Diese Forschung wurde von Naval Medical Research Center, Forschung Arbeitseinheit 6000.RAD1.J.A0310 unterstützt. Die in diesem Artikel sind die der Autoren und geben nicht unbedingt die offizielle Politik oder Position des Department of the Navy, Department of Defense, oder der US-Regierung widerspiegeln. Wei-Mei Ching ist ein Mitarbeiter der US-Regierung. Diese Arbeit wurde im Rahmen ihrer offiziellen Aufgaben vorbereitet. Titel 17 USC § 105 heißt es: &quot;Der Urheberrechtsschutz unter diesem Titel für jede Arbeit der Regierung der Vereinigten Staaten nicht zur Verfügung steht.&quot; Titel 17 USC §101 definiert eine US-Regierung Arbeit als Arbeit, die durch Militärdienst Mitglied oder Mitarbeiter der US-Regierung als Teil der Person durch Amtspflichten.

1. Bereiten Sie Plasmid-DNA Verdünnungen als Standard für den LAMP-Reaktion <ol><li> Verwenden eines Spektrophotometers die optische Dichte (OD) bei 260 nm zu messen , um das Plasmid (enthaltend Zielgen IS1111a von C. burnetii RSA 493) DNA - Konzentration zu bestimmen. Eine OD 260 von 1 entspricht 50 ug / ul DNA. </li><li> Konvertieren Sie die Menge von Plasmid-DNA in die Kopienzahl. Da die Größe des Plasmids 6330 bp ist, ist das Molekulargewicht dieses Plasmids 4,1 x 10 6 g (6.330 bp x 649 g / bp). Die DNA-Konzentration des Plasmids ist 34,2 ng / &amp; mgr; l (wie in Schritt bestimmt 1.1). 1 &amp; mgr; l dieser DNA - Probe enthält 34,2 ng Plasmid - DNA, zu gleich 5 x 10 9 Kopien (34,2 x 10 -9 g / 4,1 x 10 6 6,02 x 10 gx 23) von DNA. </li><li> Zugabe von 10 &amp; mgr; l Plasmid - DNA (5 x 10 9 Kopien / ul) und 90 ul Wasser für eine 10-fache Verdünnung einer DNA - Probe von 5 x 10 8 Kopien zu erstellen / ul. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.3 zur Herstellung von DNA - Proben von 5 x 10 7, 5 x 10 6, 5 x 10 5, 5 x 10 4, 5 × 10 3, 5 x 10 2, 5 x 10 1 und 5 x 10 0 Kopien / ul. </li></ol> 2. Bereiten Sie DNA-Vorlage von Proben für die LAMP-Reaktion <ol><li> Führen DNA Extraktion aus Humanplasmaproben Kommerzielle DNA Mini Kit nach Herstellerprotokoll. Verwenden Sie eine Gesamtmenge von 200 ul Probe für die Extraktion und Elution extrahierten DNA in einem 20 &amp; mgr; l Volumen. </li></ol> 3. Bereiten Sie 2x LAMP-Reaktionspuffer <ol><li> Mischen Sie 200 ul 10x Pol Buffer, 320 ul 5 M Trimethylglycin, 12 ul 1 M MgSO 4, 280 &amp; mgr; l dNTP - Gemisch (jeweils 10 mM) und 188 ul Wasser zur Herstellung von 1 ml 2x LAMP - Puffer. Mix von Puls-Verwirbelung für 10 Sekunden. </li></ol> 4. Führen Sie Standard-LAMP-Reaktion <ol><li> Mix 12,5 ul 2x LAMP - Puffer (wie in Schritt 3 hergestellt; 40 mM Tris-HCl (pH 8,8), 20 mM KCl, 16 mM MgSO 4, 20 mM (NH 4) 2 SO 4, 0,2% Triton X-100, 1,6 M Trimethylglycin, 1.4 mM dNTP - Gemisch), 1,2 &amp; mgr; l Primer - Mix, 1 &amp; mgr; l Bst DNA - Polymerase (8 U / ul) und 5,3 ul Wasser Reaktionsmischung (20 ul) in einem 0,2 ml PCR - Röhrchen zu bilden. </li><li> Zugabe von 5 &amp; mgr; l DNA (aus Schritt 1 oder 2) in die 20 &amp; mgr; l Reaktionsgemisch und gut mischen. </li><li> Schließen Rohr und für 60 min in einem Wasserbad oder Heizblock bei 60 ° C inkubiert. Dies ist die optimale Reaktionstemperatur zuvor bestimmt. </li><li> In 5 ul 10x Gelladepuffer, um die Reaktion zu beenden. </li><li> Last 5 &amp; mgr; l Reaktionsprodukte zu einem 2% Agarosegel, gefärbt mit stain Nukleinsäure interkalierende. </li><li> Führen Gel bei 100 V für 35 min in 1x TBE-Puffer. </li><li> Visualisieren Sie die Ergebnisse durch UV-Licht. </li></ol> 5. Führen Sie LAMP Reaktion mit RekonstituiertesReagenzien <ol><li> Mischen Sie 125 ul von 10x Pol Puffer, 200 &amp; mgr; l von 5 M Trimethylglycin, 7,5 ul 1 M MgSO 4, 667,5 ul Wasser zur Herstellung von 1 ml Rekonstitution Puffer. Mix von Puls-Verwirbelung für 10 Sekunden. </li><li> Entfernen Sie Rohre, die die lyophilisierten Reagenzien aus dem versiegelten Aluminiumfolienbeutel enthalten. Sie nicht die Rohre verwenden, wenn die Aluminiumfolienbeutel nicht abgedichtet ist, oder wenn es beschädigt ist. </li><li> In 20 ul Rekonstitution Puffer in jedes Röhrchen lyophilisierten Reagenzien erneut zu suspendieren. </li><li> Mischen durch Pipettieren Puffer nach oben und unten 5-mal. Werfen Sie einen Blick um sicherzustellen, dass die lyophilisierten Reagenzien komplett neu aufgehängt sind. Das weiße Pulver sollte in der Röhre verschwinden. </li><li> In 5 ul DNA-Template (aus Schritt 1 oder 2) zu den rekonstituierten Reagenzien und gut mischen. </li><li> Schließen Rohr und für 60 min in einem Wasserbad oder Heizblock bei 60 ° C inkubiert. </li><li> In 5 ul 10x Gelladepuffer, um die Reaktion zu beenden. </li><li> Last 5 ul ReaktionsProdukte einem 2% Agarosegel, gefärbt mit Nukleinsäure interkalierende stain. </li><li> Führen Gel bei 100 V für 35 min in 1x TBE-Puffer. </li><li> Visualisieren Sie die Ergebnisse durch UV-Licht. </li></ol> 6. Führen Sie LAMP Reaktion mit Rekonstitution Puffer, der HNB oder Fluorescent interkalierende Farbstoff <ol><li> Mischungs 125 ul 10fach Pol Puffer, 200 &amp; mgr; l von 5 M Trimethylglycin, 7,5 ul 1 M MgSO 4, 7,5 ul 20 mM HNB (oder 12,5 &amp; mgr; l 100x fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff) und 660 ul (oder 655 &amp; mgr; l) Wasser machen 1 ml Rekonstitution Puffer. Mix von Puls-Verwirbelung für 10 Sekunden. </li><li> Verwenden Sie das aufgelöste Puffer in Abschnitt 6 hergestellt, die Schritte 5.2 zu wiederholen - 5.6. </li><li> Visualisieren Sie die Ergebnisse mit dem bloßen Auge (Reaktion, die HNB) oder einem UV-Licht (Reaktion fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff enthält). </li></ol> Führen 7. Echtzeit-LAMP-Reaktion mit Rohr Scanner <ol><li> In 5 ul DNA an die reconstituted Reagenzien fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff, in der Nähe Rohr und legen Sie es auf das Rohr Scanner enthält. </li><li> Eingestellt Inkubationstemperatur auf 60 ° C. Messen der Fluoreszenz bei 520 nm für 60 min. </li></ol>

