Le attrezzature e gli esperimenti qui descritti sono stati finanziati dal Dipartimento di Cardiologia, Ospedale dei bambini Boston e da donazioni filantropiche della famiglia Haseotes. Siamo grati al Drs. Frank McGowan e Huamei Lui per averci fornito le prime esperienze con questo modello, e per Lindsay Thomson per l&#39;assistenza con opere d&#39;arte.

Questo protocollo viene eseguita in un protocollo di corrente sotto comitato cura degli animali e l&#39;uso dell&#39;istituzione. 1. Preparazione per lo Studio <ol><li> Accendere bagnomaria per riscaldare il serbatoio tampone Krebs-Henseleit (KHB) (impostato a 42 ° C). </li><li> Preparare 16 L di KHB contenente (in mM) 128 NaCl, 5.7 KCl, 1,3 MgSO 4, 25 NaHCO 3, 2.7 CaCl 2, 0,53 EDTA, 0.54 NaC 3 H 3 O 3, e 10.8 destrosio. 13 Le masse substrato sono le seguenti : 27,584 g NaCl, 1,58 g di KCl, 0,578 g MgSO 4, 8,401 g NaHCO 3, 1,47 g CaCl 2, 0,744 g di EDTA, 0,22 g NaC 3 H 3 O 3 e 7.208 g di destrosio. Nota: questi componenti possono essere conservati in provette coniche in forma di polvere per la costituzione del giorno di sperimentazione. <ol><li> Filtro 4 L di acqua deionizzata attraverso un filtro da 0,22 micron. </li><li> Aggiungere 3,7 L di questa acqua per un 4 Lbecher. Aggiungere tutti i componenti eccetto CaCl 2 all&#39;acqua. </li><li> Sciogliere il CaCl 2 nei restanti 300 ml di acqua, utilizzando un becher separato. </li><li> Ossigenare la soluzione con 95% O 2/5% CO 2 a 1 L / min (LPM) per 5 min. Questo corregge il pH a 7,40 e migliora dissoluzione CaCl 2. </li><li> Aggiungere il CaCl 2 al resto del KHB. </li><li> Aggiungere il KHB completato ad un serbatoio e far circolare attraverso tutti i tubi per 30 min. Assicurarsi che il sistema sia privo di bolle macroscopiche. Ossigenare con il 95% O 2/5% di CO 2 a 0,5 LPM. NOTA: KHB può essere conservato notte in frigorifero per non più di 1 - 2 giorni riportato a temperatura ambiente e ri-filtrato per uso. Non riutilizzare KHB tra esperimenti. </li><li> Preparare 2 x 50 ml bicchieri puliti con KHB ghiacciata e metterli in un secchio di ghiaccio nei pressi della stazione di dissezione. Assicurarsi che il KHB è ghiacciata (piuttosto che fredda) prima di ex<html> piantare cuore. </li><li> Posizionare il catetere micro pressione-volume (PV) in una siringa da 10 ml riempita con filtrato KHB per 30 minuti prima della calibrazione, secondo le istruzioni del produttore. NOTA: Temperatura di KHB utilizzato per bagnare il catetere fotovoltaico dovrebbe essere il più vicino a 37 ° C il più possibile. </li></ol></li><li> Preparare l&#39;anestesia e la stazione di dissezione per l&#39;animale. <ol><li> Provvedere ad una sufficiente isoflurano nel serbatoio. Elaborare 500 U di eparina in una siringa da 1 ml; posizionare un ago calibro 26 (1/2 &quot;) su questo siringa. Preparare una maschera per anestetizzare l&#39;animale. </li></ol></li><li> Impostare la pressione di perfusione blocco aortica a 80 mmHg e la atriale sinistro (LA) pressione di perfusione blocco a 10 mmHg. Aprire sia il blocco aortica e blocco per consentire LA caldo KHB a gocciolare fuori. Quando si è pronti a sezionare l&#39;animale, aprire il blocco aortica per consentire un lento e costante flebo di KHB fuori. </li><li> Calibrare il catetere fotovoltaico in base alle istruzioni del fabbricante. </li></ol>&quot;&gt; 2. Preparazione degli animali e la dissezione NOTA: Per ottenere i migliori risultati, assicurarsi animale è tra 300 e 500 g; abbiamo trovato che un peso dell&#39;animale tra i 425 a 450 grammi è ideale per il nostro sistema. <ol><li> Anestetizzare l&#39;animale in una camera di isoflurano utilizzando (1 - 2%) finché l&#39;animale è inconscia. Trasferire l&#39;animale alla stazione di dissezione e posizionare la maschera di anestesia con isoflurano e ossigeno sull&#39;animale. Eseguire punta pizzico per valutare il livello di sedazione. Applicare veterinario pomata sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. </li><li> Iniettare eparina, 500 unità intraperitoneale nella cavità addominale. Lasciare 10 min per l&#39;eparina di essere assorbito. Fissare gli arti dell&#39;animale con nastro per migliorare la visualizzazione del torace. </li><li> La dissezione del cuore. <ol><li> Una volta garantendo che non vi è alcuna risposta ad una presa punta, sollevare la pelle lontano dalla cavità addominale con una pinza e quindi utilizzare le forbici per incidere la cavità peritoneale, seguendo la curva di tsi diaframma torna all&#39;angolo posteriore delle costole. </li><li> Una volta che il diaframma è visibile, utilizzando piccole forbici, tagliare lungo la superficie anteriore del diaframma seguendo la direzione dei tagli prima di consentire l&#39;ingresso nel torace. Estendere ogni taglio lungo la linea ascellare bilaterale per l&#39;ascella. NOTA: I passi successivi devono essere eseguiti in modo efficiente in quanto la ventilazione sarà compromessa una volta che il diaframma è inciso. </li><li> Ritrarre la gabbia toracica anteriormente dal processo xifoideo con pinze. Incidere il pericardio e della pleura. </li><li> Identificare la vena cava inferiore (IVC) e l&#39;aorta appena sopra il diaframma e ritrarre loro in blocco anteriormente con pinze smussato. </li><li> Utilizzando grandi, forbici curve, rapidamente fare un&#39;incisione attraverso il IVC e l&#39;aorta, tirando il cuore e polmoni dalla cassa in blocco. Tagliare l&#39;esofago, trachea, arterie e vene brachiocefalici cranialmente per rimuovere il cuore ed i polmoni dal torace. Accise L&#39;tuatessuto microfono con questo blocco di tessuto. Fare attenzione a non tagliare la porzione prossimale dell&#39;aorta ascendente. </li><li> immergere immediatamente il cuore e polmoni in KHB ghiacciata e spostare all&#39;apparato Langendorff, precedentemente impostato come descritto al punto 1. </li></ol></li></ol> 3. aortica Cannulazione <ol style="margin-left: 40px;"><li> Posizionare il complesso cuore-polmoni in un piatto piano e orientare il cuore con il timo e dei grossi vasi di fronte lo sperimentatore e l&#39;aspetto posteriore dei polmoni di fronte al tavolo. Separare i due lobi del timo e identificare il decollo delle arterie brachiocefalici dall&#39;aorta. <ol><li> Telo l&#39;aorta oltre il bordo del piatto e transetto aorta utilizzando piccole forbici circa 5 mm al di sopra della valvola aortica, appena prossimale al decollo dell&#39;arteria succlavia destra. NOTA: L&#39;incisione dovrebbe produrre un cerchio rotondo pulita - l&#39;aorta in sezione trasversale. Se è angolari (cioè, un ovale largo)o incompleti, ripetere il taglio per ottenere il risultato desiderato. Ciò faciliterà efficiente incannulazione aortica. </li></ol></li><li> Usando 2 coppie di pinze curve su entrambi i lati dell&#39;aorta, guidare l&#39;aorta sopra la cannula aortica (che dovrebbe essere gocciolando lentamente con KHB). La valvola aortica dovrebbe sedersi 1 - 2 mm sotto la punta della cannula. <ol><li> Dopo dell&#39;aorta incannulamento, riposizionare la pinza perpendicolarmente l&#39;aorta per contenere l&#39;aorta in posizione. In alternativa, mettere un piccolo fascetta attraverso l&#39;aorta per tenere il complesso polmone cuore a posto, permettendo un singolo sperimentatore per completare questo modello. </li></ol></li><li> Avere un assistente passare una sutura di seta 4-0 proprio sotto la pinza e cravatta in posizione, loop intorno alla cannula e legando più volte, sia davanti e dietro il cuore. Aprire la cannula completamente per iniziare pieno flusso aortico retrogrado. Osservare il cuore battere con vigore. NOTA: Se il cuore non inizia a battere rapidamente (~ 200 BPM) e vigorosamente, lacravatta o cannula può essere occludere una o entrambe le arterie coronarie. Se si sospetta, rimuovere la fascetta e riposizionarlo lontano dalle arterie coronarie. Se il cuore si distende e non batte, la cannula può essere attraverso la valvola aortica. Se le perdite delle arterie coronarie (KHB spray dalla radice aortica), avanzare la cannula più vicino alla valvola aortica (questo fenomeno può verificarsi se una arteria anonima è cannulate in sostituzione dell&#39;aorta ascendente). </li></ol> 4. polmonare occlusione della vena e preparazione dell&#39;arteria polmonare per Incannulamento NOTA: Lo scopo di questa fase è quello di creare un sistema atriale sinistra chiuso per assicurare che tutto il volume e la pressione dal blocco atriale sinistra vengono trasmessi alle strutture cardiache sinistre. La mancata per occludere completamente le vene polmonari potrebbe risultare in deficit di precarico e può falsare i risultati o creare una preparazione instabile cuore di lavoro. <ol><li> Rimuovere il timo per migliorare l&#39;esposizione dei tharteria polmonare e (PA). </li><li> ruotare manualmente la cannula aortica in modo che la faccia posteriore del cuore sia rivolto verso l&#39;operatore. Sezionare i vasi che portano al polmone destro. Sospendere il tessuto polmonare destra usando pinze per delineare ulteriormente questi vasi. Uso di clip chirurgici medio-grandi (o di sutura), occludere l&#39;arteria e la vena giusta polmonare e dei bronchi