This research was supported by grants from the Intelligent Synthetic Biology Center of Global Frontier Project (2011-0031944), the Next-Generation Biogreen 21 Program (PJ009524), NRF-2015M3D3A1A01064875 and the KRIBB Research Initiative Program.

1. Preparação da biblioteca metagenômica com PNP-GESS <ol><li> Construir uma biblioteca metagenômica em E. coli com um vector fosmid usando um kit de produção fosmid biblioteca de acordo com o protocolo do fabricante 5. </li><li> Alíquota de 100 ul da biblioteca, para armazenamento a -70 ° C, que é uma fonte de células de biblioteca metagenomic. Nota: A densidade óptica de uma amostra medida a um comprimento de onda de 600 nm (OD 600) deste estoque biblioteca é de aproximadamente 100. </li><li> Descongelar 100 ul da biblioteca metagenômico estoque em gelo e em inocular um balão de 500 ml contendo 50 ml de meio Luria-Bertani (LB) e 12,5 ug / ml de cloranfenicol seguido de 37 ° C de incubação, durante 2 h. </li><li> Colher as células num tubo de 50 ml por centrifugação a 1000 xg durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Ressuspender o sedimento rapidamente em 50 ml de água destilada gelada (DW) e centrifugar a 1000 xg durante 20 min a 4 ° C novamente. </li><li> Resuspend o sedimento em 50 ul DW gelada com 10% (v / v) de glicerol. Utilizar 50 ul desta alíquota de células para electroporação. </li><li> Coloque a mistura de células electrocompetentes de 50 ul e pGESS (E135K) 5 de DNA (100 ng) numa cuvete de electroporação arrefecido em gelo e electroporar (1,8 kV / cm, 25 mF) a mistura. </li><li> adicionar rapidamente 1 ml de super caldo ideal com catabólica repressão médio (SOC) e voltar a suspender as células suavemente. </li><li> Transferir as células para um tubo de 14 ml de fundo redondo, usando uma pipeta e incubar a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Espalhe 500 ul das células recuperadas numa LB 20 x 20 cm placa quadrada contendo 12,5 ug / ml de cloranfenicol e 50 jig / ml de ampicilina. Incubar a placa a 30 ° C durante 12 h. </li><li> Raspe as colónias usando um raspador de células e recolher células em um tubo cônico de 50 ml utilizando meios de armazenamento de células gelada. </li><li> Centrifugar a 1.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Ressuspender o sedimento em 10 ml de mídia de armazenamento de células geladaspara chegar a um OD 600 de 100. </li><li> Aliquota de 20 uL de células para armazenamento a -70 ° C. </li></ol> 2. Remoção falsos positivos a partir da biblioteca metagenômica <ol><li> Descongelar as células ações metagenomic biblioteca (do passo 1.13) contendo fosmid DNA metagenômica e pGESS (E135K) em gelo. </li><li> Inocular 10 ml de células em 2 ml de LB contendo 50 ug / ml de ampicilina e 12,5 jig / ml de cloranfenicol em um tubo de fundo redondo de 14 ml. Incubar a 37 ° C com agitação a 200 rpm durante 4 h. </li><li> Enquanto isso, ligue a máquina de FACS e abra o software FACS padrão. Utilize as seguintes definições: diâmetro da ponta do bico, 70 mm; Adiante Área de Dispersão (-A FSC) sensibilidade, 300 amplificação V-logarítmica; Side Area Scatter (-A SSC) Sensibilidade, 350 amplificação V-logarítmica; Área fluoresceína isotiocianato (FITC-A) sensibilidade, a amplificação de 450 V-logarítmica; parâmetro de patamar, FSC-Um valor 5. Nota: As configurações mais comuns são fornecidaspara o dispositivo de FACS mencionado na tabela de materiais. Ajustar as configurações para outros dispositivos de FACS. </li><li> Dilui-se as células a partir de bibliotecas metagenomic Passo 2.2 pela adição de 5 ul da amostra para um tubo de fundo redondo de 5 ml contendo 1 ml de PBS. </li><li> Colocar a amostra biblioteca diluída para o porto de carga do instrumento FACS e clique no botão de carga no Aquisição Painel do software FACS. </li><li> Ajustar a taxa de evento para 1.000 - 1.500 eventos / seg clicando e controlar os botões Taxa de fluxo no painel. </li><li> Criar log escalado FSC-A vs. log escalado SSC-Um gráfico de