ショウジョウバエイメージ図 3 およびビデオの原稿; ありがとうダレン ObbardJ. マリー ・ ハードウィック、ウェイド ・ ギブソン、ヘザー M. ラムこの原稿の貴重な議論のため。この作業によって、卿エドワード ・ ユード記念フェローシップ (H.L.T.)、博士ウォルター Szeto 記念奨学金 (H.L.T.) が支持されたフルブライト付与生命科学研究財団フェローシップ (H.L.T.) と NCI K22 付与 CA204458 (H.L.T.) 007-2009 (H.L.T.) です。ホー ラム唐は、Shurl と生命科学研究財団 (2014-2017) ケイ Curci 財団研究員だった。

1) ハエ CaspaseTracker バイオ センサーの作製
<ol><li>CO2ハエを麻酔し、絵筆を使用してはえの食糧と新鮮な酵母のペーストと同じ瓶で 7 に 10 カスパーゼに依存した Gal4 (DQVD)19処女女性および 7 10 G トレース53 Gal4 記者若い男性のハエ (またはその逆) を転送します。 注:カスパーゼに依存 (DQVD) Gal4 と G トレース ハエの十字架 CaspaseTracker 子孫ハエが生成されます。カスパーゼ -で機密性の高い (DQVA)19 Gal4 のクロス、G トレース ハエはネガティブ コントロール ハエ (ディスカッションを参照) を提供します。新鮮な酵母ペーストは子孫の数が増加するので、卵の生産を強化するたんぱく源として提供しています。処女の女性とその表現型54によると若い男性のハエを選択します。</li>
	<li>3 〜 7 日、十字架の中に摂氏 18 度 (oC) でハエをインキュベートし、18 ° C で新しいクロスを設定する新しいバイアルにハエを転送子孫が eclose を飛ぶまでに 18 ° C で元のバイアルをインキュベートし続けます。 注:親のハエを元のバイアルに子孫の混雑を避けるために新しい瓶に転送します。親のハエは最初 2 に 3 スイッチで生鮮食品酵母の子孫を作り出すことができるし、生産性が時間大幅減少します。ハエを発生させる 18 の ° C は、CaspaseTracker バイオ センサーの非固有の信号を減らすことができます (ディスカッションを参照してください)。</li>
	<li>選択の子孫は次の実験のための正しい表現型54で飛ぶ。 注:ここで両方のカスパーゼに依存した Gal4 と G トレースの transgenes、CyO バランサーとのバランス、2 番目の染色体にあります。カスパーゼ依存 Gal4 および G トレースの両方の遺伝子を持つ (町)、なし非巻き毛翼子孫を選択します。</li>
</ol>2) 一時的な細胞死誘導 CaspaseTracker バイオ センサーへの応用を飛ぶ
<ol><li>10 に 20 新しく卵卵室の生産を許可する 18 の ° C で 1 日新鮮なはえの食糧と新鮮な酵母ペースト新しいバイアルにこの女性がジャンプを転送します。 注:雄と雌を維持する産卵室を高める可能性があります。</li>
	<li>低温ショックによってアポトーシスを受けるに卵室を誘導して、メスの成虫を 1 h の-7 ° C に配置され、新しい空のバイアルに転送します。 注: 低温プラズマ膜破裂55,56を誘導することによって細胞を傷つけます。</li>
	<li>タンパク質飢餓によるアポトーシスを受けるに卵室を誘導して、3 日間の 18 ° C で 8% 蔗糖および 1% 寒天の食物と一緒に新しいバイアルにメスの成虫を転送します。 注:タンパク質不足 (非蛋白質食品) は、アポトーシス57,58,59とオートファジー60,61を受ける卵室をトリガーできます。はえの食糧、ショ糖の最適な状態を保つために、毎日 8% のショ糖と 1% の寒天食品と新しいバイアルにハエを切り替えます。</li>
	<li>回復することを許可するように 18 ° C で 3 日間新鮮なはえの食糧と新鮮な酵母ペースト新しいバイアルに強調したハエを転送します。飢え死にしたと記述されている62として卵巣に卵室を取得する飢えた回復ハエを解剖します。 注:ショウジョウバエ卵巣を取得するを解剖、CO2ハエを麻酔しハエの頭を削除する鉗子の 2 組を使用し、ハエの卵巣を削除する腹部の基部をプルする鉗子を使用します。</li>
