ここに記載された装置および実験は、循環器科、ボストン小児病院によっておよびHaseotesファミリーからの慈善寄付によって賄われました。我々は、博士に感謝しています。フランク・マッゴーワンと華美彼のアートワークの支援のために、このモデルでは、とリンゼイ・トムソンに早期の経験を私たちに提供します。

<ol>
	<li>Langendorff, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untersuchungen+am+uberlebenden+saugethierherzen+[investigations+on+the+surviving+mammalian+heart.">Untersuchungen am uberlebenden saugethierherzen [investigations on the surviving mammalian heart.</a> Arch Ges Physiol. 61, 291-332 (1895).</li><li>Neely, J. R., Liebermeister, H., Battersby, E. J., Morgan, H. 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The authors have nothing to disclose.

この作業心臓モデルは、心室プリロードおよび後負荷、灌流液の酸素張力、ならびに心拍数の完全な制御を持つ心室性能の評価を可能にします。他の要因の中でも、in vivoモデルを使用して可能ではない方法で後負荷と前負荷の独立変力薬の本質的な心筋の効果の評価を可能にします。このモデルは、晶質灌流液を利用するので、例えば、心筋のエネルギー状態の分光分析を単純化する、ヘモグロビンからの干渉なしに評価心筋を許可ことが可能であるが、このモデルでは、図14に示すように 、右心房は、我々の器具の一部としてカニューレを挿入されていませんそうするために。我々は意図的に心筋酸素消費量の評価のための冠状静脈洞の流れのサンプリングを容易にするためにそうしないことを選びました。それは共同ポンプとして重要なことは、しかし、右心はまだこのモデルでは、圧力と体積の作業を行い、ronary洞は、肺動脈カニューレに流れ込みます。いくつかの右心室プリロードを提供することは、心室中隔のポジショニングを改善し、左心室のパフォーマンスを向上させ、そしてこのモデルの重要な要素である。15 言及するには、いくつかの実験的な落とし穴があります。最初は、虚血の期間を最小にするために（2分未満で、 すなわち ）好都合に実行されるべき最初の逆行カニュレーションです。マスターへの最も重要なスキルは、上行大動脈の効率的な単離、調製及​​び取扱いです。大動脈断端が大動脈弁上記のカニュレーションのための不十分な余地を残して、過度に短くカットされないことが重要です。しかし、大動脈断端がカニューレの周りの大動脈のトルク締めが発生する可能性があり、長すぎるではないことも重要です。大動脈カニューレと大動脈根が適切にサイズを一致させたことも重要です。小さなカニューレ上の過大​​な大動脈こともできますカニューレ上の大動脈基部のトルク締めにつながります。右鎖骨下動脈は、典型的には、約7ミリメートル大動脈弁上に上行大動脈から離陸します。解剖時に腕頭容器（直径約1ミリメートル）を識別し、大動脈のトリミングは、横方向の大動脈切開用として重要なランドマークを果たします。ちょうど最初の腕頭動脈の離陸の下に大動脈をトリミングすることをお勧めします。トリミングされた大動脈基部で、この容器を含めることは、一般的に取り組んで心臓モードに移行する際に、大動脈根圧力のKHBの漏洩、損失につながります。 挿管のもう一つの技術的に困難な側面は、左心房のカニューレ挿入です。それは左心耳にカニューレを挿入することが可能であるが、我々は、カニューレが頻繁に心耳内で立ち往生し、左心房の体内に容易に通過しないことがわかりました。したがって、我々は、ほぼ、左心房の身体に切開を作ることを好みます房室溝に優れた2ミリメートル。カニューレを固定するとき薄肉アトリウムを引き裂く回避するために挿入する前に、適切な平面内の左心房のカニューレを配置することが重要です。 私たちは、左心房切開の理想的な大きさは約3mmであることがわかりました。切開の小さすぎ作成すると、左心房のカニューレの配置がより困難になる場合があり、および左心房の裂けにつながる可能性があります。私たちは、左心房ブロック上の酸素不透過性チューブ（内径2.9ミリメートル）のストレート、8ミリメートル、面取り部分を使用してください。我々は、傾斜エッジでこれではなく、カニューレを使用して、最も安定した心房カニューレ挿入を導き、左心房ブロックを確保する処理を容易にすることを見出しました。かかわらず使用するチューブの、上に示したように、チューブの端が（心房中隔または僧帽弁によって閉塞されていないことを確認することが重要である、我々は左心房圧のトレースがこのREGAに役立つことがわかりました心房カニューレのようであっても微妙な動きRD）は、大幅に左心室プリロードし、得られた血行動態測定値を変更することができます。同じ理由から、左心房、左心房ブロックを開いた後、次漏れないことを確実にするために重要です。それは関係なく、このシステム内のチューブは心臓への十分な酸素供給を確保するために、酸素不透過性であることを確実にするために使用されるチューブの種類の重要です。 手順の他の技術的に困難な側面は、圧力 - 容積（PV）カテーテルの配置でした。私たちは、最初は大動脈ブロックを通してカテーテルの逆行配置を支持しました。技術的に可能なものの、我々は尖穿刺を介してPVカテーテルを配置するためにはるかに簡単であり、好都合であることが判明しました。時間にカテーテル内または左心室の外に移動することができるようにケアは、実験期間を通してカテーテルの位置を監視するために注意しなければなりません。これはpressuを監視することによって行うことができます時間をかけて再とボリューム追跡。 最後に、注意がKHB溶液を各実験のために新鮮に作成されることを保証するために注意すべきです。 KHBの成分を秤量し、前もって粉末形態でコニカルチューブに保存することが可能です。実験の日に、これらは、滅菌濾過し、水、二酸化炭素/酸素との混合物に添加し、カルシウムと混合することができます。このようなTergazyme（または類似）などの酵素アクティブ粉末洗剤を使用してシステムを洗浄し、定期的に灌流液フィルタを交換することも重要です。 この実験準備のいくつかの制限が注意すべきです。まず、すべて晶質灌流ランゲンドルフ調製物と同様に、KHBおよびその他のasanguinous灌流液は血液に、容量の相対を運ぶ大幅に減少した酸素を持っています。これは部分的冠動脈血管拡張および超生理学的冠動脈の流れを介して補償されるが、準備が完全にphysiologiではありませんこのような理由のために、C。この機器で使用されるウインドケッセル室のほぼ無限のコンプライアンス、収縮期および拡張期の圧力が最小限にしか分離されているため、2番目、（ 図2Aを参照）、したがって、冠動脈灌流圧は、非生理的です。これは、後負荷ブロックにエラスタンス成分を組み込むことにより、将来のモデルで克服することができます。心筋傷害または機能不全を作成する可能性がある温虚血の - （3分2）第三に、すべての単離心臓標本のように、心が定義された期間を受けます。技術の実践を通して、この損傷を最小化することは代表的な結果に最も重要です。心がKHBで再灌流されるように、この効果はすぐに廃止されることが期待されるが、さらに、動物福祉のために必要なものの、吸入麻酔薬は、早期の再灌流過程における心筋抑制剤として機能することができます。 説明ワーキングハートシステムはphysiolの多種多様なことができます患者ケア、研究と教育に関連するogic調査。いくつかの付加的な変更を加えて、システムは、肺高血圧症および単心室生理機能を含む先天性心疾患に関連する重要な生理機能をシミュレートするために使用することができます。制限は、心臓の代わりに、より高い酸素含有血液のバッファによって灌流されていることをエクスビボ製剤であることが挙げられます。

