Agradecemos Yohei Yamauchi e Roberta Mancini por nos fornecer reagentes. O laboratório AH foi apoiada pelas redes de formação inicial Marie Curie (ITN), o Conselho Europeu de Investigação (ERC), e pela Swiss National Science Foundation (Sinergia).

1. Preparação de tampões e soluções de Stock <ol><li> Preparar tampão de MNT (MES 20 mM, Tris 30 mM e NaCl 100 mM) por dissolução de 470 mg de Tris, cloridrato de 390 mg de hidrato de MES e 580 mg de NaCl em 80 ml ​​de ddH 2 O. Ajustar o tampão a pH 7,4 e trazê-lo para um volume final de 100 ml com ddH 2 O. </li><li> Preparar três soluções idênticas de tampão 500 mM MES dissolvendo 9,76 g MES hidratado em 80 ml ​​de dH2O cada um. Ajustar as memórias intermédias para um pH de 5,8, 5,4, e 5,0, respectivamente, por titulação com NaOH concentrado. Traga cada tampão para um volume final de 100 mL com dH2O </li><li> Preparar duas soluções idênticas de tampão Tris 500 mM por dissolução de 7,88 g de Tris cloridrato em 80 ml ​​de dH2O cada e ajustar o pH para 7,4 e 6,4, respectivamente, por titulação com HCl concentrado. Traga o tampão para um volume final de 100 mL com dH2O </li><li> Preparar a solução de glicerol a 50% em dH 2 O e agita-se bem até a GlycErol é homogeneamente misturada. Filtrar a solução através de uma unidade de filtro Steritop (0,22 de tamanho de poro) para um frasco de vidro. </li><li> Preparar solução a 10% de NP-40 e NaCl 1 M em dH2O </li><li> Prepare 25x inibidor de protease concentrada por dissolução de dois comprimidos em 4 ml DDH 2 O. </li></ol> 2. Preparação de gradientes de glicerol <ol><li> Prepare 5 ml de tampão detergente de mistura principal solução para cada condição de pH (300 mM de NaCl, 2% de NP-40, inibidores da protease 2x concentrado) de teste (pH 7.4, 6.4, 5.8, 5.4, e 5.0). Para este efeito, mistura 9 ml de NaCl 1 M, 6 ml de 10% de NP-40, 2,4 ml de solução stock de inibidor de protease, 25x e 9 ml de ddH 2 0. </li><li> Para cada condição pipeta pH 4,4 ml da mistura principal em um tubo de 50 ml. </li><li> Para valores de pH acima de 5,8 adicionar 0,6 ml da respectiva solução de estoque de 500 mM de Tris com pH ajustado ao tubo. Para pH 5,8 e inferior adicionar 0,6 ml da respectiva solução de MES 500 mM com o pH ajustado. </li><li> Faça 5ml de solução tampão contendo NaCl 300 mM, inibidor de protease de 2x, Tris 60 mM ajustado para pH 7,4 e ddH 2 O. Isto irá servir como tampão de gradiente de controlo sem detergente. </li><li> Se necessário, ajustar com precisão o pH das soluções para pH 7,4, 6,4, 5,8, 5,4, e 5,0 por adição de soluções de HCI ou NaOH concentrado, respectivamente. </li><li> Adicionar 5 ml de solução stock de glicerol a 50% e 5 ml de as misturas tampão contendo detergente e sem detergente, resultando em seis diferentes soluções de glicerol a 25%. Verifique os valores de pH utilizando papel indicador de pH. NOTA: No caso de o pH medido difere significativamente do valor desejado, as respectivas soluções devem ser preparadas novamente. </li><li> Preparar solução de glicerol a 15% por mistura de estoque de glicerol a 50% com dH 