The authors wish to thank T. Noguchi for helpful advice on the initial establishment of the culture technique in our laboratory. Research in the lab of R. R.-P. was funded by the DFG within the international collaborative research center TRR81.

Declaração de Ética: Os procedimentos experimentais descritos neste protocolo envolvem a trabalhar exclusivamente com Drosophila melanogaster e não estão sujeitas às leis de protecção dos animais na Alemanha. 1. preparação de meios, ferramentas e Moscas <ol><li> Prepare modificado em pó meio de crescimento M3 disponível comercialmente, sem bicarbonato de potássio 17. CUIDADO: Irritante para os olhos e pele. Suplementar o meio com 10% de soro fetal bovino, 100 U / ml de penicilina, e 100 ug / ml de estreptomicina. Use soro fetal bovino inseto-cultura-testado inativado pelo calor e para obter melhores resultados. Filtra-se o meio completo (referido daqui em diante como forma) por meio de uma unidade de filtro de garrafa superior a 0,2 ^ m e no armazenamento de alíquotas a -20 ° C. Antes da sua utilização, o filtro (0,2 um filtro de seringa de ponta) do meio de novo para remover os precipitados. </li><li> Preparar soluções de inibidor para os ensaios farmacológicos. Dissolve os produtos químicos no solvente apropriado e armazenar-se em aliquotas. Por exemplo, preparar uma solução estoque de ácido anacárdico 28,69 mM (CUIDADO: Irritante para os olhos e pele) em dimetilsulfóxido. </li><li> Preparar as ferramentas para o rompimento dos testículos pupas dissecadas e dissecção de cistos simples. Use duas agulhas afiadas e duras, em vez de um par de fórceps. A força capilar que se desenvolve entre os dois braços de um par de fórceps faz a dissecação de cistos simples em pequenas quantidades de meio muito difícil. Por exemplo, utilizar a ponta de um pino de insectos aço inoxidável inserido num suporte de ansa de inoculação. </li><li> A fim de obter pupas apropriadamente idade, cerca de 10 sementes de frascos de cultura grandes (tubos com 4 cm de diâmetro) com um número suficiente de moscas adultas (cerca de 40-60 moscas). Para analisar o switch HP, use moscas expressando H2AvD-RFP e ProtamineB-EGFP em seu padrão endógeno 12,16,22. Incubar os frascos, sob condições normais, a 25; ° C por cerca de 4-5 dias até o terceiro instar as larvas rastreamento e começar pupation nas paredes dos frascos 25. </li></ol> 2 Marcação ou Coleta Branco Pré-pupas obter 24 horas de idade, pupas para Dissecção <ol><li> Para testar a influência de certas substâncias químicas no switch HP, dissecar testículos pupa em cerca de 24 horas APF 12. Para obter pupas encenado, tomar as preparados frascos de cultura voar com pupating larvas (ver secção 1.4) e identificar como muitos brancos pré-pupas possível. Pré-pupas durante a primeira etapa em pupation aparecer como imóvel, não-alimentação, as larvas em vez encurtado com spiracles evertidas e pupário de cor branca. O pupário torna-se tan-marrom dentro de 30 a 60 min, o que indica o próximo estágio de desenvolvimento das pupas 26. </li><li> Marcam as posições de pré-pupas com um marcador permanente no lado de fora dos frascos. Incubar os tubos a 25 ° C durante cerca de 24 horas. <ol><li> Alternativamente,escolher o pré-pupas do lado dos frascos com uma pequena escova humedecido com tampão PBS. Em seguida, transferir o pré-pupas para o lado de um tubo de reacção de 50 mL fresco e incuba-se a 25 ° C durante cerca de 24 horas. </li></ol></li></ol> 3. Dissecção da Pupal Testes em cerca de 24 horas após a formação pupário <ol><li> Distribuir várias gotas (cerca de 80 ul cada) de meio de cultura de células em um de plástico 10 cm ou numa caixa de Petri. Usando uma ampla par de fórceps ou um pincel embebido em média, escolher as pupas na fase APF 24 horas dos frascos incubados (ver secção 2). Transferir uma pupa de cada gota de meio no prato. </li><li> Para a dissecção, usar um microscópio estéreo equipado com um iluminador de fibra óptica. Não aquecer os testículos acima RT durante a dissecção, pois isso pode impedir o bom desenvolvimento da cultura. <ol><li> Dissecar pupas com dois pares de n º 5 fórceps. Com um par, agarrar a pupa, na sua mais posteriorparte (dos espiráculos posteriores) e mantê-lo na posição. </li><li> Pegue os espiráculos anteriores com o outro par de fórceps e abrir o opérculo de pupa em sua extremidade anterior. Retire o caso de pupas, até, pelo menos, parte do tórax está exposta. </li><li> Continue pressionando a pupa na posição pelo seu fim mais posterior. Para liberar a pressão interna da pupa, insira os dois braços de um par de