim, a pressão de perfusão coronária é não fisiológica. Isto pode ser superado em modelos futuros através da incorporação de um componente Elastância ao bloco de pós-carga. Em terceiro lugar, como com todas as preparações de coração isolado, o coração passa por um período definido (2-3 min) de isquemia quente, que é susceptível de criar lesão miocárdica ou disfunção. Minimizando esta lesão através da prática da técnica é de extrema importância para resultados representativos. Além disso, embora necessário para o bem-estar animal, os anestésicos inalados pode servir como um supressor do miocárdio no início do processo de reperfusão, embora seja esperado que este efeito é rapidamente abolida como o coração é reperfundidos com KHB. O sistema descrito permite trabalhar o coração para uma ampla variedade de Physiolinvestigações OGIC relevantes para a assistência ao paciente, pesquisa e ensino. Com algumas modificações adicionais, o sistema também pode ser utilizado para simular a fisiologia importante relevante para a doença cardíaca congénita, incluindo a hipertensão pulmonar e fisiologia único ventrículo. As limitações incluem a que é uma preparação ex vivo, que o coração está a ser perfundido por um tampão, em vez de um sangue de conteúdo de oxigénio mais elevado.

O estudo dos órgãos isolados permite o controle das condições fisiológicas além do que é possível in vivo. Ex vivo preparações de coração foram descritos pela primeira vez por Otto Langendorff, 1, que descreveu um modelo isolado com perfusão retrógrada. Posteriormente, outros descreveram o modelo &quot;working heart&quot;, em que o miocárdio executa tanto o trabalho de pressão e volume. 2 Estas preparações têm sido fundamentais para elucidar os mecanismos de ação do miocárdio, 3 metabolismo miocárdico, 4-6 e efeitos de medicamentos cardiotônicos. 7- 9 O uso de medicamentos que melhoram a contratilidade miocárdica é comum em pacientes criticamente enfermos. No entanto, poucos dados disponíveis comparando os efeitos relativos desses medicamentos na contratilidade e do consumo de oxigênio pelo miocárdio, os dados que podem ser úteis no tratamento de pacientes com sinais clínicos de insuficiência cardíaca de no cenário pós-operatória. 10 No entanto, porque a maioria dos medicamentos cardiotônicos afectam não só o miocárdio, mas também a resistência arteriolar, capacitância venosa 11, e da taxa metabólica de um paciente, 12 ex vivo modelos em corações isolados continuam a ser os meios ideais pelos quais a estudar os efeitos de tais medicamentos no miocárdio adequada. Descreve-se a utilização de um modelo ex vivo para o estudo independente da carga de fármacos inotrópicos na função do miocárdio e do consumo de oxigénio. Corações de ratos Sprague Dawley foram canulada usando um ventrículo esquerdo trabalhando modelo de coração e perfusão usando um perfusato Krebs Henseleit modificado. pressões da aorta e átrio esquerdo foram controlados. Pressão-volume cateteres de impedância foram colocadas no ventrículo esquerdo através de punção apical para a monitorização contínua da função sistólica e diastólica. O consumo de oxigênio foi continuamente medida como a diferença indexada no teor de oxigénio entre perfus do átrio esquerdocomeram e o efluente da artéria pulmonar. Os medicamentos a serem testados foram infundidas no bloco do átrio esquerdo, e alterações no metabolismo do desempenho cardíaco e oxigénio foram medidos e comparados com uma linha de base imediatamente anterior.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="685">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:132px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">S5761</td>
			<td style="width:161px;">8.401 g/4 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>0.744 g/4 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>1.580 g/4 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>0.578 g/4 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2256</td>
			<td>0.220 g/ 4 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>27.584 g/4 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9434</td>
			<td>7.208 g/4 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td>1.470 g/4 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biventricular working heart model</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>IH-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pressure volume catheter</td>
			<td>Millar, Inc</td>
			<td>SPR-944-1</td>
			<td>6 mm spacing catheter used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LabChart Pro 8</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>Version 8.1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rodent working heart model for the study of myocardial performance and oxygen consumption