</ol>3) 固定およびイメージングの切り裂かれた卵室の汚損
<ol><li>0.5 mL リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 中一緒に切り裂かれた卵室を 1 mL の遠心管に転送します。定住する卵を許可します。 注:1% ウシ血清アルブミン (BSA) を水や卵室の先端のプラスチックの表面に固執するを防ぐために PBS に溶解とプラスチック ピペット チップをコートします。赤色けい光たんぱく質 (RFP、下流とも呼ばれます) の変質を避けるために暗闇の中で次の手順を実行、卵室で緑の蛍光蛋白質 (GFP)。</li>
	<li>ピペッティングで PBS を削除し、20 から 30 分のために室温で卵室を修正する PBS で 0.5 mL 4% パラホルムアルデヒドを適用します。 注:この手順と次のインキュベーション手順で緩やかな回転を適用します。</li>
	<li>ピペッティングして、パラホルムアルデヒドを削除し、0.5 ml の pbst; 卵室を洗浄し (PBS + 0.1% トリトン X-100) 3 回。 注:長期固定は、RFP と GFP の信号を減らすことができます。</li>
	<li>PBST と卵室に室温で 1 ~ 2 時間孵化させなさいまたは卵室を permeabilize 緩やかな回転で 4 ° C で一晩します。 注: pbst; また非 BSA のプラスチック表面に固執する卵室を避けることができます。</li>
	<li>ピペットで、pbst; を削除し、卵室に核を染色する室温で 1 ~ 2 時間に 10 μ g/ミリリットル PBST で青い核ヘキスト染料の 0.5 mL を適用します。 注 1:非固有の信号を高めるため核染付長期間の加温は避けてください。 注 2:ヘキストせず核を染色する方法は 200 を追加、DAPI μ L 抗漂白取付エージェント (資料参照) プロトコル 3.8 で説明したように、ガラス製カバー スリップ上組織をマウントする前に一晩63、孵化させなさいと。 注 3: 退色を避けるために暗闇の中で染色し、次の手順を実行します。</li>
	<li>ピペッティングで核染色を削除し、0.5 mL pbst; 洗浄の各ステップ間の緩やかな回転と 10 〜 20 分孵化での 3 時間のため 1 mL の遠心管に卵室を洗浄します。</li>
	<li>罰金のピペットですべて pbst; を削除し、200 を適用 μ L 抗漂白取付エージェント (参照資料) 卵室が管の底に沈むまで 4 ° C で 3 時間室温または一晩卵室をインキュベートします。 注意: 取り付けエージェントを完全に吸収している組織が管の底に沈みます。</li>
	<li>アンチ漂白 200 μ L でそれらを転送することによって汚された卵室をマウント 20 × 20 mm あらかじめ洗浄し、ガラス カバー スリップの卵室をカバーし、置くことによってスライド ガラスにカバーガラスをシール ピペッティングによるイメージングのためのあらかじめ洗浄し、ガラス スライド上のエージェントを実装マニキュア カバー スリップの端に。 注 1:あらかじめスライド ガラスと水または 70% エタノールとカバー スリップをきれい。 注 2:スライド ガラスと overcompression によって卵室を破壊しないようにカバー スリップの石油ゼリーを適用します。</li>
	<li>イメージの蛍光または 20 x、NA 0.8 を用いた共焦点顕微鏡を用いた卵溜まり計画アポクロマート目的は、染色性が核の励起光の波長 405 nm (検出排出 〜 461 nm)、561 RFP (進行中または最近カスパーゼ活性) 信号 (nm放出 ~ 590 nm を検出) と 488 (過去のカスパーゼ活性) GFP シグナルの nm (発光を検出 〜 518 nm)。 注:顕微鏡20,64の私たちの公開プロトコルを参照してください。</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