fórceps para a região da cabeça da pupa. </li><li> Rasgar a pupa aberto abrindo as pinças e mover a pinça na direcção anterior. Assegure-se que a abertura gerado com este movimento é tão grande quanto possível na primeira tentativa. Evite danificar a pupa em sua extremidade posterior antes que a pressão foi liberada, pois isso pode resultar nos testículos sendo empurrado diretamente através da pequena abertura e na maioria das vezes ser interrompido. </li><li> Observe que uma vez que a pupa é aberta, a pressão interna lançado da pupa pressiona a aglomerados de células de gordura corporal e do tecido através do laabertura rge na região da cabeça. Verifique se os testículos pupa já foram empurrados para fora da pupa com este material; isto ocorre em alguns casos. Os testículos não estão ligados a qualquer outro tecido em 24 horas APF e, portanto, pode ser expulso facilmente da pupa 23. </li><li> Evite apertar a pupa com a pinça, pois isso pode danificar os testículos se eles permanecem na pupa. Aumentar o tamanho da abertura usando um par de fórceps. </li><li> Em seguida, mantenha a pupa em sua extremidade mais posterior. Feche o outro par de pinças e expelido suavemente o conteúdo da pupa de posterior para anterior para libertar os testículos das crisálidas. </li></ol></li><li> Recolha os testículos puxando-os em um pré-corte de 200 mL ponteira. Tentar transferir apenas uma muito pequena quantidade de meio para reduzir o número de células de gordura corporal transferidos com os testículos. Coloque os testículos em média em um prato de cultura fresco. Lave os testes várias vezes com meio até que só célula do corpo poucos gorduras permanecem. </li><li> Para imagens ao vivo, transferir testículos a uma cultura prato fundo de vidro com meio e usar um microscópio de imagem invertida. Para os ensaios farmacológicos, continue com o passo 5. </li></ol> 4. Dissecção da masculinos Cistos linha germinal e Imagens ao vivo <ol><li> Transferir um ou mais testículos pupa a uma cultura prato fundo de vidro. </li><li> Use um microscópio estéreo com iluminação de fibra ótica e duas agulhas de aço inoxidável (ver secção 1.3) para a dissecção das germinativas cistos do sexo masculino. <ol><li> Com uma agulha, cuidadosamente tentar fixar para baixo um testículo na sua anterior ou posterior final. Segure-o na posição. Inserir a agulha no outro testículo e perturbar a bainha testículo, movendo a agulha lateralmente. Muitos dos cistos será libertada do testículo por este movimento. </li><li> Continue a segurar o testículo em posição com uma agulha. Gentilmente raia os cistos restantes do testículo com a outra agulha. </li><li> Cistos agregados separados tanto por gently movimento de uma agulha para o lado através do conjunto de cistos ou transferindo os cistos para um prato de cultura fresca com o meio com uma pipeta de ponta de 200 ul. </li></ol></li><li> Mova a placa de cultura a um microscópio de imagem invertida para geração de imagens ao vivo de cistos simples. Dispersar cistos novamente com uma agulha, se necessário. <ol><li> Identificar a fase dos cistos utilizando contraste de fase e microscopia de fluorescência. </li><li> Concentre-se em um cisto do estágio desejado. Confirmar foco e posição do cisto frequentemente durante as experiências de imagiologia mais longas, como os cistos não aderir ao fundo do prato de cultura e, por conseguinte, tendem a flutuar fora de foco. NOTA: O revestimento da placa com poli-L-lisina para a imobilização é prejudicial para o desenvolvimento de quistos germinativas iniciais. Em vez disso, os cistos individuais podem ser isolados. Com alguma prática, é possível isolar um quisto nomeadamente por muito suavemente empurrando-a com a agulha. Isto irá permitir a transferência dos cistos simples de culto separadoure pratos com uma pipeta de Pasteur de vidro, com uma parte saliente que se encaixa dentro do campo de visão do microscópio. Os cistos isolados, em seguida, pode ser facilmente transferida em placas de cultura, mesmo após a incubação de longo prazo. </li></ol></li></ol> 5. farmacológica Ensaio com intactas pupais Testículos <ol><li> Encher cada poço de uma placa de 24 poços de cultura de células com 500 ul de meio para uma experiência de 12 repetições. Transferência de uma pupa testículo a cada poço, usando um pré-corte de 200 mL ponteira. <ol><li> Entrada para a presença de protaminas nos testículos isolados utilizando um microscópio invertido de fluorescência. Os testículos deve ser livre de sinal ProtamineB-eGFP, que indica que o comutador HP não ocorreu em qualquer dos cistos. Substitua