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways that cannot be accomplished in vivo. For example, inotropic medications commonly also affect preload and afterload, precluding load-independent assessments of their myocardial effects in vivo. Additionally, this model allows for sampling of coronary sinus effluent without contamination from systemic venous return, permitting assessment of myocardial oxygen consumption. Further, the advent of miniaturized pressure-volume catheters has allowed for the precise quantification of markers of both systolic and diastolic performance. We describe a model in which the left ventricle can be studied while performing both volume and pressure work under controlled conditions. 
In this technique, the heart and lungs of a Sprague-Dawley rat (weight 300-500 g) are removed en bloc under general anesthesia. The aorta is dissected free and cannulated for retrograde perfusion with oxygenated Krebs buffer. The pulmonary arteries and veins are ligated and the lungs removed from the preparation. The left atrium is then incised and cannulated using a separate venous cannula, attached to a preload block. Once this is determined to be leak-free, the left heart is loaded and retrograde perfusion stopped, creating the working heart model. The pulmonary artery is incised and cannulated for collection of coronary effluent and determination of myocardial oxygen consumption. A pressure-volume catheter is placed into the left ventricle either retrograde or through apical puncture. If desired, atrial pacing wires can be placed for more precise control of heart rate. This model allows for precise control of preload (using a left atrial pressure block), afterload (using an afterload block), heart rate (using pacing wires) and oxygen tension (using oxygen mixtures within the perfusate).