CaspaseTracker デュアル センサー システムが斬新で、最近の検出を可能にするユニークなツールまたは進行中のカスパーゼ活性と細胞死を逆転させた細胞の追跡処理およびカスパーゼ活性体内を経て生き残るため。成長の研究が非アポトーシス カスパーゼ活性がニューロン活動79,の規制などの多様な細胞機能の潜在的な役割を果たしていることを明らかにする一方、カスパーゼ活性がアポトーシスの特徴として伝統的に仮定されて、80、学習およびメモリ81,82,83,84, necroptotic 細胞死85,86, spermatid 個別化87の抑制 88、89、細胞増殖90、91をパターニング細胞運命の処理マイクロ Rna。アポトーシスにアナスタシスは加え、CaspaseTracker バイオ センサー システムは従って脳と視葉、噴門、腸、キイロショウジョウバエマルピギー管、気管、筋肉との他の組織に存在する非アポトーシス カスパーゼ活性を検出します。ショウジョウバエ19,46,64。このバイオ センサー信号も胚または通常恒常性これらの組織の中に現在または過去の anastatic の活動を表すことができます。アナスタシスは生きている動物の一時的な細胞死を誘発する環境ストレス後、勉強するには、通常の生理条件下でのカスパーゼ バイオ活性を示さないことが誘導され、カスパーゼを受ける細胞組織を選択する重要です。一時的な細胞死誘導による活性化。通常がないのでステージ 10 に germarium からカスパーゼ活性卵58,59,92中、卵室がこの目的に最適です。
女性ショウジョウバエ非定常環境応力を公開する、蛋白質不足や低温ショックなど効率的にトリガーできるカスパーゼ活性化と細胞死卵室19,57,58、 78。プロトコルの中で重要なステップは、ハエに長時間細胞死誘導を避けることなど。タンパク質飢餓 (8% スクロースを 3 日間の 1% 寒天) と低温ショック (-7 oC で 1 h) のメスの成虫に最適化された条件できます卵室でカスパーゼ活性化細胞死のプロセスをトリガーし、する強調したハエが返された後に回復し通常の状態の19。細胞死の刺激との長期治療は、細胞死のプロセスを受けることにより多くの卵室を引き起こすことができますが、回収率も減少し、おそらく死んで卵室修復不可能なほどの大規模な被害を経験。
このプロトコルでは追加の重要なステップを横断し、調達、CaspaseTracker ハエ 18 oC. など、低温を維持する卵室の CaspaseTracker バック グラウンド信号を減らすためにはハエが卵形成58中ステージ 10 を germarium でカスパーゼ活性を表示しないから卵室の大半は最適な飼育、卵室の約 1% は細胞死誘導19 なしカスパーゼ バイオ活性を示すことが.これは生得的なエラーのため通常の離職率を反映可能性があります。 または標準的な実験室の条件によって卵形成中に意図せずに引き起こされるかもしれない。Gal4 低温93でハエに、以下の活動の表示で 18 oC ではなく、室温でハエを発生させる CaspaseTracker システムをアクティブに内因性信号を減らすことができます。また、29 oC などの高温にハエを切り替えることができます増加 CaspaseTracker システムの感度 Gal4 活動93、および可能性のあるその他内因性温度依存性酵素の増加活動。
細胞死のプロセスまたは非アポトーシス カスパーゼ活性を示す細胞からアナスタシスは受ける CaspaseTracker 陽性細胞を区別することが重要です。死細胞はその切断活性化 Gal4 進行中のカスパーゼ活性を持っていると、アポトーシス細胞表現 RFP (あるいは最近カスパーゼ活性の一時的なマーカー) とアポトーシス誘導の治療にしばしば GFP (過去のカスパーゼ活性の永久的なメーカー)その過渡 (Gal4 活動依存した RFP) と永久をアクティブに (Gal4 トリガー FLPase FRT GFP を介した) G トレース システムの記者。これらの細胞のアポトーシスを確認できない形態学的および生化学的特徴そのような米国核凝縮核染料14,19,58, 染色によって検出およびカスパーゼによって検出された胸の谷間免疫染色19,94。アナスタシスを既に受けている細胞は、G トレース システムの FLPase を介する組み換えイベントのため恒久的な GFP の表現を表示します。彼らはないにカスパーゼ活性とアポトーシス19の他の特徴を持っていると、これらの細胞 RFP 表現ないです。これらの細胞は、正常な核形態を表示もできます。細胞は、RFP と GFP 発現を頻繁に表示しても正常な核形態19に非アポトーシス カスパーゼ活性を持っています。
