この研究は、米海軍医学研究センター、研究作業単位6000.RAD1.J.A0310によってサポートされていました。この記事で表明された見解は執筆者のものであり、必ずしも海軍省、国防省、または米国政府の公式な政策や位置を反映するものではありません。魏メイチンは、米国政府の従業員です。この作品は彼女の公務の一部として用意しました。タイトル17 USC§105」このタイトルの下に著作権保護は、米国政府のいずれかの作業には使用できません。」ことを提供しますタイトル17 USC§101は、その人の公務の一環として、米国政府の兵役のメンバーや従業員によって調製作品として米国政府の仕事を定義します。

1. LAMP反応のための標準としてプラスミドDNA希釈液を調製<ol><li> （C.バーネッティ RSA 493の標的遺伝子IS1111aを含む）プラスミドを決定するために、260nmの光学密度（OD）を測定し、DNA濃度を分光光度計を使用します。 1のOD 260は、DNAを50μg/μlに相当します。 </li><li>コピー数にプラスミドDNAの量に変換します。プラスミドのサイズは6,330 bpであることから、このプラスミドの分子量は4.1×10 6グラム（6,330 bpのX 649グラム/ BP）です。プラスミドDNAの濃度は、34.2 ngの/μL（ステップ1.1で決定される）です。このDNA試料の1μlのDNAの5×10 9コピー（34.2×10 -9グラム/ 4.1×10 6 GX 6.02×10 23）に等しくする、プラスミドDNAの34.2 ngのが含まれています。 </li><li> 5×10 8コピー/μlにDNAサンプルを作るために10倍希釈するための水90μlにプラスミドDNAを10μl（5×10 9コピー/μl）を追加します。。 </li><li>繰り返しステップ1.3は、5×10 7のDNAサンプルを調製した5×10 6、5×10 5、5×10 4、5×10 3、5×10 2、5×10 1、および5×10 0コピー/ μlの。 </li></ol> 2. LAMP反応のための試料からDNAテンプレートを準備します<ol><li>製造業者のプロトコルに従って市販のDNAミニキットを使用して、ヒト血漿試料からのDNAの抽出を行います。抽出のための200μlのサンプルの合計を使用して、20μl容量で抽出したDNAを溶出します。 </li></ol> 3. 2倍LAMP反応緩衝液を準備します<ol><li> 2倍LAMP緩衝液1mlを作るために10倍ポル・バッファ、5 Mトリメチルグリシン、1MのMgSO 4、のdNTP混合物（各10mM）の280μlの水188μlに12μlの320μlの200μlのを混ぜます。 10秒間パルスボルテックスして混和します。 </li></ol> 4.標準LAMP反応を行います<ol><li> 2倍LA12.5μlのミックスMPバッファ（ステップ3で調製した、40mMのトリス-HCl（pHは8.8）、20 mMの塩化カリウム、16mMのMgSO 4を、20mMの（NH 4）2 SO 4、0.2％トリトンX-100、1.6 Mトリメチルグリシン、1.4 mMののdNTP混合物）、プライマーミックスの1.2μlを、 のBst DNAポリメラーゼ（8 U /μl）を1μlの、水5.3μlを0.2ミリリットルのPCRチューブ内で反応混合物（20μl）を作ります。 </li><li> （ステップ1または2から）20μlの反応混合物にDNAの5μl加え、よく混ぜます。 </li><li>近い管および水浴または加熱ブロック中で60分間60℃でインキュベートします。これは、以前に決定され、最適な反応温度です。 </li><li>反応を停止し、10倍ゲルローディング緩衝液5μLを加えます。 </li><li>核酸染色を挿入で染色した2％アガロースゲルに負荷反応生成物5μLを。 </li><li> 1×TBE緩衝液中で35分間、100Vでゲルを実行します。 </li><li> UV光によって結果を可視化します。 </li></ol>前記再構成でLAMP反応を行います試薬<ol><li>再構成緩衝液1mlを作るために10倍ポル・バッファ、5 Mトリメチルグリシン、1 M MgSO 4を、水の667.5μlに7.5μlの200μlを125μlのを混ぜます。 10秒間パルスボルテックスして混和します。 </li><li>密封されたアルミホイル袋から凍結乾燥試薬を含むチューブを外します。それが破損している場合アルミ箔袋が密閉されているかどうかのチューブを使用しないでください。 </li><li>凍結乾燥試薬を再懸濁するために、各チューブに再構成緩衝液20μlを追加します。 </li><li>バッファ上下に5回ピペッティングして混ぜます。凍結乾燥試薬が完全に再懸濁されていることを確認するために見てみましょう。白色粉末をチューブに消えるはずです。 </li><li> （ステップ1または2からの）再構成試薬にDNAテンプレートの5μl加え、よく混ぜます。 </li><li>近い管および水浴または加熱ブロック中で60分間60℃でインキュベートします。 </li><li>反応を停止し、10倍ゲルローディング緩衝液5μLを加えます。 </li><li>負荷反応液5μl核酸染色を挿入で染色した2％アガロースゲルに製品。 </li><li> 1×TBE緩衝液中で35分間、100Vでゲルを実行します。 </li><li> UV光によって結果を可視化します。 </li></ol> 6. HNBまたは蛍光インターカレート色素を含む再構成緩衝液でLAMP反応を行います<ol><li>への水の10倍ポルBufferを125μlの、5 ​​Mトリメチルグリシン、1MのMgSO 4、20mMのHNB（または100倍の蛍光挿入色素の12.5μl）を7.5μlに7.5μlの660μlの（または655マイクロリットル）の200μLをミックス再構成緩衝液1mlを作ります。 10秒間パルスボルテックスして混和します。 </li><li> 5.6 - 手順5.2を繰り返すセクション6で調製した再構成されたバッファを使用してください。 </li><li>肉眼での結果（HNBを含む反応）またはUV光（蛍光挿入色素を含む反応）を視覚化します。 </li></ol> 7.チューブスキャナによるリアルタイムLAMP反応を行います<ol><li> reconstitutに5μlのDNAを追加します。ED試薬は、蛍光挿入色素、近いチューブを含む、チューブスキャナにそれを挿入します。 </li><li> 60℃に設定したインキュベーション温度。 60分間の520nmでの蛍光を測定します。 </li></ol>