con una singola clip. Resecare il distale polmone destro alla clip. NOTA: a causa di difficoltà di dissezione dell&#39;arteria polmonare libera, la nostra pratica è per occludere le vene polmonari per distendere l&#39;arteria polmonare, rendendo più facile per incidere senza ferire le strutture vicine in un modello di cuore che batte. </li><li> Ripetere il passaggio 4.2 sul polmone sinistro. NOTA: potenziali insidie ​​e la soluzione dei problemi: Una volta che entrambe le arterie polmonari sono occluse, l&#39;atrio destro si visibilmente distendere e il cuore possono diventare bradicardia. Questo perché il ventricolo destro diventa pressurizzato. Se ciò non si verifica, è probabile che il pulmvene coronarico non sono completamente occluse, e che precarico saranno sufficienti per lavorare in modalità cuore. Se il cuore non è in grado di mantenere la gittata cardiaca dopo atriale sinistro (LA) incannulamento e tentato transizione al cuore (vedi sotto) di lavoro, è consigliabile inserire ulteriori clip o una cravatta attorno ai ceppi della vena polmonare per occludere qualsiasi perdita residua. Una volta che le PA sono occluse, tuttavia, Step 5 dovrebbe essere eseguita immediatamente per ridurre al minimo l&#39;ischemia miocardica. Si noti che alcuni ricercatori incise polmonare prima legatura delle vene polmonari per evitare pressurizzazione del ventricolo destro. </li><li> Polmonare arteriosa incisione <ol><li> Ruotare la cannula aortica in modo che l&#39;aspetto anteriore del cuore è rivolto verso l&#39;operatore. Identificare l&#39;arteria polmonare. Di nuovo, questa arteria può essere disteso. Utilizzando piccole forbici fare una incisione trasversale circa 3 mm sopra la valvola polmonare. NOTA: Questo sarà immediatamente alleviare la pressione e la frequenza cardiaca può aumentare. Esserecausare questo cannula è facile da rimuovere, cannulate l&#39;arteria polmonare dopo incannulamento atriale sinistra è completa. </li></ol></li></ol> 5. atriale sinistra Incannulamento <ol><li> Ruotare la cannula aortica modo che l&#39;atrio sinistro sia rivolto verso l&#39;operatore. Utilizzando le piccole forbici, fare un 2 - mm incisione 3 nel corpo superiore dell&#39;atrio sinistro, circa 3 mm sopra la scanalatura atrioventricolare. <ol><li> Posizionare la cannula atriale sinistra perpendicolare al piano della valvola mitrale e puntato verso il setto atriale. </li><li> Aprire la cannula LA fino KHB scorre. Assicurarsi che il KHB è calda al tatto (che si raffreddi in fretta quando si è seduti in qualsiasi tubi non-giacca) in modo da evitare disfunzione miocardica a causa di ipotermia seguente passaggio alla modalità di funzionamento. Transizione verso un tasso di gocciolamento durante l&#39;incannulamento. </li></ol></li><li> Utilizzando pinze per tenere contro-trazione, inserire la cannula atriale nel corpo dell&#39;atrio sinistro, facendo attenzione a non usare excessive la forza, che può strappare l&#39;atrio. NOTA: La cannula LA deve essere posizionato in modo che si trova nel mezzo dell&#39;atrio senza alcuna tensione sulla parete atriale. </li><li> Far passare una sutura 4-0 di seta intorno al corpo dell&#39;atrio sinistro e fare un nodo per creare un sigillo dell&#39;atrio attorno alla cannula. Fare attenzione che la faccia posteriore dell&#39;atrio sinistro è incluso nella sutura. Aggiungere suture supplementari necessarie. Una volta sigillato, tirare indietro la cannula 1 - 2 mm in modo che esso si trova nel mezzo dell&#39;atrio piuttosto che contro il setto atriale. NOTA: Il motivo più comune che il cuore diventa malperfused in sede di transizione di lavorare in modalità cuore è che la cannula LA confina con il setto atriale, che occlude l&#39;afflusso atriale sinistra. Il tracciato LA cambia spesso per dimostrare una vera e propria onda d&#39;onda e v quando la cannula è nella posizione corretta (vedi Figura 2E). </li><li> Aprire la valvola cannula LA interamente per amministrare la piena precarico per l&#39;atrio sinistro. monitorare latasso a goccia dal cuore (che viene da effluenti coronarica). Assicurarsi che il tasso di gocciolamento non cambia quando la cannula LA è aperto. Se lo fa, retie l&#39;atrio attorno alla cannula come descritto al punto 6.4, poiché questo rappresenta una perdita nel sistema. </li></ol> 6. Cannulazione arteria polmonare e di transizione alla modalità di funzionamento del cuore <ol><li> Se la misurazione del consumo di ossigeno del miocardio (o altre sostanze in effluenti coronarica, quali livelli di farmaco o citochine), inserire 1/32 &quot;tubo flessibile nella incisione prima nell&#39;arteria polmonare. NOTA: Il consumo di ossigeno è misurato come la differenza di contenuto di ossigeno tra perfusato atriale sinistra e effluenti arteria polmonare 2. <ol><li> Per la misura continua del consumo di ossigeno del miocardio, utilizzare un elettrodo di ossigeno in linea di confrontare atriale sinistra ed effluenti seno coronarico. </li><li> Raccogliere effluente del seno coronarico (sia dal arteria polmonare e che gocciola dal cuore) in un cyl graduatoinder per la quantificazione temporizzata del flusso coronarico. </li><li> Calcolare il consumo di ossigeno del miocardio come precedentemente descritto. 2 </li></ol></li><li> Transizione di lavorare in modalità cuore spegnendo la pompa aortica retrograda. NOTA: Quando questo è fatto, la pressione LA diventa la pressione di precarica e il resistore precedentemente fornendo resistenza alla pompa retrogrado nella modalità Langendorff fornisce ora resistenza alla gittata cardiaca, creando una pressione arteriosa media. Se la pressione arteriosa media declina sotto ~ 80 mmHg, la causa è probabilmente correlato a uno o precarico funzione miocardica. Il problema più probabile è la cannula atriale sinistra, che devono essere adeguati dopo il riavvio della pompa retrograda. </li></ol> 7. Inserimento del ventricolo sinistro Volume Pressione Catetere NOTA: Il catetere PV può essere posizionato sia retrograda (attraverso la valvola aortica) o tramite foratura apicale. Il vantaggio di retrograda è che posizione è più coerente ed evita la necessità di foratura apicale ei rischi concomitanti lesioni coronarica o perdita di precarico. Tuttavia, il posizionamento retrogrado a volte può essere molto impegnativo, in modo che entrambe le tecniche descrivere qui. <ol><li> Attaccare un catetere 1.4 pressione-volume francese al sistema a ciclo pressione volume. Calibrare il sistema a caldo KHB secondo le istruzioni del produttore. Assicurarsi la forma d&#39;onda è visibile in tempo reale. Portare il catetere e cavi vicino alla superficie del LV in modo da non staccare seguendo posizionamento. </li><li> Per il posizionamento retrogrado, aprire la valvola regolabile e nutrire il catetere PV delicatamente attraverso la valvola aortica fino a quando vengono identificati una pressione stabile e la forma d&#39;onda del volume. Evitare l&#39;uso eccessivo della forza che può danneggiare la valvola aortica o forare l&#39;apice del ventricolo. NOTA: Abbiamo trovato che è importante ridurre al minimo la lunghezza dei tubi e del numero di giri che il catetere PV deve navigare avvicinarsi al AV. essopuò essere utile per ridurre il tubo che viene fornito con il sistema. </li><li> Per il posizionamento apicale, utilizzare un 24 G angio-catetere per creare una foratura apicale nel LV. Assicurati di evitare discendente anteriore dell&#39;arteria coronaria. Obiettivo l&#39;ago verso la valvola aortica dall&#39;apice del ventricolo. Avanzare il catetere pressione-volume nel corpo del LV. Arrestare avanzare il catetere non appena la pressione e il volume waveform LV è identificato. </li><li> Una volta che il catetere di pressione-volume è in posizione, spostare la camicia d&#39;acqua in posizione intorno al cuore. Fissare il catetere alla parete della camicia d&#39;acqua con un piccolo pezzo di nastro. </li><li> Garantire almeno un periodo di 30 minuti di stabilità prima di iniziare qualsiasi misurazione o interventi. </li></ol> 8. L&#39;infusione di farmaci <ol><li> (Opzionale) Infondere farmaci (ad esempio, dopamina) nel blocco atriale sinistra utilizzando una pompa farmaco standard. NOTA: Abbiamo i farmaci dosati secondo il da te peso corporeo dell&#39;animale dal flusso equivalente ad una gittata cardiaca intera passa attraverso il blocco atriale; solo una piccola parte di questo passa attraverso la circolazione coronarica, come avviene in vivo. In alternativa, una seconda serie di perfusato può essere creato con una concentrazione prefissato di farmaco e usato per perfusione cuore. NOTA: Nel nostro protocollo, abbiamo infondere farmaci per un periodo di 12 min, raccogliendo dati fisiologici durante la finale 10 min di ogni infusione e confrontandola con una immediatamente precedente 10 min basale. </li></ol> 9. fisiologici Manipolazioni <ol><li> Frequenza cardiaca <ol><li> (Opzionale) sutura due fili di stimolazione sulla parete dell&#39;atrio destro e collegare a un dispositivo di stimolazione temporanea. NOTA: Ciò consente un preciso controllo della frequenza cardiaca (sopra la frequenza sinusale nativo) e la comprensione del rapporto tra la frequenza cardiaca e della contrattilità indipendente da un farmaco cardiotonico. </li></ol></li><li> precarico <ol><li> variare laprecarico (definita come il volume diastolica del ventricolo sinistro) variando l&#39;altezza della colonna di alimentare il blocco atriale sinistra. </li></ol></li><li> Pressione sanguigna <ol><li> Manipolare la pressione del sangue (il determinante primario di post-carico in questo modello) utilizzando le valvole di pressione sulla IH-51. </li></ol></li><li> contenuto di ossigeno coronarica <ol><li> Realizzare vari gradi di ipossia miocardica mediante perfusione del cuore con KHB saturi in varie miscele di gas. Per fare ciò, utilizzando serbatoi rivestiti separati (ciascuno con una propria miscela di gas) al fine di garantire l&#39;equilibrio tra il gas e KHB. </li><li> Realizzare ischemia coronarica da sutura legando un coronarica distale. NOTA: La legatura delle arterie coronarie prossimali in modalità cardiaca di lavoro può causare disfunzione miocardica letale. </li><li> Indurre ischemia coronarica globale interrompendo o ritardare la perfusione retrograda per un periodo di tempo definito. