This work was supported by National Institutes of Health Grants R00 HL112952 (to R. H.), R01 HL108618 (to J.P.G.), P01 HL051971, and P20 GM104357. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.

<ol>
	<li>Neely, J. R., Morgan, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+carbohydrate+and+lipid+metabolism+and+the+energy+balance+of+heart+muscle.">Relationship between carbohydrate and lipid metabolism and the energy balance of heart muscle.</a> Annu Rev Physiol. 36, 413-459 (1974).</li><li>Sen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+regulation+of+load-induced+mTOR+signaling+and+ER+stress+in+mammalian+heart.">Glucose regulation of load-induced mTOR signaling and ER stress in mammalian heart.</a> J Am Heart Assoc. 2, e004796 (2013).</li><li>Young, M. E., McNulty, P., Taegtmeyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+and+maladaptation+of+the+heart+in+diabetes:+Part+II:+potential+mechanisms.">Adaptation and maladaptation of the heart in diabetes: Part II: potential mechanisms.</a> Circulation. 105, 1861-1870 (2002).</li><li>Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+substrate+metabolism+in+the+normal+and+failing+heart.">Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart.</a> Physiol Rev. 85, 1093-1129 (2005).</li><li>Fillmore, N., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+mitochondrial+oxidative+metabolism+as+an+approach+to+treat+heart+failure.">Targeting mitochondrial oxidative metabolism as an approach to treat heart failure.</a> Biochim Biophys Acta. 1833, 857-865 (2013).</li><li>Jaswal, J. S., Keung, W., Wang, W., Ussher, J. R., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+fatty+acid+and+carbohydrate+oxidation--a+novel+therapeutic+intervention+in+the+ischemic+and+failing+heart.">Targeting fatty acid and carbohydrate oxidation--a novel therapeutic intervention in the ischemic and failing heart.</a> Biochim Biophys Acta. 1813, 1333-1350 (2011).</li><li>Taegtmeyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+metabolism+as+a+target+for+the+treatment+of+heart+failure.">Cardiac metabolism as a target for the treatment of heart failure.</a> Circulation. 110, 894-896 (2004).</li><li>Taegtmeyer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+Cardiac+Metabolism:+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association.">Assessing Cardiac Metabolism: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Circ Res. , (2016).</li><li>Barr, R. L., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodology+for+measuring+in+vitro/ex+vivo+cardiac+energy+metabolism.">Methodology for measuring in vitro/ex vivo cardiac energy metabolism.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 43, 141-152 (2000).</li><li>Neely, J. R., Liebermeister, H., Battersby, E. J., Morgan, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pressure+development+on+oxygen+consumption+by+isolated+rat+heart.">Effect of pressure development on oxygen consumption by isolated rat heart.</a> Am J Physiol. 212, 804-814 (1967).</li><li>Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+energy-providing+substrates+in+the+isolated+working+rat+heart.">Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart.</a> Biochem J. 186, 701-711 (1980).</li><li>Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+continuing+evolution+of+the+Langendorff+and+ejecting+murine+heart:+new+advances+in+cardiac+phenotyping.">The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, H156-H167 (2012).</li><li>Cingolani, O. H., Kass, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure-volume+relation+analysis+of+mouse+ventricular+function.">Pressure-volume relation analysis of mouse ventricular function.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301, H2198-H2206 (2011).</li><li>Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Batkai, S., Kass, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cardiac+function+using+pressure-volume+conductance+catheter+technique+in+mice+and+rats.">Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats.</a> Nat Protoc. 3, 1422-1434 (2008).</li><li>Abraham, D., Mao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Pressure-Volume+Loop+Analysis+Using+Conductance+Catheters+in+Mice.">Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice.</a> J Vis Exp. , (2015).</li><li>Harmancey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+improves+metabolic+and+contractile+efficiency+in+stressed+rat+heart.">Insulin resistance improves metabolic and contractile efficiency in stressed rat heart.</a> FASEB J. 26, 3118-3126 (2012).</li><li>Harmancey, R., Vasquez, H. G., Guthrie, P. H., Taegtmeyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+long-chain+fatty+acid+oxidation+impairs+postischemic+recovery+of+the+insulin-resistant+rat+heart.">Decreased long-chain fatty acid oxidation impairs postischemic recovery of the insulin-resistant rat heart.</a> FASEB J. 27, 3966-3978 (2013).</li><li>Goodwin, G. W., Taylor, C. S., Taegtmeyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+energy+metabolism+of+the+heart+during+acute+increase+in+heart+work.">Regulation of energy metabolism of the heart during acute increase in heart work.</a> J Biol Chem. 273, 29530-29539 (1998).</li><li>Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+fatty+acid+metabolism+in+health+and+disease.">Myocardial fatty acid metabolism in health and disease.</a> Physiol Rev. 90, 207-258 (2010).</li><li>Neely, J. R., Denton, R. M., England, P. J., Randle, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+increased+heart+work+on+the+tricarboxylate+cycle+and+its+interactions+with+glycolysis+in+the+perfused+rat+heart.">The effects of increased heart work on the tricarboxylate cycle and its interactions with glycolysis in the perfused rat heart.</a> Biochem J. 128, 147-159 (1972).</li><li>Katz, J., Dunn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-2-t+as+a+tracer+for+glucose+metabolism.">Glucose-2-t as a tracer for glucose metabolism.</a> Biochemistry. 6, 1-5 (1967).</li><li>Gillis, A. M., Kulisz, E., Mathison, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+electrophysiological+variables+in+blood-perfused+and+buffer-perfused,+isolated,+working+rabbit+heart.">Cardiac electrophysiological variables in blood-perfused and buffer-perfused, isolated, working rabbit heart.</a> Am J Physiol. 271, H784-H789 (1996).</li><li>Qiu, Y., Hearse, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+ischemic+vulnerability+and+responsiveness+to+cardioplegic+protection+in+crystalloid-perfused+versus+blood-perfused+hearts.">Comparison of ischemic vulnerability and responsiveness to cardioplegic protection in crystalloid-perfused versus blood-perfused hearts.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. 103, 960-968 (1992).</li><li>Cotter, D. G., Schugar, R. C., Crawford, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ketone+body+metabolism+and+cardiovascular+disease.">Ketone body metabolism and cardiovascular disease.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, H1060-H1076 (2013).</li><li>Huang, Y., Zhou, M., Sun, H., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branched-chain+amino+acid+metabolism+in+heart+disease:+an+epiphenomenon+or+a+real+culprit?.">Branched-chain amino acid metabolism in heart disease: an epiphenomenon or a real culprit?.</a> Cardiovasc Res. 90, 220-223 (2011).</li><li>Buse, M. G., Biggers, J. F., Friderici, K. H., Buse, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+of+branched+chain+amino+acids+by+isolated+hearts+and+diaphragms+of+the+rat.+The+effect+of+fatty+acids,+glucose,+and+pyruvate+respiration.">Oxidation of branched chain amino acids by isolated hearts and diaphragms of the rat. The effect of fatty acids, glucose, and pyruvate respiration.</a> J Biol Chem. 247, 8085-8096 (1972).</li><li>Liepinsh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heart+is+better+protected+against+myocardial+infarction+in+the+fed+state+compared+to+the+fasted+state.">The heart is better protected against myocardial infarction in the fed state compared to the fasted state.</a> Metabolism. 63, 127-136 (2014).</li><li>Niu, Y. G., Hauton, D., Evans, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+triacylglycerol-rich+lipoproteins+by+the+working+rat+heart:+routes+of+uptake+and+metabolic+fates.">Utilization of triacylglycerol-rich lipoproteins by the working rat heart: routes of uptake and metabolic fates.</a> J Physiol. 