2 O em uma proporção de 3: 7. </li></ol> 3. Ultracentrifugação da IAV <ol><li> Adicionar solução de glicerol a 3 ml de 15% em tubos de centrifugação ultra-claros (13,2 ml, 14 mm x 89 mm) usando uma seringa de 5 ml e uma needle (21 G, 9 cm de comprimento). Não deixar gotas para a parede interior do tubo como este poderia perturbar a integridade do gradiente. Repetir este para um total de seis tubos de centrifugação, uma para cada um dos cinco condições de pH para testar e uma para a amostra de controlo. </li><li> Com cuidado, coloque solução de glicerol a 3,4 ml de 25% sob a camada de glicerol 15%, utilizando uma seringa de 5 ml e uma agulha longa. Tome cuidado para não misturar as duas camadas. Repita este procedimento para todas as seis condições para testar com as respectivas soluções de glicerol com o pH ajustado. NOTA: Trabalho na classe II biossegurança gabinete para as etapas seguintes. </li><li> Suavemente sobrepor os gradientes de glicerol com 30 ul clarificadas fluido alantóide que contém IAV (X31, H3N2) diluído em 1 ml de tampão de MNT (corresponde a cerca de 20-30 ug da proteína virai total) para cada gradiente. </li><li> Equilíbrio oposição tubos e colocá-los em um rotor SW41 ultracentrifugação. Centrifugar durante 150 minutos, a 55000 x g, e 12 ° C. </li><li> Após a centrifugação, cuidadosamenteremover o sobrenadante, isto é, ambas as camadas de glicerol, usando uma pipeta de Pasteur limpa e um aspirador. Ressuspender o sedimento em 40 ul (1x) não redutoras tampão de amostra LDS. É importante para pipetar para cima e para baixo várias vezes para dissolver completamente o sedimento. Transferir a amostra para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li></ol> 4. SDS-PAGE de fracções de pellets e coloração com Coomassie <ol><li> Aquecer todas as amostras a 95 ° C durante 10 min. Neste ponto, as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C até serem analisadas por SDS-PAGE. </li><li> Carga de 20 ul das pelotas dissolvidas em um gradiente de pré-molde (4-12%) em gel de mini-Bis-Tris e correr durante 1 h a 200 V em MOPS SDS 1x tampão de corrida. </li><li> Fazer a solução de fixação com 40% de metanol e ácido acético glacial a 10% em DDH 2 O. </li><li> Incubar o gel na solução de fixação durante 1 hora e manchar durante a noite numa placa de cultura celular 15 cm, com um volume suficiente de solução de Coomassie coloidal enquanto suavementeagitação à temperatura ambiente. NOTA: É importante para fechar o prato, a fim de evitar a evaporação da solução de coloração. </li><li> Destain o gel em ddH 2 O. Substitua o DDH 2 O a cada 15-20 minutos até que o fundo gel torna-se clara. Armazenar o gel em ddH2O a 4 ° C até ser digitalizada para quantificação banda. </li><li> Digitalizar o gel em alta resolução e use um software disponível ou personalizado comercialmente para a quantificação de intensidades das bandas de proteína. Subtrair o sinal de fundo a partir de uma região próxima às respectivas bandas e normalizar estes valores para as amostras de controlo sem detergente (a pH 7,4). </li></ol>