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Questo modello cuore di lavoro permette valutazione della funzione ventricolare con il pieno controllo del precarico ventricolare e post-carico, tensione di ossigeno del perfusato, così come la frequenza cardiaca. Tra gli altri fattori, permette la valutazione degli effetti del miocardio intrinseche dei farmaci inotropi indipendenti di post-carico e precarico, che modi che non sono possibili utilizzando un modello in vivo. Poiché questo modello utilizza un perfusato cristalloide, permette la valutazione del miocardio senza interferenza da emoglobina, semplificare l&#39;analisi spettroscopica di stati di energia del miocardio, per esempio. 14 In questo modello, l&#39;atrio destro non viene cannulata come parte di una strumentazione, anche se è possibile fare così. Abbiamo volutamente scelto di non farlo, al fine di facilitare la campionatura del flusso seno coronarico per la valutazione del consumo di ossigeno del miocardio. È importante sottolineare, però, il cuore destro esegue ancora la pressione e volume di lavoro in questo modello come le pompe di cosinusale ronary fluiscono nella cannula arteria polmonare. Fornendo alcuni precarico del ventricolo destro migliora il posizionamento del setto ventricolare e migliora le prestazioni del ventricolo sinistro, ed è una componente importante di questo modello. 15 Ci sono diverse insidie ​​sperimentali parlare. La prima è la cannulazione retrograda iniziale, che deve essere eseguita speditamente (cioè, in meno di 2 minuti) per minimizzare il periodo di ischemia. L&#39;abilità più importante da padrone è l&#39;isolamento efficiente, preparazione e la manipolazione dell&#39;aorta ascendente. È importante che il moncone aortico non essere tagliato troppo breve, lasciando spazio sufficiente per incannulazione sopra la valvola aortica. Tuttavia, è anche importante che il moncone aortico non essere troppo lungo, che può causare torqueing dell&#39;aorta intorno alla cannula. E &#39;anche importante che la cannula aorta e radice aortica essere opportunamente dimensioni abbinati. Un troppo grande dell&#39;aorta su una piccola cannula può ancheportare torqueing della radice aortica sulla cannula. L&#39;arteria succlavia destra richiede in genere fuori dal aorta ascendente circa 7 mm sopra la valvola aortica. L&#39;indicazione delle navi brachiocefalici (circa 1 mm di diametro) durante la dissezione e taglio dell&#39;aorta servono punti di riferimento come importanti per l&#39;incisione aortica trasversale. Taglio l&#39;aorta appena sotto il decollo della prima arteria anonima è consigliabile. L&#39;inclusione di questa imbarcazione in radice aortica rifilato porta normalmente a una perdita di KHB, e la perdita di pressione della radice aortica sulla transizione in modalità di lavoro del cuore. Un altro aspetto tecnicamente impegnativo del cateterismo è la cannulazione atriale sinistra. Anche se è fattibile cannulate dell&#39;atrio sinistro, abbiamo trovato che la cannula di frequente si blocca all&#39;interno dell&#39;appendice, e non passa facilmente nel corpo dell&#39;atrio sinistro. Così, si preferisce effettuare l&#39;incisione nel corpo dell&#39;atrio sinistro, circa2 mm superiori al solco atrioventricolare. È importante posizionare la cannula atriale sinistra nel piano corretto prima dell&#39;inserimento per evitare di strappare l&#39;atrio parete sottile quando si fissa la cannula. Abbiamo trovato che la dimensione ideale dell&#39;incisione atrio sinistro era di circa 3 mm. Creazione troppo piccolo di una incisione può anche rendere il posizionamento della cannula atriale sinistra più difficile, e può portare alla lacerazione dell&#39;atrio sinistro. Usiamo una scala da 8 mm, pezzo di tubo smussato impermeabile all&#39;ossigeno (diametro interno 2,9 millimetri) sul blocco atriale sinistra. Abbiamo trovato che con questo, piuttosto che una cannula con un bordo smussato, porta a cannulazione atriale più consistente e facilita il processo di fissaggio del blocco atriale sinistra. Indipendentemente dal tubo impiegato, è importante garantire che l&#39;estremità del tubo non è occlusa dal setto atriale o la valvola mitrale (come illustrato in precedenza, abbiamo scoperto che il tracciato della pressione atriale sinistra era disponibile in questo regard), come anche il movimento sottile cannula atriale può alterare in modo significativo il precarico ventricolare sinistra e conseguenti misure emodinamiche. Per la stessa ragione, è importante garantire che l&#39;atrio sinistro non perde segue dopo l&#39;apertura del blocco atriale sinistra. È importante indipendentemente dal tipo di tubo impiegato per assicurare che il tubo all&#39;interno di questo sistema è ossigeno impermeabile a garantire un adeguato apporto di ossigeno al cuore. Un altro aspetto tecnicamente impegnativo della procedura è il posizionamento del catetere pressione-volume (PV). Inizialmente abbiamo favorito un posizionamento retrograda del catetere attraverso il blocco aortica. Anche se tecnicamente fattibile, abbiamo scoperto che è molto più semplice e conveniente per posizionare il catetere fotovoltaico tramite la puntura transapicale. Bisogna fare attenzione per monitorare la posizione del catetere per tutta la durata dell&#39;esperimento, come a volte il catetere può muoversi dentro o fuori del ventricolo sinistro. Questo può essere fatto controllando la pressiori e tracciati di volume nel tempo. Infine, occorre prestare attenzione per garantire che la soluzione KHB si crea fresco per ogni esperimento. È possibile pesare i costituenti di KHB e memorizzarli in provette coniche in forma di polvere prima del tempo. Il giorno della sperimentazione, questi possono essere miscelati con acqua sterile, filtrata, biossido di carbonio / ossigeno, e quindi calcio aggiunto alla miscela. E &#39;anche importante lavare il sistema con l&#39;enzima detergente in polvere attiva, quali Tergazyme (o simile) e sostituire il filtro perfusato regolarmente. Diversi limiti di questa preparazione sperimentale da notare. In primo luogo, simile a tutti i preparati Langendorff cristalloidi-perfusione, KHB e altri perfusates asanguinous hanno una ossigeno significativamente diminuita capacità di carico rispetto al sangue. Anche se questo è parzialmente compensata attraverso la vasodilatazione coronarica e il flusso coronarico soprafisiologiche, la preparazione non è del tutto physiologic per questo motivo. In secondo luogo, a causa della conformità pressoché infinita della camera Windkessel utilizzato in questo strumento, le pressioni sistolica e diastolica sono solo minimamente separati (vedere la Figura 2A) e quindi la pressione di perfusione coronarica è non fisiologico. Questo può essere superata in modelli futuri incorporando un componente elastance al blocco post-carico. In terzo luogo, come con tutti i preparati cuore isolato, il cuore subisce un determinato periodo di tempo (2 - 3 min) di ischemia calda che rischia di creare danno miocardico o disfunzione. Minimizzare questa lesione attraverso la pratica della tecnica è della massima importanza ai risultati rappresentativi. Inoltre, anche se necessaria per il benessere degli animali, anestetici inalatori possono servire come un soppressore del miocardio nelle prime fasi del processo di riperfusione, anche se si prevede che questo effetto è rapidamente abolito come il cuore è riperfuso con KHB. Il sistema cardiaco lavoro descritto consente una vasta gamma di Physiolindagini OGIC rilevanti per la cura dei pazienti, della ricerca e dell&#39;insegnamento. Con poche modifiche aggiuntive, il sistema può anche essere utilizzato per simulare importante fisiologia rilevante per malattia cardiaca congenita, comprese ipertensione polmonare e singola fisiologia ventricolo. Limitazioni comprendono che è una preparazione ex vivo, che il cuore è perfuso da un buffer invece di un sangue contenuto di ossigeno superiore.