dispersão em uma planilha global, clicando no botão gráfico de pontos na barra de ferramentas. Ajuste o portão de dispersão R1 para abranger os eventos singlet (população bacteriana) usando o botão Polígono Gate na barra de ferramentas. </li><li> Traçar um histograma com a contagem de células vs. log escalado FITC-A na planilha clicando no botão histograma. Em seguida, ajuste a tensão FITC do CytomeTer separador Definições na janela de Controlo Inspector de tal modo que o pico da distribuição em forma de sino é inferior a 10 2 de FITC-A. </li><li> Criar um log escalado FSC-A vs. o log FITC-A trama clicando no botão gráfico de pontos na planilha global. Definir um portão triagem R2 no terreno utilizando o botão de porta polígono na barra de ferramenta, de modo que a porta está localizada entre as células + 5% e -5% do centro da distribuição (10% total de células em torno do pico de a de sino curva em forma). </li><li> Colocar num tubo de recolha contendo 1,2 ml de LB contendo 50 ug / ml de ampicilina e 12,5 jig / ml de cloranfenicol na saída do instrumento FACS e classificar 10 6 células que satisfaçam ambos os R1 e R2 portas. </li><li> Retire o tubo de coleta, boné, e gentilmente vortex. </li></ol> 3. metagenômico Enzyme Screening <ol><li> Incubar as células escolhidas (do passo 2.11) a 37 ° C com agitação a 200 rpm até a DO600 atinge 0,5. </li><li> Adicionar 1 ml copiar solução de indução para amplificar o número de cópias fosmid intracelular. Incubam-se as células durante mais 3 horas adicionais a 37 ° C com agitação a 250 rpm. </li><li> Para preparar as células para seleccionar, adicionar 0,5 ml de células em cultura e de um substrato adequado (p-nitrofenil de etilo, p-nitrofenil-β-D-celobiósido, fosfato ou fenilo) para um tubo de 14 ml de fundo redondo numa concentração final de 100 uM. <ol><li> Para uma amostra de controlo, adicionar 0,5 ml de células cultivadas a partir do Passo 3.2 para um tubo de fundo redondo de 14 ml. Adicionar o mesmo volume de PBS como o volume do substrato no passo 3.3. </li></ol></li><li> Incubam-se as duas amostras, a 37 ° C com agitação a 200 rpm durante 3 h. </li><li> Ao mesmo tempo, preparar a máquina de FACS com as mesmas configurações que o passo 2.3. </li><li> Adicionar 5 uL de células (para selecção), e células de controlo para dois tubos de 5 ml de fundo redondo contendo 1 ml de PBS, respectivamente. </li><li> Colocar o tubo contendo células de controle para tele porto de carregamento dos FACS e clique no botão Carregar na Aquisição Painel do software FACS. Ajustar a taxa de eventos para 1.000 - 3.000 eventos / seg, controlando Taxa de Fluxo botões no painel. </li><li> Log criar escalado FSC-A vs. log escalado SSC-Um gráfico de dispersão, clicando no botão gráfico de pontos na planilha global do software e ajustar o portão de dispersão R1 para abranger os eventos singlet (população bacteriana) utilizando o botão Polígono Portão sobre o barra de ferramentas. </li><li> Log criar escalado FSC-A vs. log escalado FITC-Um gráfico de dispersão, clicando no botão gráfico de pontos na planilha e definir uma classificação portão R2 no terreno utilizando o botão Polígono Portão na barra de ferramentas para que menos de 0,1% de células negativas são detectados dentro do portão R2. </li><li> Substitua o tubo de amostra de controlo com o tubo de amostra de triagem, e ajustar a taxa de evento para 1.000 - 3.000 eventos / seg, controlando os botões Taxa de fluxo no painel. </li><li> Coloque um tubo de coleta contendo 0,5ml LB na saída do instrumento FACS e resolver 10 4 células que satisfaçam ambas as portas R1 e R2. Nota: O critério de ordenação pode variar de topo de 0,1% a 5% de FITC-A na porta R2. Neste protocolo, as células top 1% foram recolhidos como positivos. </li><li> Retire o tubo de coleta, boné, e gentilmente vortex. </li><li> Espalhe as amostras de 0,5 ml recolhidos em duas placas de ágar (90 mm de placas de Petri) contendo LB, 50 ug / ml de ampicilina, 12,5 ug / ml de cloranfenicol