testículos que já apresentam cistos ProtamineB-EGFP-positivos. </li><li> Para os primeiros 12 poços, adicionar 500 mL de meio contendo composto inibidor diluído (ácido anacárdico) para alcançar a concentração final desejada(150 fiM) em 1 ml de meio por poço. Use os poços restantes como controles não tratados; adicionar 500 mL de meio com a mesma quantidade de solvente utilizado como com os compostos inibidores. Nota: se forem utilizados diversos compostos e solventes diferentes, pode ser mais eficiente ao utilizar meio sozinho como controlo e para testar a influência de aumentar as concentrações de solventes, em experiências separadas. </li></ol></li><li> Incubar a placa a 25 ° C durante 24 horas no escuro. </li><li> Verificar novamente para a presença de protaminas nos testículos incubadas como descrito acima. Os testículos de controle deve agora mostrar cistos um ou mais ProtamineB-EGFP-positivos, o que indica a transição através do switch HP. </li><li> Com uma pipeta com uma ponta de 200 mL, transferir os testículos aos slides poli-L-lisina-revestido, fazer os preparativos de squash e mancha com anticorpos fluorescentes adequadas conforme descrito em outros lugares 12,27,28. </li></ol>

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	<li>Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+cell+proliferation+and+differentiation+in+Drosophila+spermatogenesis.">Genetic control of cell proliferation and differentiation in Drosophila spermatogenesis.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 9 (4), 433-444 (1998).</li><li>de Cuevas, M., Matunis, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stem+cell+niche:+lessons+from+the+Drosophila+testis.">The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis.</a> Development. 138 (14), 2861-2869 (2011).</li><li>Tokuyasu, K. T., Peacock, D. W. J., Hardy, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+spermiogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Dynamics of spermiogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 124 (4), 479-506 (1972).</li><li>Noguchi, T., Miller, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+dynamics+in+individualization+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Development. 130 (9), 1805-1816 (2003).</li><li>Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can&#8217;t+live+without+them,+can+live+with+them:+roles+of+caspases+during+vital+cellular+processes.">Can&#8217;t live without them, can live with them: roles of caspases during vital cellular processes.</a> Apoptosis. 14 (8), 980-995 (2009).</li><li>Govin, J., Caron, C., Lestrat, C., Rousseaux, S., Khochbin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+histones+in+chromatin+remodelling+during+mammalian+spermiogenesis.">The role of histones in chromatin remodelling during mammalian spermiogenesis.</a> Eur. J. Biochem. 271 (17), 3459-3469 (2004).</li><li>Hecht, N., Behr, R., Hild, A., Bergmann, M., Weidner, W., Steger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+common+marmoset+(Callithrix+jacchus)+as+a+model+for+histone+and+protamine+expression+during+human+spermatogenesis.">The common marmoset (Callithrix jacchus) as a model for histone and protamine expression during human spermatogenesis.</a> Hum. Reprod. 24 (3), 536-545 (2009).</li><li>Kanippayoor, R. L., Alpern, J. H. M., Moehring, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protamines+and+spermatogenesis+in+Drosophila+and+Homo+sapiens.">Protamines and spermatogenesis in Drosophila and Homo sapiens.</a> Spermatogenesis. 3 (2), (2013).</li><li>Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+dynamics+during+spermiogenesis.">Chromatin dynamics during spermiogenesis.</a> Biochim. Biophys. Acta. , (2013).</li><li>Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+remodelling+and+epigenetic+features+of+germ+cells.">Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells.</a> Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).</li><li>Rathke, C., Baarends, W. M., Jayaramaiah-Raja, S., Bartkuhn, M., Renkawitz, R., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transition+from+a+nucleosome-based+to+a+protamine-based+chromatin+configuration+during+spermiogenesis+in+Drosophila.">Transition from a nucleosome-based to a protamine-based chromatin configuration during spermiogenesis in Drosophila.</a> J. Cell Sci. 120 (9), 1689-1700 (2007).</li><li>Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H4+acetylation+is+essential+to+proceed+from+a+histone-+to+a+protamine-based+chromatin+structure+in+spermatid+nuclei+of+Drosophila+melanogaster.">Histone H4 acetylation is essential to proceed from a histone- to a protamine-based chromatin structure in spermatid nuclei of Drosophila melanogaster.