Esta pesquisa foi apoiada pela Naval Medical Research Center, a pesquisa unidade de trabalho 6000.RAD1.J.A0310. As opiniões expressas neste artigo são de responsabilidade dos autores e não reflecte necessariamente a política oficial ou a posição do Departamento da Marinha, Departamento de Defesa, ou do Governo dos Estados Unidos. Wei-Mei Ching é um funcionário do governo dos EUA. Este trabalho foi preparado como parte de seus deveres oficiais. Título 17 USC §105 prevê que «proteção dos direitos autorais sob este título não está disponível para qualquer obra do Governo dos Estados Unidos. &#39; Título 17 USC §101 define uma obra governo dos Estados Unidos como um trabalho preparado pelo membro do serviço militar ou funcionário do governo dos EUA como parte de suas funções oficiais dessa pessoa.

1. Preparar diluições de DNA plasmídico como padrão para a Reacção LAMP <ol><li> Utilizar um espectrofotómetro para determinar a densidade óptica (OD) a 260 nm para determinar o plasmídeo (contendo IS1111a gene alvo de C. burnetii RSA 493) a concentração de ADN. Um OD 260 de 1 é igual a 50 ug / ul de ADN. </li><li> Converter a quantidade de DNA de plasmídeo no número de cópias. Uma vez que o tamanho do plasmídeo é 6330 pb, o peso molecular deste plasmídeo é de 4,1 x 10 6 g (6,330 pb x 649 g / BP). A concentração do ADN do plasmídeo é 34,2 ng / mL (tal como determinado a partir do passo 1.1). 1 ul desta amostra de ADN contém 34,2 ng de ADN plasmídico, o equivalente a 5 x 10 9 cópias (34,2 x 10 -9 g / 4,1 x 10 6 6,02 x 10 gx 23) de ADN. </li><li> Adicionar 10 ul de ADN de plasmídeo (5 x 10 9 cópias / mL) a 90 uL de água para uma diluição de 10 vezes para fazer uma amostra de ADN de 5 x 10 8 cópias / ul. </li><li> Repetir o passo 1.3 para preparar amostras de ADN de 5 x 10 7, 5 x 10 6, 5 x 10 5, 5 x 10 4, 5 x 10 3, 5 x 10 2, 5 x 10 1, e 5 x 10 0 cópias / ul. </li></ol> 2. Prepare Template DNA a partir de amostras de Reacção LAMP <ol><li> Realizar a extracção do ADN a partir de amostras de plasma humano, utilizando um kit de ADN de mini-comercial de acordo com o protocolo do fabricante. Usar um total de 200 ul de amostra para a extracção e eluir o DNA extraído num volume de 20 ul. </li></ol> 3. Prepare 2x Tampão LAMP Reaction <ol><li> Misturar 200 mL de 10x tampão de Pol, 320 ul de 5 M trimetilglicina, 12 ul de 1 M de MgSO4, 280 uL de mistura de dNTP (10 mM cada) e 188 ul de água para perfazer 1 ml de tampão de 2x LAMP. Misture por pulso-vórtex durante 10 segundos. </li></ol> 4. Execute lâmpada padrão Reaction <ol><li> Misture 12,5 ul de 2x LATampão PM (tal como preparado no passo 3; Tris-HCl 40 (pH 8,8), KCl 20 mM, MgSO mM 16 4, 20 mM de (NH 4) 2 SO 4, 0,2% de Triton X-100, trimetilglicina 1,6 M, 1,4 mistura de dNTP mM), 1,2 ul de mistura de iniciadores, 1 mL de polimerase de ADN Bst (8 U / ul) e 5,3 ul de água para tornar a mistura de reacção (20 ul) num tubo de PCR de 0,2 ml. </li><li> Adicionar 5 uL de ADN (do passo 1 ou 2) para a mistura reaccional de 20 ul e misturar bem. </li><li> Primeiro tubo e incubar a 60 ° C durante 60 min num banho-maria ou bloco de aquecimento. Esta é a temperatura de reacção óptima previamente determinada. </li><li> Adicionar 5 uL de tampão de carga de gel de 10x para terminar a reacção. </li><li> Carga de 5 ul dos produtos de reacção a um gel de agarose a 2% corado com intercalando mancha de ácido nucleico. </li><li> Executar gel a 100 V durante 35 min em tampão 1 x TBE. </li><li> Visualize os resultados por luz UV. </li></ol> 5. Execute Reaction LAMP com Reconstituídoreagentes <ol><li> Misturar 125 ul de Tampão 10 x Pol, 200 mL de 5 M trimetilglicina, 7,5 ul de 1 M de MgSO4, 667,5 ul de água para perfazer 1 ml de tampão de reconstituição. Misture por pulso-vórtex durante 10 segundos. </li><li> Retire os tubos que contêm os reagentes liofilizados a partir do saco de folha de alumínio selado. Não utilize os tubos se o saco de folha de alumínio não está vedada ou se ele estiver danificado. </li><li> Adicionar 20 ul de tampão de reconstituição em cada tubo para ressuspender reagentes liofilizados. </li><li> Misture pipetando tampão cima e para baixo 5 vezes. Dê uma olhada para garantir que os reagentes liofilizados são completamente re-suspensa. O pó branco deve desaparecer no tubo. </li><li> Adicionam-se 5 ul de molde de ADN (do passo 1 ou 2) para os reagentes reconstituídos e misturar bem. </li><li> Primeiro tubo e incubar a 60 ° C durante 60 min num banho-maria ou bloco de aquecimento. </li><li> Adicionar 5 uL de tampão de carga de gel de 10x para terminar a reacção. </li><li> Carga de 5 ul de reacçãoprodutos para um gel de agarose a 2% corado com corante intercalante ácido nucleico. </li><li> Executar gel a 100 V durante 35 min em tampão 1 x TBE. </li><li> Visualize os resultados por luz UV. </li></ol> 6. Execute LAMP Reação com Reconstituição tampão contendo HNB ou fluorescente intercalando Dye <ol><li> Misturar 125 mL de 10x Pol de Amortecimento, 200 mL de 5 M trimetilglicina, 7,5 ul de 1 M de MgSO4, 7,5 ul de HNB 20 mM (ou 12,5 ul de 100x corante fluorescente intercalante) e 660 uL (ou 655 ul) de água para fazer 1 ml de tampão de reconstituição. Misture por pulso-vórtex durante 10 segundos. </li><li> Use o tampão reconstituído preparado na seção 6 para repetir os passos 5.2 - 5.6. </li><li> Visualize os resultados por a olho nu (reacção contendo HNB) ou uma luz UV (reacção contendo corante de intercalação fluorescente). </li></ol> 7. Realizar em tempo real Reaction LAMP com Scanner Tubo <ol><li> Adicionam-se 5 ul de DNA para o reconstitutreagentes ed contendo corante de intercalação fluorescente, perto do tubo e inseri-lo para o scanner tubo. </li><li> Ajuste da temperatura de incubação a 60 ° C. Medir a fluorescência a 520 nm durante 60 min. </li></ol>