<ol>
	<li>Taubenberger, J. K., Kash, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+Virus+Evolution,+Host+Adaptation,+and+Pandemic+Formation.">Influenza Virus Evolution, Host Adaptation, and Pandemic Formation.</a> Cell host &amp; microbe. 7 (6), 440-451 (2010).</li><li>Skehel, J. J., Wiley, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+binding+and+membrane+fusion+in+virus+entry:+the+influenza+hemagglutinin.">Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin.</a> Annual review of biochemistry. 69, 531-569 (2000).</li><li>de Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+influenza+a+virus+endocytic+routes+reveals+macropinocytosis+as+an+alternative+entry+pathway.">Dissection of the influenza a virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway.</a> PLoS pathogens. 7 (3), e1001329 (2011).</li><li>Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+entry+pathway+of+influenza+virus+in+a+canine+kidney+cell+line.">Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line.</a> J Cell Biol. 91 (3 Pt 1), 601-613 (1981).</li><li>Patterson, S., Oxford, J. S., Dourmashkin, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mechanism+of+influenza+virus+entry+into+cells.">Studies on the mechanism of influenza virus entry into cells.</a> J Gen Virol. 43 (1), 223-229 (1979).</li><li>Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+endocytic+machinery+around+individual+influenza+viruses+during+viral+entry.">Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry.</a> Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).</li><li>Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+virus+entry+via+endocytosis.">Dissecting virus entry via endocytosis.</a> J Gen Virol. 83 (Pt 7), 1535-1545 (2002).</li><li>Yoshimura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+Cell+Entry+Mechanism+of+Influenza+Virus.">Infectious Cell Entry Mechanism of Influenza Virus.</a> Journal of Virology. 43 (1), 284-293 (1982).</li><li>White, J., Kartenbeck, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-fusion+activity+of+influenza+virus.">Membrane-fusion activity of influenza virus.</a> Embo Journal. 1 (2), 217-222 (1982).</li><li>Martin, K., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+transport+of+influenza+virus+ribonucleoproteins:+The+viral+matrix+protein+(M1)+promotes+export+and+inhibits+import.">Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: The viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import.</a> Cell. 67 (1), 117-130 (1991).</li><li>Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+47.">Chapter 47.</a> Fields Virology. , 1647-1690 (2006).</li><li>Chou, Y. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+Different+Influenza+Viral+RNA+Segments+in+the+Cytoplasm+before+Viral+Budding+as+Shown+by+Single-molecule+Sensitivity+FISH+Analysis.">Colocalization of Different Influenza Viral RNA Segments in the Cytoplasm before Viral Budding as Shown by Single-molecule Sensitivity FISH Analysis.</a> PLoS Pathog. 9 (5), e1003358 (2013).</li><li>Martin, K., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+incoming+influenza+virus+nucleocapsids+into+the+nucleus.">Transport of incoming influenza virus nucleocapsids into the nucleus.</a> Journal of Virology. 65 (1), 232-244 (1991).</li><li>Bui, M., Whittaker, G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+M1+protein+and+low+pH+on+nuclear+transport+of+influenza+virus+ribonucleoproteins.">Effect of M1 protein and low pH on nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins.</a> Journal of Virology. 70 (12), 8391-8401 (1996).