</a> Syst. Biol. Reprod. Med. 56 (1), 44-61 (2010).</li><li>Olivieri, G., Olivieri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoradiographic+study+of+nucleic+acid+synthesis+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Autoradiographic study of nucleic acid synthesis during spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Mutat. Res. Fund. Mol. Mech. Mut. 2 (4), 366-380 (1965).</li><li>Gould-Somero, M., Holland, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+timing+of+RNA+synthesis+for+spermiogenesis+in+organ+cultures+ofDrosophila+melanogaster+testes.">The timing of RNA synthesis for spermiogenesis in organ cultures ofDrosophila melanogaster testes.</a> Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 174 (2), 133-148 (1974).</li><li>Barreau, C., Benson, E., Gudmannsdottir, E., Newton, F., White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-meiotic+transcription+in+Drosophila+testes.">Post-meiotic transcription in Drosophila testes.</a> Development. 135 (11), 1897-1902 (2008).</li><li>Barckmann, B., Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+levels+of+regulation+lead+to+protamine+and+Mst77F+expression+in+Drosophila.">Three levels of regulation lead to protamine and Mst77F expression in Drosophila.</a> Dev. Biol. 377 (1), 33-45 (2013).</li><li>Cross, D. P., Shellenbarger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis+in+in+vitro+cultures.">The dynamics of Drosophila melanogaster spermatogenesis in in vitro cultures.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 53 (1), 345-351 (1979).</li><li>Rebollo, E., Gonz&#225;lez, C., Henderson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Lapse+Imaging+of+Male+Meiosis+by+Phase-Contrast+and+Fluorescence+Microscopy.">Time-Lapse Imaging of Male Meiosis by Phase-Contrast and Fluorescence Microscopy.</a> Drosophila Cytogenetics Protocols. , 77-87 (2004).</li><li>Kawamoto, T., Kawai, K., Kodama, T., Yokokura, T., Niki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+differentiation+of+Drosophila+spermatogonia+in+vitro.">Autonomous differentiation of Drosophila spermatogonia in vitro.</a> Dev. Growth Differ. 50 (7), 623-632 (2008).</li><li>Sheng, X. R., Matunis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+Drosophila+spermatogonial+stem+cell+niche+reveals+novel+mechanisms+regulating+germline+stem+cell+output.">Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output.</a> Development. 138 (16), 3367-3376 (2011).</li><li>Leser, K., Awe, S., Barckmann, B., Renkawitz-Pohl, R., Rathke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bromodomain-containing+protein+tBRD-1+is+specifically+expressed+in+spermatocytes+and+is+essential+for+male+fertility.">The bromodomain-containing protein tBRD-1 is specifically expressed in spermatocytes and is essential for male fertility.</a> Biol. Open. 1 (6), 597-606 (2012).</li><li>Jayaramaiah Raja, S., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replacement+by+Drosophila+melanogaster+Protamines+and+Mst77F+of+Histones+during+Chromatin+Condensation+in+Late+Spermatids+and+Role+of+Sesame+in+the+Removal+of+These+Proteins+from+the+Male+Pronucleus.">Replacement by Drosophila melanogaster Protamines and Mst77F of Histones during Chromatin Condensation in Late Spermatids and Role of Sesame in the Removal of These Proteins from the Male Pronucleus.</a> Mol. Cell. Biol. 25 (14), 6165-6177 (2005).</li><li>Bodenstein, D., Demerec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+postembryonic+development+of+Drosophila.">The postembryonic development of Drosophila.</a> Biology of Drosophila. , 275-367 (1950).</li><li>Susic-Jung, L., Hornbruch-Freitag, C., Kuckwa, J., Rexer, K. H., Lammel, U., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multinucleated+smooth+muscles+and+mononucleated+as+well+as+multinucleated+striated+muscles+develop+during+establishment+of+the+male+reproductive+organs+of+Drosophila+melanogaster.">Multinucleated smooth muscles and mononucleated as well as multinucleated striated muscles develop during establishment of the male reproductive organs of Drosophila melanogaster.</a> Dev. Biol. 370 (1), 86-97 (2012).</li><li>Ashburner, M., Roote, J., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+Culture+of+Drosophila.">Laboratory Culture of Drosophila.</a> Drosophila Protocols. , 585-599 (2000).</li><li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 66 (1), 57-80 (1981).