Um diagrama esquemático de um coração totalmente instrumentada em perfusão retrógrada (Figura 1A) e no coração de trabalho ventricular esquerda (Figura 1B). Aórticas típica, átrio esquerdo e pressão ventricular esquerda e de volume traçados são mostrados na Figura 2A -. D A pressão típica diastólico final é de cerca de 3 - 5 mm Hg neste modelo, e o pico de pressão sistólica é de cerca de 100 mmHg Figura 2E mostra a mudança. no lado esquerdo rastreio fibrilação quando a cânula LA é movido para longe do septo atrial durante a colocação e posicionamento da cânula. Nestas experiências, a pressão aórtica foi fixado em 90 mm Hg, e a pressão LA foi ajustado para 10 mmHg. Para testar os efeitos das catecolaminas, cada parâmetro fisiológico (derivado principalmente a partir do cateter de pressão-volume e software associado) foi comparado com o que precede imediatamente<html> período de referência. No exemplo mostrado, a dopamina foi infundida a 15 ng / kg / min para dentro do bloco átrio esquerdo. Embora a pressão diastólica final é idêntica nas duas condições (dada a pressão atrial corrigido neste modelo), o volume diastólico final do ventrículo esquerdo diminui em 2,5%, e o volume sistólico final do ventrículo esquerdo diminui 4,9%, obtendo-se um aumento do volume sistólico (Figura 3A). Em comparação com as infusões de placebo, o trabalho ventricular esquerda acidente vascular cerebral, identificada como a área dentro da curva de pressão-volume, um aumento de 32% durante o tratamento com a dopamina (Figura 3B, P &lt;0,001, teste t, n = 10 por grupo). Isto foi associado com um maior aumento no consumo de oxigénio do miocárdio em relação ao placebo infusões (Figura 3C). Desta forma, os custos de energia e potência relativas de diferentes medicamentos cardiotónicos e doses pode ser comparado a um outro independente dos seus efeitos sobre as condições de carga. conteúdo &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54149/54149fig1.jpg" /> Figura 1: Diagrama de Fluxo em um coração totalmente instrumentada em retrógrado perfusão e Modo Coração de Trabalho (Painel A: modo de Langendorff; Painel B:.. Modo de coração a trabalhar no modo retrógrado, KHB é infundida a uma pressão de ajuste de perfusão na raiz da aorta. este modo é utilizado para recuperar o miocárdio seguinte tempo de isquemia e durante a instrumentação. ao trabalhar modo de coração, perfusato flui através do coração esquerdo antes de perfusão da circulação coronária. neste modo, o miocárdio deve gerar sua própria pressão de perfusão. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54149/54149fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54149/54149fig2.jpg" /> FIGURA 2: Pressão Representante e Desconto traçados obtidos durante as medições da linha de base. (A) Pressão na raiz aórtica, (B) a pressão atrial esquerda, (C) a pressão ventricular esquerda e (D) traçados volume ventricular esquerdo durante uma medida de referência são exibidos. O volume sistólico, trabalho acidente vascular cerebral, o débito cardíaco, tau, e outros parâmetros podem ser automaticamente calculado e exibida em tempo real pelo software. Um traçado embotada átrio esquerdo (E) associada a um débito cardíaco pobre no modo coração de trabalho pode ser um indício de que a cânula é mal posicionado no átrio esquerdo. Note que o v onda de destaque no traçado de pressão do átrio esquerdo bem colocado é comum, provavelmente devido a uma diminuição da complacência atrial esquerda no animal totalmente instrumentada. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54149/54149fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 3: Efeito da dopamina. Sobre a pressão-volume Curva da infusão de dopamina resulta em um deslocamento para a esquerda na curva de PV (A), incluindo um aumento do volume da pulsação, diminuiu terminar volume sistólico, em comparação com as medições da linha de base. Note-se que a forma de alguns componentes destas curvas PV diferem daqueles tipicamente medida in vivo (ver Figura 4), ​​devido à ausência de pressão arterial e Elastância venosa. (B) relativa a uma linha de base imediatamente anterior, o trabalho de acidente vascular cerebral aumentou significativamente mais durante as infusões de dopamina do que o placebo (**, P = 0,0017, teste t), assim como o consumo de oxigénio do miocárdio (*, P = 0,013, t-teste, C). Usando esse modelo, o consumo de oxigênio do miocárdio médio na linha de base foi de 0,22 ± 0,02 mmol O2 / grama de tecido / minuto, utilizando um dissolv estimadoEd teor de oxigénio de 165 nmol / L em solução salina a 40 ° C. Tais medições podem ser usados ​​para comparar o consumo de oxigênio do miocárdio de vários medicamentos. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54149/54149fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54149/54149fig4.jpg" /> Figura 4: Análise de Loops Desconto Pressão. The Loop Pressão-Volume teórico Mostrado descreve o ciclo normal cardíaca após o fechamento da válvula aórtica (AV) (1), a contração isovolêmica ocorre (1 - 2). Como a pressão ventricular cai abaixo da pressão atrial. A duração desta fase está representada por Tau. A válvula mitral (MV), em seguida, abre simultaneamente com a sístole auricular, o enchimento do ventrículo (2-3). Sístole, em seguida, começa com contracti isovolêmicaem (3-4) até que a pressão ventricular exceder a pressão arterial diastólica, momento em que o abre AV. Volume sistólico é a diferença entre as linhas 1 - 2 e 3 -. 4 trabalho acidente vascular cerebral é a área dentro da 1 - 2 - 3 -. Curva 4 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54149/54149fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Isolated working heart models can be used to measure the effect of loading conditions, heart rate, and medications on myocardial performance and oxygen consumption. We describe methods for preparation of a rodent left heart working model that permits study of systolic and diastolic performance and oxygen consumption under various conditions.

Roedor Trabalho Modelo do coração para o estudo do desempenho do miocárdio eo consumo de oxigênio

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

rodent-working-heart-model-for-study-myocardial-performance-oxygen

Research

JoVE Journal

Biology

20.0K visualizações.  Boston Children’s Hospital. Isolated working heart models can be used to measure the effect of loading conditions, heart rate, and medications on myocardial performance and oxygen consumption. We describe methods for preparation of a rodent left heart working model that permits study of systolic and diastolic performance and oxygen consumption under various conditions.