<ol>
	<li>Anderson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+Q+fever+United+States,+2013:+recommendations+from+CDC+and+the+Q+Fever+Working+Group.">Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group.</a> MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).</li><li>Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+ratio+of+serum+doxycycline+concentration+to+MIC+and+rapid+decline+of+antibody+levels+during+treatment+of+Q+fever+endocarditis.">Correlation between ratio of serum doxycycline concentration to MIC and rapid decline of antibody levels during treatment of Q fever endocarditis.</a> Antimicrob. Agents and Chemother. 49 (7), 2673-2676 (2005).</li><li>Fournier, P. E., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+PCR+and+serology+assays+for+early+diagnosis+of+acute+Q+fever.">Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever.</a> J. Clin. Microbiol. 41 (11), 5094-5098 (2003).</li><li>Schneeberger, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+with+serum+samples+is+indispensable+for+early+diagnosis+of+acute+Q+fever.">Real-time PCR with serum samples is indispensable for early diagnosis of acute Q fever.</a> Clin. Vaccine Immunol. 17 (2), 286-290 (2010).</li><li>Turra, M., Chang, G., Whybrow, D., Higgins, G., Qiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+acute+Q+fever+by+PCR+on+sera+during+a+recent+outbreak+in+rural+South+Australia.">Diagnosis of acute Q fever by PCR on sera during a recent outbreak in rural South Australia.</a> Ann. N Y Acad. Sci. 1078, 566-569 (2006).</li><li>Notomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+of+DNA.">Loop-mediated isothermal amplification of DNA.</a> Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).</li><li>Paris, D. H., Blacksell, S. D., Newton, P. N., Day, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple,+rapid+and+sensitive+detection+of+Orientia+tsutsugamushi.+by+loo-isothermal+DNA+amplification.">Simple, rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi. by loo-isothermal DNA amplification.</a> Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 102 (12), 1239-1246 (2008).</li><li>Huber, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+assay+targeting+the+47-kDa+gene+of+Orientia+tsutsugamushi.:+A+rapid+and+sensitive+alternative+to+real-time+PCR.">Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the 47-kDa gene of Orientia tsutsugamushi.: A rapid and sensitive alternative to real-time PCR.</a> J. Med. Microb. Diagn. 1 (112), (2012).</li><li>Pan, L., Zhang, L., Wang, G., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+sensitive+detection+of+the+ompB+gene+of+spotted+fever+group+rickettsiae+by+loop-mediated+isothermal+amplification.">Rapid, sensitive detection of the ompB gene of spotted fever group rickettsiae by loop-mediated isothermal amplification.</a> BMC Infect. Dis. 12 (254), (2012).</li><li>Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+by+turbidity+derived+from+magnesium+pyrophosphate+formation.">Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1), 150-154 (2001).</li><li>Qiao, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+for+rapid+detection+of+Bacillus+anthracis.spores.">Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis.spores.</a> Biotechnol. Lett. 29 (12), 1939-1946 (2007).</li><li>Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP)+of+gene+sequences+and+simple+visual+detection+of+products.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.</a> Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).</li><li>Thekisoe, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+Loop-Mediated+Isothermal+Amplification+(LAMP)+reagents+and+its+amplification+efficiency+on+crude+trypanosome+DNA+templates.">Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates.</a> J. Vet. Med. Sci. 71 (4), 471-475 (2009).</li><li>Chen, H. W., Ching, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+loop-mediated+isothermal+amplification+assays+for+rapid+and+easy+detection+of+Coxiella+Burnetii.">Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii.</a> J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+In-House+Real-Time+LAMP+Assays+with+a+Commercial+Assay+for+the+Detection+of+Pathogenic+Bacteria.">A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria.</a> Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