Lo studio degli organi isolati permette il controllo delle condizioni fisiologiche di là di ciò che è possibile in vivo. Ex vivo preparati cardiaci sono stati descritti da Otto Langendorff, 1 che ha descritto un modello isolata con perfusione retrograda. Successivamente, altri hanno descritto il modello &quot;di lavoro del cuore&quot;, in cui il miocardio esegue sia la pressione e volume di lavoro. 2 Tali preparati sono stati strumentali nel chiarire i meccanismi d&#39;azione del miocardio, 3 metabolismo miocardico, 4-6 e gli effetti di farmaci cardiotonici. 7- 9 L&#39;uso di farmaci che migliorano la contrattilità miocardica è comune nei pazienti critici. Tuttavia, sono disponibili pochi dati a confronto gli effetti relativi di questi farmaci sulla contrattilità e il consumo di ossigeno del miocardio, i dati che possono essere utili nella cura dei pazienti con segni clinici di insufficienza cardiaca del nell&#39;impostazione postoperatorio. 10 Tuttavia, poiché la maggior parte dei farmaci cardiotonico influenzano non solo il miocardio, ma anche la resistenza arteriolare, capacitanza venosa 11, e il tasso metabolico del paziente, 12 ex vivo modelli cuore isolato rimangono il mezzo ottimale per studiare gli effetti di tali farmaci sul miocardio corretta. Descriviamo l&#39;uso di un modello ex vivo per lo studio indipendente dal carico di farmaci inotropi sulla funzione miocardica e consumo di ossigeno. Cuori da ratti Sprague Dawley sono stati cannulate con un ventricolo sinistro di lavoro modello cuore e perfusi utilizzando una versione modificata perfusato Krebs Henseleit. pressione atriale aortica e di sinistra sono stati controllati. cateteri impedenza pressione-volume sono stati collocati nel ventricolo sinistro attraverso la puntura apicale per il monitoraggio continuo della funzione sistolica e diastolica. Il consumo di ossigeno è stata continuamente misurato come differenza indicizzato nel contenuto di ossigeno tra perfus atriale sinistramangiato e l&#39;effluente arteria polmonare. I farmaci da testare sono state infuse nel blocco atriale sinistra, e cambiamenti nel metabolismo cardiaco prestazioni e l&#39;ossigeno sono stati misurati e confrontati con una linea di base immediatamente precedente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="685">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:132px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">S5761</td>
			<td style="width:161px;">8.401 g/4 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>0.744 g/4 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>1.580 g/4 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>0.578 g/4 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2256</td>
			<td>0.220 g/ 4 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>27.584 g/4 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9434</td>
			<td>7.208 g/4 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td>1.470 g/4 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biventricular working heart model</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>IH-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pressure volume catheter</td>
			<td>Millar, Inc</td>
			<td>SPR-944-1</td>
			<td>6 mm spacing catheter used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LabChart Pro 8</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>Version 8.1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rodent working heart model for the study of myocardial performance and oxygen consumption