</li><li>Hime, G. R., Brill, J. A., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+ring+canals+in+the+male+germ+line+from+structural+components+of+the+contractile+ring.">Assembly of ring canals in the male germ line from structural components of the contractile ring.</a> J. Cell Sci. 109, 2779-2788 (1996).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M., W, S. u. l. l. i. v. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+analysis+of+spermatocyte+growth+and+male+meiosis+in+Drosophila+melanogaster.">Cytological analysis of spermatocyte growth and male meiosis in Drosophila melanogaster.</a> Drosophila Protocols. , 87-109 (2000).</li><li>Stern, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+of+testes+in+Drosophila.+I.+The+relation+between+vas+deferens+and+testis+within+various+species.">The growth of testes in Drosophila. I. The relation between vas deferens and testis within various species.</a> J. Exp. Zool. 87 (1), 113-158 (1941).</li><li>Lim, J. G. Y., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+cell+lineage+is+required+for+differentiation+and+not+maintenance+of+germline+stem+cells+in+Drosophila+testes.">Somatic cell lineage is required for differentiation and not maintenance of germline stem cells in Drosophila testes.</a> PNAS. 109 (45), 18477-18481 (2012).</li><li>Fuller, M. T., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis.">Spermatogenesis.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 71-147 (1993).</li><li>Braun, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+paternal+chromosomes+with+protamine.">Packaging paternal chromosomes with protamine.</a> Nature Genet. 28 (1), 10-12 (2001).</li><li>G&#246;risch, S. M., Wachsmuth, M., T&#243;th, K. F., Lichter, P., Rippe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+increases+chromatin+accessibility.">Histone acetylation increases chromatin accessibility.</a> J. Cell Sci. 118 (24), 5825-5834 (2005).</li><li>Demerec, M., Kaufmann, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila Guide: Introduction to the Genetics and Cytology of Drosophila melanogaster. , (1996).</li><li>Wang, W., Yoder, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Pupal+Abdomen+Immunohistochemistry.">Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry.</a> J. Vis. Exp. (56), (2011).</li><li>Sang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Quantitative+Nutritional+Requirements+of+Drosophila+Melanogaster.">The Quantitative Nutritional Requirements of Drosophila Melanogaster.</a> J. Exp. Biol. 33 (1), 45-72 (1956).</li><li>Meynadier, G., Vago, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Aseptic rearing of invertebrates for tissue culture. In: Invertebrate tissue culture. 1, (1971).</li><li>Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Price, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+histone+acetyltransferase+activity+by+anacardic+acid+sensitizes+tumor+cells+to+ionizing+radiation.">Inhibition of histone acetyltransferase activity by anacardic acid sensitizes tumor cells to ionizing radiation.</a> FEBS Lett. 580 (18), 4353-4356 (2006).</li><li>Aldaz, S., Escudero, L. M., Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+imaginal+disc+development.">Live imaging of Drosophila imaginal disc development.</a> PNAS. 107 (32), 14217-14222 (2010).</li><li>Niki, Y., Yamaguchi, T., Mahowald, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+stable+cell+lines+of+Drosophila+germ-line+stem+cells.">Establishment of stable cell lines of Drosophila germ-line stem cells.</a> PNAS. 103 (44), 16325-16330 (2006).</li><li>Church, K., Lin, H. P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+microtubules+and+chromosome+movement+during+prometaphase+in+Drosophila+melanogaster+spermatocytes+studied+in+life+and+with+the+electron+microscope.">Kinetochore microtubules and chromosome movement during prometaphase in Drosophila melanogaster spermatocytes studied in life and with the electron microscope.</a> Chromosoma. 92 (4), 273-282 (1985).</li><li>Rebollo, E., Gonz&#225;lez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+spindle+checkpoint+in+Drosophila+spermatocytes.">Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes.</a> EMBO rep. 1 (1), 65-70 (2000).</li><li>Cheng, J., Hunt, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Live+Imaging+of+Stem+Cells+in+Drosophila+Testis.">Time-lapse Live Imaging of Stem Cells in Drosophila Testis.</a> Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 11, 2E.2.1-2E.2.8 (2009).</li></ol>

Os autores não têm interesses conflitantes.