558, 225-237 (2004).</li><li>Goodwin, G. W., Arteaga, J. R., Taegtmeyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+turnover+in+the+isolated+working+rat+heart.">Glycogen turnover in the isolated working rat heart.</a> J Biol Chem. 270, 9234-9240 (1995).</li><li>Sender, P. M., Garlick, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+rates+of+protein+in+the+Langendorff-perfused+rat+heart+in+the+presence+and+absence+of+insulin,+and+in+the+working+heart.">Synthesis rates of protein in the Langendorff-perfused rat heart in the presence and absence of insulin, and in the working heart.</a> Biochem J. 132, 603-608 (1973).</li><li>Hindlycke, M., Jansson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+tolerance+and+pancreatic+islet+blood+flow+in+rats+after+intraperitoneal+administration+of+different+anesthetic+drugs.">Glucose tolerance and pancreatic islet blood flow in rats after intraperitoneal administration of different anesthetic drugs.</a> Ups J Med Sci. 97, 27-35 (1992).</li><li>Zuurbier, C. J., Keijzers, P. J., Koeman, A., Van Wezel, H. B., Hollmann, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia's+effects+on+plasma+glucose+and+insulin+and+cardiac+hexokinase+at+similar+hemodynamics+and+without+major+surgical+stress+in+fed+rats.">Anesthesia's effects on plasma glucose and insulin and cardiac hexokinase at similar hemodynamics and without major surgical stress in fed rats.</a> Anesth Analg. 106, 135-142 (2008).</li><li>Oguchi, T., Kashimoto, S., Yamaguchi, T., Nakamura, T., Kumazawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+pentobarbital+appropriate+for+basal+anesthesia+in+the+working+rat+heart+model?.">Is pentobarbital appropriate for basal anesthesia in the working rat heart model?.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 29, 37-43 (1993).</li><li>Segal, J., Schwalb, H., Shmorak, V., Uretzky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+anesthesia+on+cardiac+function+and+response+in+the+perfused+rat+heart.">Effect of anesthesia on cardiac function and response in the perfused rat heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 22, 1317-1324 (1990).</li><li>Webster, I., Smith, A., Lochner, A., Huisamen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sanguinarine+non-+versus+re-circulation+during+isolated+heart+perfusion--a+Jekyll+and+Hyde+effect?.">Sanguinarine non- versus re-circulation during isolated heart perfusion--a Jekyll and Hyde effect?.</a> Cardiovasc Drugs Ther. 28, 489-491 (2014).</li><li>Belke, D. D., Larsen, T. S., Lopaschuk, G. D., Severson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+and+fatty+acid+metabolism+in+the+isolated+working+mouse+heart.">Glucose and fatty acid metabolism in the isolated working mouse heart.</a> Am J Physiol. 277, R1210-R1217 (1999).</li><li>Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rats!+.">Rats! .</a> Dis Model Mech. 2, 206-210 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Dettagli Il protocollo precedente i metodi per quantificare simultaneamente il flusso di substrato attraverso l&#39;ossidazione del glucosio e ossidazione degli acidi grassi nel cuore isolato di ratto di lavoro. Le misurazioni possono essere sovrapposte ai parametri funzionali cardiaci registrati per determinare il rapporto tra substrati metabolismo e lavoro cardiaco in condizioni basali e di stress (variazione del carico di lavoro, ischemia-riperfusione, ecc ...). E &#39;anche possibile valutare come il rapporto metabolismo / contrazione è influenzata dalle condizioni preesistenti come l&#39;insufficienza cardiaca e diabete. Inoltre, cuore di roditori geneticamente modificati può essere utilizzato per interrogare l&#39;effetto di una proteina specifica sul metabolismo e la funzione cardiaca. Infine, l&#39;effetto di farmaci e altri fattori che circolano su questi parametri può essere testato singolarmente. Poiché il flusso di glucosio attraverso la glicolisi non sempre correlata con la velocità di ossidazione del glucosio, può essere informativa di seguire i tassi di flusso del glucosio attraverso entrambe le vie in un unico ambiente sperimentale. I tassi di glicolisi possono essere determinati aggiungendo [5- 3 H] glucosio al buffer di perfusione, perché il rilascio di 3 H 2 O è determinata dall&#39;attività del passo enolasi della glicolisi 20. In alternativa [2- 3 H] glucosio, che porta alla produzione di 3 H 2 O nella fase fosfoglucosio isomerasi della glicolisi, può essere utilizzato per interrogare i tassi di assorbimento di glucosio da parte del muscolo cardiaco 16,17,21. La possibilità di scegliere tra più traccianti radioattivi per studiare il destino di glucosio a diversi livelli del suo catabolismo è un altro esempio della versatilità della tecnica. Tuttavia, poiché tutti gli misurazioni di flusso basano sul recupero quantitativo o 3 H 2 O o 14 CO 2 dall&#39;effluente coronarica, solo due radiomarcatotraccianti ED (una 3 H-etichettato e l&#39;altro marcato con 14 C) può essere utilizzato nel buffer di perfusione alla volta. considerazioni metodologiche Ci sono alcune limitazioni inerenti la misura del flusso metabolico cardiaco e funzione che utilizza questo protocollo. Sebbene l&#39;uso di tampone KH permette un controllo totale sulla composizione del perfusato, la rilevanza fisiologica di questo apparato sperimentale può essere discutibile. In primo luogo, l&#39;uso di una soluzione cristalloide su sangue è noto per avere un impatto negativo emodinamica cardiaca e resistenza all&#39;ischemia 22,23. In secondo luogo, il buffer di perfusione descriviamo qui manca una varietà di ormoni e sostanze nutritive che possono modulare direttamente il metabolismo cardiaco e di conseguenza un impatto la risposta del cuore ad una condizione di stress simulato. In effetti, il cuore dei mammiferi è un onnivoro metabolico e può, oltre a glucosio e acidi grassi, utilizzare altri substrati a fulfill suo fabbisogno energetico (lattato, piruvato, corpi chetonici, a catena ramificata aminoacidi). Ci sono prove che alcuni di questi substrati svolgono un ruolo importante nel rimodellamento metabolico del cuore malato 24,25. E &#39;del tutto possibile che il ricercatore di aggiungere questi substrati al buffer di perfusione, di modulare la loro concentrazione in modo da imitare più da vicino diverse condizioni fisiologiche (ad esempio stomaco pieno rispetto digiuno) o malattia Uniti, e di seguire i loro tassi di ossidazione utilizzando il appropriati traccianti radioattivi 26,27. Il metabolismo dei trigliceridi può anche essere rintracciato, e in tal caso si raccomanda di evitare l&#39;uso di eparina prima escissione del cuore come questo indurrà il rilascio di lipoproteina lipasi da endotelio e ridurre significativamente l&#39;estrazione di trigliceridi dal buffer 28. Con un&#39;attenta selezione dei traccianti radioattivi, l&#39;incorporazione di radioattività varmetaboliti tessuto ious possono anche essere misurati dopo perfusione di determinare parametri quali de novo sintesi dei trigliceridi, fatturato glicogeno, oi tassi di sintesi proteica 18,29,30. In altre parole, il ricercatore può lavorare con una vasta gamma di combinazioni di substrati / ormoni e concentrazioni. La scelta della composizione buffer principalmente dipenderà dagli obiettivi dell&#39;esperimento. Poiché queste condizioni di buffer controllate creare un modello fisiologico &quot;semplificato&quot;, deriva dalla ex vivo di lavoro esperimenti di perfusione cardiaca devono essere interpretati con cautela e, se possibile, i dati dovrebbero essere ulteriormente validati in vivo. Scelta dell&#39;anestetico L&#39;anestetico utilizzato su ratti prima di escissione del cuore devono essere selezionati con cura basata su gli effetti accertati sulla funzione cardiopolmonare e il metabolismo per garantire che questo non interferisca con l&#39;esperimento da eseguireed. Sia anestetici iniettabili e inalatori rapidamente inducono iperglicemia e gradi di intolleranza al glucosio che possono influenzare il metabolismo cardiaco durante la perfusione 31,32. Rispetto ad altri agenti, gli effetti a breve termine di barbiturici (pentobarbital e thiobutabarbital) sulla omeostasi del glucosio sono relativamente trascurabili 31. Tuttavia, intraperitoneale anestesia pentobarbital prima di escissione cuore è stato dimostrato di diminuire la gittata cardiaca, compromettere la funzione ventricolare sinistra, e aumentare il rilascio di lattato miocardico in un ex vivo protocollo di