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways that cannot be accomplished in vivo. For example, inotropic medications commonly also affect preload and afterload, precluding load-independent assessments of their myocardial effects in vivo. Additionally, this model allows for sampling of coronary sinus effluent without contamination from systemic venous return, permitting assessment of myocardial oxygen consumption. Further, the advent of miniaturized pressure-volume catheters has allowed for the precise quantification of markers of both systolic and diastolic performance. We describe a model in which the left ventricle can be studied while performing both volume and pressure work under controlled conditions. 
In this technique, the heart and lungs of a Sprague-Dawley rat (weight 300-500 g) are removed en bloc under general anesthesia. The aorta is dissected free and cannulated for retrograde perfusion with oxygenated Krebs buffer. The pulmonary arteries and veins are ligated and the lungs removed from the preparation. The left atrium is then incised and cannulated using a separate venous cannula, attached to a preload block. Once this is determined to be leak-free, the left heart is loaded and retrograde perfusion stopped, creating the working heart model. The pulmonary artery is incised and cannulated for collection of coronary effluent and determination of myocardial oxygen consumption. A pressure-volume catheter is placed into the left ventricle either retrograde or through apical puncture. If desired, atrial pacing wires can be placed for more precise control of heart rate. This model allows for precise control of preload (using a left atrial pressure block), afterload (using an afterload block), heart rate (using pacing wires) and oxygen tension (using oxygen mixtures within the perfusate).