Vídeo: Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Teste de sensibilidade visual para a velocidade e direção do movimento em Lagartos

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Biologia

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In particular, understanding the constraints on visual signal design for communication has been of great interest. Traditional methods for investigating animal interactions have used basic observational techniques, staged encounters, or physical manipulation of morphology. Less intrusive methods have tried to simulate conspecifics using crude playback tools, such as mirrors, still images, or models. As technology has become more advanced, video playback has emerged as another tool in which to examine visual communication (Rosenthal, 2000). However, to move one step further, the application of computer-animation now allows researchers to specifically isolate critical components necessary to elicit social responses from conspecifics, and manipulate these features to control interactions. Here, I provide detail on how to create an animation using the Jacky dragon as a model, but this process may be adaptable for other species. In building the animation, I elected to use Lightwave  3D to alter object morphology, add texture, install bones, and provide comparable weight shading that prevents exaggerated movement. The animation is then matched to select motor patterns to replicate critical movement features. Finally, the sequence must rendered into an individual clip for presentation. Although there are other adaptable techniques, this particular method had been demonstrated to be effective in eliciting both conspicuous and social responses in staged interactions.

Computer-generated stimuli using the Jacky dragon as a model.

Gerados por computador Modelo Estímulos animal

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

LAD-Ligation: A Murine Model of Myocardial Infarction

Research models of infarction and myocardial ischemia are essential to investigate the acute and chronic pathobiological and pathophysiological processes in myocardial ischemia and to develop and optimize future treatment.
Two different methods of creating myocardial ischemia are performed in laboratory rodents. The first method is to create cryo infarction, a fast but inaccurate technique, where a cryo-pen is applied on the surface of the heart (1-3). Using this method the scientist can not guarantee that the cryo-scar leads to ischemia, also a vast myocardial injury is created that shows pathophysiological side effects that are not related to myocardial infarction. The second method is the permanent ligation of the left anterior descending artery (LAD). Here the LAD is ligated with one single stitch, forming an ischemia that can be seen almost immediately. By closing the LAD, no further blood flow is permitted in that area, while the surrounding myocardial tissue is nearly not affected. This surgical procedure imitates the pathobiological and pathophysiological aspects occurring in infarction-related myocardial ischemia.
The method introduced in this video demonstrates the surgical procedure of a mouse infarction model by ligating the LAD. This model is convenient for pathobiological and pathophysiological as well as immunobiological studies on cardiac infarction. The shown technique provides high accuracy and correlates well with histological sections.

This video demonstrates how to use a fast and reliable model to study pathobiological and pathophysiological processes of myocardial ischemia.

LAD Ligadura: Um Modelo murino de Infarto do Miocárdio

Research models of infarction and myocardial ischemia are essential to investigate the acute and chronic pathobiological and pathophysiological processes ...

Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon

For both scientific and animal welfare reasons, training in basic surgical concepts and techniques should be undertaken before ever seeking to perform surgery on a rodent. Students, post-doctoral scholars, and others interested in performing surgery on rodents as part of a research protocol may not have had formal surgical training as part of their required coursework. Surgery itself is a technical skill, and one that will improve with practice. The principles of aseptic technique, however, often remain unexplained or untaught. For most new surgeons, this vital information is presented in piecemeal fashion or learned on the job, neither of which is ideal. It may also make learning how to perform a particular surgery difficult, as the new surgeon is learning both a surgical technique and the principles of asepsis at the same time. This article summarizes and makes recommendations for basic surgical skills and techniques necessary for successful rodent surgery. This article is designed to supplement hands-on training by the user's institution.

Before attempting surgery, a new surgeon should have training in basic surgical techniques and concepts. This article will present basic surgical considerations with an emphasis on rodents.