ischemia-riperfusione 33. L&#39;effetto inotropo negativo che pentobarbital ha sul cuore isolato di ratto è suggerito per essere causato da accumulo di tessuto del farmaco 34. Al contrario l&#39;uso di anestetici inalatori, che sono più rapidamente lavati fuori dal tessuto cardiaco, è associata con una migliore funzione contrattile ex vivo 33. anestetici volatili possono effettivamente fornire cardioprotection durante ischemia-riperfusione attraverso un meccanismo che coinvolge l&#39;apertura dei canali mitocondriali K ATP e aumentato legame di esochinasi ai mitocondri 32. In sintesi, il tipo di anestetico usato in un isolato lavoro protocollo cuore perfusione è una variabile importante nella valutazione di parametri sia funzionali e metabolici che possono influenzare direttamente i risultati dell&#39;esperimento. Pertanto, il tipo e la dose di anestetico usato devono sempre essere riportati nella sezione Metodi di un esperimento, e questi parametri non devono essere modificati tra esperimenti che sono destinate ad essere confrontati. Radioisotopi nei perfusione cuore Tutte le misurazioni di flusso eseguite con il protocollo precedente vengono eseguite in modalità senza ricircolo, il che significa che l&#39;effluente coronarica viene scartato invece di essere restituito al serbatoio tampone (Figura 1). L&#39;investigatore può piuttostoscegliere di utilizzare l&#39;apparecchio perfusione in modalità ricircolo, che ha il vantaggio di richiedere un volume molto più piccolo di tampone e quindi la radioattività di operare. Tuttavia, riciclo dell&#39;effluente coronarica compromette la composizione a regime del buffer di perfusione attraverso il recupero dei sottoprodotti derivanti da attività metabolica del cuore (compreso lattato, ma anche 3 H 2 O e H 14 CO3-), che complica la determinazione flussi metabolici e può anche alterare la funzione cardiaca nel corso del tempo 35. Questi problemi sono evitati in modalità non-ricircolo. A causa della quantità di radioattività e del grande volume di tampone perfusione utilizzato in un singolo esperimento, l&#39;investigatore dovrebbe essere particolarmente prudenti quando si usa il cuore di ratto lavorare in flusso metabolico analisi. Quando si utilizza un apparato di perfusione per la prima volta, si raccomanda di effettuare diversi esperimenti finti con tampone non radioattivo per diventare conoscenza delladiverse fasi del protocollo e con le procedure di sicurezza. Il montaggio del cuore sulle cannule è un passo particolarmente sensibile perché richiede stabilire uno stretto contatto con l&#39;attrezzo e perché tampone può perdere o sparare fuori da uno dei vasi sanguigni recisi del cuore. L&#39;apparato perfusione descritto da Taegtmeyer e colleghi 11 ha il vantaggio di includere un serbatoio Langendorff che è del tutto indipendente dal resto dell&#39;apparato perfusione, e può quindi essere riempito con tampone KH non radioattivo per evitare fuoriuscite di materiale radioattivo durante cannulazione del cuore . Indipendentemente dal sistema utilizzato, gli esperimenti devono essere eseguite in un&#39;area dedicata ad accesso limitato. La stanza dovrebbe includere un lavandino e una fornitura di acqua ultrapura per effettuare la preparazione buffer e pulizia delle attrezzature contaminati nella stessa area. Gli investigatori dovrebbero lavorare a stretto contatto con l&#39;ufficio di sicurezza di radiazione della loro istituzione per stabilire specifici contenimento, controllo e procedure di decontaminazione. Pulizia dell&#39;apparato perfusione La pulizia dopo sperimentale dell&#39;apparato perfusione è un passaggio fondamentale che viene troppo spesso trascurato e, se non eseguita con cura, responsabile della maggior parte dei problemi legati alla scarsa riproducibilità sperimentale. Il buffer di perfusione ricco di sostanze nutritive e l&#39;alta temperatura del sistema di perfusione forniscono condizioni ideali per la crescita di batteri e funghi. L&#39;utilizzo di proteine ​​(insulina, BSA) e acidi grassi nel buffer di perfusione aggiunge un altro grado di complessità alla procedura di pulizia perché questi composti si attacchi alla superficie del tubo e bicchieri, rendendole difficili da stanare dell&#39;apparecchiatura. L&#39;uso di radioisotopi anche imporre vincoli aggiuntivi quali la creazione di una zona di contenimento dedicata in laboratorio per la manipolazione del materiale contaminato e smaltimento di un solidod rifiuti radioattivi liquidi. Pertanto, la procedura di pulizia adeguata sarà principalmente dipenderà sia la composizione del tampone di perfusione e del tipo di apparecchiatura utilizzata perfusione. Se si utilizza un apparato commerciale, visitare il sito web del produttore o contattare il servizio clienti per ottenere informazioni su come eseguire la pulizia senza danneggiare nessuno dei componenti dell&#39;apparato. In generale, tutte le parti in vetro e plastica possono essere lavati con una vasta gamma di saponi. detersivi alimentati enzimi attivi sono particolarmente utili per eliminare acidi grassi-BSA residui. La maggior parte dei contaminanti saranno rimossi eseguendo 0,1 M HCl o 0,1 M HNO 3 attraverso l&#39;apparecchio per diverse ore. Si ottiene risultati di pulizia soddisfacenti dal lavaggio dell&#39;impianto prima con HCl 0,1 M, poi con una fresca 1% (w: v) soluzione di detergente alimentato enzima attivo preparato in acqua calda, ed infine risciacquando il sistema con acqua ultrapura. Quando si utilizza un apparato di perfusione fuoriserie di quelli originariamente described da Taegtmeyer e colleghi 11, può essere più facile e più efficace smontare completamente l&#39;apparato alla fine di ogni giornata sperimentale. Il vetro viene pulito da un 15 min immersione in un bagno concentrata di un acido cromico e acido solforico in miscela. Le parti in plastica e il tubo in PVC possono essere lavati con un detergente senza residui. Abbiamo trovato è effettivamente più veloce e più affidabile per sostituire interamente il tubo in PVC ogni giorno, perché limita la manipolazione di materiali contaminati da radiochimici e perché impedisce lasciare residui di detergenti dietro. In ogni caso, lo sperimentatore deve applicare le seguenti regole: 1- Pulire l&#39;apparato perfusione e tutte le attrezzature sporche subito dopo aver completato l&#39;esperimento di perfusione. In attesa servirà solo a rendere la pulizia più difficile e richiede tempo. 2- Controllare il bagno di circolazione del sistema camicia d&#39;acqua regolarmente per contaminazioni. L&#39;uso di un condizionatore di acqua aumenterà l&#39;intervallo tra cpendente del bagnomaria. 3- Dopo la pulizia, accuratamente risciacquati e tubi con acqua del rubinetto più volte e finire risciacquo con acqua ultrapura per rimuovere residui di detergenti. 4- Due preparati cardiaci consecutivamente avendo quando la dissezione è stato accuratamente eseguita e il buffer di perfusione curata sono suscettibili di indice di contaminazione del dispositivo (sia da batteri o da residui di solvente). Se questo accade, il lavaggio e risciacquo procedure devono essere interamente ripetuta. Scaling fino al cuore del mouse Anche se il protocollo precedente concentra sulla determinazione dei tassi metabolici nel cuore isolato di ratto di lavoro, le stesse procedure possono essere applicati al cuore del mouse con poche modifiche alla perfusione e acquisizione dati attrezzature 36. Grazie alla sua dimensione più piccola del cuore isolato del mouse di lavoro è tecnicamente più impegnativo, ma a causa del suo modo significativoportata minore ha il vantaggio di richiedere un volume molto più basso di tampone perfusione. Il gran numero di modelli murini geneticamente modificati che sono già disponibili rende anche il cuore isolato topo lavoro molto interessante per studiare la funzione di un singolo prodotto genico sul metabolismo cardiaca e rimodellamento funzionale. Tuttavia, i recenti progressi tecnologici nella modifica del genoma e un catalogo in rapida crescita di ratti transgenici e knockout stanno rapidamente colmando il divario tra le due specie di roditori. Inoltre, il ratto è stato a lungo elogiato come un modello animale superiore per studiare le malattie cardiovascolari, perché la sua fisiopatologia imita da vicino le condizioni umane 37. Per queste ragioni, riteniamo che l&#39;isolato che lavora cuore di ratto continuano a detenere un posto importante in epoca moderna della ricerca cardiovascolare.