e Incubar a placa a 37 ° C durante a noite. </li><li> Se necessário, execute rodadas adicionais de triagem para FITC-A enriquecimento, repetindo as etapas 3.1-3.14. </li></ol> 4. Hit Confirmação Seleção e atividade enzimática <ol><li> Citometria de fluxo Análise <ol><li> A partir da placa incubada na Etapa 3.14, selecione uma colônia mostrando ausência de fluorescência usando um seletor de colônia sob a observação de 488 nm de comprimento de onda de um iluminador LED. </li><li> Inocular a colônia selecionado em um 14 ml ro-und fundo do tubo contendo 2 ml de LB contendo 50 ug / ml de ampicilina e 12,5 jig / ml de cloranfenicol a 37 ° C com agitação a 200 rpm até a DO600 atinge 0,5. </li><li> Adicione 2 mL copiar solução de indução para amplificar o número de cópias fosmid intracelular. Incubam-se as células durante mais 3 horas adicionais a 37 ° C com agitação a 250 rpm. </li><li> Preparar um tubo de 14 ml de fundo redondo e adicionar 1 ml de células em cultura (passo 4.1.3). Adicionar um substrato adequado (acetato de p-nitrofenilo, p -nitrophenyl- β -D-celobiósido, ou fosfato de fenilo) a uma concentração final de 100 uM. <ol><li> Para um controlo, adicionar 1 ml das células de cultura do passo 4.1.3 em um tubo de 14 ml de fundo redondo e adicionar o mesmo volume de PBS como o volume do substrato no passo 4.1.4. </li></ol></li><li> Incubam-se as duas amostras, a 37 ° C com agitação a 200 rpm durante 3 h. </li><li> Enquanto isso, prepare a máquina FACS com as mesmas configurações como Passo 2.3. </li><li> Adicionar 5 uL das células de controlo e substrato tratado para tubos de 5 ml de fundo redondo contendo 1 ml de PBS, respectivamente. </li><li> Coloque as células controle tubo contendo no porto de carregamento do dispositivo FACS e clique no botão Carregar na Aquisição Painel do software FACS. Ajustar a taxa de evento para 1.000 - 3.000 eventos / seg usando Vazão botões no painel. </li><li> Clique no botão Aquisição para medir FITC-A. </li><li> Substituir o tubo de amostra de controlo com o tubo de amostra substrato tratado. Ajustar a taxa de evento para 1.000 - 3.000 eventos / seg usando Vazão botões no painel. </li><li> Clique no botão Aquisição para medir FITC-A. </li><li> Comparar a fluorescência dos dois grupos de células através da representação gráfica de um histograma de contagem de células vs o log dimensionado FITC-A. </li></ol></li><li> Outros ensaios para confirmar a actividade da enzima <ol><li> Para posterior identificação dos candidatos de enzimas selecionadas, extrair DNA fosmid usando pro extração padrãoprocedimentos dos kits de extração comerciais e analisar a sequência de nucleotídeos, ou testar a atividade enzimática in vitro 6,7. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Aumentar a eficiência da produção de biocatalisadores é uma chave para o sucesso de bio-química indústria baseada 9 e metagenome é considerado um dos melhores fonte de enzima natural. Neste sentido, é essencial para o rastreio de novas enzimas a partir da metagenome onde a maioria dos recursos genéticos não têm sido explorados 10. Vários métodos de rastreio foram desenvolvidos que detectam directamente produtos enzimáticos utilizando activadores de transcrição 11, 12, mas estas técnicas exigem sistema específico de transcrição metabólito-responsivo. Por outro lado, GESS é amplamente aplicável dependendo do uso de fenol ou com etiquetas pNP substratos. Embora a maioria das enzimas relatados produzindo compostos fenólicos ou PNP na base de dados BRENDA (Tabela 1), (incluindo os três exemplos deste trabalho) pertencem à hidrolase (número 3 CE) enzimas de classe, explorando mais diversos substratos fenólicos e até mesmo a concepção de um artificial substrato submetendo aactividade da enzima alvo, como alternativas de substratos naturais, poderia estender significativamente a aplicabilidade do sistema de rastreio. Note-se que a escolha de um fenol apropriado ou com etiquetas pNP substrato é um dos passos importantes