<ol>
	<li>Anderson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+Q+fever+United+States,+2013:+recommendations+from+CDC+and+the+Q+Fever+Working+Group.">Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group.</a> MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).</li><li>Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+ratio+of+serum+doxycycline+concentration+to+MIC+and+rapid+decline+of+antibody+levels+during+treatment+of+Q+fever+endocarditis.">Correlation between ratio of serum doxycycline concentration to MIC and rapid decline of antibody levels during treatment of Q fever endocarditis.</a> Antimicrob. Agents and Chemother. 49 (7), 2673-2676 (2005).</li><li>Fournier, P. E., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+PCR+and+serology+assays+for+early+diagnosis+of+acute+Q+fever.">Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever.</a> J. Clin. Microbiol. 41 (11), 5094-5098 (2003).</li><li>Schneeberger, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+with+serum+samples+is+indispensable+for+early+diagnosis+of+acute+Q+fever.">Real-time PCR with serum samples is indispensable for early diagnosis of acute Q fever.</a> Clin. Vaccine Immunol. 17 (2), 286-290 (2010).</li><li>Turra, M., Chang, G., Whybrow, D., Higgins, G., Qiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+acute+Q+fever+by+PCR+on+sera+during+a+recent+outbreak+in+rural+South+Australia.">Diagnosis of acute Q fever by PCR on sera during a recent outbreak in rural South Australia.</a> Ann. N Y Acad. Sci. 1078, 566-569 (2006).</li><li>Notomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+of+DNA.">Loop-mediated isothermal amplification of DNA.</a> Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).</li><li>Paris, D. H., Blacksell, S. D., Newton, P. N., Day, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple,+rapid+and+sensitive+detection+of+Orientia+tsutsugamushi.+by+loo-isothermal+DNA+amplification.">Simple, rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi. by loo-isothermal DNA amplification.</a> Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 102 (12), 1239-1246 (2008).</li><li>Huber, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+assay+targeting+the+47-kDa+gene+of+Orientia+tsutsugamushi.:+A+rapid+and+sensitive+alternative+to+real-time+PCR.">Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the 47-kDa gene of Orientia tsutsugamushi.: A rapid and sensitive alternative to real-time PCR.</a> J. Med. Microb. Diagn. 1 (112), (2012).</li><li>Pan, L., Zhang, L., Wang, G., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+sensitive+detection+of+the+ompB+gene+of+spotted+fever+group+rickettsiae+by+loop-mediated+isothermal+amplification.">Rapid, sensitive detection of the ompB gene of spotted fever group rickettsiae by loop-mediated isothermal amplification.</a> BMC Infect. Dis. 12 (254), (2012).</li><li>Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+by+turbidity+derived+from+magnesium+pyrophosphate+formation.">Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1), 150-154 (2001).</li><li>Qiao, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+for+rapid+detection+of+Bacillus+anthracis.spores.">Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis.spores.</a> Biotechnol. Lett. 29 (12), 1939-1946 (2007).</li><li>Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP)+of+gene+sequences+and+simple+visual+detection+of+products.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.</a> Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).</li><li>Thekisoe, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+Loop-Mediated+Isothermal+Amplification+(LAMP)+reagents+and+its+amplification+efficiency+on+crude+trypanosome+DNA+templates.">Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates.</a> J. Vet. Med. Sci. 71 (4), 471-475 (2009).</li><li>Chen, H. W., Ching, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+loop-mediated+isothermal+amplification+assays+for+rapid+and+easy+detection+of+Coxiella+Burnetii.">Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii.</a> J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+In-House+Real-Time+LAMP+Assays+with+a+Commercial+Assay+for+the+Detection+of+Pathogenic+Bacteria.">A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria.</a> Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Anteriormente, foi desenvolvido um ensaio LAMP sensível e específico visando o elemento de inserção IS1111a 14. O elemento IS1111 foi selecionado porque ele é altamente conservado entre as diferentes estirpes de C. burnetii e o seu elevado número de cópias (7-110) em que as bactérias (Klee 2006). Os nossos resultados mostraram que a lâmpada pode detectar cerca de 25 cópias do elemento IS1111, que pode correlacionar-se com tão pouco como uma única cópia cromossómica de ADN Coxiella. Neste estudo, a DNA polimerase Bst, primers lâmpada e dNTPs foram liofilizadas e embalado em um saco de papel de alumínio compactado. A sensibilidade destes reagentes liofilizados permanece em 25 cópias; semelhante aos reagentes recém-preparados para pelo menos um mês quando armazenada à temperatura ambiente. É muito importante para garantir que o saco de folha de alumínio está devidamente selada antes de abrir. Não utilize os tubos se o saco de folha de alumínio não está vedada ou se ele estiver danificado. Isto pode causar a re-hidratação óf os reagentes liofilizados, que conduz à perda da sua reactividade. O outro passo essencial é a re-suspensão dos reagentes liofilizados com tampão de reconstituição. A reação LAMP não funcionará corretamente com reagentes que não são totalmente re-suspensão. Por causa das elevadas concentrações de sal do tampão de reacção e elevada viscosidade da solução trimetilglicina, eles não podem ser liofilizados com êxito com DNA polimerase Bst, iniciadores LAMP, e dNTPs. Um passo especial é necessário para preparar o tampão de reconstituição com esses componentes. Potencialmente, a reacção pode ser testado LAMP a baixas concentrações de sal, com baixa ou nenhuma trimetilglicina. Se houver uma condição de reacção que tem a mesma sensibilidade de detecção, mas com baixo teor de sal e baixa concentração trimetilglicina, o reagente liofilizado só precisa de ser reconstituído com água. Isto vai simplificar ainda mais os passos de reacção. Recentemente, Wang et al. 15 em comparação em dozeensaios LAMP -house com a isotérmica kit Mix Master comercializado e encontrou os ensaios in-house tem resultados falso-positivos. Em nosso laboratório, nós desenvolvemos vários ensaios LAMP para a detecção de bactérias diferentes e nunca ter encontrado resultados falso-positivos nesses ensaios in-house. Além disso, nos estágios iniciais do desenvolvimento do método LAMP, os ensaios foram testados com tanto internamente preparadas mistura principal e comercializado mistura principal e nenhuma diferença foi observada na sensibilidade e especificidade dos ensaios. Nosso estudo também apresenta vários métodos que não só podem detectar os produtos de lâmpada sem abrir os tubos de reacção para diminuir a probabilidade de contaminação laboratorial cruz, mas também têm um tempo de processo mais curto para ler resultados se comparam ao método de eletroforese em gel. A vantagem de utilizar estes métodos de detecção irá aumentar grandemente a nossa capacidade de realizar o ensaio e rapidamente diagnosticar um indivíduo com C. burnetii </em&gt; infecção em áreas de recursos limitados. Isto irá permitir o tratamento rápido e adequado da febre Q aguda e diminuir o potencial de infecção crônica futuro. Ao contrário dos métodos baseados em PCR, onde é necessário um termociclador, um bloco de aquecimento, banho-maria ou incubadora mantendo uma temperatura constante de cerca de 60 ° C é tudo o que é necessário para o ensaio de LAMP. Isso faz com que o ensaio particularmente adequado na configuração de recursos limitados. Ao contrário do ensaio inicial LAMP, polimerase Bst ADN, iniciadores LAMP, e dNTPs necessitam de ser armazenados a -20 ° C. Estes reagentes liofilizados podem ser armazenados à temperatura ambiente o que torna ainda mais útil para um cenário de recursos limitados onde a febre Q é endêmica. O estudo de estabilidade a longo prazo dos reagentes liofilizados, a 4 ° C, 25 ° C, e 37 ° C, está actualmente em curso. No futuro, gostaríamos de demonstrar que este ensaio da lâmpada utilizando reagentes liofilizados pode detectar C. burnetii com sensibilidade semelhante àde PCR em uma configuração remota.