Princípios de Cirurgia de roedores para o Cirurgião Nova

For both scientific and animal welfare reasons, training in basic surgical concepts and techniques should be undertaken before ever seeking to perform ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

Todo-mount Análise imuno-histoquímica para Vascularização embrionárias Limb pele: um sistema modelo para estudar Morfogênese Branching Vascular em Embrião

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Abordagens genéticas e bioquímicas para<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; Avaliação de oligomerização da proteína: A Case Study rianodina Receptor

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of myocardial metabolism have been linked to the development of contractile dysfunction and heart failure. Therefore, unraveling the link between metabolism and contraction should shed light on some of the mechanisms governing cardiac adaptation or maladaptation in disease states. The isolated working rat heart preparation can be used to follow, simultaneously and in real time, cardiac contractile function and flux of energy providing substrates into oxidative metabolic pathways. The present protocol aims to provide a detailed description of the methods used in the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of the rates of oxidation for glucose and fatty acids, the main energy providing substrates of the heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed. In brief, the technique is based on the supply of 14C- radiolabeled glucose and a 3H- radiolabeled long-chain fatty acid to an ex vivo beating heart via normothermic crystalloid perfusion. 14CO2 and 3H2O, end byproducts of the enzymatic reactions involved in the utilization of these energy providing substrates, are then quantitatively recovered from the coronary effluent. With knowledge of the specific activity of the radiolabeled substrates used, it is then possible to individually quantitate the flux of glucose and fatty acid in the oxidation pathways. Contractile function of the isolated heart can be determined in parallel with the appropriate recording equipment and directly correlated to metabolic flux values. The technique is extremely useful to study the metabolism/contraction relationship in response to various stress conditions such as alterations in pre and after load and ischemia, a drug or a circulating factor, or following the alteration in the expression of a gene product.

The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.

Os métodos para a determinação das taxas de glicose e ácido gordo oxidação no coração isolado de rato de Trabalho

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

Medição das taxas de consumo de oxigênio em intacta Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Intrathoracic Injection for the Study of Adult Zebrafish Heart

The adult zebrafish heart provides a powerful model in cardiac regeneration research. Although the strength of this system is based on transgenic approaches, a rapid delivery of exogenous factors provides a complementary technique in functional studies. Here, we present a method that relies on administration of a few microliters of solution into the pericardial cavity without causing myocardial damage. Intrathoracic (IT) injections can efficiently deliver proteins and chemical compounds directly onto the heart surface. The injected substances diffuse through the epicardium into the underlying cardiac tissues. Compared to intraperitoneal (IP) injections, the main advantage of intrathoracic injections is the focal administration of the tested factors on the target organ. The delivery of molecules directly into the pericardium is a suitable strategy for studies of cardiac preconditioning and regeneration in adult zebrafish.

This method relies on the injection of 0.5&#8722;3 &#956;L of solution into the thorax of adult zebrafish. The procedure efficiently delivers proteins and chemical compounds into the proximity of the zebrafish heart without damaging the organ. The approach is suitable for testing effects of exogenous factors on various tissues of the heart.

Injeção intratorácica para o estudo do coração de zebrafish adulto

The adult zebrafish heart provides a powerful model in cardiac regeneration research. Although the strength of this system is based on transgenic ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer progression. How the chromosomal location and function of a centromere (i.e., centromere identity) are determined and participate in accurate chromosome segregation is a fundamental question. CENP-A is proposed to be the non-DNA indicator (epigenetic mark) of centromere identity, and CENP-A ubiquitylation is required for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability.
Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-CENP-A K124R mutant suggesting that ubiquitylation at a different lysine is induced because of the EYFP tagging in the CENP-A K124R mutant protein. Lysine 306 (K306) ubiquitylation in EYFP-CENP-A K124R was successfully identified, which corresponds to lysine 56 (K56) in CENP-A through mass spectrometry analysis. A caveat is discussed in the use of GFP/EYFP or the tagging of high molecular weight protein as a tool to analyze the function of a protein. Current technical limit is also discussed for the detection of ubiquitylated bands, identification of site-specific ubiquitylation(s), and visualization of ubiquitylation in living cells or a specific single cell during the whole cell cycle.
The method of mass spectrometry analysis presented here can be applied to human CENP-A protein with different tags and other centromere-kinetochore proteins. These combinatory methods consisting of several assays/analyses could be recommended for researchers who are interested in identifying functional roles of ubiquitylation.

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

CENP-A ubiquitylation is an important requirement for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability. Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) protein.