de aplicação PNP-GESS desde a permeabilidade da membrana celular e o efeito do substrato de influenciar consideravelmente o protocolo de rastreio. Aqui, mostramos que industrialmente importantes três tipos diferentes de enzimas pode ser identificada de um modo de elevado rendimento utilizando o sistema de triagem único. A abordagem de utilizar FACS, para além da pesquisa de alto rendimento de enzimas metagenomic, pode ser também aplicado a engenharia reguladores transcricionais (TRs) para TR especificidade alterada. Um exemplo é um estudo em que uma variante de AraC que detectado mevalonato em vez de arabinose foi isolado usando FACS, e, em seguida, empregado para as células produtoras de tela 13 mevalonato. Além disso, a alteração da especificidade de ATR permitiu Further engenharia da actividade da enzima. TR auto-regulado, PCAU, foi concebida para detectar 3,4-di-hidroxibenzoato (34DHB) e, em seguida aplicado para o rastreio de enzimas desidratase desidroshikimato (AsbF) a sua actividade máxima de conversão desidroshikimato endógena para 34DHB 14. O conceito básico destes estudos é semelhante ao de PNP-GESS, desde PNP-GESS utiliza uma variante DMPR para detectar pNP e mostra o desempenho de alto rendimento no rastreio de uma biblioteca genética em larga escala. No entanto, a especificidade de engenharia pode provocar não intencionais falsos positivos entre as visitas, uma vez que é possível desencadear a expressão repórter por outros indutores, como resultado da especificidade alargada. Por conseguinte, seria desejável investigar a ortogonalidade de resposta TR antes de o TR é aplicado. Por outro lado, aumentando a sensibilidade e a gama dinâmica da TR poderia compensar geração falso positivo. Por exemplo, a sensibilidade de GESS foi melhorada através da inserção de RBS e optimizadas sequ terminadorcias no sistema. Os falsos positivos do sistema de triagem, possivelmente vêm de mau funcionamento do circuito genético, produtos químicos fenólicos não intencionais ativando o TR, o crescimento celular heterogênea, e difusão livre de fenol ou pNP. eram esperados 2,9 para remover as células falsos positivos liberação de fluorescência sem tratamento substrato - Os processos de seleção negativos de Passos 2.1. Estas células positivas falsas pode também ser reduzida através da maximização da relação sinal-ruído do circuito genético. Juntamente com o RBS e o terminador de engenharia, o uso de meios de M9-glicose melhorou significativamente o sinal (7 vezes mais elevada do que o meio LB) no desempenho PNP-GESS 5. Mas, neste protocolo, LB foi usado como um compromisso entre a expressão do gene metagenomic desconhecido e intensidade do sinal GESS. Investigar condições mais delicadas do crescimento celular e PNP-GESS efeito substrato em M9-glicose permite melhorar a intensidade do sinal. regulação apertada do tempo de reacção dos substratos, na Etapa 3.5, étambém importante para evitar falsos positivos desencadeadas por fenol ou difusão pNP. GESS permite a conversão da função da enzima para a expressão da proteína repórter mediada por transcrição a um nível de uma única célula, mas a identificação indirecta através das proteínas repórter pode ser uma das limitações inatas. Então, ensaio in vitro enzima e LC / análise de GC-MS de um produto devem ser seguidos para a identificação definitiva de um candidato enzima putativa 6,7. Também é possível utilizar GESS sem a necessidade de uma análise FACS caros, anexando repórteres alternativos, tais como genes de resistência a antibióticos ou enzimas cromogénicos com repórteres fluorescentes. Para melhorar ainda mais as aplicações gess, é necessário estabelecer um método para caracterizar a actividade da enzima e identificar as enzimas de um modo de alto rendimento. Junto com outras tecnologias de alta capacidade, tais como sequenciamento de última geração, GESS será uma estratégia amplamente utilizada para a proteína e Enzyme engenharia catalisador na indústria baseada na biologia.