Uno schema di un cuore completamente fornito in perfusione retrograda (Figura 1A) e nel ventricolo sinistro del cuore lavoro (Figura 1B). Aortica tipica, atriale sinistra e pressione ventricolare sinistra e del volume tracciati sono mostrati in figura 2A -. D Il tipico pressione di fine diastolica è di circa 3 - 5 mmHg in questo modello, e la pressione di picco sistolico si trova a circa 100 mmHg Figura 2E dimostra il cambiamento. in sinistra tracing atriale quando la cannula lA viene allontanato dal setto atriale durante il posizionamento e il posizionamento della cannula. In questi esperimenti, la pressione aortica è stato fissato a 90 mmHg, e pressione LA è stato impostato a 10 mmHg. Per testare gli effetti delle catecolamine, ciascun parametro fisiologico (derivato principalmente dal catetere pressione-volume e il software associato) è stato confrontato immediatamente precedente<html> periodo basale. Nell&#39;esempio illustrato, dopamina è stata infusa a 15 mcg / kg / min nel blocco atriale sinistra. Anche se la fine della pressione diastolica è identico nelle due condizioni (data la pressione atriale fisso in questo modello), il volume diastolica del ventricolo sinistro diminuisce del 2,5%, e il volume sistolico del ventricolo sinistro diminuisce del 4,9%, ottenendo un volume di corsa maggiore (Figura 3A). Rispetto al placebo infusioni, il lavoro di sinistra ictus ventricolare, identificata come l&#39;area all&#39;interno della curva pressione-volume, è aumentato del 32% durante il trattamento con dopamina (Figura 3B, P &lt;0,001, test t, n = 10 per gruppo). Questo è stato associato ad un maggiore aumento del consumo di ossigeno del miocardio rispetto al placebo infusioni (Figura 3C). In questo modo, i relativi costi potenza ed energia di diversi farmaci cardiotonico e dosi possono essere confrontati tra loro indipendente delle loro effetti sulle condizioni di carico. contenuti &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54149/54149fig1.jpg" /> Figura 1: Schema di flusso in un cuore completamente fornito in Retrograde perfusione e Modalità Cuore di lavoro (Pannello A: modalità Langendorff; Pannello B:.. Modalità cuore si lavora in modalità retrograda, KHB è infuso ad una pressione impostata di perfusione nella radice aortica. questa modalità viene utilizzata per recuperare il miocardio seguente tempo di ischemia e durante la strumentazione. lavorando modalità cuore, perfusato scorre attraverso il cuore sinistro prima di perfusione della circolazione coronarica. In questa modalità, il miocardio deve generare la propria pressione di perfusione. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54149/54149fig1large.jpg" target="_blank">clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54149/54149fig2.jpg" /> FIGURA 2: pressione Rappresentante e del volume Tracciati ottenuti durante misurazioni basali. (A) pressione della radice aortica, (B) ha lasciato la pressione atriale, (C) pressione ventricolare sinistra e (D) vengono visualizzati tracciati volume ventricolare sinistro durante una misurazione di riferimento. gittata sistolica, il lavoro ictus, la gittata cardiaca, tau, e altri parametri possono essere calcolati e visualizzati in tempo reale dal software automaticamente. Una traccia blunted sinistra atriale (E) associato ad una gittata cardiaca povero in modalità cardiaca di lavoro può essere un indizio che la cannula è mal posizionati nell&#39;atrio sinistro. Si noti che il primo piano v onda nel tracciato pressione atriale sinistra ben piazzato è comune, probabilmente a causa di una conformità atriale sinistra è diminuito negli animali completamente strumentata. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54149/54149fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 3:. Effetto della dopamina sulla pressione Volume Curve risultati dopamina infusione in uno spostamento verso sinistra della curva PV (A), tra cui una gittata sistolica aumentata, diminuita volume telesistolico, rispetto a misurazioni di base. Si noti che la forma di alcuni componenti di queste curve FV differiscono da quelli tipicamente misurata in vivo (vedi figura 4) per l&#39;assenza di arterioso e elastance venosa. (B) Rispetto ad una linea di base immediatamente precedente, il lavoro ictus aumentato significativamente più durante infusioni di dopamina rispetto al placebo (**, P = 0,0017, t-test), così come il consumo di ossigeno del miocardio (*, P = 0,013, t-test, C). Utilizzando questo modello, il consumo medio di ossigeno del miocardio al basale era 0,22 ± 0,02 mmol O 2 / grammo di tessuto / minuto, utilizzando un dissolv stimatoed il contenuto di ossigeno del 165 mmol / l in soluzione salina a 40 ° C. Tali misure possono essere utilizzati per confrontare il consumo di ossigeno del miocardio di vari farmaci. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54149/54149fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54149/54149fig4.jpg" /> Figura 4: Analisi di Loops Volume pressione. Il teorico Loop pressione-volume indicato descrive il ciclo normale cardiaca, dopo la chiusura delle valvole aortica (AV) (1), si verifica la contrazione isovolemica (1 - 2). Come la pressione del ventricolo diminuisce al di sotto della pressione atriale. La durata di questa fase è rappresentato da Tau. La valvola mitrale (MV) si apre contemporaneamente con la sistole atriale, riempiendo il ventricolo (2 - 3). Sistole inizia poi con contracti isovolemicail (3 - 4) finché la pressione ventricolare supera la pressione arteriosa diastolica, momento in cui si apre il AV. Gittata sistolica è la differenza tra le linee 1 - 2 e 3 -. 4 lavoro ictus è l&#39;area all&#39;interno del 1 - 2 - 3 -. Curva 4 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54149/54149fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Isolated working heart models can be used to measure the effect of loading conditions, heart rate, and medications on myocardial performance and oxygen consumption. We describe methods for preparation of a rodent left heart working model that permits study of systolic and diastolic performance and oxygen consumption under various conditions.