分離された臓器の研究は、 生体内で可能であるものを超えた生理学的条件の制御を可能にする。 エクスビボ心臓製剤は、最初の逆行性灌流で分離されたモデルを説明したオットー・ランゲンドルフ、1によって説明されました。その後、他の人が心筋が両方の圧力と体積の作業を実行するには「働く心」モデルを、説明した。2そのような調製物は、心筋の作用メカニズム、3心筋代謝、4-6と強心薬の効果を解明に尽力してきています。7- 9 心筋の収縮性を高める薬物の使用は、重症患者では一般的です。しかし、いくつかのデータは、術後の設定での心不全の臨床徴候を有する患者のケアに有用である可能性が収縮し、心筋酸素消費量、データに対するこれらの薬剤の相対的効果を比較ご利用いただけます。10しかし、ほとんどの強心薬だけでなく、心筋だけでなく、動脈抵抗、静脈容量11、および患者の代謝率、12 ex vivoで単離された心臓モデルは上のような薬剤の効果を研究することにより、最適な手段のままに影響を与えるので、心筋適切。 私たちは、心筋機能と酸素消費量に強心薬の負荷に依存しない研究のためのex vivoモデルの使用を記載しています。 SDラットから心臓を心臓モデルを作業左心室を使用してカニューレを挿入し、変更されたクレブスヘンゼライト灌流液を用いて灌流しました。大動脈と左心房の圧力を制御しました。圧 - 容積インピーダンスカテーテルは、収縮期および拡張期機能を連続的に監視するための頂端穿刺を介して左心室に入れました。酸素消費量を連続的に左心房perfus間の酸素含有量でインデックス付きの差として測定しました。食べたと肺動脈流出液。試験される薬物は、左心房のブロックに注入し、心臓の性能および酸素代謝の変化を測定し、直前のベースラインと比較しました。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="685">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:132px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">S5761</td>
			<td style="width:161px;">8.401 g/4 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>0.744 g/4 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>1.580 g/4 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>0.578 g/4 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2256</td>
			<td>0.220 g/ 4 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>27.584 g/4 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9434</td>
			<td>7.208 g/4 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td>1.470 g/4 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biventricular working heart model</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>IH-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pressure volume catheter</td>
			<td>Millar, Inc</td>
			<td>SPR-944-1</td>
			<td>6 mm spacing catheter used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LabChart Pro 8</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>Version 8.1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rodent working heart model for the study of myocardial performance and oxygen consumption