A pequena bactéria gram-negativa Coxiella burnetii é o agente causador da febre Q, que é uma zoonose em todo o mundo. Devido à distribuição mundial da febre Q ea alta infectividade do C. burnetii, pessoal militar e civil dos Estados Unidos desdobradas no exterior estão em risco de serem infectados nas áreas endêmicas. febre Q manifesta de duas formas: infecções agudas e crónicas. Febre Q aguda apresenta-se com sintomas semelhantes aos da gripe, hepatite ou pneumonia, e geralmente é uma doença autolimitada, com uma taxa de mortalidade baixa. Febre Q crónica, embora menos prevalente, muitas vezes resulta em endocardite, que tem uma taxa de mortalidade muito maior se não tratada 1,2. Portanto, o diagnóstico precoce para orientar um tratamento adequado é fundamental para o atendimento ao paciente. Reacção em cadeia da polimerase (PCR) e PCR quantitativo em tempo real (qPCR) ensaios foram desenvolvidos para a detecção de C. DNA burnetii em culturas de células e amostras clínicas 3-5 &lt;/ Sup&gt;. Ambos PCR e qPCR são caros e muitas vezes não é facilmente disponível em áreas com recursos limitados para o trabalho de rotina. Originalmente descrito por Notomi 6, amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) oferece um método de amplificação de DNA alternativa. LAMP utiliza ADN-polimerase Bst ADN para a síntese de deslocamento de cadeia, juntamente com conjuntos de iniciadores especialmente concebidos para que reconhecem, pelo menos, seis regiões independentes do gene alvo. A vantagem mais significativa de LAMP é que a amplificação ocorre sob condições isotérmicas. Por conseguinte, apenas um banho de água, ou um bloco de aquecimento da incubadora é necessária. Este método tem sido utilizado para detectar vários agentes patogénicos rickettsiais 7-9. A visualização dos produtos de ADN amplificados por electroforese em gel é o método mais preciso que pode diferenciar a partir de verdadeiros positivos falsos positivos devido à amplificação não específica. No entanto, os procedimentos envolvidos na electroforese em gel não são práticos para ar de recursos limitadoseas. Vários métodos alternativos foram desenvolvidos para detectar os produtos de reacção. Estes alternativa, tal como turbidez derivado de pirofosfato de magnésio formação 10 ou utilizando um corante fluorescente intercalante a ser visualizado sob luz UV 11,12 são mais favoráveis ​​do que a execução de um gel. Os reagentes LAMP foram estáveis ​​durante um mês quando armazenada a 25 ° C e 37 ° C, que são temperatura ambiente em países tropicais e sub-tropicais onde a febre Q é endémica 13. Um ensaio de LAMP foi desenvolvido no nosso laboratório para detectar a presença de C. burnetii em amostras de plasma 14. Descrevemos aqui um protocolo simples para a preparação da mistura de reacção a partir de LAMP os reagentes liofilizados. Os reagentes liofilizados são estáveis ​​durante um mês quando armazenada à temperatura ambiente. Quando combinado com um método fácil visualização, este é um método ideal para utilizar para a detecção de C. burnetii em um ambiente de recursos limitados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="773">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:215px;">LAMP primers</td>
			<td style="width:188px;">Eurofins MWG operon</td>
			<td style="width:131px;">10 nmol, salt free</td>
			<td style="width:240px;">Sequence designed by customer</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:215px;">Bst DNA polymerase</td>
			<td style="width:188px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">M0275L</td>
			<td style="width:240px;">8 units/ml</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:215px;">10X Thermo pol buffer</td>
			<td style="width:188px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">B9004S</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:215px;">dNTP mixture</td>
			<td style="width:188px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">N0447L</td>
			<td style="width:240px;">10 mM each</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:215px;">Betaine</td>
			<td style="width:188px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">B0300</td>
			<td style="width:240px;">5 M, Trimethylglycine</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:215px;">Magnesium Sulfate</td>
			<td style="width:188px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">M3409-1ML</td>
			<td style="width:240px;">1 M</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:215px;">10X Bluejuice</td>
			<td style="width:188px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">10816-015</td>
			<td style="width:240px;">gel loading buffer</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:215px;">SYBR green</td>
			<td style="width:188px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">S7585</td>
			<td style="width:240px;">10,000X, visualize products in tubes</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:215px;">GelRed</td>
			<td style="width:188px;">Phenix Research Products</td>
			<td style="width:131px;">RGB-4103</td>
			<td style="width:240px;">10,000X, visualize products in gels</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:215px;">Lyophilized reagents</td>
			<td style="width:188px;">Gene Reach</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:215px;">Hydroxynaphthol blue</td>
			<td style="width:188px;">Fluka</td>
			<td style="width:131px;">33936-10G</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:215px;">ESEQuant tube scanner</td>
			<td style="width:188px;">Qiagen</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:240px;">real-time detection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the development of lyophilized loop-mediated isothermal amplification reagents for the detection of coxiella burnetii