Uma técnica de ensaio de uma única célula de alto rendimento recentemente desenvolvido permite novas enzimas a ser rastreada a partir de uma biblioteca genética em larga escala com base nas suas actividades funcionais 1. No nível de célula única, as proteínas que regulam a transcrição são empregues para provocar a expressão do gene repórter por detecção pequenas moléculas que são produzidos como um resultado de uma actividade da enzima alvo. Uma abordagem precoce envolvido o isolamento de um operão de fenol-degradantes de Ralstonia eutropha E2 utilizando a expressão genética induzida por substrato rastreio método (SIGEX), em que o substrato induz a expressão de uma proteína repórter 2. NHAr de Pseudomonas putida foi usado para seleccionar benzaldeído desidrogenase 3, e de Corynebacterium glutamicum LysG foi utilizado para o rastreio de alto rendimento de uma nova estirpe de L-lisina-produzir diversas bibliotecas de mutantes 4. Anteriormente, uma enzima screeni genéticasistema ng (GESS) foi proposta como uma plataforma de triagem geralmente aplicável 5. Este sistema utiliza o regulador dimetilfenol-reconhecendo fenol, DMPR, de P. putida. DMPR (E135K), e um mutante de DMPR, também pode ser empregue em GESS (PNP-GESS) para a detecção de p-nitrofenol (PNP). Na presença de enzimas alvo a produção de compostos fenólicos, GESS em E. células de E. coli emite um sinal de fluorescência, permitindo o isolamento rápido de células isoladas usando um classificador de células activadas por fluorescência (FACS). Mas a expressão da enzima metagenômico parece ser mais fraca do que a de enzimas recombinantes convencionais; portanto, GESS foi desenhado para detectar compostos fenólicos com o máximo de sensibilidade ao investigar a combinação de local de ligação ribossómica (RBS) e sequências de terminação junto com ótima condição operacional 5. Uma das vantagens fundamentais do GESS é que este método único permite teoricamente o rastreio de OVer de 200 tipos diferentes de enzimas na base de dados BRENDA (Tabela 1, http: // www.brenda-enzymes.info, 2013.7) simplesmente empregar substratos diferentes. Foi mostrado que a celulase, lipase e hidrolase metil paration (MPH) pode ser detectada utilizando PNP-GESS com substratos apropriados de p-nitrofenilo butirato, p-nitrofenil-cellotrioside, e metil paration, respectivamente 5. Recentemente, provou-se que uma fosfatase alcalina (AP), que é uma das novas enzimas identificadas utilizando PNP-GESS, é o primeiro AP termolábil encontrados em metagenomes marinhos adaptados ao frio 6. Aqui, os detalhes do processo de triagem é apresentado com PNP-GESS detectar as actividades de três tipos diferentes de lipase enzymes-, celulase, e fosfatase alcalina -e rapidamente identificar novas enzimas candidatas a partir de uma biblioteca metagenômico 5,6. Os processos incluem metagenome pré-processamento com PNP-GESS e operação de uma flow citometria classificador. Enquanto os acertos obtidos terão de ser sequenciado para posterior identificação, este protocolo abrange o procedimento acima para os passos de confirmação de actividade enzimática utilizando citometria de fluxo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1251">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">CopyControl</td>
			<td style="width:109px;">Epicentre</td>
			<td style="width:88px;">CCFOS110</td>
			<td style="width:736px;">Fosmid library production kit&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">CopyControl Induction Solution</td>
			<td style="width:109px;">Epicentre</td>
			<td style="width:88px;">CCIS125</td>
			<td>Fosmid copy induction solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">EPI300</td>
			<td style="width:109px;">Epicentre</td>
			<td style="width:88px;">EC300110</td>
			<td>Electrocompetent cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">pCC1FOS</td>
			<td style="width:109px;">Epicentre</td>
			<td style="width:88px;">CCFOS110</td>
			<td>Fosmid vector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Gene Pulser Mxcell</td>
			<td style="width:109px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td>Electroporation cuvette and electroporate system</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">FACSAria III</td>
			<td style="width:109px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td>Flow Cytometry (FACS machine)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">AZ100M</td>
			<td style="width:109px;">Nikon</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td>Microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">UltraSlim&#160;</td>
			<td style="width:109px;">Maestrogen</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td>LED illuminator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">50-mL conical tube</td>
			<td style="width:109px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">14-mL round-bottom tube&#160;</td>
			<td style="width:109px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">5-mL round-bottom tube</td>
			<td style="width:109px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">p-nitrophenyl phosphate</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">N7653</td>
			<td>Substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">p-nitrophenyl &#946;-D-cellobioside</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">N5759</td>
			<td>Substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">p-nitrophenyl butylate</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">N9876&#160;</td>
			<td>Substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Luria- Bertani (LB)</td>
			<td style="width:109px;">BD Difco</td>
			<td style="width:88px;">244620</td>
			<td>Tryptone 10g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 10g/L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Super Optimal broth (SOB)</td>
			<td style="width:109px;">BD Difco</td>
			<td style="width:88px;">244310</td>
			<td>Tryptone 20g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 0.5g/L, Magnesium Sulfate 2.4g/L, Potassium Chloride 186mg/L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC)</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td>SOB, 0.4 % glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2x Yeast Extract Tryptone (2xYT)</td>
			<td style="width:109px;">BD Difco</td>
			<td style="width:88px;">244020</td>
			<td>Pancreatic digest of Casein 16g/L, Yeast extract 10g/L, Yeast extract 5g/L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Cell storage media</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td>2xYT broth, 15 % Glycerol, 2 % Glucose</td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:319px;">pGESS(E135K)</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:736px;">A DNA vector containing dmpR, egfp genes with their appropriate promoters, RBS, and terminator. 
			See the reference 5 in the manuscript for more details.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:109px;">Sigma</td>
			<td style="width:88px;">C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:109px;">Sigma</td>
			<td style="width:88px;">A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">BD FACSDiva</td>
			<td style="width:109px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td>Flow Cytometry Software Version 7.0</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:319px;">PBS</td>
			<td style="width:109px;">Gibco</td>
			<td style="width:88px;">70011-044</td>
			<td>0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-enzyme screening using a high-throughput genetic enzyme screening system