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH-Controlled+Two-Step+Uncoating+of+Influenza+Virus.">pH-Controlled Two-Step Uncoating of Influenza Virus.</a> Biophysical Journal. 106 (7), 1447-1456 (2014).</li><li>Stauffer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+priming+by+acidic+pH+and+high+K++is+required+for+efficient+uncoating+of+influenza+A+virus+cores+after+penetration.">Stepwise priming by acidic pH and high K+ is required for efficient uncoating of influenza A virus cores after penetration.</a> Journal of Virology. , (2014).</li><li>Zhirnov, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubilization+of+matrix+protein+M1/M+from+virions+occurs+at+different+pH+for+orthomyxo-+and+paramyxoviruses.">Solubilization of matrix protein M1/M from virions occurs at different pH for orthomyxo- and paramyxoviruses.</a> Virology. 176 (1), 274-279 (1990).</li><li>Banerjee, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+A+virus+uses+the+aggresome+processing+machinery+for+host+cell+entry.">Influenza A virus uses the aggresome processing machinery for host cell entry.</a> Science. 346 (6208), 473-477 (2014).</li><li>Huotari, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cullin-3+regulates+late+endosome+maturation.">Cullin-3 regulates late endosome maturation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (3), 823-828 (2012).</li><li>Yamauchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+Deacetylase+8+Is+Required+for+Centrosome+Cohesion+and+Influenza+A+Virus+Entry.">Histone Deacetylase 8 Is Required for Centrosome Cohesion and Influenza A Virus Entry.</a> PLoS Pathog. 7 (10), e1002316 (2011).</li><li>Bachmayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Solubilization+of+Hemagglutinin+and+Neuraminidase+from+Influenza+Viruses.">Selective Solubilization of Hemagglutinin and Neuraminidase from Influenza Viruses.</a> Intervirology. 5 (5), 260-272 (1975).</li><li>Reginster, M., Nermut, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Characterization+of+Influenza+Virus+Cores.">Preparation and Characterization of Influenza Virus Cores.</a> Journal of General Virology. 31 (2), 211-220 (1976).</li><li>Nermut, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+Investigation+on+the+Fine+Structure+of+Influenza+Virus.">Further Investigation on the Fine Structure of Influenza Virus.</a> Journal of General Virology. 17 (3), 317-331 (1972).</li><li>Schulze, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+influenza+virus:+II.+A+model+based+on+the+morphology+and+composition+of+subviral+particles.">The structure of influenza virus: II. A model based on the morphology and composition of subviral particles.</a> Virology. 47 (1), 181-196 (1972).</li><li>Candiano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+silver:+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis.">Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).</li><li>Greber, U. F., Singh, I., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+virus+uncoating.">Mechanisms of virus uncoating.</a> Trends in microbiology. 2 (2), 52-56 (1994).</li><li>Yamauchi, Y., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+entry+at+a+glance.">Virus entry at a glance.</a> Journal of Cell Science. 126 (6), 1289-1295 (2013).</li><li>Zhirnov, O. P., Grigoriev, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disassembly+of+Influenza+C+Viruses,+Distinct+from+That+of+Influenza+A+and+B+Viruses+Requires+Neutral-Alkaline+pH.">Disassembly of Influenza C Viruses, Distinct from That of Influenza A and B Viruses Requires Neutral-Alkaline pH.</a> Virology. 200 (1), 284-291 (1994).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