<ol>
	<li>Anderson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+Q+fever+United+States,+2013:+recommendations+from+CDC+and+the+Q+Fever+Working+Group.">Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group.</a> MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).</li><li>Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+ratio+of+serum+doxycycline+concentration+to+MIC+and+rapid+decline+of+antibody+levels+during+treatment+of+Q+fever+endocarditis.">Correlation between ratio of serum doxycycline concentration to MIC and rapid decline of antibody levels during treatment of Q fever endocarditis.</a> Antimicrob. Agents and Chemother. 49 (7), 2673-2676 (2005).</li><li>Fournier, P. E., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+PCR+and+serology+assays+for+early+diagnosis+of+acute+Q+fever.">Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever.</a> J. Clin. Microbiol. 41 (11), 5094-5098 (2003).</li><li>Schneeberger, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+with+serum+samples+is+indispensable+for+early+diagnosis+of+acute+Q+fever.">Real-time PCR with serum samples is indispensable for early diagnosis of acute Q fever.</a> Clin. Vaccine Immunol. 17 (2), 286-290 (2010).</li><li>Turra, M., Chang, G., Whybrow, D., Higgins, G., Qiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+acute+Q+fever+by+PCR+on+sera+during+a+recent+outbreak+in+rural+South+Australia.">Diagnosis of acute Q fever by PCR on sera during a recent outbreak in rural South Australia.</a> Ann. N Y Acad. Sci. 1078, 566-569 (2006).</li><li>Notomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+of+DNA.">Loop-mediated isothermal amplification of DNA.</a> Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).</li><li>Paris, D. H., Blacksell, S. D., Newton, P. N., Day, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple,+rapid+and+sensitive+detection+of+Orientia+tsutsugamushi.+by+loo-isothermal+DNA+amplification.">Simple, rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi. by loo-isothermal DNA amplification.</a> Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 102 (12), 1239-1246 (2008).</li><li>Huber, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+assay+targeting+the+47-kDa+gene+of+Orientia+tsutsugamushi.:+A+rapid+and+sensitive+alternative+to+real-time+PCR.">Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the 47-kDa gene of Orientia tsutsugamushi.: A rapid and sensitive alternative to real-time PCR.</a> J. Med. Microb. Diagn. 1 (112), (2012).</li><li>Pan, L., Zhang, L., Wang, G., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+sensitive+detection+of+the+ompB+gene+of+spotted+fever+group+rickettsiae+by+loop-mediated+isothermal+amplification.">Rapid, sensitive detection of the ompB gene of spotted fever group rickettsiae by loop-mediated isothermal amplification.</a> BMC Infect. Dis. 12 (254), (2012).</li><li>Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+by+turbidity+derived+from+magnesium+pyrophosphate+formation.">Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1), 150-154 (2001).</li><li>Qiao, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+for+rapid+detection+of+Bacillus+anthracis.spores.">Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis.spores.</a> Biotechnol. Lett. 29 (12), 1939-1946 (2007).</li><li>Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP)+of+gene+sequences+and+simple+visual+detection+of+products.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.</a> Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).</li><li>Thekisoe, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+Loop-Mediated+Isothermal+Amplification+(LAMP)+reagents+and+its+amplification+efficiency+on+crude+trypanosome+DNA+templates.">Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates.</a> J. Vet. Med. Sci. 71 (4), 471-475 (2009).</li><li>Chen, H. W., Ching, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+loop-mediated+isothermal+amplification+assays+for+rapid+and+easy+detection+of+Coxiella+Burnetii.">Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii.</a> J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+In-House+Real-Time+LAMP+Assays+with+a+Commercial+Assay+for+the+Detection+of+Pathogenic+Bacteria.">A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria.</a> Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Bisher haben wir eine empfindliche und spezifische LAMP - Targeting - Assay das Einsatzelement IS1111a 14. Das IS1111 Element wurde ausgewählt , weil es stark unter den verschiedenen Stämmen von C. konserviert burnetii und die hohe Anzahl der Kopien (7-110) in den Bakterien (Klee 2006). Unsere Ergebnisse zeigten , dass LAMP können etwa 25 Kopien des IS1111 Element erkennen, die so wenig wie eine chromosomale Kopie von Coxiella DNA korrelieren. In dieser Studie, Bst - DNA - Polymerase, LAMP Primer und dNTPs wurden in einem Reißverschlussaluminiumfolienbeutel gefriergetrocknet und verpackt. Die Empfindlichkeit dieser lyophilisierten Reagenzien bleibt bei 25 Kopien; ähnlich wie die frisch mindestens einem Monat hergestellten Reagenzien zur wenn bei RT gelagert. Es ist sehr wichtig, die Aluminiumfolie Tasche, um sicherzustellen, ordnungsgemäß vor dem Öffnen verschlossen ist. Sie nicht die Rohre verwenden, wenn die Aluminiumfolienbeutel nicht abgedichtet ist, oder wenn es beschädigt ist. Dies kann die Rehydrierung o verursachenf die lyophilisierte Reagenzien, die zum Verlust seiner Reaktivität führt. Der andere kritische Schritt ist die Resuspension der lyophilisierten Reagenzien mit Rekonstitutionspuffer. Die LAMP-Reaktion wird nicht richtig mit Reagenzien arbeiten, die nicht vollständig wieder suspendiert. Wegen der hohen Salzkonzentration des Reaktionspuffers und eine hohe Viskosität der Lösung , Trimethylglycin, können sie nicht erfolgreich mit Bst DNA - Polymerase, LAMP - Primer, dNTPs und lyophilisiert werden. Ein besonderer Schritt ist erforderlich, um die Rekonstitution Puffer mit diesen Komponenten herzustellen. Potenziell kann die LAMP-Reaktion bei niedrigen Salzkonzentrationen mit geringer oder keiner Trimethylglycin getestet werden. Wenn es eine Reaktionsbedingung ist, die die gleiche Nachweisempfindlichkeit, aber mit niedrigen Salz und niedrige Trimethylglycin Konzentration hat, muss das gefriergetrocknete Reagenz nur mit Wasser anrühren werden. Dies wird die Reaktionsschritte zu vereinfachen. Vor kurzem al Wang et. 15 verglichen zwölf in-Haus LAMP-Assays mit der kommerzialisierten isothermen Master Mix Kit und fand die in-house-Tests haben falsch-positive Ergebnisse. In unserem Labor haben wir mehrere LAMP-Assays für den Nachweis verschiedener Bakterien entwickelt und nie falsch-positiven Ergebnissen in diesen in-house-Assays gefunden. Ferner wird in der Anfangsphase der Entwicklung des LAMP-Verfahren wurden die Tests getestet mit sowohl im Haus vorbereitet Master-Mix und kommerzialisiert Master-Mix und es wurde kein Unterschied in den Tests &quot;Sensitivität und Spezifität beobachtet. Unsere Studie zeigt auch mehrere Methoden, die nicht nur die LAMP Produkte ohne Öffnen der Reaktionsgefäße erkennen kann, die Wahrscheinlichkeit von Laborkreuzkontamination zu verringern, sondern haben auch eine kürzere Prozesszeit führt zu Gelelektrophorese Methode vergleichen, um zu lesen. Der Vorteil dieser Nachweismethoden verwendet , wird unsere Fähigkeit , erheblich verbessern , um schnell den Assay durchzuführen , und eine Person mit C. diagnostizieren burnetii </em&gt; Infektion in begrenzten Ressource-Bereiche. Dies wird eine schnelle und angemessene Behandlung von akuten Q-Fieber ermöglichen und das Potenzial der Zukunft eine chronische Infektion zu verringern. Im Gegensatz zu PCR-basierten Verfahren, bei denen ein Thermocycler erforderlich ist, einem Heizblock, Wasserbad oder Inkubator eine konstante Temperatur von etwa 60 ° C gehalten ist alles, was für das LAMP-Assay erforderlich ist. Dies macht den Test besonders geeignet in begrenzten Ressource-Einstellung. Im Gegensatz zum ursprünglichen LAMP - Assay, Bst DNA - Polymerase, LAMP - Primer, dNTPs und müssen bei -20 ° C gelagert werden. Diese lyophilisierten Reagenzien können bei Raumtemperatur gelagert werden, die es noch nützlicher für einen begrenzten Ressource-Einstellung macht, wo Q-Fieber endemisch ist. Die Langzeit-Stabilitätsstudie der lyophilisierten Reagenzien bei 4 ° C, 25 ° C und 37 ° C ist derzeit im Gange. In Zukunft möchten wir zeigen, dass dieser LAMP - Test gefriergetrocknet unter Verwendung von Reagenzien C. erkennen kann burnetii mit Empfindlichkeit ähnlich dervon PCR in einer Remote-Umgebung.