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways that cannot be accomplished in vivo. For example, inotropic medications commonly also affect preload and afterload, precluding load-independent assessments of their myocardial effects in vivo. Additionally, this model allows for sampling of coronary sinus effluent without contamination from systemic venous return, permitting assessment of myocardial oxygen consumption. Further, the advent of miniaturized pressure-volume catheters has allowed for the precise quantification of markers of both systolic and diastolic performance. We describe a model in which the left ventricle can be studied while performing both volume and pressure work under controlled conditions. 
In this technique, the heart and lungs of a Sprague-Dawley rat (weight 300-500 g) are removed en bloc under general anesthesia. The aorta is dissected free and cannulated for retrograde perfusion with oxygenated Krebs buffer. The pulmonary arteries and veins are ligated and the lungs removed from the preparation. The left atrium is then incised and cannulated using a separate venous cannula, attached to a preload block. Once this is determined to be leak-free, the left heart is loaded and retrograde perfusion stopped, creating the working heart model. The pulmonary artery is incised and cannulated for collection of coronary effluent and determination of myocardial oxygen consumption. A pressure-volume catheter is placed into the left ventricle either retrograde or through apical puncture. If desired, atrial pacing wires can be placed for more precise control of heart rate. This model allows for precise control of preload (using a left atrial pressure block), afterload (using an afterload block), heart rate (using pacing wires) and oxygen tension (using oxygen mixtures within the perfusate).