以前、我々は、挿入要素IS1111a 14をターゲットに高感度で特異的なLAMPアッセイを開発しました。それは非常にC.の異なる株の間で保存されているため、IS1111要素が選択されましたバーネッティと細菌中のコピーのその高い番号（110から7）（クレー2006）。我々の結果は、LAMPはコクシエラ DNAのわずか1染色体コピーに相関し得るIS1111要素の約25コピーを検出することができることを示しました。本研究では、 のBst DNAポリメラーゼ、LAMPプライマー、およびdNTPを凍結乾燥し、圧縮さアルミ箔袋に包装されます。これらの凍結乾燥試薬の感度は25コピーのまま。室温で保存された少なくとも1ヶ月間、新たに調製した試薬に似ています。アルミ箔袋が適切にそれを開く前に、密閉されていることを確認してくださいすることが非常に重要です。それが破損している場合アルミ箔袋が密閉されているかどうかのチューブを使用しないでください。これは、再水和Oを引き起こす可能性がありますその反応性の喪失をもたらす凍結乾燥試薬F。他の重要なステップは、再構成緩衝液を用いて凍結乾燥試薬の再懸濁液です。 LAMP反応は、完全に再懸濁されていない試薬で正しく動作しません。なぜなら、反応緩衝液およびトリメチルグリシン溶液の高粘度の高い塩濃度で、それらは正常のBst DNAポリメラーゼ、LAMPプライマー、およびdNTPを用いて凍結乾燥することができません。特別なステップは、これらのコンポーネントを用いて再構成バッファを用意する必要があります。潜在的LAMP反応は、低または無トリメチルグリシンとの低塩濃度で試験することができます。同一の検出感度を有するが、低塩および低トリメチルグリシン濃度の反応条件が存在する場合、凍結乾燥された試薬は、水で再構成する必要があります。これにより、反応工程を簡素化します。 最近、Wangら 15は、内12を比較しました市販等温マスターミックスキットでLAMPアッセイ - ハウスや社内アッセイは、偽陽性の結果を持っているが見つかりました。当研究室では、我々は異なる細菌の検出のためのいくつかのLAMPアッセイを開発しており、これらの社内アッセイにおいて偽陽性の結果を発見したことがありません。また、LAMP法の開発の初期段階において、アッセイは、社内で調製したマスターミックスと商品化マスターミックスの両方で試験し、有意差がアッセイ」感度および特異性は観察されませんでした。 我々の研究はまた、実験室でのクロスコンタミネーションの可能性を減少させるために反応チューブを開けることなく、LAMP産物を検出するだけでなく、結果は、ゲル電気泳動法と比較読み取る短い処理時間を持つことができるだけでなく、いくつかの方法を提示します。これらの検出方法を使用する利点は、非常に迅速にアッセイを実施し、Cと個体を診断する能力を強化しますバーネッティ </eメートル&gt;リソースが限定された地域での感染。これは、急性Q熱の迅速かつ適切な治療を可能にし、将来の慢性感染の可能性を軽減します。 サーモサイクラーが必要とされるPCRベースの方法とは異なり、60℃付近の一定温度を維持する加熱ブロック、水浴またはインキュベータは、LAMPアッセイのために必要とされるすべてです。これは、リソースが制限された設定でのアッセイは、特に適しています。オリジナルのLAMPアッセイとは異なり、 のBst DNAポリメラーゼ、LAMPプライマー、およびdNTPは、-20℃で保存する必要があります。これらの凍結乾燥された試薬は、Q熱が流行しているリソースが制限された設定のそれがさらに便利になり、室温で保存することができます。 4°C、25°C、37°C​​で凍結乾燥された試薬の長期安定性研究は現在進行中です。将来的には、凍結乾燥された試薬を用いて、このLAMPアッセイはCを検出できることを証明したいと思い同様の感度でバーネッティPCRのリモート設定インチ