Coxiella burnetii, o agente causador da febre Q, é uma bactéria intracelular obrigatório. Ensaios de diagnóstico baseado em PCR, têm sido desenvolvidos para a detecção de C. ADN burnetii em culturas de células e amostras clínicas. PCR exige equipamento especializado e treinamento extensivo usuário final e, portanto, não é adequado para o trabalho de rotina, especialmente em uma área de recursos limitados. Nós desenvolvemos um ensaio de amplificação isotérmica mediada por ciclo (LAMP) para detectar a presença de C. burnetii em amostras de doentes. Este método é realizado em uma única temperatura de cerca de 60 ° C em um banho-maria ou bloco de aquecimento. A sensibilidade deste ensaio de LAMP é muito semelhante a PCR com um limite de detecção de cerca de 25 cópias por reacção. Este relatório descreve a preparação de reacção, utilizando reagentes liofilizados e visualização dos resultados utilizando azul hydroxynaphthol (HNB) ou uma lâmpada de UV com corante fluorescente intercalante na reacção. Os reagentes LAMP foram lyophilized e armazenado à temperatura ambiente (TA) durante um mês sem perda de sensibilidade de detecção. Este ensaio LAMP é particularmente robusto, porque a preparação da mistura de reacção não envolve etapas complexas. Este método é ideal para uso em ambientes de recursos limitados onde a febre Q é endêmica.