cápsides virais são complexos macromoleculares metaestáveis. Enquanto a montagem de viriões requer a encapsidação e condensação do genoma do vírus, o início da próxima ronda de infecção depende de desmontagem desta estrutura capsídeo compacto. Vírus evoluíram para explorar vários mecanismos celulares para controlar o ciclo de revestimento-desencapsulamento, incluindo receptores celulares, chaperones, enzimas proteolíticas, forças físicas proporcionadas pelas proteínas do motor ou helicases, bem como o pH e interruptores iónicos 26,27. Aqui, descrevemos uma abordagem in vitro com base em uma centrifugação em gradiente de glicerol para testar especificamente, o efeito de factores que promovem a desmontagem do núcleo IAV. A técnica pode ser potencialmente adaptado para dissecar os processos não revestidos de outros vírus com envelope. Através da utilização de Coomassie coloidal, as principais proteínas estruturais IAV M1, NP, HA e podem ser claramente detectados em SDS-PAGE, mesmo com um relativamente pequeno partic vírusnúmero le. No entanto, uma caracterização mais aprofundada da estrutura do capsídeo sedimentado e sua composição exigiria acompanhamento análises, tais como microscopia eletrônica (como apresentado anteriormente 28), Western blot, espalhamento dinâmico de luz ou espectrometria de massa. Além disso extensão do protocolo pode incluir fraccionamento da (25%) fase de glicerol inferior e análise dos componentes principais específicos. Ajustamento da camada de glicerol inferior para o pH óptimo de fusão de 5,0 (para X31) levou a uma dissociação quase completa da camada de matriz (Figura 2) 16. No entanto, cerca de 30% do sinal de entrada NP pode ainda ser detectada a este pH. É possível que, devido à ausência de factores celulares não revestidos Nesta configuração, como a recentemente identificada desacetilase de histona 6 (HDAC6) 18, a desmontagem incompleta ocorre. Dentro da célula, a acidificação lenta do núcleo virai e exposição a um comutador a partir de Na + para a K + </sup&gt; prepara o vírus para a liberação vRNP completa controlada por uncoating fatores 16. Não se pode excluir que, em nossa configuração, o detergente não-iônico interrompe parcialmente o núcleo exposto de ácido e desestabilizado. No entanto, nenhum efeito sobre o núcleo sedimentando a pH neutro, é observado indicados pelas intensidades da banda de proteína semelhante, em comparação com amostras não solubilizadas (Figura 2A, comparar as pistas 1 e 2). Embora, o ensaio aqui apresentado provou ser altamente reprodutível e (tal como é) suficientemente robusto para a quantificação da faixa, pode ser observado um certo grau de variação. O uso de glicerol neste protocolo é crítico para os resultados da experiência. Como relatado anteriormente 17, através de uma ultracentrifugação em gradiente de sacarose desestabiliza o núcleo IAV, o que é provavelmente devido a uma elevada força osmótica criada por sacarose. A purificação através de gradientes de sacarose IAV pode exercer efeitos semelhantes. Portanto, em comparação ovo-X31 cultivadas derivadas de cl<html> líquido alantóico arified e os estoques purificado com sacarose. Sem grande diferença pode ser observada no que diz respeito à influência do pH sobre a estabilidade ácida núcleo (dados não mostrados). No entanto, a fim de excluir potenciais efeitos colaterais da sacarose osmoticamente activo, recomendamos a realização do ensaio in vitro perda do revestimento com esclarecidas alantï¿½co sobrenadantes de cultura de células de fluidos ou concentrados. Além da escolha do material de gradiente, é importante para manter a integridade do gradiente para não influenciar o comportamento de sedimentação dos núcleos virais lisadas e assegurar a reprodutibilidade dos resultados. Além disso, a ressuspensão incompleta da fracção de pelete após ultracentrifugação provavelmente conduz a resultados diferentes. Finalmente, é altamente recomendável o ajustamento do pH das soluções tampão contendo detergente idealmente no mesmo dia da experiência de pequenas alterações na concentração iónica pode ter um efeito drástico sobre a estabilidade do núcleo virai. conteúdo &quot;&gt; É importante notar que, dependendo da estirpe IAV particular, diferentes eficiências de desmontagem pode ocorrer baseados nas propriedades da respectiva M1 e NP variantes. Isto também pode aplicar para vírus mutantes. Assim, os limiares de pH para a camada da matriz e vRNP dissociação têm que ser determinados para a respectiva estirpe IAV antes de testar influências adicionais. para a análise das condições específicas a estabilidade do núcleo virai sugerimos ajustar a camada de glicerol inferior a um valor de pH de modo que é conseguida a desmontagem de metade do máximo de M1. é possível para investigar a influência de iões específicos, ou agentes redutores, modificando a camada contendo detergente em conformidade. factores não revestidos celulares putativos podem ser adicionados directamente ao gradiente de glicerol. no caso dos factores citoplásmicos, uma terceira camada de glicerol na parte inferior do gradiente pode ser introduzido, que é ajustado para pH neutro, contém o factor celular de interesse, e é livre de detergente. desta forma, the gradiente de três camadas seria ainda mais estreitamente imitar a passagem do vírus através do sistema de endocitose e libertação de segmentos de genes para o citoplasma neutro. Tomados em conjunto, apresentamos um ensaio robusta, mas simples in vitro para estudar IAV priming e uncoating, que tem o potencial para modificações versáteis, a fim de abordar diversas questões no contexto de entrada IAV. Além disso, ele pode ser aplicado para investigar processos de entrada de outros vírus com envelope com mecanismos relacionados não revestidos.