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

Os três substratos fenólicos foram examinados para identificar novas enzimas metagenomic de uma biblioteca metagenome de sedimentos planas oceano-corrente em Taean, Coreia do Sul, seguindo o protocolo proposto. Para a construção da biblioteca, média 30 - sequências metagenome 40 kb foram inseridos no fosmids, que são baseados na E. coli F fator de replicão e apresentados como uma única cópia de uma célula. Note-se que fosmids têm sido amplamente utilizados para a construção de bibliotecas genómicas complexos, devido à sua propagação estável 8. A Figura 1 mostra um fluxograma de breve o protocolo de rastreio incluindo a remoção de falsos positivos com a classificação negativa (Figura 1 A), seguida por selecção positiva com sucesso R1 e R2 triagem portões (Figura 1 B). Os acertos foram avaliados por comparação da fluorescência das amostras com e sem substratos(Figura 1 C). No caso de acetato de p-nitrofenilo rastreio mediada, cinco candidatos de lipase foram confirmadas em que a fluorescência de células substrato tratado foram superiores aos das células de controlo (Figura 2 A). Apesar das amplas distribuições dos três candidatos de celulase na Figura 2 B, que também mostraram diferenças claras de intensidade média com FITC das populações. Quatro candidatos fosfatase também mostraram elevado nível de fluorescência em comparação com as células de controle (Figura 2 C). Quanto mais diferença de fluorescência entre as células negativas eo candidato a atividade da enzima mais forte podem ser deduzidas desde o repórter fluorescência do PNP-GESS mostra as respostas quantitativas para as concentrações de fenol 5. Neste protocolo, apenas as diferenças de fluorescência foram confirmados utilizando uma citometria de fluxo, mas vários ensaios de identificação pode ser aplicado um4.2. s mencionados no Passo A Figura 3 demonstra o exemplo de identificação PA 6. Um clone seleccionado entre quarenta e sete colónias altamente fluorescente do rastreio foi sequenciado e uma ORF do candidato AP foi identificado. A ORF inserida num vector plasmídeo foi confirmada ter actividade de AP com citometria de fluxo. Na Figura 3, mostra o hit sinal de fluorescência mais forte do que as células portadoras do plasmídeo vazio (negativo). Outras análises de sequência e de actividade enzimática in vitro descobriu que este AP era altamente semelhante aos outros PAs conhecidos nas suas características enzimáticas, excepto elevada actividade catalítica a temperaturas mais baixas (35 ° C) e uma instabilidade térmica notável (65 ° C) dentro de 15 min 6 . Além disso, o AP protegida foi comparável ao disponível comercialmente APs na remoção de fosfatos terminais de extremidades coesivas e sem corte de ADN de plasmídeo linearizado 6. Figura 1:. Multi Enzyme processo de seleção (A) Remoção de células falso-positivos que mostram fluorescência sem substrato. O portão de apartação estar localizado no meio da densidade de população de células de forma que a porta inclui 10% das células totais. (B) Triagem alta fluorescente (FITC-A), células positivas () satisfazendo portões R1 e R2, na presença de um substrato apropriado. (C) após a selecção e o isolamento de célula única, a actividade das enzimas candidatas foi analisada com e sem o substrato (denotado como W / W e substratos de E / S, respectivamente). A diferença sinal claro entre as duas amostras implica o vetor fosmid das células contém informação genética alvo de interesse. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54059/54059fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> </p&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54059/54059fig2.jpg" /> Figura 2: Actividade Enzima Avaliação utilizando citometria de fluxo de enzimas candidatos metagenômico rastreados por pNP-GESS com três substratos diferentes (A) acetato de p-nitrofenilo (PNPA), (B) p-nitrofenil-β-D-celobiósido (pNPG2), e. (C) fosfato de fenilo. Todos os candidatos apresentaram diferença sinal claro entre as células com e sem substrato. Os controles são as células sem o seu tratamento substrato correspondente. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54059/54059fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54059/54059fig3.jpg" /> Figura 3: Fosfatase Alcalina IDENTIFICAÇÃO. painel da esquerda mostra a fluorescência diferença clara entre as células que contêm o enzima e atingiu um vector de plasmídeo vazio (negativo). À direita, o ensaio de fosfatase de células contendo o gene da fosfatase candidato num vector plasmídeo em LB agar contendo fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo como substracto colorimétrico é mostrado. colónias azuis indicam que as células seleccionadas contêm o gene que codifica uma fosfatase metagenômico. Veja 6 para mais detalhes. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54059/54059fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"> Número da CE </td><td> Descrição </td><td> Número de enzimas produzindo p-nitrofenol </td><td> Número de enzimas do fenol produzindo </td></tr><tr><td> CE 1 &lt;/ Td&gt; <td> 1.3 </td><td> Agindo sobre o grupo CH-CH de doadores </td><td> - </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Oxirredutases </td><td> 1.11 </td><td> Peroxygenase </td><td> 2 </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td rowspan="2"> 1.14 </td><td> Agindo sobre os doadores emparelhados, com a incorporação ou </td><td rowspan="2"> - </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td></td><td> redução do oxigênio molecular </td></tr><tr><td> CE 2 </td><td> 2.3 </td><td> aciltransferases </td><td> 1 </td><td> - </td></tr><tr><td> transferases </td><td> 2.4 </td><td> glicosiltransferases </td><td> 8 </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td> 2.5 </td><td> grupos alquilo ou arilo de transferência, do que outros grupos metílicos </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td></td><td> 2.7 </td><td> A transferência de grupos contendo fósforo </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td></td><td> 2.8 </td><td> A transferência de grupos contendo enxofre </td><td> 3 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> CE 3 </td><td> 3.1 </td><td> Lei sobre ligações éster </td><td> 67 </td><td> 16 </td></tr><tr><td> hidrolases </td><td> 3.2 </td><td> glicosilase </td><td> 75 </td><td> 21 </td></tr><tr><td></td><td> 3.4 </td><td> Lei sobre ligações peptídicas - peptidase </td><td> 26 </td><td> 4 </td></tr><tr><td></td><td> 3,5 </td><td> Lei sobre ligações carbono-azoto, excepto ligações peptídicas </td><td> 5 </td><td> 3 </td></tr><tr><td></td><td> 3.6 </td><td> Lei sobre anidridos de ácidos </td><td> 4 </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td> 3.7 </td><td> Lei sobre ligações carbono-carbono </td><td> 2 </td><td> - </td></tr><tr><td> CE 4 </td><td> 4.1 </td><td> liases carbono-carbono </td><td> - </td><td> 3 </td></tr><tr><td> liases </td><td> 4.2 </td><td> liases carbono-oxigênio </td><td> 1 </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td> 4.3 </td><td> liases carbono-azoto </td><td> 1 </td><td> - </td></tr><tr><td colspan="3"> número subtotal de enzimas </td><td> 197 </td><td> 53 </td></tr><tr><td colspan="3"> Número total de enzimas (excluindo enzimas sobrepostas) </td><td colspan="2"> 211 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: O número de enzimas que produzem p-nitrofenol ou fenol a partir da base de dados BRENDA.