Os reagentes liofilizados LAMP no interior do tubo de 0,2 ml contém polimerase de ADN Bst, iniciadores e os dNTP. 20 ul de tampão de reconstituição é utilizado para re-suspender os reagentes liofilizados. A Figura 1 mostra os resultados da reacção LAMP em géis de agarose com reagentes recém-preparados e reagentes liofilizados. O reagente liofilizado não reduz a sua actividade. Reacções LAMP preparados por ambos os reagentes pode detectar 25 cópias de ADN molde. A Figura 2 mostra a detecção dos produtos da reacção com HNB ou corante intercalante fluorescente presente na reacção. A adição de HNB para a reacção produz uma mudança de cor visuais de púrpura para azul com 25, 50 e 100 cópias de matriz de ADN presentes nas reacções. A inclusão de corante intercalante fluorescente na reacção mostra um forte sinal de fluorescência com luz UV, quando 25, 50, e 100 cópias de moldes de ADN estão presentes. Um scanner de tubo foi utilizadanesse estudo para a detecção em tempo real. Esta máquina pode executar 8 reacções simultaneamente. A Figura 3 mostra o uso do scanner tubo para monitorizar os sinais de fluorescência em tempo real com a presença intercalante corante fluorescente. Os sinais de fluorescência são acima da linha de base após 14, 18, ​​21, e 23 min com 10 6, 10 4, 10 3, e 100 cópias de DNA molde nas reacções. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53839/53839fig1.jpg" /> Figura 1. LAMP resulta em agarose gel com reagentes recém-preparados (A) e liofilizado Reagentes (B). As misturas de reacção foram incubadas a 60 ° C durante 60 min. (A) A pista 1, 100 pb escada; Pista 2 - 3, 4-5, 6-7 e 8-9 são reacções com 2,5 x 10 3, 2,5 x 10 2, 2,5 x 10, e não há cópias de DNA plasmídeo. (B) A pista 10 - 11, 12 - 13, 14-15, e 16-17 são reaCÇÕES com 2,5 x 10 3, 2,5 x 10 2, 2,5 x 10 e 0 cópias de DNA plasmídeo. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53839/53839fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53839/53839fig2.jpg" /> Figura 2. Métodos para detectar os produtos da lâmpada. HNB (A) ou fluorescente corante de intercalação (B) foram utilizados para detectar produtos lâmpada. As reacções foram realizadas a 60 ° C durante 60 min. Pista 1 a 5, reações com 0, 10, 25, 50 e 100 cópias de plasmídeo. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53839/53839fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53839/53839fig3.jpg" /> Figura 3. </forte&gt; detecção em tempo real de luz de produtos. As reacções foram realizadas a 60 ° C durante 60 min. Reações com cópias de plasmídeo 10 6 (preto), 10 4 (vermelho), 10 3 (verde), 100 (amarelo), 10 (azul), 1 (laranja) e 0 (marrom e castanho claro). Três detecções foram realizados de forma independente. Eles foram altamente reprodutível. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53839/53839fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii at JoVE.com