Die kleine Gram-negative Bakterium Coxiella burnetii ist der Erreger des Q - Fiebers, das ein weltweit Zoonose ist. Durch den weltweiten Vertrieb von Q - Fieber und die hohe Infektiosität von C. burnetii, US - Militär- und Zivilpersonal im Ausland im Einsatz sind in Gefahr, in den Endemiegebieten infiziert. Q-Fieber manifestiert sich in zwei Formen: akute und chronische Infektionen. Akute Q-Fieber präsentiert sich mit grippeähnlichen Symptomen, Hepatitis oder Pneumonie, und ist in der Regel eine selbstlimitierend Krankheit mit einer niedrigen Sterblichkeit. Chronische Q-Fieber, während weniger verbreitet, führt oft zu Endokarditis, die eine viel höhere Mortalitätsrate hat , wenn 1,2 unbehandelt. Daher ist eine frühzeitige Diagnose führen eine geeignete Behandlung für die Patientenversorgung kritisch ist. Polymerase - Kettenreaktion (PCR) und quantitative Echtzeit - PCR (qPCR) Assays wurden zum Nachweis von C. entwickelt burnetii DNA in Zellkulturen und klinische Proben 3-5 &lt;/ Sup&gt;. Beide PCR und qPCR sind teuer und oft nicht ohne weiteres verfügbar in ressourcenbeschränkte Bereiche für die Routinearbeit. Ursprünglich von Notomi 6 beschrieben, Loop-vermittelte isothermen Amplifikation (LAMP) bietet eine alternative DNA - Verstärkungsverfahren. LAMP verwendet Bst DNA - Polymerase zusammen mit speziell entwickelten Primer - Sets Verschiebung DNA Synthese Strang, der mindestens sechs unabhängigen Regionen des Zielgens zu erkennen. Der signifikanteste Vorteil ist, dass LAMP-Amplifikation unter isothermischen Bedingungen auftritt. Daher ist nur ein Wasserbad, Heizblock oder ein Inkubator ist nicht erforderlich. Dieses Verfahren wurde verwendet 7-9 verschiedene rickettsial Pathogene zu erkennen. Visualisierung von amplifizierte DNA-Produkte durch Gelelektrophorese ist die genaueste Methode, die wahren Positiven von Fehlalarme aufgrund unspezifischer Amplifikation unterscheiden kann. Jedoch sind die in der Gelelektrophorese angewandten Verfahren nicht praktikabel für begrenzten Ressource-areas. Es wurden verschiedene alternative Verfahren entwickelt, um die Reaktionsprodukte zu detektieren. Diese alternativen, wie Trübung , abgeleitet von Magnesiumpyrophosphat Formation 10 oder unter Verwendung eines fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff unter UV - Licht visualisiert werden 11,12 sind günstiger als ein Gel läuft. Die LAMP - Reagenzien waren einen Monat lang stabil , wenn sie bei 25 ° C und 37 ° C gelagert, die sind Umgebungstemperaturen in tropischen und subtropischen Ländern , in denen Q - Fieber endemisch 13 ist. Ein LAMP - Assay wurde in unserem Labor entwickelt , um das Vorhandensein von C. zu erkennen burnetii in Plasmaproben 14. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die Herstellung der LAMP Reaktionsmischung aus dem lyophilisierten Reagenzien. Die lyophilisierten Reagenzien sind stabil für einen Monat, wenn bei RT gelagert. Wenn sie mit einem einfachen Visualisierungsverfahren kombiniert werden , ist dies eine ideale Methode zum Nachweis C. verwenden burnetii in einer begrenzten Ressource-Einstellung.