小さ ​​いグラム陰性菌コクシエラバーネッティは、世界中の人獣共通感染症であり、Q熱の原因物質です。 Q熱の世界的な分布とCの高い感染へ海外展開バーネッティ 、米軍と文民要員が流行地域に感染しているの危険にさらされています。 急性および慢性の感染症：Q熱は、2つの形で現れます。急性Q熱は、インフルエンザ様症状、肝炎、または肺炎で自身を提示し、通常、低い死亡率と自己制限疾患です。慢性Q熱は、あまり普及しているが、多くの場合、1,2-放置すれば、はるかに高い死亡率を有している心内膜炎、になります。したがって、適切な治療を導くために早期診断は患者のケアのために重要です。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）および定量的リアルタイムPCR（定量PCR）アッセイは、Cを検出するために開発されています細胞培養物および臨床サンプル3-5 &lt;中バーネッティ DNA/ SUP&gt;。 PCRおよび定量PCRの両方がルーチンワークのリソースに制約のある地域でのコストがかかり、多くの場合、容易に入手できません。 もともと納富6で説明した、LAMP法（LAMP）は、代替のDNA増幅法を提供しています。 LAMPは、標的遺伝子の少なくとも6つの独立した領域を認識する特別に設計されたプライマーセットと共に、鎖置換型DNA合成のためのBst DNAポリメラーゼを使用します。 LAMPの最も重要な利点は、増幅が等温条件下で起こることです。したがって、唯一の水浴、加熱ブロックまたはインキュベータが必要です。この方法は、いくつかのリケッチア病原体7-9を検出するために使用されてきました。ゲル電気泳動により増幅されたDNA産物の可視化は、非特異的な増幅に起因する偽陽性から真陽性を区別することができる最も正確な方法です。しかし、ゲル電気泳動に関わる手順は、リソースが制限されたARのための実用的ではありませんEAS。いくつかの代替方法は、反応生成物を検出するために開発されました。このようなピロリン酸マグネシウムの形成10またはUV光11,12の下で可視化する蛍光挿入色素を使用してから派生した濁度としてこれらの代替は、ゲルを実行するよりも有利で ​​す。 Q熱が流行し13である熱帯および亜熱帯の国では、周囲温度である25℃、37℃、で保存した場合LAMP試薬は、1ヶ月間安定でした。 LAMPアッセイはCの存在を検出するために我々の研究室で開発されました血漿試料中のバーネッティ 14。ここでは、凍結乾燥試薬からLAMP反応液を調製するためのシンプルなプロトコルを記述します。室温で保存した場合、凍結乾燥試薬は、1ヶ月間安定です。簡単に可視化手法と組み合わせると、これはCを検出するために使用するのに理想的な方法であり、リソース制限の設定においてバーネッティ 。