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

O Desenvolvimento da liofilizado Loop-mediadas isotérmicas de amplificação Reagentes para a detecção de<em&gt; Burnetii Coxiella</em

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

the-development-lyophilized-loop-mediated-isothermal-amplification

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

10.4K visualizações.  Naval Medical Research Center. We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Vídeo: The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

Detecção de vírus infecciosos de Campo mosquitos coletados por Vero Ensaio Cultura de Células

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Imunologia e Infecção

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field 4. The use of cell-based arenavirus minigenome systems together with the ability to generate recombinant infectious arenaviruses with predetermined mutations in their genomes has facilitated the investigation of the contribution of viral determinants to the different steps of the arenavirus life cycle, as well as virus-host interactions and mechanisms of arenavirus pathogenesis 1, 3, 11 . In addition, the development of trisegmented arenaviruses has permitted the use of the arenavirus genome to express additional foreign genes of interest, thus opening the possibility of arenavirus-based vaccine vector applications 5 . Likewise, the development of single-cycle infectious arenaviruses capable of expressing reporter genes provides a new experimental tool to improve the safety of research involving highly pathogenic human arenaviruses 16 . The generation of recombinant arenaviruses using plasmid-based reverse genetics techniques has so far relied on the use of rodent cell lines 7,19 , which poses some barriers for the development of Food and Drug Administration (FDA)-licensed vaccine or vaccine vectors. To overcome this obstacle, we describe here the efficient generation of recombinant arenaviruses in FDA-approved Vero cells.

Rescue of recombinant arenaviruses from cloned cDNAs, an approach referred to as reverse genetics, allows researchers to investigate the role of specific viral gene products, as well as the contribution of their different specific domains and residues, to many different aspects of the biology of arenavirus. Likewise, reverse genetics techniques in FDA-approved cell lines (Vero) for vaccine development provides novel possibilities for the generation of effective and safe vaccines to combat human pathogenic arenaviruses.

Geração de Arenavirus recombinante de Desenvolvimento de Vacinas no FDA-approved células Vero

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal Peyer&#39;s patch (PP). Common dendritic cell progenitors (CDPs, lin- c-kitlo CD115+ Flt3+) were purified from the bone marrow of C57BL6 mice by FACS and transferred to recipient mice that lack a significant pDC population in PP; in this case, Ifnar-/- mice were used as the transfer recipients. In some mice, overexpression of the dendritic cell growth factor Flt3 ligand (Flt3L) was enforced prior to adoptive transfer of CDPs, using hydrodynamic gene transfer (HGT) of Flt3L-encoding plasmid. Flt3L overexpression expands DC populations originating from transferred (or endogenous) hematopoietic progenitors. At 7-10 days after progenitor transfer, pDCs that arise from the adoptively transferred progenitors were distinguished from recipient cells on the basis of CD45 marker expression, with pDCs from transferred CDPs being CD45.1+ and recipients being CD45.2+. The ability of transferred CDPs to contribute to the pDC population in PP and to respond to Flt3L was evaluated by flow cytometry of PP single cell suspensions from recipient mice. This method may be used to test whether other progenitor populations are capable of generating PP pDCs. In addition, this approach could be used to examine the role of factors that are predicted to affect pDC development in PP, by transferring progenitor subsets with an appropriate knockdown, knockout or overexpression of the putative developmental factor and/or by manipulating circulating cytokines via HGT. This method may also allow analysis of how PP pDCs affect the frequency or function of other immune subsets in PPs. A unique feature of this method is the use of Ifnar-/- mice, which show severely depleted PP pDCs relative to wild type animals, thus allowing reconstitution of PP pDCs in the absence of confounding effects from lethal irradiation.

This protocol describes experimental procedures to assess the differentiation of plasmacytoid dendritic cells in Peyer&#8217;s patch from common dendritic cell progenitors, using techniques involving FACS-mediated cell isolation, hydrodynamic gene transfer, and flow analysis of immune subsets in Peyer&#8217;s patch.