<table><tbody><tr><td>LAMP primers</td><td>Eurofins MWG operon</td><td>10 nmol, salt free</td><td>Sequence designed by customer</td></tr><tr><td>Bst DNA polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0275L</td><td>8 units/ml</td></tr><tr><td>10x Thermo pol buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B9004S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mixture</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>10 mM each</td></tr><tr><td>Betaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0300</td><td>5 M, Trimethylglycine</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3409-1ML</td><td>1 M</td></tr><tr><td>10x Bluejuice</td><td>Invitrogen</td><td>10816-015</td><td>gel loading buffer</td></tr><tr><td>SYBR green</td><td>Invitrogen</td><td>S7585</td><td>10,000x, visualize products in tubes</td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Phenix Research Products</td><td>RGB-4103</td><td>10,000x, visualize products in gels</td></tr><tr><td>Lyophilized reagents</td><td>Gene Reach</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydroxynaphthol blue</td><td>Fluka</td><td>33936-10G</td><td></td></tr><tr><td>ESEQuant tube scanner</td><td>Qiagen</td><td></td><td>real-time detection</td></tr></tbody></table>

the development of lyophilized loop-mediated isothermal amplification reagents for the detection of coxiella burnetii

Coxiella burnetii, der Agent Q - Fieber verursacht, ist ein obligat intrazelluläres Bakterium. PCR - basierten diagnostischen Assays wurden zum Nachweis von C. entwickelt burnetii DNA in Zellkulturen und klinischen Proben. PCR erfordert spezielle Ausrüstung und umfassende Schulung von Endanwendern, und daher ist es für Routinearbeiten vor allem in einem ressourcenbeschränkte Bereich nicht geeignet. Wir haben eine loop-vermittelte isothermische Amplifikation (LAMP) Assay entwickelt , um die Anwesenheit von C. nachzuweisen burnetii in Patientenproben. Dieses Verfahren wird bei einer einzigen Temperatur etwa 60 ° C in einem Wasserbad oder Heizblock durchgeführt. Die Empfindlichkeit dieses LAMP-Test ist sehr ähnlich wie PCR mit einer Nachweisgrenze von etwa 25 Kopien pro Reaktion. Dieser Bericht beschreibt die Herstellung der Reaktion lyophilisierten Reagenzien und Visualisierung der Ergebnisse mit hydroxynaphthol blau (HNB) oder einer UV-Lampe mit fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff in der Reaktion verwendet wird. Die LAMP-Reagenzien waren lyophilized und bei Raumtemperatur (RT) einen Monat lang ohne Verlust der Detektionsempfindlichkeit gespeichert. Diese LAMP-Test ist besonders robust, da die Reaktionsgemischaufbereitung nicht komplexe Schritte beinhaltet. Diese Methode ist ideal für den Einsatz in begrenzten Ressource-Einstellungen, wo Q-Fieber endemisch ist.