O protocolo apresentado descreve duas aplicações diferentes com base tanto na capacidade para dissecar os testículos de Drosophila e cistos único de linha germinal numa determinada fase de desenvolvimento e no desenvolvimento ex vivo destas células e tecidos em uma placa de cultura. Uma aplicação é o tratamento farmacológico de processos vitais, durante o desenvolvimento do esperma. É importante ressaltar que este permite o acesso a espermatogênese pós-meiótica que não é facilmente obtido utilizando análises funcionais baseadas na genética da mosca. A outra aplicação é a observação microscópica de vida e desenvolvimento de células germinativas e testículos. Especialmente esta aplicação benefícios da capacidade de células e órgãos de Drosophila em cultura para sobreviver e desenvolver à RT e sob atmosfera normal. Assim, uma imagem de microscópio invertido equipado com um estágio de aquecimento (aquecimento até à temperatura de reprodução padrão de 25 ° C) é suficiente para se obter resultados significativos em experimentos ao vivo por imagem. Maisexistem mais, muitas cepas transgênicas mosca expressando proteínas marcadas em proteínas fluorescentes para imagens ao vivo ou pode ser facilmente estabelecida. Para obter testículos pupa ou cistos em células germinais de um estágio específico do desenvolvimento, é fundamental que se está familiarizado com o tempo de desenvolvimento da Drosophila. O momento exato para cada estágio pode variar entre laboratórios, condições de cultura e estirpes de voar e deve ser estabelecido empiricamente. Como descrito acima, isso é especialmente importante para os ensaios farmacológicos que, por exemplo, têm como alvo o switch HP. Para estes experimentos, é aconselhável sempre verificar espermatídeos com um sinal ProtamineB-eGFP antes do teste real, porque o inibidor de temporização pode variar um pouco, ainda dentro de uma população. Seguindo o protocolo acima deve habilitar o experimentador para dissecar testículos de pupa início como órgãos intactos livres do tecido adiposo anexado corpo. Estes testes e, mais ainda, isolado gecistos de linha rm são muito frágeis. Por isso, é fundamental desenvolver a destreza manual ea experiência necessária para manusear e transferência de testículos e cistos com pinças, agulhas e pipetas. Especialmente os estudos que visam o desenvolvimento de células germinativas de pós-meiótica meiose e início iria beneficiar com isso. Embora seja relativamente fácil de dissecar cistos de espermátides final com longa flagelos de testículos de adultos, é difícil a obtenção de fases anteriores. Dissecando esses cistos de testículos pupa início seguindo este protocolo é muito mais eficiente. Tenha em mente que em uma cepa mosca de costume, apenas cerca de 50% das pupas será do sexo masculino. Portanto, prepare-se para dissecar, pelo menos, o dobro pupas como o número de testes necessários. Em alternativa, é possível identificar macho larvas L3 usando um estereomicroscópio, tal como os testículos pode ser identificado como órgãos redondos translúcidas incorporados nos tecidos do corpo gordo laterais da larva intacta 23,34, e recolher em frascos de cultura fresco que podeser usado para escolher pré-pupa para o estadiamento e dissecações. Também é possível identificar macho pré-pupas 35. Percebemos que ambos os isolados em células germinais cistos e os testículos pupa intactas em cultura são sensíveis à luz, como também já foi relatado anteriormente 18. Esta sensibilidade à luz também pode segurar por alguns compostos químicos utilizados em ensaios farmacológicos. Portanto, é melhor para manter as placas de cultura de um ensaio, no escuro, durante a incubação. Da mesma forma, ao planejar experimentos com imagens de lapso de tempo com testículos em desenvolvimento e, especialmente, cistos isolados, tenha em mente que os tempos de exposição muito longos e / ou taxas de amostragem demasiado elevadas podem inibir ex vivo de desenvolvimento. A taxa de