rilevanza clinica Nel cuore dei mammiferi, vi è una forte relazione positiva tra il flusso dei substrati attraverso vie metaboliche ossidative, la produzione di ATP e il lavoro cardiaco 1. Nel corso degli ultimi due decenni, l&#39;indagine del legame intricato tra il metabolismo e la funzione cardiaca ha portato a riconoscere che le alterazioni nel metabolismo cardiaco sono una causa per la disfunzione contrattile e forse patologico rimodellamento strutturale nel contesto di diversi tipi di malattie cardiache 2-4. Pertanto, si prevede che la nostra comprensione dei meccanismi che regolano rimodellamento metabolica del cuore sottolineato porterà alla identificazione di bersagli terapeutici per la prevenzione o il trattamento di insufficienza cardiaca 5-7. La recente pubblicazione di una dichiarazione scientifica della American Heart Association su &quot;Valutare Cardiac Metabolism&quot;, sottolinea il crescente interesse della comunità scientifica per tsuo campo di ricerca 8. Ma mentre i progressi tecnologici nel campo dell&#39;imaging cardiaco permettono ora per una valutazione rapida e accurata della morfologia e funzione cardiaca, lo studio in vivo del metabolismo cardiaco rimane limitata e gravoso: Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) e tomografia ad emissione di positroni (PET) può essere utilizzati per seguire cardiaca metabolismo del fosfato ad alta energia e l&#39;attività ciclo di Krebs, ma queste tecniche sono afflitti da costi di gestione elevati e dalla loro incapacità di determinare il contributo di vari substrati al metabolismo ossidativo in condizioni di stato stazionario 9 .Per questa data l&#39;ex vivo lavoro di preparazione cuore rappresenta la sola e unica tecnica a disposizione per studiare, simultaneamente e in tempo reale, funzione contrattile e del flusso dei substrati nelle vie metaboliche ossidative 7,9. Il seguente protocollo prefigge di fornire orientamenti nella preparazione e utilizzo di reagenti utilizzati per determinare il rattoes di utilizzo substrati, nel cuore isolato di ratto di lavoro. L&#39;isolato Apparato Cuore di lavoro per roditori Anche se la tecnica è quasi mezzo secolo di vita, il lavoro di preparazione isolato cuore di ratto rimane un metodo di scelta per la ricerca cardiovascolare. Come per la preparazione del cuore Langendorff, cuore roditore lavoro offre un modo relativamente semplice, affidabile e poco costoso per misurare una vasta gamma di parametri cardiaci indipendentemente dagli effetti confondenti di altri organi, neurormonali e altri fattori circolanti. Ma a differenza cuore Langendorff-perfuso, cuore lavorando continua a svolgere lavoro cardiaco quasi fisiologica, un prerequisito per la generazione di flusso metabolico ossidativo a livelli che sono rilevanti per le condizioni in vivo. Ciò si ottiene fornendo il buffer perfusione del ventricolo sinistro (LV) attraverso una cannula collegata all&#39;atrio sinistro, e come riempie e contratti LV, latampone viene espulso attraverso la linea aortica contro un post-carico determinata pressione idrostatica. Il design dell&#39;apparato perfusione originariamente descritto da Neely e colleghi 10 è stato successivamente migliorato da Taegtmeyer, orli e Krebs 11, ma è cambiato molto poco da allora. Come descritto nel l&#39;apparato originale, funzione contrattile può essere valutata attraverso la determinazione della gittata cardiaca, utilizzando non più di cilindri graduati e un cronometro per misurare aortica e coronarica flussi 10,11. Diversi fornitori offrono ora sistemi completi di roditori di lavoro del cuore di perfusione. Queste apparecchiature disponibili in commercio possono essere acquisite con flowprobes, trasduttori di pressione, un catetere pressione-volume e tutta l&#39;attrezzatura necessaria per l&#39;acquisizione dati funzionali cardiaca e analisi. I produttori forniscono ampie sessioni di documentazione e formazione per familiarizzare il nuovo utente con le loro attrezzature. Diversi articoli di revisione anche i protocolli di dettaglio sul strum cuore di lavoroentazione e l&#39;uso di cateteri per misurare la funzione cardiaca nei roditori 12-15. Per questo motivo, ci sarà solo brevemente menzionare il set-up dell&#39;apparato perfusione e l&#39;apparecchio di controllo. Il presente protocollo piuttosto mira a completare le informazioni già disponibili con una descrizione dei metodi che possono essere implementate per misurare simultaneamente i tassi di glucosio e di catena lunga ossidazione degli acidi grassi, i due principali substrati energetici fornendo nel cuore normale. Descriviamo qui tutti i passi necessari per l&#39;uso di substrati energetici radiomarcati per la valutazione del metabolismo ossidativo miocardica, dalla preparazione dei reagenti e tamponi per il recupero e l&#39;elaborazione dei campioni, l&#39;analisi dei dati. Principi del metodo Cardiomyocytes generano la maggior parte della loro energia per la contrazione della fosforilazione ossidativa degli acidi grassi (acidi grassi a lunga catena principalmente) e carboidrati (glucosE e lattato). Il cuore è molto limitato riserve energetiche e si basa su un costante rifornimento di questi substrati energetici fornendo dalla circolazione. Il catabolismo del glucosio attraverso la via glicolitica produce piruvato che viene poi decarbossilata dal piruvato deidrogenasi della membrana mitocondriale interna. Gli acidi grassi a catena lunga, estratti da albumina o lipoproteine ​​circolanti trigliceridi, vengono dapprima attivati ​​in molecole acil-CoA nel citosol e successivamente trasportati all&#39;interno della matrice mitocondriale attraverso la navetta carnitina per entrare nel pathway beta-ossidazione. Le molecole acetil-CoA prodotti dal catabolismo di glucosio e acidi grassi alimentano il ciclo di Krebs per generare gli equivalenti riducenti (NADH e FADH2) che sono usati dalla catena di trasporto degli elettroni per costruire la forza proton-motrice attraverso la membrana mitocondriale interna e generare ATP attraverso l&#39;attività di ATP sintasi. Acqua e biossido di carbonio sono i sottoprodotti finali dile reazioni enzimatiche che avvengono all&#39;interno del ciclo di Krebs. La fornitura di 14 C e 3 H- substrati radiomarcati (ad esempio 14 glucosio C-radiomarcato e acido oleico 3 H-radiomarcato) al cuore lavorare isolato sarà di conseguenza portare alla produzione di 14 CO 2 e 3 H 2 O che può essere quantitativamente recuperato dall&#39;effluente coronarica. La raccolta di 14 CO 2 viene effettuata mantenendo cuore isolato e perfuso in una camera sigillata e immediatamente recuperare l&#39;effluente coronarica quando esce cuore. Una colonna piccola scambiatrice di anioni viene utilizzato per separare e recuperare 3 H 2 O dall&#39;effluente coronarica. La radioattività dei campioni trattati viene misurata con un contatore a scintillazione liquida, e con la consapevolezza della specifica attività dei substrati radiomarcati utilizzato, è quindi possibile quantificare singolarmente il flusso di glucosio e acido grasso nelossidazione Percorsi di 16,17.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4*7H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AG 1-X8 resin, chloride form, 100-200 dry mesh size, 500 g</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1401441</td>
			<td>This item can be replaced by purchasing directly the hydoxide form&#160; (see reference below), but this will cost almost 8 times more</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AG 1-X8 resin, hydroxide form, 100-200 dry mesh size, 100 g</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1432445</td>
			<td>Purchasing this item allows to bypass the conversion of the anion exchange resin from the chloride form to the hydroxide form (See section 1.2 of protocol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Microanalysis Vacuum Filter Holder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-753-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318</td>
			<td>Corrosive. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Dispersion Tube with Fritted Cylinder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-138B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>820027</td>
			<td>We recommend the use of a charcoal-defatted BSA, as other purification process such as cold ethanol fractionation may leave residues toxic for the heart.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Oleate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O7501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic Acid, [9,10-3H(N)]-</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NET289005MC</td>
			<td>Radioactive material. Follow your Institution&#39;s radiation safety office guidelines for ordering and handling.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane Tubing, 29 mm diameter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-667E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose, D-[14C(U)]-</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEC042B005MC</td>
			<td>Radioactive material. Follow your Institution&#39;s radiation safety office guidelines for ordering and handling.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humulin R U-100</td>
			<td>Eli Lilly and Company</td>
			<td>NDC 0002-8215-01 (HI-210)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inactin Hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T133</td>
			<td>Controlled substance on USDEA Schedule III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 Silk Black Braid</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>SUT-15-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Hyamine Hydroxide</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6003005</td>
			<td>Highly toxic and causes severe burns. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL Glass Scintillation Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-341-25E</td>
			<td>Use glass vials for quantitative recovery of 14CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL HDPE Scintillation Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-23B</td>
			<td>Use HDPE vials for quantitative recovery of 3H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Rubber Sleeve Stoppers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-126DD</td>
			<td>Fit 20 mL scintillation vials; Reusable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle 23G x 40 mm</td>
			<td>BD</td>
			<td>305194</td>
			<td>Use to inject perchloric acid through the rubber sleeve stopper of the CO2 trap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perchloric Acid, 60%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A228</td>
			<td>Highly corrosive and may act as an oxidizer and/or cause an explosion hazard. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultima Gold, Scintillation Cocktail</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6013327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Wool</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC38606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decon Dri-Clean Detergent Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355</td>
			<td>For cleaning of glassware, plastic parts, and tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alconox Tergazyme Enzyme-Active Powered Detergent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-000-115</td>
			<td>For cleaning of &#34;hard to reach&#34; surfaces (tubing, glassware) contaminated by fatty acid-BSA residue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for the determination of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart

Il cuore dei mammiferi è un grande consumatore di ATP e richiede un costante rifornimento di substrati energetici per la contrazione. Non sorprendentemente, alterazioni del metabolismo miocardico sono stati collegati allo sviluppo della disfunzione contrattile e insufficienza cardiaca. Pertanto, svelare il legame tra il metabolismo e la contrazione dovrebbe far luce su alcuni dei meccanismi che regolano l&#39;adattamento cardiaca o disadattamento negli stati di malattia. Il lavoro di preparazione cuore isolato di ratto può essere utilizzata per seguire, contemporaneamente ed in tempo reale, la funzione contrattile cardiaca e flusso di energia fornire substrati in vie metaboliche ossidative. Il presente protocollo intende fornire una descrizione dettagliata dei metodi utilizzati per la preparazione e l&#39;utilizzo di tamponi per la misurazione quantitativa dei tassi di ossidazione per glucosio e gli acidi grassi, l&#39;energia principale fornendo substrati del cuore. I metodi utilizzati per l&#39;analisi dei campioni e l&#39;interpretazione dei dati vengono anche discussi.In breve, la tecnica si basa sulla fornitura di 14 C-glucosio radiomarcato e un acido grasso a catena lunga radiomarcato 3 H- al cuore ex vivo battere via normotermica perfusione cristalloide. 14 CO 2 e 3 H 2 O, sottoprodotti finali di le reazioni enzimatiche coinvolte nella utilizzazione di questi substrati energetici fornendo, vengono poi quantitativamente recuperati dall&#39;effluente coronarica. Con la conoscenza della specifica attività dei substrati radiomarcati utilizzati, è quindi possibile quantificare singolarmente il flusso di glucosio e acido grasso nei percorsi di ossidazione. funzione contrattile del cuore isolato può essere determinato in parallelo con l&#39;apparecchio di controllo appropriate e direttamente correlato ai valori flusso metabolico. La tecnica è estremamente utile per studiare il rapporto metabolismo / contrazione in risposta a varie condizioni di stress, come alterazioni nella pre e dopo carico e ischemia, un farmaco o un circulafattore ting, o alla alterazione dell&#39;espressione di un prodotto genico.