両方は GFP のみを表示し、細胞死の認刻極印があるため非アポトーシス カスパーゼ活性過去があったそれらの細胞からアナスタシスは経験豊富な細胞を区別するために困難になることができます。したがって、注意の制御実験は、含まれている19をある必要があります。例については卵室でアナスタシスを勉強する強調回復ハエと非強調したハエ (マイナス コントロール) の両方における GFP 発現を調べることが不可欠です。アナスタシスは、カスパーゼ活性化後に発生した場合回復したハエ gfp 発現する強勢のショウジョウバエよりセルが表示されます。また、キューティクル、顔料、および脂肪体19の観測としての非特異的自己蛍光 CaspaseTracker 蛍光信号を区別することが重要です。我々 は、非分解シーケンス (DQVA) にバイオ センサー (DQVD) のカスパーゼの胸の谷間のサイトを変更しそれによりレンダリング制御バイオ センサーをカスパーゼ活性19に対応して陰性対照バイオ センサー ハエを生成されます。信号は、カスパーゼ機密 (DQVD) の検出しますが、ネガティブ コントロール (DQVA) バイオ センサーのハエではなく自動蛍光よりもむしろカスパーゼ活性によってトリガーされる、興味の信号。
私たちの現在のショウジョウバエデュアル CaspaseTracker バイオは、RFP の式による「最近」のカスパーゼ活性細胞と GFP19の発現による「過去」のカスパーゼ活性細胞を識別できます。我々 は RFP が「リアルタイム」カスパーゼのアクティビティインジケーターはカスパーゼ活性への応答における RFP の発現を駆動する Gal4 の反応時間のいくつかの時間がかかるので注意してください。最近開発された iCasper バイオ センサー52, と「リアルタイム」関数を追加するショウジョウバエCaspaseTracker バイオ センサーを組み合わせることは、「リアルタイム」と「明るい、暗い」体内バイオ センサーだけだとその赤外信号を表示します。カスパーゼによって裂かれます。
アポトーシスから離れて CaspaseTracker 可能性がある細胞は、直接または間接的、後オートファジーなどのカスパーゼ活性化の過程で細胞死経路を切り替えることができますとしても別の種類の細胞死の中にアクティブ化します。飢餓95,96, 冷たい衝撃誘起プラズマ膜破裂19,55,56,78, スタウロスポリン誘発ネクロトーシス97、によって壊死 98。私たちの現在と以前の研究実証 CaspaseTracker バイオ センサーがこれら細胞死誘導生体外でまたは生体内で17,18,19から回復した細胞をラベルすることができます。,20,21. 死細胞の回復が、アナスタシスは、異なる細胞死を逆にすることができます一般的な細胞回復現象を示唆しているようにこれらの細胞の死の帰納だけでは、同じセルに複数の細胞死経路を有効にできる同時に、プロセスを個別に、または同時に、アポトーシス、オートファジー、壊死、ネクロトーシスを含みます。
体内の CaspaseTracker バイオ センサーはまだ未知の機能、メカニズム、およびアナスタシスは(図 4)21の治療上の含意の追求を促進します。アナスタシスはの分子シグネチャを明らかにするため行った時間コース全ゲノム遺伝子発現マイクロ アレイ研究エタノールによるアポトーシス誘導の反転中マウス初代肝細胞を分析し、興味深いことの顕著な変化を発見するには生存、抗酸化の DNA 損傷応答、ヒストン修飾、血管新生、細胞移動、変換18,21を含む複数の経路に関与する遺伝子の転写。この発見は、ひと肝臓癌 HepG2 細胞のアポトーシス18,21, からの回復の検証研究とまた HeLa 細胞アポトーシス99の回復の最近独立した RNA 塩基配列解読研究によってサポートされます。興味深いことに、anastatic の細胞で見つけられたいくつかの生存因子の発現は心不全反転、腫瘍の進行と癌再発100,101,102, 観察も示唆アナスタシスはの潜在的な参加。アナスタシスは生理学的、病理学的、治療の可能性を研究するには、これは機構と治療研究を有効にすると anastatic 細胞を識別し、小動物の彼らの運命を追跡することが重要です。私たちショウジョウバエおよび哺乳類の CaspaseTracker バイオ センサーは正常な発達、恒常性、組織の回復、腫瘍の進化、ガンの再発、転移のアナスタシスはの潜在的な貢献をテストするための便利なツールになります。これらの研究からの知見はアナスタシスは、自然な役割の私達の理解を増加し、細胞死と生存とアナスタシスはの制御を媒介して難治性疾患の画期的な新しい治療法を識別するために可能性を提供します。