Die lyophilisierten LAMP Reagenzien innerhalb der 0,2 - ml - Röhrchen enthält Bst DNA - Polymerase, Primer und dNTPs. 20 ul Rekonstitution Puffer wird verwendet , die lyophilisierten Reagenzien erneut zu suspendieren. Abbildung 1 zeigt die LAMP Reaktion führt auf Agarosegelen mit frisch zubereiteten Reagenzien und gefriergetrocknet Reagenzien. Das gefriergetrocknete Reagenz verringert nicht seine Aktivität. LAMP Reaktionen von beiden Reagenzien hergestellt werden , können 25 Kopien der DNA - Matrize zu erkennen. 2 zeigt den Nachweis der Reaktionsprodukte mit HNB oder fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff in der Reaktion. Zugabe von HNB zur Reaktion erzeugt eine visuelle Farbveränderung von violett nach blau mit 25, 50 und 100 Kopien der DNA-Matrize, die in den Reaktionen. Die Aufnahme von fluoreszierenden interkalierenden Farbstoffs in der Reaktions zeigt eine starke Fluoreszenzsignal mit UV-Licht bei 25, 50 und 100 Kopien von DNA-Matrizen vorhanden sind. Ein Rohr Scanner wurde verwendet,in dieser Studie für die Echtzeit-Detektion. Diese Maschine kann 8 Reaktionen gleichzeitig durchführen. Abbildung 3 zeigt die Röhre Scanner mit Hilfe der Fluoreszenzsignale in Echtzeit mit fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff Präsenz zu überwachen. Die Fluoreszenzsignale werden über der Grundlinie nach 14, 18, ​​21 und 23 min mit 10 6, 10 4, 10 3 und 100 Kopien der DNA - Matrize in den Reaktionen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53839/53839fig1.jpg" /> Abbildung 1. LAMP Ergebnisse auf Agarose - Gel mit frisch hergestelltem Reagenzien (A) und gefriergetrocknet Reagenzien (B). Die Reaktionsmischungen wurden 60 min bei 60 ° C inkubiert. (A) Spur 1, 100 bp - Leiter; Spur 2 - 3, 4 - 5, 6 - 7 und 8 - 9 sind Umsetzungen mit 2,5 × 10 3, 2,5 × 10 2, 2,5 x 10 und keine Kopien der Plasmid - DNA. (B) Lane 10 - 11, 12 - 13, 14 - 15 und 16 - 17 sind reactions mit 2,5 × 10 3, 2,5 × 10 2, 2,5 x 10 und 0 Kopien von Plasmid - DNA. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53839/53839fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53839/53839fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53839/53839fig2.jpg" /> Abbildung 2. Methoden zur LAMP Produkte erkennen. HNB (A) oder fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff (B) wurden verwendet , LAMP Produkte zu erkennen. Die Reaktionen wurden für 60 min bei 60 ° C durchgeführt. Bahn 1 bis 5, Reaktionen mit 0, 10, 25, 50 und 100 Kopien von Plasmid. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53839/53839fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53839/53839fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53839/53839fig3.jpg" /> Abbildung 3. </strong&gt; Echtzeit - Erkennung von LAMP - Produkte. Die Reaktionen wurden für 60 min bei 60 ° C durchgeführt. Reaktionen mit 10 6 (schwarz), 10 4 (rot), 10 3 (grün), 100 (gelb), 10 (blau), 1 (orange) und 0 (braun und hellbraun) Kopien von Plasmid. Drei Erfassungen wurden unabhängig voneinander durchgeführt. Sie waren sehr gut reproduzierbar. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53839/53839fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53839/53839fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii at JoVE.com

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Die Entwicklung der Lyophilisierte Loop-mediated Isothermal Amplification Reagenzien zum Nachweis von<em&gt; Coxiella burnetii</em

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

the-development-lyophilized-loop-mediated-isothermal-amplification

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

10.4K Aufrufe.  Naval Medical Research Center. We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Serie: The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

A Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many countries around the world. Severe yield losses are caused by direct feeding, and even more importantly, also by the transmission of more than 100 harmful plant pathogenic viruses. As for other invasive pests, increased international trade facilitates the dispersal of B. tabaci to areas beyond its native range. Inspections of plant import products at points of entry such as seaports and airports are, therefore, seen as an important prevention measure. However, this last line of defense against pest invasions is only effective if rapid identification methods for suspicious insect specimens are readily available. Because the morphological differentiation between the regulated B. tabaci and close relatives without quarantine status is difficult for non-taxonomists, a rapid molecular identification assay based on the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology has been developed. This publication reports the detailed protocol of the novel assay describing rapid DNA extraction, set-up of the LAMP reaction, as well as interpretation of its read-out, which allows identifying B. tabaci specimens within one hour. Compared to existing protocols for the detection of specific B. tabaci biotypes, the developed method targets the whole B. tabaci species complex in one assay. Moreover the assay is designed to be applied on-site by plant health inspectors with minimal laboratory training directly at points of entry. Thorough validation performed under laboratory and on-site conditions demonstrates that the reported LAMP assay is a rapid and reliable identification tool, improving the management of B. tabaci.

A Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

This paper reports the protocol for a rapid identification assay for Bemisia tabaci based on loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology. The protocol requires minimal laboratory training and can, therefore, be implemented on-site at points of entry for plant imports such as seaports and airports.

Ein Loop-vermittelten isothermen Verstärkung (Lampe) Assay für schnelle Identifizierung von Tabak tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many ...

Forschung

Umwelt

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

Phytophthora capsici is a devastating oomycete pathogen that affects many important solanaceous and cucurbit crops causing significant economic losses in vegetable production annually. Phytophthora capsici is soil-borne and a persistent problem in vegetable fields due to its long-lived survival structures (oospores and chlamydospores) that resist weathering and degradation. The main method of dispersal is through the production of zoospores, which are single-celled, flagellated spores that can swim through thin films of water present on surfaces or in water-filled soil pores and can accumulate in puddles and ponds. Therefore, irrigation ponds can be a source of the pathogen and initial points of disease outbreaks. Detection of P. capsici in irrigation water is difficult using traditional culture-based methods because other microorganisms present in the environment, such as Pythium spp., usually overgrow P. capsici making it undetectable. To determine the presence of P. capsici spores in water sources (irrigation water, runoff, etc.), we developed a hand pump-based filter paper (8-10 &#181;m) method that captures the pathogen&#8217;s spores (zoospores) and is later used to amplify the pathogen&#8217;s DNA through a novel loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay designed for the specific amplification of P. capsici. This method can amplify and detect DNA from a concentration as low as 1.2 x 102 zoospores/mL, which is 40 times more sensitive than conventional PCR. No cross-amplification was obtained when testing closely related species. LAMP was also performed using a colorimetric LAMP master mix dye, displaying results that could be read with the naked eye for on-site rapid detection. This protocol could be adapted to other pathogens that reside, accumulate, or are dispersed via contaminated irrigation systems.

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

We developed a method to detect Phytophthora capsici zoospores in water sources using a filter paper DNA extraction method coupled with a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay that can be analyzed in the field or in the lab.

Nachweis von Phytophthora capsici im Bewässerungswasser mit Loop-Mediad Isothermale Amplifikation

Phytophthora capsici is a devastating oomycete pathogen that affects many important solanaceous and cucurbit crops causing significant economic losses in ...

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease mechanisms and may elucidate new markers to substratify disease with different clinical features and better understand pathogenesis. We have developed a highly quantitative method called Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS) for profiling patient sera antibody responses to autoantigens and pathogen antigens associated with infection. Unlike ELISAs, the highly sensitive LIPS is easily implemented to survey humoral serological response profiles to different antigens in a universal format and produces dynamic antibody titer ranges up to 6 log10 for some antigens. In these studies, quantitative profiling by LIPS of patient humoral responses against panels of antigens or even the entire proteome of some pathogens (i.e. HIV), is typically more informative than testing a single antigen by ELISA. In addition, LIPS also eliminates time and effort needed to produce highly purified antigens as well as the labor-intensive assay optimization steps needed for standard ELISAs. Here we provide a detailed protocol describing the technical aspects of performing LIPS assays for readily profiling antibody responses to single or multiple antigens.

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems LIPS

The technical aspects of performing LIPS (Luciferase Immunoprecipitation Systems) are described. The overall approach involves expressing chimeric genes encoding antigens fused to Renilla luciferase (Ruc) in mammalian cells. Crude Ruc-antigen extracts are then prepared and, without purification, employed in immunoprecipitation assays to quantify antibodies.

Antikörper Profiling von Luciferase Immunpräzipitation Systems (LIPS)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease ...

Biologie

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm&#8217;s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.

Loop-vermittelte isothermen Amplifikation (LAMP) Assays für die artspezifischen Nachweis von<em&gt; Eimeria</em&gt;, Die Hühner infizieren

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Immunologie und Infektion

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Generation und Multi-phänotypischen High-Content-Screening<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon-Mutanten

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

Anwenden von Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) zu untersuchen Effektor Translokation Effizienz durch<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Während siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

Visuelle Erkennung von mehreren Nukleinsäuren in einem Kapillar Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Biotechnik