<table><tbody><tr><td>LAMP primers</td><td>Eurofins MWG operon</td><td>10 nmol, salt free</td><td>Sequence designed by customer</td></tr><tr><td>Bst DNA polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0275L</td><td>8 units/ml</td></tr><tr><td>10x Thermo pol buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B9004S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mixture</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>10 mM each</td></tr><tr><td>Betaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0300</td><td>5 M, Trimethylglycine</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3409-1ML</td><td>1 M</td></tr><tr><td>10x Bluejuice</td><td>Invitrogen</td><td>10816-015</td><td>gel loading buffer</td></tr><tr><td>SYBR green</td><td>Invitrogen</td><td>S7585</td><td>10,000x, visualize products in tubes</td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Phenix Research Products</td><td>RGB-4103</td><td>10,000x, visualize products in gels</td></tr><tr><td>Lyophilized reagents</td><td>Gene Reach</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydroxynaphthol blue</td><td>Fluka</td><td>33936-10G</td><td></td></tr><tr><td>ESEQuant tube scanner</td><td>Qiagen</td><td></td><td>real-time detection</td></tr></tbody></table>

the development of lyophilized loop-mediated isothermal amplification reagents for the detection of coxiella burnetii

Q熱リケッチア 、Q熱を引き起こす因子は、偏性細胞内細菌です。 PCRに基づく診断アッセイは、Cを検出するために開発されています細胞培養物および臨床試料中バーネッティ DNA。 PCRは、特殊な装置や大規模なエンドユーザのトレーニングを必要とし、したがって、それは、特に、リソ​​ースに制約のある領域にルーチン作業には適していません。我々は、Cの存在を検出するためのループ媒介等温増幅（LAMP）アッセイを開発しました患者サンプル中バーネッティ 。この方法は、水浴または加熱ブロック中60℃付近の単一の温度で行われます。このLAMPアッセイの感度は、反応当たり約25コピーの検出限界を用いたPCRに非常に類似しています。このレポートでは、凍結乾燥試薬およびhydroxynaphtholブルー（HNB）または反応中の蛍光挿入色素とUVランプを使用して結果の可視化を用いて反応の調製を記載します。 LAMP試薬はlyophiliました検出感度を損なうことなくZED 1ヶ月室温（RT）で保存しました。反応混合物の調製は、複雑な工程を必要としないので、このLAMPアッセイは、特に頑強です。この方法は、Q熱が流行しているリソースが制限された設定での使用に最適です。

0.2ミリリットル管内の凍結乾燥LAMP試薬はのBst DNAポリメラーゼ、プライマー、およびdNTPが含まれています。再構成用緩衝液20μlを、凍結乾燥された試薬を再懸濁するために使用される。 図1は、新たに調製した試薬および凍結乾燥試薬を用いて、アガロースゲル上でLAMP反応結果を示します。凍結乾燥試薬は、その活性を低下させません。両方の試薬 ​​によって調製LAMP反応は、DNA鋳型の25コピーを検出することができる。 図2は、HNBまたは反応中に存在する蛍光インターカレート染料との反応生成物の検出を示します。反応にHNBの添加は、反応中に存在するDNAテンプレートの25、50および100コピーと青紫から視覚的な色の変化を生じます。反応中の蛍光インターカレート色素を含めることは、DNAテンプレートの25、50、及び100のコピーが存在するUV光で強い蛍光シグナルを示しています。チューブスキャナを使用しましたリアルタイム検出のために本研究です。このマシンは、同時に8反応を行うことができます。蛍光挿入色素の存在と、リアルタイムで蛍光シグナルを監視するために、チューブスキャナを使用して、図3に示す図 。蛍光シグナルは、反応中、14の後にベースラインを超えている18、21、及び10 6と23分、10 4、10 3、及びDNA鋳型の100コピー。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53839/53839fig1.jpg" /> 新たに調製された試薬（A）及び凍結乾燥試薬（B）とのアガロースゲル上で 図1 LAMP結果。反応混合物を60分間60℃でインキュベートしました。 （A）レーン1、100bpラダー。レーン2から3、4から7と8 - - 5、6〜9は、2.5×10 3との反応は、ある2.5×10×10 2、2.5、およびプラスミドDNAのコピーなし。 （B）レーン10から11まで、12から13まで、14から15、および16から17はレアです2.5×10 3でctions、2.5×10 2、×10 2.5、およびプラスミドDNAの0コピー。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53839/53839fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53839/53839fig2.jpg" /> 図2 の方法は、LAMP産物を検出する。HNB（A）または蛍光インターカレート染料（B）は、LAMP産物を検出するために使用しました。反応を60分間60℃で行いました。 5レーン1、0、10、25、50、およびプラスミドの100コピーとの反応。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53839/53839fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53839/53839fig3.jpg" /> 図3。 </LAMP産物の強い&gt; リアルタイム検出。反応を60分間60℃で行いました。 10 6（黒）、10 4（赤）、10 3（緑）、100（黄色）、10（青）、1（オレンジ）と0（ブラウンとライトブラウン）プラスミドのコピーとの反応。三つの検出は、独立して行きました。彼らは非常に再現性があった。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53839/53839fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