プログラムされたアポトーシスなどの細胞死は、多細胞生物1,2,3不要、負傷、または危険な細胞を排除することによって胚と通常の恒常性に重要な役割を果たしています。細胞死と生存のバランスの損失は、癌、心不全、自己免疫疾患、変性4,5,6,7,8など致命的な結果につながることができます。カスパーゼは、"ノーリターンのポイント「アポトーシス9,10、11、それとして従来考えられている死刑執行人の活性化を迅速かつ大規模な細胞解体12、トリガー 13,14,,1516。この一般的な教義に挑戦、我々 は実証が死ぬ主細胞と癌細胞を回復できるだけでも次の重要な細胞のカスパーゼ活性化後、膜ブレブ、細胞の収縮を含む死の特徴ミトコンドリアの断片化、細胞質、核 chromatin の凝縮が、DNA 損傷、核の断片化へのミトコンドリアのチトクロームcの放出細胞アポトーシス小体の形成とホスファチジルセリン (PS) の表面の露出17,18,19,20,21. 提案するそのアナスタシスは本質的な細胞回復現象、死細胞は細胞死の刺激17,18,19,20,を除去した後回復できるよう21. 私たちの造語「アナスタシスは」(Αναστάσης)18、「上昇生活に」ギリシャ語でを意味するこの予期しない細胞回復現象を記述します。アナスタシスはの私達の観察はホスファチジルセリン外在化22,23,24、限定ミトコンドリア、後細胞の回復も明らかに最近の独立した研究によってサポートされてさらに外側膜透過25キナーゼのような混合系の活性化 (MLKL) と細胞収縮26。
アナスタシスを規定しているメカニズムを特徴付けるお越しのパラダイム シフトの生理学的、病理学的、および治療の影響。アナスタシスは救助または左心室と心室をアンロードして重要な後細胞と置き換えるには、困難な組織、おそらく心不全逆転のアカウントを保持する未知の細胞保護メカニズムを表すことができます。脳損傷32後デバイス (LVADs)27,28, 視細胞の過度光29,30,31, 一時的な露出やニューロンの修理後の復旧を支援します。その場合推進アナスタシスは細胞・組織の回復を高めることができます。逆に、アナスタシスはがん細胞が細胞死誘導療法、がん再発17,18の原因を生き残るために使用予期しないエスケープ戦術かもしれない。したがって、アナスタシスは中にがん細胞が死ぬことで、がん治療後の再発を防止することによって癌を治療する新たな治療戦略を抑制します。
アナスタシスはの過程で、我々 は、アポトーシス18,20,21 の中に DNA 損傷原因の可能性が発生したこと、いくつかの回復された細胞恒久的な遺伝子変異を取得し、発癌を受けたを発見しました。.DNA ダメージを受けた細胞の死のプロセスを逆転させることができる腫瘍形成のメカニズム、食道の慢性的な熱損傷が誘発されるよう組織の様にがんのリスクを増加可能性のある組織の損傷を繰り返し観察の基礎となります。非常に熱い飲料33,34,35、アルコール中毒36,37による肝臓の損傷、腫瘍の進化の遺伝毒性癌療法38,後の消費によって39,40, および抗癌性療法41,42,43,44のサイクルの間隔中に発生した正常組織から新しい癌の開発.True の場合、アナスタシスはターゲットを防ぐ可能性があります。 または癌の発生と進行を逮捕します。我々 は、飢餓による死生殖細胞を再供給のショウジョウバエ19でアナスタシスは受けることを発見しました。 アナスタシスは DNA 損傷と生殖細胞の発生、環境ストレスを長期観察のためのアカウントは、遺伝病の開発を促進するかもしれない。たとえば、飢饉は継代継承可能な糖尿病と冠動脈心疾患45疾患の発展に貢献します。したがって、この潜在的なメカニズムに起因する継承可能な疾患の発症予防のための戦略理解アナスタシスは可能性があります。
アナスタシスはの発見を活用し、革新的な治療法の開発にそれを直接、原因とアナスタシスは生きている動物での結果を研究に不可欠です。ただし、それは技術的に識別し、細胞死のプロセスから回収した細胞は通常の健康な細胞と形態学的区別がつかない表示され、アナスタシスはマーカーがないため anastatic 細胞は生体内で、追跡に挑戦します。特定まだ17,18,21。これらの問題に対処するため、我々 は最近新しい生体内でカスパーゼ バイオ センサーを識別およびカスパーゼ活性化19,46, 後アポトーシスを生き残る細胞を追跡する"CaspaseTracker"19日を指定を開発、アポトーシス10,14の特徴。スキャット12,47、Apoliner48, CA GFP49、ApoAlert18,50, C3AIs51 iCasper52 など「リアルタイム」カスパーゼ バイオ センサーとそれを区別します。にカスパーゼ活性を検出する、CaspaseTracker バイオ センサーはまた永久にも一過性細胞その特急のカスパーゼ活性にラベルを付ける機能します。したがって、CaspaseTracker バイオ センサーは、カスパーゼを介した崩細胞死のプロセスで vivo後アナスタシスはの長期追跡を可能。 にします。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;CONSUMABLES AND REAGENTS&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mounting medium</td><td>Vector Products</td><td>H-1000</td><td>Antifade mounting medium</td></tr><tr><td>Vectashield mounting medium (with DAPI)</td><td>Vector Products</td><td>H-1200</td><td>Antifade mounting medium with DAPI</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Ted Pella</td><td>#505 (110mm, #5)</td><td>Dumont tweezer biology grade, stainless steel</td></tr><tr><td>Hanging Drop Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565B</td><td>Glass slides</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Molecular Probes</td><td>H1399</td><td>DNA stain</td></tr><tr><td>Mitotracker Red CMXRos&amp;nbsp;</td><td>Molecular Probes</td><td>M-7512</td><td>Mitochondria stain</td></tr><tr><td>Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#9661</td><td>Stain for active fragment of caspase-3</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BAS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806</td><td>Blocking agent for immunostaining</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>114-056-101</td><td>Medium for washing and immunostaining</td></tr><tr><td>Triton&amp;trade; X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Detergent for cell permeabilization</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM780 confocal microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Drosophila dissection</td></tr><tr><td>AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W</td><td>AmScope</td><td>WBM99316&amp;nbsp;</td><td>Light source</td></tr></tbody></table>