Vírus da Influenza A (IAV) é um vírus envolvido que pertence à família de Orthomyxoviridae. Seus genes são codificados em uma, de sentido negativo e segmentada genoma de ARN de cadeia simples. Nos seres humanos, IAV causa infecções respiratórias, que ocorrem em surtos epidêmicos sazonais e tem o potencial para pandemias globais 1. Após a ligação de resíduos de ácido siálico na superfície das células de acolhimento 2, IAV é internalizado por endocitose dependente de clatrina e vias independentes de clatrina 3-8. O meio ácido (pH &lt;5,5) nos vacúolos de endocitose desencadeia uma mudança conformacional na IAV pico glicoproteína hemaglutinina (HA), o que resulta na fusão do vírus e no final da membrana endossomal 9. Uma vez que a cápside IAV (aqui também referido como &quot;núcleo&quot; viral) escapou de endossomas tardios (EIE), que é não revestidos no citosol seguido por transporte das ribonucleoproteínas virais (vRNPs) no núcleo - o local de Oa replicação do vírus e transcrição F 10-13. Antes da activação de ácido HA do vírus sofre uma redução gradual do pH no sistema endocítico, que prepara o núcleo para a sua desmontagem posterior 14-16. Neste &quot;priming&quot; intensificar os canais de íon M2 na membrana viral mediar o influxo de prótons e K +10,14,16. A mudança na concentração iônica no interior vírus perturba as interações construir pela proteína da matriz viral M1 ea vRNP pacote de oito, e facilita IAV uncoating no citoplasma seguindo a fusão da membrana 10,14-17. análise directa e quantitativa do passo de iniciação tem sido dificultada pelo facto de endossomas são difíceis de aceder experimentalmente. O processo de entrada é, aliás, altamente não-síncrona. Além disso, ensaios de ponto final, como qRT-PCR de RNA ou da infecciosidade medições virais libertados, não fornecem uma imagem detalhada sobre o estado bioquímico do capsi virald em qualquer etapa de entrada. Enquanto perturbação da endossomas por siRNA ou tratamento de drogas tem contribuído significativamente para a compreensão de entrada IAV 18-20, ajuste fino é difícil e propenso a efeitos colaterais não específicos no programa endosome maturação rigidamente controlado. Para evitar estes problemas, nós adaptamos um protocolo previamente desenvolvido in vitro, com base na utilização de centrifugação em gradiente de velocidade de 17. Em contraste com outras tentativas 21,22, 23,24, que eram na maior parte baseados em combinações de clivagem proteolítica e tratamento com detergente, seguido por análise de EM, esta abordagem permitiu um resultado facilmente quantificáveis. Centrifugação através de diferentes camadas de gradiente permite que as partículas sedimentam a ser expostos e reagem com mudança de condições, de forma controlada. No protocolo apresentado, IAV derivados a partir de fluido alantóico clarificado ou partículas virais purificadas são sedimentadas numa glicerol de duas camadasgradiente em que a camada inferior contém o detergente não-iónico NP-40 (Figura 1). Tal como o vírus entra na segunda camada, contendo detergente, o envelope lipídico e glicoproteínas do envelope viral são suavemente solubilizada e deixado para trás. O núcleo, composto pelo feixe vRNP e oito rodeado por uma camada de matriz, sedimentos como uma estrutura estável na fracção de sedimento. proteínas de núcleo virai, tais como M1 e nucleoproteína vRNP-associado (NP), pode ser identificado no sedimento por SDS-PAGE e coloração com Coomassie. Em particular, tomando vantagem de géis de gradiente disponíveis comercialmente e a coloração com Coomassie coloidal altamente sensível 25, permite alta precisão e a detecção de mesmo pequenas quantidades de proteínas associadas ao núcleo virai. Isso define a base para testar se condições diferentes, como pH, concentração de sal, e os fatores não revestidos putativos têm efeitos sobre o