Avaliando o Desenvolvimento da murino células dendríticas plasmocitóides em placas de Peyer Usando transferência adoptiva de Progenitores hematopoiéticos

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

In Vitro Análise do mediada por Myd88 Cellular resposta imune a vírus do Nilo Ocidental Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor Fc&#949;RI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated allergic reactions. As a consequence of the high affinity binding between IgE and Fc&#949;RI, along with the continuous production of IgE by B cells, allergies usually persist throughout life, with currently no permanent cure available. Horses, especially race horses, which are commonly inbred, are a species of mammals that are very prone to the development of hypersensitivity responses, which can seriously affect their performance. Physiological responses to allergic sensitization in horses mirror that observed in humans and dogs. In this paper we describe the development of an in situ assay system for the quantitative assessment of the release of mediators of the allergic response pertaining to the equine system. To this end, the gene encoding equine Fc&#949;RI&#945; was transfected into and expressed onto the surface of parental Rat Basophil Leukemia (RBL-2H3.1) cells. The gene product of the transfected equine &#945;-chain formed a functional receptor complex with the endogenous rat &#946;- and &#947;-chains 1. The resultant assay system facilitated an assessment of the quantity of mediator secreted from equine Fc&#949;RI&#945; transfected RBL-2H3.1 cells following sensitization with equine IgE and antigenic challenge using &#946;-hexosaminidase release as a readout 2, 3. Mediator release peaked at 36.68% &#177; 4.88% at 100 ng ml-1 of antigen. This assay was modified from previous assays used to study human and canine allergic responses 4, 5. We have also shown that this type of assay system has multiple applications for the development of diagnostic tools and the safety assessment of potential therapeutic intervention strategies in allergic disease 6, 2, 3.

The current study describes the development and applications of a genetically engineered assay system based on the transfection of rat basophilic leukemia cells with the equine Fc&#949;RI&#945; gene. Transfected cells express a functional receptor where the release of mediators of the allergic response can be activated by IgE and antigen.

Desenvolvimento de um<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema modelo para estudar a interacção de<em&gt; Equus</em&gt;<em&gt; Caballus</em&gt; IgE ao seu receptor de elevada afinidade FceRI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm&#8217;s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.

Isothermal amplificação (lâmpada), Ensaios mediada por loop para detecção específica da espécie os de<em&gt; Eimeria</em&gt; Que infectam Galinhas

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Geração e Multi-fenotípica rastreio de alto teor de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; mutantes por transposões

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Qualitativos e quantitativos Os ensaios para a detecção e caracterização de antimicrobianos Proteína

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

Aplicando Transferência de ressonância de fluorescência Energia (FRET) para examinar Eficiência Effector translocação pela<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; Durante siRNA silenciamento

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the majority of Vibrio-associated infections. Thus, accurate differentiation among Vibrio spp. and detection of V. parahaemolyticus is critically important to ensure the safety of our food supply. Although molecular techniques are increasingly common, culture-depending methods are still routinely done and they are considered standard methods in certain circumstances. Hence, a novel chromogenic agar medium was tested with the goal of providing a better method for isolation and differentiation of clinically relevant Vibrio spp. The protocol compared the sensitivity, specificity and detection limit for the detection of V. parahaemolyticus between the new chromogenic medium and a conventional medium. Various V. parahaemolyticus strains (n=22) representing diverse serotypes and source of origins were used. They were previously identified by Food and Drug Administration (FDA) and Centers for Disease Control and Prevention (CDC), and further verified in our laboratory by tlh-PCR. In at least four separate trials, these strains were inoculated on the chromogenic agar and thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose (TCBS) agar, which is the recommended medium for culturing this species, followed by incubation at 35-37 &#176;C for 24-96 hr. Three V. parahaemolyticus strains (13.6%) did not grow optimally on TCBS, nonetheless exhibited green colonies if there was growth. Two strains (9.1%) did not yield the expected cyan colonies on the chromogenic agar. Non-V. parahaemolyticus strains (n=32) were also tested to determine the specificity of the chromogenic agar. Among these strains, 31 did not grow or exhibited other colony morphologies. The mean recovery of V. parahaemolyticus on the chromogenic agar was ~96.4% relative to tryptic soy agar supplemented with 2% NaCl. In conclusion, the new chromogenic agar is an effective medium to detect V. parahaemolyticus and to differentiate it from other vibrios.

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.

Desenvolvimento de uma mais sensível e específica Cromogênico Agar para a detecção de<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; E outro<em&gt; Vibrio</em&gt; Espécies

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...