Due esperimenti di rappresentanza sono descritte nelle figure seguenti. In entrambi i casi, il cuore di 16 settimane di età maschio Sprague Dawley di ratto è stato isolato e perfuso in posizione di lavoro con tampone KH preparato secondo il protocollo precedente. In ogni esperimento, il cuore è stato sottoposto ad una condizione di stress di influenzare lavoro cardiaco. funzione contrattile cardiaca è stata valutata mediante registrazione continua della pressione differenziale attraverso l&#39;inserimento di un trasduttore di pressione nella linea aortica e determinazione della potenza cardiaca. Le conseguenze di ciascuna condizione di stress sulla utilizzazione di substrati energetici fornendo stati simultaneamente determinati misurando i tassi di glucosio e ossidazione oleato. Nel primo esperimento, un aumento acuto del carico di lavoro è stato simulato dopo 20 min di perfusione a carico di lavoro vicino fisiologica aumentando la postcarico del 40% (ottiene manualmentesollevando la camera di deflusso aortica) e aggiungendo epinefrina (1 mmol / L) al buffer di perfusione (Figura 3A). Frequenza cardiaca, che può essere determinato misurando l&#39;intervallo tra i valori di picco di pressione sistolica sulla traccia pressione del polso, immediatamente aumentato di oltre il 50% dopo induzione workjump (Figura 3B). Potere cardiaco aumentato di oltre il 40% a workjump, accompagnato da un aumento in entrambi i tassi di glucosio e ossidazione oleato (Figura 3C). I risultati mostrano che, sotto lo stress di un aumento acuto del carico di lavoro, il cuore si adatta rapidamente per aumentare la produzione di energia per la contrazione sia da glucosio e ossidazione degli acidi grassi. Tuttavia, l&#39;aumento relativo tasso di ossidazione è più importante per il glucosio (~ 2,8 volte) rispetto era per oleato (~ 1,3 volte). Aumento della dipendenza da carboidrati ossidazione per far fronte al carico di lavoro supplementare è una caratteristica tipica del cuore dei mammiferi pressione sovraccarico 18 </sup&gt;. Nel secondo esperimento, il cuore è stato perfuso in condizioni basali per 20 minuti seguiti da 15 min totale, globale, ischemia normotermica (indotta chiudendo sia il atriale e linee aortica) e 30 min riperfusione (Figura 4A). In queste condizioni sperimentali, una pressione del polso quasi normale fu restaurata tra 2 e 3 minuti dopo l&#39;inizio della riperfusione (Figura 4B). Potenza cardiaca rapidamente aumentata al di sopra dei valori pre-ischemia nei primi 10 min di riperfusione per poi scendere a valori quasi basali (Figura 4C). Rispetto al basale, il tasso di ossidazione oleato è aumentato durante la riperfusione, mentre l&#39;ossidazione del glucosio rapidamente tornati ai valori pre-ischemici livelli. Per misurare simultaneamente funzione contrattile e entrambi i tassi di ossidazione del substrato si può chiaramente comprendere che, nelle attuali condizioni sperimentali, la variazione dei tassi di ossido acido grassozione è il principale determinante per i cambiamenti nella quantità di lavoro generata a riperfusione. L&#39;interruttore più in alto verso l&#39;utilizzo di acidi grassi dopo l&#39;ischemia è una caratteristica ben estalished-del cuore riperfuso 19. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54497/54497fig1.jpg" /> Figura 1:. Semplificata Schema del isolata Apparato Cuore Lavorare Rat Il buffer di Krebs-Henseleit integrato con la soluzione di acido grasso-BSA è ossigenato passando attraverso un ossigenatore a membrana. valori di precarico e postcarico cardiaco tipici per un cuore di ratto perfuso in condizioni simili a quelle fisiologiche sono indicati. Le impostazioni possono essere modificate regolando l&#39;altezza del serbatoio atriale e la camera di troppo pieno aortica. I tubi di siringhe graduate sono stati posti sotto della camera cuore e la camera di deflusso aortica per misurare il flusso coronarico e flusso aortico, rispettivamente. Il flusso dibuffer può essere interrotto (quando si misurano i flussi aortica e coronariche) o reinstradata (passaggio dal Langendorff alla modalità di lavoro) attraverso l&#39;uso di rubinetti a tre vie. Le frecce rosse indicano il posizionamento ottimale per in-line microlelectrodes ossigeno per determinare la differenza di ossigeno &quot;artero-venosa&quot;. In linea sonde di flusso e trasduttori di pressione possono essere collocati nelle linee di precarico e postcarico per misurare sia i tassi e le pressioni (frecce verdi) di flusso atriale e aortica. pressioni ventricolare sinistra e volumi possono anche essere registrati con un catetere PV inserito attraverso l&#39;apice del ventricolo sinistro. Non mostrato sulla figura è la camicia d&#39;acqua che circonda tutti gli elementi in vetro e il tubo perfusione nel colore blu scuro. Questi elementi camicia d&#39;acqua sono tutti collegati in serie tramite un tubo in un bagno d&#39;acqua che circola a 37 ° C. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54497/54497fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di t</a>la sua figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54497/54497fig2.jpg" /> Figura 2:. Rappresentazione delle diverse fasi coinvolte nel setup della trappola di CO 2 (A) Aggiungere 1 ml di idrossido di 10x concentrata di hyamine. (B) Aggiungere un campione da 0,5 ml contenuta in un tubo senza cappuccio. (C) Sigillare la fiala. (D) Iniettare 200 ml di acido perclorico (60% w: w%). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54497/54497fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54497/54497fig3.jpg" /> Figura 3: Risultati Rappresentante di un esperimento Workjump (A) registrazione continua della pressione differenziale.. (B) Breve inregistrazione Terval raffigurante la variazione di pressione del polso, al momento dell&#39;iniziazione workjump. (C) i tassi cardiache di ossidazione del glucosio (traccia rossa con cerchi) e l&#39;ossidazione oleato (traccia blu con quadrati) sono stati determinati mediante analisi dell&#39;effluente coronarica in un intervallo di 5 minuti. Potenza cardiaca (traccia nera con triangoli) è stata determinata dalla misurazione della gittata cardiaca, allo stesso tempo i campioni di effluenti coronarici sono stati recuperati. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54497/54497fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54497/54497fig4.jpg" /> Figura 4: Rappresentante dei risultati di un esperimento ischemia-riperfusione (A) registrazione continua della pressione di impulso.. (B) registrazione a intervalli brevi raffigurante il recupero della funzione contrattile dusuonare i primi 5 minuti di riperfusione. (C) tassi cardiache di ossidazione del glucosio (traccia rossa con cerchi) ed ossidazione oleato (traccia blu con piazze) sono stati determinati mediante analisi dell&#39;effluente coronarica ad un intervallo di 5 min, tranne durante i primi 5 minuti di riperfusione cui analisi sono state eseguite a un intervallo di 1 min. Potenza cardiaca (traccia nera con triangoli) è stata determinata dalla misurazione della gittata cardiaca, allo stesso tempo i campioni di effluenti coronarici sono stati recuperati. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54497/54497fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart at JoVE.com