Roditore Working Model Cuore per lo Studio della performance miocardica e consumo di ossigeno

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

rodent-working-heart-model-for-study-myocardial-performance-oxygen

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

20.1K Views.  Boston Children’s Hospital. Isolated working heart models can be used to measure the effect of loading conditions, heart rate, and medications on myocardial performance and oxygen consumption. We describe methods for preparation of a rodent left heart working model that permits study of systolic and diastolic performance and oxygen consumption under various conditions.

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Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Test di sensibilità visiva alla velocità e direzione del movimento in lucertole

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

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Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In particular, understanding the constraints on visual signal design for communication has been of great interest. Traditional methods for investigating animal interactions have used basic observational techniques, staged encounters, or physical manipulation of morphology. Less intrusive methods have tried to simulate conspecifics using crude playback tools, such as mirrors, still images, or models. As technology has become more advanced, video playback has emerged as another tool in which to examine visual communication (Rosenthal, 2000). However, to move one step further, the application of computer-animation now allows researchers to specifically isolate critical components necessary to elicit social responses from conspecifics, and manipulate these features to control interactions. Here, I provide detail on how to create an animation using the Jacky dragon as a model, but this process may be adaptable for other species. In building the animation, I elected to use Lightwave  3D to alter object morphology, add texture, install bones, and provide comparable weight shading that prevents exaggerated movement. The animation is then matched to select motor patterns to replicate critical movement features. Finally, the sequence must rendered into an individual clip for presentation. Although there are other adaptable techniques, this particular method had been demonstrated to be effective in eliciting both conspicuous and social responses in staged interactions.

Computer-generated stimuli using the Jacky dragon as a model.

Computer-Generated modello animale Stimoli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

LAD-Ligation: A Murine Model of Myocardial Infarction

Research models of infarction and myocardial ischemia are essential to investigate the acute and chronic pathobiological and pathophysiological processes in myocardial ischemia and to develop and optimize future treatment.
Two different methods of creating myocardial ischemia are performed in laboratory rodents. The first method is to create cryo infarction, a fast but inaccurate technique, where a cryo-pen is applied on the surface of the heart (1-3). Using this method the scientist can not guarantee that the cryo-scar leads to ischemia, also a vast myocardial injury is created that shows pathophysiological side effects that are not related to myocardial infarction. The second method is the permanent ligation of the left anterior descending artery (LAD). Here the LAD is ligated with one single stitch, forming an ischemia that can be seen almost immediately. By closing the LAD, no further blood flow is permitted in that area, while the surrounding myocardial tissue is nearly not affected. This surgical procedure imitates the pathobiological and pathophysiological aspects occurring in infarction-related myocardial ischemia.
The method introduced in this video demonstrates the surgical procedure of a mouse infarction model by ligating the LAD. This model is convenient for pathobiological and pathophysiological as well as immunobiological studies on cardiac infarction. The shown technique provides high accuracy and correlates well with histological sections.