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. Although mycoplasma do not usually kill contaminated cells, they are difficult to detect and can cause a variety of effects on cultured cells, including altered metabolism, slowed proliferation and chromosomal aberrations. In short, mycoplasma contamination compromises the value of those cell lines in providing accurate data for life science research.
The sources of mycoplasma contamination in the laboratory are very challenging to completely control. As certain mycoplasma species are found on human skin, they can be introduced through poor aseptic technique. Additionally, they can come from contaminated supplements such as fetal bovine serum, and most importantly from other contaminated cell cultures. Once mycoplasma contaminates a culture, it can quickly spread to contaminate other areas of the lab. Strict adherence to good laboratory practices such as good aseptic technique are key, and routine testing for mycoplasma is highly recommended for successful control of mycoplasma contamination.
PCR-based detection of mycoplasma has become a very popular method for routine cell line maintenance. PCR-based detection methods are highly sensitive and can provide rapid results, which allows researchers to respond quickly to isolate and eliminate contamination once it is detected in comparison to the time required using microbiological techniques. The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit is highly sensitive, with a detection limit of only 2 genomes per &mu;l. Taking advantage of the highly specific JumpStart Taq DNA Polymerase and a proprietary primer design, false positives are greatly reduced. The convenient 8-tube format, strips pre-coated with dNTPs, and associated primers helps increase the throughput to meet the needs of customers with larger collections of cell lines.
Given the extreme sensitivity of the kit, great care must be taken to prevent inadvertent contamination of samples and reagents. The step-by-step protocol we demonstrate highlights the precautions and practices required for reliable mycoplasma detection. We also show and discuss typical results and their interpretation. Our goal is to ensure the success of researchers using the LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit.

The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit utilizes the polymerase chain reaction (PCR), which is established as the method of choice for highest sensitivity in the detection of Mycoplasma, Acholeplasma, and Ureaplasma contamination in cell cultures and other cell culture derived biologicals.

Optimierte PCR-basierten Nachweis von Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

Diagnose von bakteriellen Atemwegsinfektionen beim Menschen mittels isothermer Amplifikation

Rapid Detection of Bacterial Pathogens Causing Lower Respiratory Tract Infections via Microfluidic-Chip-Based Loop-Mediated Isothermal Amplification

Respiratory tract infections (RTIs) are among the most common problems in clinical settings. Rapid and accurate identification of bacterial pathogens will provide practical guidelines for managing and treating RTIs. This study describes a method for rapidly detecting bacterial pathogens that cause respiratory tract infections via multi-channel loop-mediated isothermal amplification (LAMP). LAMP is a sensitive and specific diagnostic tool that rapidly detects bacterial nucleic acids with high accuracy and reliability. The proposed method offers a significant advantage over traditional bacterial culturing methods, which are time-consuming and often require greater sensitivity for detecting low levels of bacterial nucleic acids. This article presents representative results of K. pneumoniae infection and its multiple co-infections using LAMP to detect samples (sputum, bronchial lavage fluid, and alveolar lavage fluid) from the lower respiratory tract. In summary, the multi-channel LAMP method provides a rapid and efficient means of identifying single and multiple bacterial pathogens in clinical samples, which can help prevent the spread of bacterial pathogens and aid in the appropriate treatment of RTIs.

Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung des schnellen Nachweises von Atemwegserregern mit mikrofluidischem Chip 

Various bacterial pathogens can cause respiratory tract infections and lead to serious health issues if not detected accurately and treated promptly. Rapid and accurate detection of these pathogens via&#160;loop-mediated isothermal amplification provides effective management and control of respiratory tract infections in clinical settings.

Schneller Nachweis von bakteriellen Krankheitserregern, die Infektionen der unteren Atemwege verursachen, durch mikrofluidische Chip-basierte schleifenvermittelte isotherme Amplifikation

Respiratory tract infections (RTIs) are among the most common problems in clinical settings. Rapid and accurate identification of bacterial pathogens will ...

Die Entwicklung der Lyophilisierte Loop-mediated Isothermal Amplification Reagenzien zum Nachweis von

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

Ein Loop-vermittelten isothermen Verstärkung (Lampe) Assay für schnelle Identifizierung von Tabak tabaci

Nachweis von Phytophthora capsici im Bewässerungswasser mit Loop-Mediad Isothermale Amplifikation

Antikörper Profiling von Luciferase Immunpräzipitation Systems (LIPS)

Loop-vermittelte isothermen Amplifikation (LAMP) Assays für die artspezifischen Nachweis von

Generation und Multi-phänotypischen High-Content-Screening

Anwenden von Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) zu untersuchen Effektor Translokation Effizienz durch

Visuelle Erkennung von mehreren Nukleinsäuren in einem Kapillar Array

Optimierte PCR-basierten Nachweis von Mycoplasma

Schneller Nachweis von bakteriellen Krankheitserregern, die Infektionen der unteren Atemwege verursachen, durch mikrofluidische Chip-basierte schleifenvermittelte isotherme Amplifikation

Schneller Nachweis von bakteriellen Krankheitserregern, die Infektionen der unteren Atemwege verursachen, durch mikrofluidische Chip-basierte schleifenvermittelte isotherme Amplifikation