comportamento de sedimentação dos componentes do núcleo e stabil núcleo<html> dade. Para este objectivo, apenas a camada inferior, contendo o detergente em o gradiente de glicerol é modificado através da introdução do factor ou condição de interesse. A técnica tem sido particularmente útil em investigar o efeito de diferentes valores de pH e concentrações de sal sobre a integridade do núcleo 16 IAV. Etapas intermediárias de IAV desencapsulamento poderia ser monitorada incluindo dissociação da camada de matriz a um pH ligeiramente ácido (&lt;6,5), seguido de vRNP de dissociação a pH 5,5 e inferior 16,17 (Figura 1). O último passo foi adicionalmente reforçada pela presença de alta concentração de K + na camada de glicerol, reflectindo um ambiente endocítica final 16. Assim, como o vírus e o núcleo sedimentado através do gradiente que experimentaram uma mudança de meio, imitando as condições em endossomas. O resultado foi uma desmontagem gradual do núcleo virai in vitro, completando os resultados derivados a partir de ensaios de biologia celular. t &quot;&gt; O método aqui apresentado, permitiu rápido e altamente reprodutível análise de IAV (X31 e A / WSN / 33) e IBV (B / Lee / 40) desencapsulamento desencadeada pelo pH ácido e aumentando +16,17 K, bem como desmontagem de núcleos paramixovírus após exposição pH alcalino 17. é concebível que a abordagem pode ser adaptada para outros vírus com envelope para obter insights sobre as propriedades bioquímicas da estrutura da cápside virai e desmontagem da cápside durante a entrada na célula.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1103">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">cOmplete&#8482;, EDTA-free protease inhibitor tablets</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">11873580001</td>
			<td style="width:473px;">The stock solution can be stored at 2 to 8 &#176;C for 1 to 2 weeks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glacial acetic acid</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>100063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol anhydrous BioChemica</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>100317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Long injection needle (21 GA, 9 cm, bevel or blunt-end)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>106009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NP-40</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td>Now commercially available as IGEPAL&#174; CA-630</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE&#174; 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 wells, 1.0 mm</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE&#174; LDS sample buffer (4X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE&#174; MOPS SDS running buffer (20X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pH indicator strips, pH 4.0 - 7.0</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>109542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QC Colloidal Coomassie Stain</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>1610803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>106406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodiumhydroxide</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>106498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Steritop&#8482; filter unit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SCGPT05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2 ml, 14 x 89 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris hydrochloride&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid</td>
			<td>Virapur</td>
			<td></td>
			<td>Freshly thawed on 4&#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro disassembly of influenza a virus capsids by gradient centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