This video demonstrates how to use a fast and reliable model to study pathobiological and pathophysiological processes of myocardial ischemia.

LAD-Legatura: un modello murino di infarto miocardico

Research models of infarction and myocardial ischemia are essential to investigate the acute and chronic pathobiological and pathophysiological processes ...

Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon

For both scientific and animal welfare reasons, training in basic surgical concepts and techniques should be undertaken before ever seeking to perform surgery on a rodent. Students, post-doctoral scholars, and others interested in performing surgery on rodents as part of a research protocol may not have had formal surgical training as part of their required coursework. Surgery itself is a technical skill, and one that will improve with practice. The principles of aseptic technique, however, often remain unexplained or untaught. For most new surgeons, this vital information is presented in piecemeal fashion or learned on the job, neither of which is ideal. It may also make learning how to perform a particular surgery difficult, as the new surgeon is learning both a surgical technique and the principles of asepsis at the same time. This article summarizes and makes recommendations for basic surgical skills and techniques necessary for successful rodent surgery. This article is designed to supplement hands-on training by the user's institution.

Before attempting surgery, a new surgeon should have training in basic surgical techniques and concepts. This article will present basic surgical considerations with an emphasis on rodents.

Principi di Chirurgia roditori per il chirurgo nuovo

For both scientific and animal welfare reasons, training in basic surgical concepts and techniques should be undertaken before ever seeking to perform ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

Con tutto il supporto per l&#39;analisi immunoistochimica vasi embrionali pelle degli arti: un sistema modello per studiare morfogenesi vascolare diramazione in embrione

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Approcci genetici e biochimici per<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; La valutazione di proteine ​​Oligomerizzazione: Il rianodina Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of myocardial metabolism have been linked to the development of contractile dysfunction and heart failure. Therefore, unraveling the link between metabolism and contraction should shed light on some of the mechanisms governing cardiac adaptation or maladaptation in disease states. The isolated working rat heart preparation can be used to follow, simultaneously and in real time, cardiac contractile function and flux of energy providing substrates into oxidative metabolic pathways. The present protocol aims to provide a detailed description of the methods used in the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of the rates of oxidation for glucose and fatty acids, the main energy providing substrates of the heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed. In brief, the technique is based on the supply of 14C- radiolabeled glucose and a 3H- radiolabeled long-chain fatty acid to an ex vivo beating heart via normothermic crystalloid perfusion. 14CO2 and 3H2O, end byproducts of the enzymatic reactions involved in the utilization of these energy providing substrates, are then quantitatively recovered from the coronary effluent. With knowledge of the specific activity of the radiolabeled substrates used, it is then possible to individually quantitate the flux of glucose and fatty acid in the oxidation pathways. Contractile function of the isolated heart can be determined in parallel with the appropriate recording equipment and directly correlated to metabolic flux values. The technique is extremely useful to study the metabolism/contraction relationship in response to various stress conditions such as alterations in pre and after load and ischemia, a drug or a circulating factor, or following the alteration in the expression of a gene product.

The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.

Metodi per la determinazione dei tassi di glucosio e acidi grassi ossidazione nel cuore isolato di lavoro Rat

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

Misurazione dei tassi di consumo di ossigeno in intatto Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Intrathoracic Injection for the Study of Adult Zebrafish Heart

The adult zebrafish heart provides a powerful model in cardiac regeneration research. Although the strength of this system is based on transgenic approaches, a rapid delivery of exogenous factors provides a complementary technique in functional studies. Here, we present a method that relies on administration of a few microliters of solution into the pericardial cavity without causing myocardial damage. Intrathoracic (IT) injections can efficiently deliver proteins and chemical compounds directly onto the heart surface. The injected substances diffuse through the epicardium into the underlying cardiac tissues. Compared to intraperitoneal (IP) injections, the main advantage of intrathoracic injections is the focal administration of the tested factors on the target organ. The delivery of molecules directly into the pericardium is a suitable strategy for studies of cardiac preconditioning and regeneration in adult zebrafish.

This method relies on the injection of 0.5&#8722;3 &#956;L of solution into the thorax of adult zebrafish. The procedure efficiently delivers proteins and chemical compounds into the proximity of the zebrafish heart without damaging the organ. The approach is suitable for testing effects of exogenous factors on various tissues of the heart.

Iniezione intrathoracica per lo studio del cuore di zebrafish adulto

The adult zebrafish heart provides a powerful model in cardiac regeneration research. Although the strength of this system is based on transgenic ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer progression. How the chromosomal location and function of a centromere (i.e., centromere identity) are determined and participate in accurate chromosome segregation is a fundamental question. CENP-A is proposed to be the non-DNA indicator (epigenetic mark) of centromere identity, and CENP-A ubiquitylation is required for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability.
Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-CENP-A K124R mutant suggesting that ubiquitylation at a different lysine is induced because of the EYFP tagging in the CENP-A K124R mutant protein. Lysine 306 (K306) ubiquitylation in EYFP-CENP-A K124R was successfully identified, which corresponds to lysine 56 (K56) in CENP-A through mass spectrometry analysis. A caveat is discussed in the use of GFP/EYFP or the tagging of high molecular weight protein as a tool to analyze the function of a protein. Current technical limit is also discussed for the detection of ubiquitylated bands, identification of site-specific ubiquitylation(s), and visualization of ubiquitylation in living cells or a specific single cell during the whole cell cycle.
The method of mass spectrometry analysis presented here can be applied to human CENP-A protein with different tags and other centromere-kinetochore proteins. These combinatory methods consisting of several assays/analyses could be recommended for researchers who are interested in identifying functional roles of ubiquitylation.

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

CENP-A ubiquitylation is an important requirement for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability. Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) protein.