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.

Metodi per la determinazione dei tassi di glucosio e acidi grassi ossidazione nel cuore isolato di lavoro Rat

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

methods-for-determination-rates-glucose-fatty-acid-oxidation-isolated

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.6K Views.  University of Mississippi Medical Center. The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.

Video: Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in common laboratory rats or mice and these quite frequently serve as an intermediate step between bench-top experiments and large animal testing or human trials. Given that rodents provide an established, cost-effective, and physiologically-relevant model system in which to test novel combinations of scaffolding materials and cells, they are particularly well-suited for cardiovascular tissue engineering studies. Presently, we describe an open-heart surgical procedure to implant engineered tissue containing myogenic progenitor cells in the atrioventricular (AV) groove of a rat heart. These implants are intended to create an electrical conduit between the right atrium and right ventricle with the ultimate goal of providing an alternative treatment to conventional pacemaker implantation in pediatric patients with complete heart block[1]. The engineered tissue is implanted in the AV-groove by means of a thoracotomy. For our purposes, Lewis rats are anesthetized and invasively ventilated to maintain positive airway pressure during the sterile surgical procedure. The approach to the heart is performed by a right thoracotomy through an antero-lateral incision at the 5th intercostal space. The tissue construct is fixed in the AV groove using a single 7-0 Prolene suture and positioned between the right ventricle and atrium at the ventral portion of the heart. The epicardium is partially removed to allow direct contact between the recipient myocardial cells and those contained in the engineered tissue. Following implantation, the chest wall is closed in layers, any pneumothorax is evacuated, and the animal is extubated and treated with analgesic.

Here, we describe a cardiac surgical procedure to implant engineered tissue in the atrioventricular (AV)-groove of an adult Lewis rat.