Como já foi discutido, priming em endossomos é necessária para tornar o núcleo IAV perda do revestimento competente. A protonação do núcleo enfraquece interacção de M1 e vRNPs (composto do RNA viral, NP, e o complexo de polimerase PB1 / PB2 / PA). Este processo inicia-se quando o vírus de entrada está exposta a um pH de 6.5 (ou inferior) em endossomas precoces (EES) e continua até que os fusíveis de vírus em torno de pH 5,0 em les. A fim de imitar a diminuição do pH, a camada inferior dos gradientes de glicerol foram ajustadas para valores entre pH 7,4 e 5,0, a uma concentração constante de sal. X31 derivada a partir de fluido alantóico clarificada foi submetida a centrifugação em gradiente de velocidade e analisadas por SDS-PAGE (Figura 2A, B). Sem detergente presentes na gradiente (Figura 2A, lane1) viriões intactos são sedimentadas, tal como reflectido pelo padrão característico debandas que representam HA (HA1 e HA2; 63 kDa), NP (56 kDa), e M1 (27 kDa) no gel corado com Coomassie. Uma vez que o gel foi corrida sob condições não redutoras, HA1 e HA2 proteoliticamente clivado ainda estão ligados por ligações dissulfureto e executar a aproximadamente 64 kDa. Sob condições redutoras as bandas correspondentes a HA1 e HA2 afiguram-se muito perto das bandas NP e M1, respectivamente, tornando-se difíceis de interpretar fielmente e determinar intensidades de bandas que são exclusivamente derivados do núcleo virai (Figura 2B). Após a adição de NP-40 para a parte inferior (25%) de glicerol camada do envelope viral, incluindo HA, NA e M2 foram solubilizadas e o núcleo viral sozinho sedimentado em pelete durante a ultracentrifugação (Figura 1; a Figura 2, pista 2). Começando com um pH abaixo de 6,5, M1 é gradualmente perdida a partir da fracção sedimento, atingindo um mínimo entre pH 5,8 e 5,4 (Fig2A, B). Abaixo de pH 5.8 vRNPs foram dissociadas e, portanto, perdido a partir do sedimento. Anteriormente, demonstrou-se que, de facto, vRNPs inteiras são libertados para a camada superior, como a sua saída correlacionada com a perda de PB2 da fracção de sedimento 16. Foram determinadas as intensidades banda de proteína, revelando dois limiares distintos de pH para a desmontagem da camada de M1 e de dissociação de feixes vRNP, respectivamente (Figura 2). bandas adicionais podem ser observados no gel, o que pode corresponder à proteínas de polimerase PB1 (87 kDa), PB2 (86 kDa), PA (83 kDa), e M2 (11 kDa). Devido aos seus números de cópias menores dentro virions IAV não foi possível determinar com segurança a sua identidade e que, consequentemente, não foram levados em consideração para a quantificação. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53909/53909fig1.jpg" /> Figura 1: Representação esquemática do IAV <em&gt; ensaio in vitro desmontagem do núcleo. Resumidamente, partículas virais purificadas são carregadas num gradiente de glicerol de duas etapas. A camada inferior contém o detergente NP-40 e é ajustado para o pH e concentração de sal desejada, enquanto a camada superior, livre de detergente é mantida a um pH e concentração de sal constante. Dependendo da condição na camada inferior de glicerol, completos núcleos virais sedimentar para o fundo (1) ou são dissociados e permanecer na camada de glicerol (2). pH neutro conduz a sedimentação de núcleos virais intactas compostos de M1 e vRNPs. As condições favoráveis ​​para o desencapsulamento, tais como pH ácido (5,0), resulta na dissociação dos componentes virais do núcleo e, portanto, a perda a partir da fracção de sedimento. Na sequência de ultracentrifugação, sobrenadantes de glicerol são removidos e pelotas são analisadas por SDS-PAGE. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53909/53909fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> </<html> p&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53909/53909fig2.jpg" /> Figura 2: IAV desmontagem núcleo in vitro mediante acidificação (A) in vitro desmontagem de núcleos X31 em diferentes condições de pH na camada de glicerol inferior.. Como um controlo, NP-40 foi omitido da camada de glicerol inferior (primeira coluna). As amostras foram separadas por SDS-PAGE sob condições não redutoras, seguido de coloração com Coomassie. bandas de proteínas virais estão indicadas à direita. (B) densitométrica quantificação das intensidades das bandas de proteínas virais mostrado em (A). Proteína intensidades de banda de M1 e NP foram normalizados para aqueles a pH 7,4 sem NP-40. Os dados estão representados como médias de experiências em duplicado ± o desvio padrão (SD). Adaptado de Stauffer et al., 2014 16.ge.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation at JoVE.com

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In Vitro A desmontagem do vírus influenza A capsï¿½eos por centrifugação em gradiente

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

in-vitro-disassembly-influenza-virus-capsids-gradient

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

8.9K visualizações.  ETH Zurich. Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

Vídeo: In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Geração de recombinante do vírus Influenza de DNA plasmidial

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Imunologia e Infecção

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Usando imagens Bioluminescent para Investigar sinergismo entre Streptococcus pneumoniae E Vírus da Influenza A em Ratos infantil

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Alta capacidade método de detecção de vírus Influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

Isolamento de monócitos humanos por duas vezes centrifugação em gradiente e sua diferenciação de macrófagos em revestidos de teflon Cultura de Células Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Propagação do vírus Influenza em ovos de galinha embrionados

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Co-imunoprecipitação da proteína do rato Mx1 com a nucleoproteína do vírus da gripe A

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Nasal Wipes para Influenza A detecção de vírus e Isolamento de suínos

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 &#176;C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.

We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.

Medindo Anexo e Internalização do Vírus da Influenza A em células A549 por citometria de fluxo

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Isolamento de neutrófilos e análise para determinar seu papel na linfoma sensibilidade das células a agentes terapêuticos

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.