detecting anastasis in vivo by caspasetracker biosensor

アナスタシスは (ギリシャ語の生活に""ライジング) という本質的に取り返しのつかないことに一般に見なされる後期細胞死のプロセスを逆転できる死ぬセルが最近発見された細胞回復現象であります。アナスタシスを促進が保持または原則レスキューけが細胞心筋細胞や神経細胞、これにより組織の回復を促進するなど交換しにくい。逆に、抗癌治療後アポトーシスを受けるアナスタシスは癌細胞を抑制することで、癌細胞の死をことを確認可能性があり、再発の可能性を減らします。ただし、これらの研究は、生きている動物のアナスタシスを受ける細胞の運命を追跡するためのツールの欠如によって妨げられています。課題は、回復後の形態学的正常な外観にもかかわらず細胞死のプロセスを逆転させた細胞を識別することです。この困難を克服するため、ショウジョウバエおよび哺乳類の CaspaseTracker バイオ センサー システムを識別および anastatic 細胞体外か体内を永久に追跡することができますを開発しました。生成と検出および細胞死の刺激に対する一時的な暴露後アナスタシスはキイロショウジョウバエを追跡する CaspaseTracker デュアル センサー システムの使用のため生体内でプロトコルを紹介します。一方、従来のバイオ センサー、プロトコル積極的に受けてアポトーシス細胞死細胞をラベルすることができます、CaspaseTracker バイオ センサー完全にカスパーゼ活性化 - 後期アポトーシスの特徴後回復した細胞にラベルをでき、同時にアクティブなアポトーシス プロセスを識別します。このバイオ センサーは、直接または間接的に関与カスパーゼ活性細胞死の他の形態をした細胞の回復も追跡できます。したがって、このプロトコルにより、私たちは継続的にこれらの細胞との生物学的機能、分子機構、生理学的および病理学的結果との治療上の含意将来の研究を促進する彼らの子孫の運命を追跡するにはアナスタシスは。また、非アポトーシス カスパーゼ活性のin vivoを表示するからアナスタシスを受けるセルを区別するために適切なコントロールを議論しました。

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Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

アナスタシスは、細胞死のプロセスを逆転させた細胞は通常の健康な細胞と形態学的区別することができますので、生体内で検出する技術的に困難です。ここでの検出と追跡システムを使用して、新たに開発した生体内でCaspaseTracker バイオ センサー アナスタシスは生きている動物を受ける細胞のプロトコルについて述べる。

アナスタシスはIn Vivo CaspaseTracker バイオ センサーによる検出

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

detecting-anastasis-in-vivo-by-caspasetracker-biosensor

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

9.2K ビュー.  Johns Hopkins University School of Medicine. アナスタシスは、細胞死のプロセスを逆転させた細胞は通常の健康な細胞と形態学的区別することができますので、生体内で検出する技術的に困難です。ここでの検出と追跡システムを使用して、新たに開発した生体内でCaspaseTracker バイオ センサー アナスタシスは生きている動物を受ける細胞のプロトコルについて述べる。

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Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first to be activated in these pathways. This group includes caspase-2, -8, and -9, as well as the inflammatory caspases, caspase-1, -4, and -5. The initiator caspases are all activated by dimerization following recruitment to specific multiprotein complexes called activation platforms. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is an imaging-based approach where split fluorescent proteins fused to initiator caspases are used to visualize the recruitment of initiator caspases to their activation platforms and the resulting induced proximity. This fluorescence provides a readout of one of the earliest steps required for initiator caspase activation. Using a number of different microscopy-based approaches, this technique can provide quantitative data on the efficiency of caspase activation on a population level as well as the kinetics of caspase activation and the size and number of caspase activating complexes on a per cell basis.

This protocol describes caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC); an imaging-based method that can be used to visualize induced proximity of initiator caspases, which is the first step in their activation.

カスパーゼ活性化分子蛍光補完への道をライトアップ

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

生化学

cADDisによるcAMP解析:シングルセルからハイスループットまでのスクリーニング

Real-Time cAMP Dynamics in Live Cells Using the Fluorescent cAMP Difference Detector In Situ

cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) is a novel biosensor that allows for the continuous measurement of cAMP levels in living cells. The biosensor is created from a circularly permuted fluorescent protein linked to the hinge region of Epac2. This creates a single fluorophore biosensor that displays either increased or decreased fluorescence upon binding of cAMP. The biosensor exists in red and green upward versions, as well as green downward versions, and several red and green versions targeted to subcellular locations. To illustrate the effectiveness of the biosensor, the green downward version, which decreases in fluorescence upon cAMP binding, was used. Two protocols using this sensor are demonstrated: one utilizing a 96-well plate reading spectrophotometer&#160;compatible with high-throughput screening and another utilizing single-cell imaging on a fluorescent microscope. On the plate reader, HEK-293 cells cultured in 96-well plates were stimulated with 10 &#181;M forskolin or 10 nM isoproterenol, which induced rapid and large decreases in fluorescence in the green downward version. The biosensor was used to measure cAMP levels in individual human airway smooth muscle (HASM) cells monitored under a fluorescent microscope. The green downward biosensor displayed similar responses to populations of cells when stimulated with forskolin or isoproterenol. This single-cell assay allows visualization of the biosensor location at 20x and 40x magnification. Thus, this cAMP biosensor is sensitive and flexible, allowing real-time measurement of cAMP in both immortalized and primary cells, and with single cells or populations of cells. These attributes make cADDis a valuable tool for studying cAMP signaling dynamics in living cells.