の検出のための凍結乾燥LAMP法試薬の開発<em&gt; Q熱リケッチア</em

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

the-development-lyophilized-loop-mediated-isothermal-amplification

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

10.4K ビュー.  Naval Medical Research Center. We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

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A Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many countries around the world. Severe yield losses are caused by direct feeding, and even more importantly, also by the transmission of more than 100 harmful plant pathogenic viruses. As for other invasive pests, increased international trade facilitates the dispersal of B. tabaci to areas beyond its native range. Inspections of plant import products at points of entry such as seaports and airports are, therefore, seen as an important prevention measure. However, this last line of defense against pest invasions is only effective if rapid identification methods for suspicious insect specimens are readily available. Because the morphological differentiation between the regulated B. tabaci and close relatives without quarantine status is difficult for non-taxonomists, a rapid molecular identification assay based on the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology has been developed. This publication reports the detailed protocol of the novel assay describing rapid DNA extraction, set-up of the LAMP reaction, as well as interpretation of its read-out, which allows identifying B. tabaci specimens within one hour. Compared to existing protocols for the detection of specific B. tabaci biotypes, the developed method targets the whole B. tabaci species complex in one assay. Moreover the assay is designed to be applied on-site by plant health inspectors with minimal laboratory training directly at points of entry. Thorough validation performed under laboratory and on-site conditions demonstrates that the reported LAMP assay is a rapid and reliable identification tool, improving the management of B. tabaci.

A Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

This paper reports the protocol for a rapid identification assay for Bemisia tabaci based on loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology. The protocol requires minimal laboratory training and can, therefore, be implemented on-site at points of entry for plant imports such as seaports and airports.

タバココナジラミの迅速同定のループ介在増幅法 (LAMP) アッセイ

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many ...

環境学

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

Phytophthora capsici is a devastating oomycete pathogen that affects many important solanaceous and cucurbit crops causing significant economic losses in vegetable production annually. Phytophthora capsici is soil-borne and a persistent problem in vegetable fields due to its long-lived survival structures (oospores and chlamydospores) that resist weathering and degradation. The main method of dispersal is through the production of zoospores, which are single-celled, flagellated spores that can swim through thin films of water present on surfaces or in water-filled soil pores and can accumulate in puddles and ponds. Therefore, irrigation ponds can be a source of the pathogen and initial points of disease outbreaks. Detection of P. capsici in irrigation water is difficult using traditional culture-based methods because other microorganisms present in the environment, such as Pythium spp., usually overgrow P. capsici making it undetectable. To determine the presence of P. capsici spores in water sources (irrigation water, runoff, etc.), we developed a hand pump-based filter paper (8-10 &#181;m) method that captures the pathogen&#8217;s spores (zoospores) and is later used to amplify the pathogen&#8217;s DNA through a novel loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay designed for the specific amplification of P. capsici. This method can amplify and detect DNA from a concentration as low as 1.2 x 102 zoospores/mL, which is 40 times more sensitive than conventional PCR. No cross-amplification was obtained when testing closely related species. LAMP was also performed using a colorimetric LAMP master mix dye, displaying results that could be read with the naked eye for on-site rapid detection. This protocol could be adapted to other pathogens that reside, accumulate, or are dispersed via contaminated irrigation systems.