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Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

Multi-enzima Triagem Usando um de alta capacidade Enzyme genética Sistema de Triagem

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

multi-enzyme-screening-using-high-throughput-genetic-enzyme-screening

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.7K visualizações.  Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology. This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate). 

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High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

Alto rendimento Triagem e Biossensoriais com Fluorescente C. elegans Cepas

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Biologia

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

High Throughput Screening da atividade endoglucanase de fungos em Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi de triagem para identificar fenótipos pós-embrionário em C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

High-throughput screening para pequenas moléculas Moduladores de canais de potássio Interiores retificador

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

Bioquímica e Alto Rendimento Avaliação microscópica de massa gorda em<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

De alta capacidade de Triagem funcional usando um caseiro Dual-brilho ensaio de luciferase

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Rastreio de alto rendimento para moduladores químicos de Genes Post-transcriptionally Regulamentados

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identificação de pares Kinase-substrato utilizando High Throughput Screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food applications or in the replacement of petro-based chemicals. We describe an analytical platform to be automated on a liquid handling system that allows the fast and reliable analysis of the type and the amount of EPS produced by microorganisms. It enables the user to identify novel natural microbial exopolysaccharide producers and to analyze the carbohydrate fingerprint of the corresponding polymers within one day in high-throughput (HT). Using this platform, strain collections as well as libraries of strain variants that might be obtained in engineering approaches can be screened. The platform has a modular setup, which allows a separation of the protocol into two major parts. First, there is an automated screening system, which combines different polysaccharide detection modules: a semi-quantitative analysis of viscosity formation via a centrifugation step, an analysis of polymer formation via alcohol precipitation and the determination of the total carbohydrate content via a phenol-sulfuric-acid transformation. Here, it is possible to screen up to 384 strains per run. The second part provides a detailed monosaccharide analysis for all the selected EPS producers identified in the first part by combining two essential modules: the analysis of the complete monomer composition via ultra-high performance liquid chromatography coupled with ultra violet and electrospray ionization ion trap detection (UHPLC-UV-ESI-MS) and the determination of pyruvate as a polymer substituent (presence of pyruvate ketal) via enzymatic oxidation that is coupled to a color formation. All the analytical modules of this screening platform can be combined in different ways and adjusted to individual requirements. Additionally, they can all be handled manually or performed with a liquid handling system. Thereby, the screening platform enables a huge flexibility in order to identify various EPS.

We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.

Automated Modular High Throughput exopolissacï¿½ido Plataforma de Triagem Juntamente com Análise Carboidratos Fingerprint Highly Sensitive

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food ...

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived inheritance encoded in protein conformation (rather than sequence) has long been viewed as paradigm-shifting but rare. The best characterized examples of such epigenetic elements are prions, which possess a self-assembling behavior that can drive the heritable manifestation of new phenotypes. Many archetypal prions display a striking N/Q-rich sequence bias and assemble into an amyloid fold. These unusual features have informed most screening efforts to identify new prion proteins. However, at least three known prions (including the founding prion, PrPSc) do not harbor these biochemical characteristics. We therefore developed an alternative method to probe the scope of protein-based inheritance based on a property of mass action: the transient overexpression of prion proteins increases the frequency at which they acquire a self-templating conformation. This paper describes a method for analyzing the capacity of the yeast ORFeome to elicit protein-based inheritance. Using this strategy, we previously found that &gt;1% of yeast proteins could fuel the emergence of biological traits that were long-lived, stable, and arose more frequently than genetic mutation. This approach can be employed in high throughput across entire ORFeomes or as a targeted screening paradigm for specific genetic networks or environmental stimuli. Just as forward genetic screens define numerous developmental and signaling pathways, these techniques provide a methodology to investigate the influence of protein-based inheritance in biological processes.

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

This protocol describes a high-throughput methodology to functionally screen for protein-based inheritance in S. cerevisiae.