L&#39;impianto di ingegneria tessutale nel Cuore Rat

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

Ricerca

Biologia

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

Visualizzare il cuore pulsante di Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Fosfoproteomica quantitativa in acidi grassi Stimolati Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Measures of Heart and Ventilatory Rates in Freely Moving Crayfish

The fear, flight or fight response serves as the fundamental physiological basis for examining an organism's awareness of its environment under an impending predator attack.  Although it is not known whether invertebrates posses an autonomic nervous system identical to that of vertebrates, evidence shows invertebrates have a  sympathetic-like  response to regulate the internal environment and ready the organism to act behaviorally to a given stimuli.  Furthermore, this physiological response can be feasibly measured and it acts as a biological index for the animal's internal state.  Measurements of the physiological response can be directly related to internal and external stressors through changes in the central nervous system controlled coordination of the cardio-vascular and respiratory systems.   More specifically, monitoring heart and ventilation rates provide quantifiable measures of the stress response not always behaviorally observed. Crayfish are good model organisms for heart and ventilatory rate measurements due to the feasibility of recording, as well as the rich history known of the morphology of the crayfish, dating back to Huxley in 1888, and the well-studied typical behaviors.

Invertebrates show an autonomic sympathetic-like response similar to that described for vertebrates. The coordination of the cardio-vascular and ventilatory systems allows for measurement of a biological index in which to assess an organism internal state.

Misure di Cuore e Tariffe ventilatoria a muoversi liberamente gamberi di fiume

The fear, flight or fight response serves as the fundamental physiological basis for examining an organism's awareness of its environment under an ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Preparazione di embrioni per la microscopia elettronica del Drosophila Tubo cuore embrionale

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

Quantificazione dei γH2AX Foci in risposta alle radiazioni ionizzanti

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone H2AX1,2. This phosphorylation of H2AX is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)3. The phosphorylated form of H2AX, referred to as &gamma;H2AX, spreads to adjacent regions of chromatin from the site of the DSB, forming discrete foci, which are easily visualized by immunofluorecence microscopy3. Analysis and quantitation of &gamma;H2AX foci has been widely used to evaluate DSB formation and repair, particularly in response to ionizing radiation and for evaluating the efficacy of various radiation modifying compounds and cytotoxic compounds4.
Given the exquisite specificity and sensitivity of this de novo marker of DSBs, it has provided new insights into the processes of DNA damage and repair in the context of chromatin. For example, in radiation biology the central paradigm is that the nuclear DNA is the critical target with respect to radiation sensitivity. Indeed, the general consensus in the field has largely been to view chromatin as a homogeneous template for DNA damage and repair. However, with the use of &gamma;H2AX as molecular marker of DSBs, a disparity in &gamma;-irradiation-induced &gamma;H2AX foci formation in euchromatin and heterochromatin has been observed5-7. Recently, we used a panel of antibodies to either mono-, di- or tri- methylated histone H3 at lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) which are epigenetic imprints of constitutive heterochromatin and transcriptional silencing and lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), which are tightly correlated actively transcribing euchromatic regions, to investigate the spatial distribution of &gamma;H2AX following ionizing radiation8. In accordance with the prevailing ideas regarding chromatin biology, our findings indicated a close correlation between &gamma;H2AX formation and active transcription9. Here we demonstrate our immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in non-adherent cells, with a particular focus on co-localization with other epigenetic markers, image analysis and 3D-modeling.

Evaluation of the Spatial Distribution of &#947;H2AX following Ionizing Radiation

Microscopic analysis of &gamma;H2AX foci, which form following the phosphorylation of H2AX at Ser-139 in response to DNA double-strand breaks, has become an invaluable tool in radiation biology. Here we used an antibody to mono-methylated histone H3 at lysine 4 as an epigenetic marker of actively transcribing euchromatin, to evaluate the spatial distribution of radiation-induced &gamma;H2AX formation within the nucleus.

Valutazione della distribuzione spaziale delle γH2AX seguenti radiazioni ionizzanti

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

Quantificare singolo microvasi Permeabilità in Isolata Blood-perfusione Rat Lung Preparazione

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid oxidation, or alternatively, synthesize new lipid via de novo lipogenesis. The net sum of these pathways is dictated by a number of factors, which in certain disease states leads to fatty liver disease. Excess hepatic lipid accumulation is associated with whole body insulin resistance and coronary heart disease. Tools to study lipid metabolism in hepatocytes are useful to understand the role of hepatic lipid metabolism in certain metabolic disorders.
In the liver, hepatocytes regulate the breakdown and synthesis of fatty acids via &#946;-fatty oxidation and de novo lipogenesis, respectively. Quantifying metabolism in these pathways provides insight into hepatic lipid handling. Unlike in vitro quantification, using primary hepatocytes, making measurements in vivo is technically challenging and resource intensive. Hence, quantifying &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis in cultured mouse hepatocytes provides a straight forward method to assess hepatocyte lipid handling. 
Here we describe a method for the isolation of primary mouse hepatocytes, and we demonstrate quantification of &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled substrates.

De novo lipogenesis and &#946;-fatty acid oxidation constitute key metabolic pathways in hepatocyte, pathways that are perturbed in several metabolic disorders, including fatty liver disease. Here we demonstrate isolation of mouse primary hepatocytes and describe quantification of &#946;-fatty acid oxidation and lipogenesis.

Determinazione della ossidazione degli acidi grassi e la lipogenesi nel topo primaria Epatociti

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways that cannot be accomplished in vivo. For example, inotropic medications commonly also affect preload and afterload, precluding load-independent assessments of their myocardial effects in vivo. Additionally, this model allows for sampling of coronary sinus effluent without contamination from systemic venous return, permitting assessment of myocardial oxygen consumption. Further, the advent of miniaturized pressure-volume catheters has allowed for the precise quantification of markers of both systolic and diastolic performance. We describe a model in which the left ventricle can be studied while performing both volume and pressure work under controlled conditions. 
In this technique, the heart and lungs of a Sprague-Dawley rat (weight 300-500 g) are removed en bloc under general anesthesia. The aorta is dissected free and cannulated for retrograde perfusion with oxygenated Krebs buffer. The pulmonary arteries and veins are ligated and the lungs removed from the preparation. The left atrium is then incised and cannulated using a separate venous cannula, attached to a preload block. Once this is determined to be leak-free, the left heart is loaded and retrograde perfusion stopped, creating the working heart model. The pulmonary artery is incised and cannulated for collection of coronary effluent and determination of myocardial oxygen consumption. A pressure-volume catheter is placed into the left ventricle either retrograde or through apical puncture. If desired, atrial pacing wires can be placed for more precise control of heart rate. This model allows for precise control of preload (using a left atrial pressure block), afterload (using an afterload block), heart rate (using pacing wires) and oxygen tension (using oxygen mixtures within the perfusate).

Isolated working heart models can be used to measure the effect of loading conditions, heart rate, and medications on myocardial performance and oxygen consumption. We describe methods for preparation of a rodent left heart working model that permits study of systolic and diastolic performance and oxygen consumption under various conditions.

Roditore Working Model Cuore per lo Studio della performance miocardica e consumo di ossigeno

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...