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

We developed a method to detect Phytophthora capsici zoospores in water sources using a filter paper DNA extraction method coupled with a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay that can be analyzed in the field or in the lab.

ループ媒介等熱増幅を用いた灌漑水中フィ トフトーラカプシ の検出

Phytophthora capsici is a devastating oomycete pathogen that affects many important solanaceous and cucurbit crops causing significant economic losses in ...

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease mechanisms and may elucidate new markers to substratify disease with different clinical features and better understand pathogenesis. We have developed a highly quantitative method called Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS) for profiling patient sera antibody responses to autoantigens and pathogen antigens associated with infection. Unlike ELISAs, the highly sensitive LIPS is easily implemented to survey humoral serological response profiles to different antigens in a universal format and produces dynamic antibody titer ranges up to 6 log10 for some antigens. In these studies, quantitative profiling by LIPS of patient humoral responses against panels of antigens or even the entire proteome of some pathogens (i.e. HIV), is typically more informative than testing a single antigen by ELISA. In addition, LIPS also eliminates time and effort needed to produce highly purified antigens as well as the labor-intensive assay optimization steps needed for standard ELISAs. Here we provide a detailed protocol describing the technical aspects of performing LIPS assays for readily profiling antibody responses to single or multiple antigens.

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems LIPS

The technical aspects of performing LIPS (Luciferase Immunoprecipitation Systems) are described. The overall approach involves expressing chimeric genes encoding antigens fused to Renilla luciferase (Ruc) in mammalian cells. Crude Ruc-antigen extracts are then prepared and, without purification, employed in immunoprecipitation assays to quantify antibodies.

ルシフェラーゼ免疫系による抗体のプロファイリング（LIPS）

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease ...

生物学

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm&#8217;s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.

の種特異的検出のためのLAMP法（LAMP）アッセイ<em&gt;アイメリア</em&gt;鶏に感染する

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

免疫・感染学

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

発生とのマルチ表現型ハイコンテンツスクリーニング<em&gt; Q熱リケッチア</em&gt;トランスポゾン変異体

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

によってエフェクター転効率を検査するための蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を適用<em&gt; Q熱リケッチア</em&gt;のsiRNAサイレンシング中

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

キャピラリー配列で複数の核酸の視覚的検出

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

生物工学

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. Although mycoplasma do not usually kill contaminated cells, they are difficult to detect and can cause a variety of effects on cultured cells, including altered metabolism, slowed proliferation and chromosomal aberrations. In short, mycoplasma contamination compromises the value of those cell lines in providing accurate data for life science research.
The sources of mycoplasma contamination in the laboratory are very challenging to completely control. As certain mycoplasma species are found on human skin, they can be introduced through poor aseptic technique. Additionally, they can come from contaminated supplements such as fetal bovine serum, and most importantly from other contaminated cell cultures. Once mycoplasma contaminates a culture, it can quickly spread to contaminate other areas of the lab. Strict adherence to good laboratory practices such as good aseptic technique are key, and routine testing for mycoplasma is highly recommended for successful control of mycoplasma contamination.
PCR-based detection of mycoplasma has become a very popular method for routine cell line maintenance. PCR-based detection methods are highly sensitive and can provide rapid results, which allows researchers to respond quickly to isolate and eliminate contamination once it is detected in comparison to the time required using microbiological techniques. The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit is highly sensitive, with a detection limit of only 2 genomes per &mu;l. Taking advantage of the highly specific JumpStart Taq DNA Polymerase and a proprietary primer design, false positives are greatly reduced. The convenient 8-tube format, strips pre-coated with dNTPs, and associated primers helps increase the throughput to meet the needs of customers with larger collections of cell lines.
Given the extreme sensitivity of the kit, great care must be taken to prevent inadvertent contamination of samples and reagents. The step-by-step protocol we demonstrate highlights the precautions and practices required for reliable mycoplasma detection. We also show and discuss typical results and their interpretation. Our goal is to ensure the success of researchers using the LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit.