逆行性灌流（ 図1A）で、左心室の作業心臓（ 図1B）で完全に計装心の概略図。典型的な拡張末期圧は約3であるD - - 。典型的な大動脈、左心房と左心室圧と容積トレーシングは 、 図2Aに示されているこのモデルでは5 mmHgで、ピーク収縮期圧は約100 mmHgである。図2Eは、変化を示しています。 LAカニューレは、カニューレの配置および位置決め中に離れて心房中隔から移動したときに、左心房でトレース。これらの実験では、大動脈圧が90 mmHgのに設定し、LA圧が10 mmHgのに設定しました。 カテコールアミンの効果をテストするには、（圧力 - 容積カテーテルおよび関連ソフトウェアから主に由来する）各生理学的パラメータは、直前と比較しました<html>ベースライン期間。図示の例では、ドーパミンは、左心房のブロックには15μg/ kg /分で注入しました。拡張末期圧（このモデルでは、固定心房圧与えられた）二つの条件が同一であるが、左心室拡張末期容積は2.5％減少し、左心室収縮末期容積が増加し、ストローク量を得、4.9％減少します（ 図3A）。プラセボ点滴、左心室ストロークワーク、圧力-容積曲線内の領域として同定され、ドーパミンでの処理中に32％増加した（ 図3B、P &lt;0.001、t検定、群当たりn = 10）と比較。これは、プラセボ注入に対する心筋酸素消費量（ 図3C）において大きな増加と関連していました。このようにして、別の強心薬や用量の相対的な効力およびエネルギーコストが負荷条件に対するそれらの効果を互いに独立に比較することができます。 コンテンツ &quot;FO：キープtogether.withinページ=&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54149/54149fig1.jpg" /> 図1： 逆行性灌流およびワーキングハートモードで完全計装心臓内の流れの図 （ パネルA：ランゲンドルフモード; パネルB：。。作業心臓モード逆行モードでは、KHBは大動脈ルートに設定された灌流圧で注入されます。このモードは、虚血時間や計測中に次の心筋を回復するために利用される。心臓の作業モードでは、灌流液は、冠循環を灌流する前に、左心を通って流れる。このモードでは、心筋が独自の灌流圧を生成する必要があります。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54149/54149fig1large.jpg" target="_blank">ご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図の拡大版。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54149/54149fig2.jpg" /> Figure 2： ベースライン測定時に得られた代表的な圧力とボリュームトレーシング。 （A）大動脈根圧力、（B）左心房圧、（C）、左心室の圧力及び（D）は、ベースライン測定時心室容積の追跡を左に表示されています。一回拍出量、脳卒中作業、心拍出量、タウ、および他のパラメータを自動的に計算し、ソフトウェアによりリアルタイムで表示することができます。ワーキング心モードの貧しい心臓出力に関連鈍化左心房トレース（E）は、カニューレが左心房に位置異常されていることを手がかりとすることができます。うまく配置された左心房圧トレースの著名なV波が原因で完全にインストルメント動物で減少した左心房のコンプライアンスに、共通の可能性があることに注意してください。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54149/54149fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図 3： 圧力-容積曲線に対するドパミンの効果が増加行程容積を含むPV曲線（A）中左シフト、内ドーパミン輸液結果は、ベースライン測定と比較して、収縮期容積を終了減少しました。これらのPV曲線のいくつかの構成要素の形状が原因で動脈と静脈のエラスタンスの不在に（ 図4を参照）は、典型的には、 生体内で測定されたものとは異なること。（B）直前のベースラインと比較して、ストロークの作業は注入の間に有意に多くの増加に注意してくださいプラセボよりもドーパミンの（**、P = 0.0017、t検定）、心筋酸素消費をしたとして（*、P = 0.013、t検定、C）。このモデルを使用して、ベースラインでの平均心筋酸素消費量は、推定dissolvを用いて、0.22±0.02ミリモルO 2 /グラム組織/分40℃の生理食塩水で165マイクロモル/ LのEDの酸素含有量このような測定は、様々な薬の心筋酸素消費量を比較するために使用することができます。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54149/54149fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54149/54149fig4.jpg" /> 図4： 圧力ボリュームループの解析。示さ理論的圧-容積ループは、正常な心臓サイクルを記述し （1）、isovolemic収縮が発生した大動脈弁（AV）の閉鎖（1から2）に続いて。心室圧として心房圧未満に減少します。この段階の持続時間は、タウによって表されます。僧帽弁（MV）を心室（ - 2,3）を充填し、心房収縮と同時に開きます。収縮期はその後isovolemic contracti始まります（3 - 4）に心室圧までAVが開く時の拡張期動脈圧を超えます。 2と3 - -ストロークボリュームはライン1との間の差である。2 - - 3 - 4ストローク作業が1内の領域である。4、曲線<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54149/54149fig4large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Isolated working heart models can be used to measure the effect of loading conditions, heart rate, and medications on myocardial performance and oxygen consumption. We describe methods for preparation of a rodent left heart working model that permits study of systolic and diastolic performance and oxygen consumption under various conditions.

心筋パフォーマンスと酸素消費量の研究のための齧歯類のワーキングハートモデル

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

rodent-working-heart-model-for-study-myocardial-performance-oxygen

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

20.1K ビュー.  Boston Children’s Hospital. Isolated working heart models can be used to measure the effect of loading conditions, heart rate, and medications on myocardial performance and oxygen consumption. We describe methods for preparation of a rodent left heart working model that permits study of systolic and diastolic performance and oxygen consumption under various conditions.