著者スポットライト:cADDis Biosensorを使用した細胞内のリアルタイムcAMP検出の進歩

The protocol presented in this study illustrates the effectiveness of the cAMP Difference Detector In Situ in measuring cAMP through two methods. One method utilizes a 96-well plate reading spectrophotometer with HEK-293 cells. The other method demonstrates individual HASM cells under a fluorescent microscope.

蛍光cAMP差検出器In Situを用いた生細胞のリアルタイムcAMPダイナミクス

cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) is a novel biosensor that allows for the continuous measurement of cAMP levels in living cells. The biosensor is ...

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and allostasis. Moreover, dysregulated protease activity drives pathogenesis and is a functional biomarker of diseases such as cancer; therefore, the ability to detect protease activity in vivo may provide clinically relevant information for biomedical diagnostics. The goal of this protocol is to create nanosensors that probe for protease activity in vivo by producing a quantifiable signal in urine. These protease nanosensors consist of two components: a nanoparticle and substrate. The nanoparticle functions to increase circulation half-life and substrate delivery to target disease sites. The substrate is a short peptide sequence (6-8 AA), which is designed to be specific to a target protease or group of proteases. The substrate is conjugated to the surface of the nanoparticle and is terminated by a reporter, such as a fluorescent marker, for detection. As dysregulated proteases cleave the peptide substrate, the reporter is filtered into urine for quantification as a biomarker of protease activity. Herein we describe construction of a nanosensor for matrix metalloproteinase 9 (MMP9), which is associated with tumor progression and metastasis, for detection of colorectal cancer in a mouse model.

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are tightly regulated enzymes involved in fundamental biological processes, and dysregulated protease activity drives progression of complex diseases such as cancer. This method&#39;s goal is to create nanosensors that measure protease activity in vivo by producing a cleavage signal that is detectable from host urine and discriminates disease.

非侵襲的診断のプロテアーゼ活動In Vivo検出するナノセンサー

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...

生物工学

がん診断のためのCRISPR-Cas合成尿バイオマーカー検査

CRISPR-Cas-mediated Multianalyte Synthetic Urine Biomarker Test for Portable Diagnostics

Creating synthetic biomarkers for the development of precision diagnostics has enabled detection of disease through pathways beyond those used for traditional biofluid measurements. Synthetic biomarkers generally make use of reporters that provide readable signals in the biofluid to reflect the biochemical alterations in the local disease microenvironment during disease incidence and progression. The pharmacokinetic concentration of the reporters and biochemical amplification of the disease signal are paramount to achieving high sensitivity and specificity in a diagnostic test. Here, a cancer diagnostic platform is built using one format of synthetic biomarkers: activity-based nanosensors carrying chemically stabilized DNA reporters that can be liberated by aberrant proteolytic signatures in the tumor microenvironment. Synthetic DNA as a disease reporter affords multiplexing capability through its use as a barcode, allowing for the readout of multiple proteolytic signatures at once. DNA reporters released into the urine are detected using CRISPR nucleases via hybridization with CRISPR RNAs, which in turn produce a fluorescent or colorimetric signal upon enzyme activation. In this protocol, DNA-barcoded, activity-based nanosensors are constructed and their application is exemplified in a preclinical mouse model of metastatic colorectal cancer. This system is highly modifiable according to disease biology and generates multiple disease signals simultaneously, affording a comprehensive understanding of the disease characteristics through a minimally invasive process requiring only nanosensor administration, urine collection, and a paper test which enables point-of-care diagnostics.

著者スポットライト:疾患検出およびイメージングのための分子ツールのエンジニアリング

This protocol describes a CRISPR-Cas-mediated, multianalyte synthetic urine biomarker test that enables point-of-care cancer diagnostics through the ex vivo analysis of tumor-associated protease activities.

携帯型診断のためのCRISPR-Cas媒介多検体合成尿バイオマーカー検査

Creating synthetic biomarkers for the development of precision diagnostics has enabled detection of disease through pathways beyond those used for ...

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct regulation of inflammatory signaling and is activated by proximity-induced dimerization following recruitment to inflammasomes. Caspase-1 is abundant in the monocytic cell lineage and induces maturation of the pro-inflammatory cytokines interleukin (IL)-1&#946; and IL-18 to active secreted molecules. The other inflammatory caspases, caspase-4 and -5 (and their murine homolog caspase-11) promote IL-1&#946; release by inducing pyroptosis. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is a tool used to measure inflammatory caspase induced proximity as a readout of caspase activation. The caspase-1, -4, or -5 prodomain, which contains the region that binds to the inflammasome, is fused to non-fluorescent fragments of the yellow fluorescent protein Venus (Venus-N [VN] or Venus-C [VC]) that associate to reform the fluorescent Venus complex when the caspases undergo induced proximity. This protocol describes how to introduce these reporters into primary human monocyte-derived macrophages (MDM) using nucleofection, treat the cells to induce inflammatory caspase activation, and measure caspase activation using fluorescence and confocal microscopy. The advantage of this approach is that it can be used to identify the components, requirements, and localization of the inflammatory caspase activation complex in living cells. However, careful controls need to be considered to avoid compromising cell viability and behavior. This technique is a powerful tool for the analysis of dynamic caspase interactions at the inflammasome level as well as for the interrogation of the inflammatory signaling cascades in living MDM and monocytes derived from human blood samples.