The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit utilizes the polymerase chain reaction (PCR), which is established as the method of choice for highest sensitivity in the detection of Mycoplasma, Acholeplasma, and Ureaplasma contamination in cell cultures and other cell culture derived biologicals.

マイコプラズマの最適化されたPCRベースの検出

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

等温増幅法を用いたヒト呼吸器細菌感染症診断

Rapid Detection of Bacterial Pathogens Causing Lower Respiratory Tract Infections via Microfluidic-Chip-Based Loop-Mediated Isothermal Amplification

Respiratory tract infections (RTIs) are among the most common problems in clinical settings. Rapid and accurate identification of bacterial pathogens will provide practical guidelines for managing and treating RTIs. This study describes a method for rapidly detecting bacterial pathogens that cause respiratory tract infections via multi-channel loop-mediated isothermal amplification (LAMP). LAMP is a sensitive and specific diagnostic tool that rapidly detects bacterial nucleic acids with high accuracy and reliability. The proposed method offers a significant advantage over traditional bacterial culturing methods, which are time-consuming and often require greater sensitivity for detecting low levels of bacterial nucleic acids. This article presents representative results of K. pneumoniae infection and its multiple co-infections using LAMP to detect samples (sputum, bronchial lavage fluid, and alveolar lavage fluid) from the lower respiratory tract. In summary, the multi-channel LAMP method provides a rapid and efficient means of identifying single and multiple bacterial pathogens in clinical samples, which can help prevent the spread of bacterial pathogens and aid in the appropriate treatment of RTIs.

著者スポットライト:マイクロ流体チップを使用した呼吸器病原体の迅速な検出の進歩 

Various bacterial pathogens can cause respiratory tract infections and lead to serious health issues if not detected accurately and treated promptly. Rapid and accurate detection of these pathogens via&#160;loop-mediated isothermal amplification provides effective management and control of respiratory tract infections in clinical settings.

マイクロ流体チップベースのループ媒介等温増幅による下気道感染症を引き起こす細菌性病原体の迅速な検出

Respiratory tract infections (RTIs) are among the most common problems in clinical settings. Rapid and accurate identification of bacterial pathogens will ...

の検出のための凍結乾燥LAMP法試薬の開発

要約

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タバココナジラミの迅速同定のループ介在増幅法 (LAMP) アッセイ

ループ媒介等熱増幅を用いた灌漑水中フィトフトーラカプシの検出

ルシフェラーゼ免疫系による抗体のプロファイリング（LIPS）

の種特異的検出のためのLAMP法（LAMP）アッセイ

発生とのマルチ表現型ハイコンテンツスクリーニング

によってエフェクター転効率を検査するための蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を適用

キャピラリー配列で複数の核酸の視覚的検出

マイコプラズマの最適化されたPCRベースの検出

マイクロ流体チップベースのループ媒介等温増幅による下気道感染症を引き起こす細菌性病原体の迅速な検出

マイクロ流体チップベースのループ媒介等温増幅による下気道感染症を引き起こす細菌性病原体の迅速な検出

の検出のための凍結乾燥LAMP法試薬の開発

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タバココナジラミの迅速同定のループ介在増幅法 (LAMP) アッセイ

ループ媒介等熱増幅を用いた灌漑水中フィ トフトーラカプシ の検出

ルシフェラーゼ免疫系による抗体のプロファイリング（LIPS）

の種特異的検出のためのLAMP法（LAMP）アッセイ

発生とのマルチ表現型ハイコンテンツスクリーニング

によってエフェクター転効率を検査するための蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を適用

キャピラリー配列で複数の核酸の視覚的検出

マイコプラズマの最適化されたPCRベースの検出

マイクロ流体チップベースのループ媒介等温増幅による下気道感染症を引き起こす細菌性病原体の迅速な検出

マイクロ流体チップベースのループ媒介等温増幅による下気道感染症を引き起こす細菌性病原体の迅速な検出

ループ媒介等熱増幅を用いた灌漑水中フィトフトーラカプシの検出