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Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

トカゲの運動の速度と方向の視覚感度のテスト

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

生物学

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In particular, understanding the constraints on visual signal design for communication has been of great interest. Traditional methods for investigating animal interactions have used basic observational techniques, staged encounters, or physical manipulation of morphology. Less intrusive methods have tried to simulate conspecifics using crude playback tools, such as mirrors, still images, or models. As technology has become more advanced, video playback has emerged as another tool in which to examine visual communication (Rosenthal, 2000). However, to move one step further, the application of computer-animation now allows researchers to specifically isolate critical components necessary to elicit social responses from conspecifics, and manipulate these features to control interactions. Here, I provide detail on how to create an animation using the Jacky dragon as a model, but this process may be adaptable for other species. In building the animation, I elected to use Lightwave  3D to alter object morphology, add texture, install bones, and provide comparable weight shading that prevents exaggerated movement. The animation is then matched to select motor patterns to replicate critical movement features. Finally, the sequence must rendered into an individual clip for presentation. Although there are other adaptable techniques, this particular method had been demonstrated to be effective in eliciting both conspicuous and social responses in staged interactions.

Computer-generated stimuli using the Jacky dragon as a model.

コンピュータによって生成された動物モデルの刺激

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

LAD-Ligation: A Murine Model of Myocardial Infarction

Research models of infarction and myocardial ischemia are essential to investigate the acute and chronic pathobiological and pathophysiological processes in myocardial ischemia and to develop and optimize future treatment.
Two different methods of creating myocardial ischemia are performed in laboratory rodents. The first method is to create cryo infarction, a fast but inaccurate technique, where a cryo-pen is applied on the surface of the heart (1-3). Using this method the scientist can not guarantee that the cryo-scar leads to ischemia, also a vast myocardial injury is created that shows pathophysiological side effects that are not related to myocardial infarction. The second method is the permanent ligation of the left anterior descending artery (LAD). Here the LAD is ligated with one single stitch, forming an ischemia that can be seen almost immediately. By closing the LAD, no further blood flow is permitted in that area, while the surrounding myocardial tissue is nearly not affected. This surgical procedure imitates the pathobiological and pathophysiological aspects occurring in infarction-related myocardial ischemia.
The method introduced in this video demonstrates the surgical procedure of a mouse infarction model by ligating the LAD. This model is convenient for pathobiological and pathophysiological as well as immunobiological studies on cardiac infarction. The shown technique provides high accuracy and correlates well with histological sections.

This video demonstrates how to use a fast and reliable model to study pathobiological and pathophysiological processes of myocardial ischemia.

LAD -ライゲーション：心筋梗塞のマウスモデル

Research models of infarction and myocardial ischemia are essential to investigate the acute and chronic pathobiological and pathophysiological processes ...

Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon

For both scientific and animal welfare reasons, training in basic surgical concepts and techniques should be undertaken before ever seeking to perform surgery on a rodent. Students, post-doctoral scholars, and others interested in performing surgery on rodents as part of a research protocol may not have had formal surgical training as part of their required coursework. Surgery itself is a technical skill, and one that will improve with practice. The principles of aseptic technique, however, often remain unexplained or untaught. For most new surgeons, this vital information is presented in piecemeal fashion or learned on the job, neither of which is ideal. It may also make learning how to perform a particular surgery difficult, as the new surgeon is learning both a surgical technique and the principles of asepsis at the same time. This article summarizes and makes recommendations for basic surgical skills and techniques necessary for successful rodent surgery. This article is designed to supplement hands-on training by the user's institution.

Before attempting surgery, a new surgeon should have training in basic surgical techniques and concepts. This article will present basic surgical considerations with an emphasis on rodents.