This protocol describes the workflow to obtain monocytes-derived macrophages (MDM) from human blood samples, a simple method to efficiently introduce inflammatory caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) reporters into human MDM without compromising cell viability and behavior, and an imaging-based approach to measure inflammatory caspase activation in living cells.

ヒト単球由来マクロファージにおける炎症性カスパーゼ誘導近接の可視化

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

免疫・感染学

Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is the initiation of innate immune programmed cell death (PCD) to eliminate infected or damaged cells and propagate immune responses. However, excess PCD is associated with inflammation and pathology. Therefore, understanding the activation and regulation of PCD is a central aspect of characterizing innate immune responses and identifying new therapeutic targets across the disease spectrum.
This protocol provides methods for characterizing innate immune PCD activation by monitoring caspases, a family of cysteine-dependent proteases that are often associated with diverse PCD pathways, including&#160;apoptosis,&#160;pyroptosis, necroptosis, and PANoptosis. Initial reports characterized caspase-2, caspase-8, caspase-9, and caspase-10 as initiator caspases and caspase-3, caspase-6, and caspase-7 as effector caspases in apoptosis, while later studies found the inflammatory caspases, caspase-1, caspase-4, caspase-5, and caspase-11, drive pyroptosis. It is now known that there is extensive crosstalk between the caspases and other innate immune and&#160;cell death molecules across the previously defined PCD pathways, identifying a key knowledge gap in the mechanistic understanding of innate immunity and PCD and&#160;leading to the characterization of PANoptosis. PANoptosis is a unique innate immune inflammatory PCD pathway regulated by PANoptosome complexes, which integrate components, including caspases,&#160;from other cell death pathways.
Here, methods for assessing the activation of caspases in response to various stimuli are provided. These methods allow for the characterization of PCD pathways both in vitro and in vivo, as activated caspases undergo proteolytic cleavage that can be visualized by western blotting using optimal antibodies and blotting conditions. A protocol and western blotting workflow have been established that allow for the assessment of the activation of multiple caspases from the same cellular population, providing a comprehensive characterization of the PCD processes. This method can be applied across research areas in development, homeostasis, infection, inflammation, and cancer to evaluate PCD pathways throughout cellular processes in health and disease.

This protocol describes a comprehensive method for assessing caspase activation (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9, and caspase-11) in response to both in vitro and in vivo (in mice) models of infection, sterile insults, and cancer to determine the initiation of cell death pathways, such as pyroptosis, apoptosis, necroptosis, and PANoptosis.

自然免疫細胞死を評価するためのカスパーゼ活性化の評価

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is ...

アナスタシスはIn Vivo CaspaseTracker バイオセンサーによる検出

要約

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カスパーゼ活性化分子蛍光補完への道をライトアップ

蛍光cAMP差検出器In Situを用いた生細胞のリアルタイムcAMPダイナミクス

蛍光cAMP差検出器In Situを用いた生細胞のリアルタイムcAMPダイナミクス

蛍光cAMP差検出器In Situを用いた生細胞のリアルタイムcAMPダイナミクス

非侵襲的診断のプロテアーゼ活動In Vivo検出するナノセンサー

携帯型診断のためのCRISPR-Cas媒介多検体合成尿バイオマーカー検査

携帯型診断のためのCRISPR-Cas媒介多検体合成尿バイオマーカー検査

携帯型診断のためのCRISPR-Cas媒介多検体合成尿バイオマーカー検査

ヒト単球由来マクロファージにおける炎症性カスパーゼ誘導近接の可視化

自然免疫細胞死を評価するためのカスパーゼ活性化の評価

アナスタシスはIn Vivo CaspaseTracker バイオ センサーによる検出

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蛍光cAMP差検出器In Situを用いた生細胞のリアルタイムcAMPダイナミクス

蛍光cAMP差検出器In Situを用いた生細胞のリアルタイムcAMPダイナミクス

蛍光cAMP差検出器In Situを用いた生細胞のリアルタイムcAMPダイナミクス

非侵襲的診断のプロテアーゼ活動In Vivo検出するナノセンサー

携帯型診断のためのCRISPR-Cas媒介多検体合成尿バイオマーカー検査

携帯型診断のためのCRISPR-Cas媒介多検体合成尿バイオマーカー検査

携帯型診断のためのCRISPR-Cas媒介多検体合成尿バイオマーカー検査

ヒト単球由来マクロファージにおける炎症性カスパーゼ誘導近接の可視化

自然免疫細胞死を評価するためのカスパーゼ活性化の評価

アナスタシスはIn Vivo CaspaseTracker バイオセンサーによる検出