新外科医のための齧歯類の外科の原則

For both scientific and animal welfare reasons, training in basic surgical concepts and techniques should be undertaken before ever seeking to perform ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

胚肢の皮膚の血管系のためのホールマウント免疫組織化学的解析：胚における血管分岐形態形成を研究するモデルシステム

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

以下のための遺伝学的および生化学的アプローチ<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;インビトロ</em&gt;タンパク質のオリゴマーの評価：リアノジン受容体のケーススタディ

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of myocardial metabolism have been linked to the development of contractile dysfunction and heart failure. Therefore, unraveling the link between metabolism and contraction should shed light on some of the mechanisms governing cardiac adaptation or maladaptation in disease states. The isolated working rat heart preparation can be used to follow, simultaneously and in real time, cardiac contractile function and flux of energy providing substrates into oxidative metabolic pathways. The present protocol aims to provide a detailed description of the methods used in the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of the rates of oxidation for glucose and fatty acids, the main energy providing substrates of the heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed. In brief, the technique is based on the supply of 14C- radiolabeled glucose and a 3H- radiolabeled long-chain fatty acid to an ex vivo beating heart via normothermic crystalloid perfusion. 14CO2 and 3H2O, end byproducts of the enzymatic reactions involved in the utilization of these energy providing substrates, are then quantitatively recovered from the coronary effluent. With knowledge of the specific activity of the radiolabeled substrates used, it is then possible to individually quantitate the flux of glucose and fatty acid in the oxidation pathways. Contractile function of the isolated heart can be determined in parallel with the appropriate recording equipment and directly correlated to metabolic flux values. The technique is extremely useful to study the metabolism/contraction relationship in response to various stress conditions such as alterations in pre and after load and ischemia, a drug or a circulating factor, or following the alteration in the expression of a gene product.

The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.

単離されたワーキングラット心臓におけるグルコースおよび脂肪酸酸化の宿泊料金を決意するための方法

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

そのまま線虫の酸素消費量の測定

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Intrathoracic Injection for the Study of Adult Zebrafish Heart

The adult zebrafish heart provides a powerful model in cardiac regeneration research. Although the strength of this system is based on transgenic approaches, a rapid delivery of exogenous factors provides a complementary technique in functional studies. Here, we present a method that relies on administration of a few microliters of solution into the pericardial cavity without causing myocardial damage. Intrathoracic (IT) injections can efficiently deliver proteins and chemical compounds directly onto the heart surface. The injected substances diffuse through the epicardium into the underlying cardiac tissues. Compared to intraperitoneal (IP) injections, the main advantage of intrathoracic injections is the focal administration of the tested factors on the target organ. The delivery of molecules directly into the pericardium is a suitable strategy for studies of cardiac preconditioning and regeneration in adult zebrafish.

This method relies on the injection of 0.5&#8722;3 &#956;L of solution into the thorax of adult zebrafish. The procedure efficiently delivers proteins and chemical compounds into the proximity of the zebrafish heart without damaging the organ. The approach is suitable for testing effects of exogenous factors on various tissues of the heart.

成人ゼブラフィッシュハートの研究のための胸腔内圧注射

The adult zebrafish heart provides a powerful model in cardiac regeneration research. Although the strength of this system is based on transgenic ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer progression. How the chromosomal location and function of a centromere (i.e., centromere identity) are determined and participate in accurate chromosome segregation is a fundamental question. CENP-A is proposed to be the non-DNA indicator (epigenetic mark) of centromere identity, and CENP-A ubiquitylation is required for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability.
Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-CENP-A K124R mutant suggesting that ubiquitylation at a different lysine is induced because of the EYFP tagging in the CENP-A K124R mutant protein. Lysine 306 (K306) ubiquitylation in EYFP-CENP-A K124R was successfully identified, which corresponds to lysine 56 (K56) in CENP-A through mass spectrometry analysis. A caveat is discussed in the use of GFP/EYFP or the tagging of high molecular weight protein as a tool to analyze the function of a protein. Current technical limit is also discussed for the detection of ubiquitylated bands, identification of site-specific ubiquitylation(s), and visualization of ubiquitylation in living cells or a specific single cell during the whole cell cycle.
The method of mass spectrometry analysis presented here can be applied to human CENP-A protein with different tags and other centromere-kinetochore proteins. These combinatory methods consisting of several assays/analyses could be recommended for researchers who are interested in identifying functional roles of ubiquitylation.

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

CENP-A ubiquitylation is an important requirement for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability. Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) protein.