amostragem adequado deve ser determinado experimentalmente. A infecção bacteriana e / ou fúngica e um excesso de crescimento em placas de cultura representa um problema grave. Placas de cultura infectados com muitas bactérias não suportam ex vivo desenvolvimento dos testículos e cistos. Portanto, o meio de cultura descrito contém penicilina e estreptomicina (ver passo 1.1), mas durante a incubação a longo prazo, estes antibióticos podem ser degradado e pode diminuir a sua actividade. Esta poderia ser uma das razões para o pouco tempo de sobrevivência (max. 72 hr) de cistos cultivadas observados quando se utiliza o protocolo acima. No entanto, esse prazo não poderá ser prorrogado por substituição regular do meio de cultura nos pratos. Conclui-se que outros factores podem influenciar a sobrevivência em cultura, tais como a falta de sinais de crescimento de outros tecidos do trato genital. Por outro lado, o desenvolvimento pós-meiótica é mais rápido do que em Drosophila nos mamíferos. Em Drosophila, espermiogênese leva cerca de 90 horas, eo switch HP tem lugar entre 50 e 60 horas após a meiose 9,12. Assim, o tempo habitual de sobrevivência de cerca de 48 horas alcançado com este protocolo é bem adequado para acompanhar os processos de desenvolvimento cruciais na spermatogenesis, como divisões meióticas ou o switch HP. Embora a contaminação bacteriana ou fúngica pode ser evitado pelo uso de ferramentas limpas e meios de comunicação, o protocolo apresentado não faz uso das condições de trabalho estritamente estéreis porque moscas e voar testículos já contêm bactérias quando criados em condições normais. No entanto, algumas aplicações desta técnica de cultura podem se beneficiar do moscas dissecadas ou mesmo criados em condições assépticas (para protocolos, consulte 17,36,37). Os ensaios farmacológicos dependem do uso de compostos químicos que actuam como inibidores, activadores ou de várias enzimas. Os compostos comumente usados ​​em tais experiências, muitas vezes diferem muito em sua especificidade alvo. Como vantagem, este oferece o potencial para atingir as classes de enzimas inteiras, por exemplo, com ácido anacárdico p300 inibidores / CBP, PCAF e membros da família MYST de HATs 38. A desvantagem desta situação poderia ser potencial off-alvo ou efeitos citotóxicos induced por tais compostos. Portanto, cada composto utilizado em um ensaio com testículos pupa ou cistos devem ser testados quanto à sua citotoxicidade e efeito específico, em diferentes concentrações. Além disso, pequenas variações nas condições de cultura, concentração de composto ou de actividade, e as variações de permeabilidade celular pode conduzir a variabilidade dos efeitos induzidos. Portanto, é necessário controlar o êxito do tratamento em cada experiência. Por exemplo, quando foi utilizado ácido anacárdico a 150 uM, observou-se ligeira variabilidade na força do fenótipo condensação da cromatina entre e, por vezes, dentro de alguns dos testículos, ao passo que a acetilação da histona H4, foi consistentemente reduzida. Os ensaios farmacológicos com testículos de Drosophila em cultura foram utilizados para analisar os mecanismos pré e pós-meióticas da espermatogênese 4,12,14,21. Uma vez que é difícil ter acesso a espermatogênese pós-meiótica com ferramentas genéticas para atingir os jogadores com essênciafunções l pré-meióticas e meiose, esta abordagem ex vivo constitui uma alternativa. Além disso, em princípio, o método pode ser adaptado para pulse-chase experiências para seguir o desenvolvimento de células germinativas tratados ao longo do tempo. No entanto, nós ainda não testou essa possibilidade. Fazendo uso de testículos de pupa precoce é uma vantagem em ensaios farmacológicos. Em primeiro lugar, a bainha exterior fina dos jovens testículos pupa (cerca de 24 hr APF) pode permitir a permeabilidade melhorada de compostos químicos. Em segundo lugar, quando se estuda o switch HP pós-meiótica, os testículos pupas dissecadas em 24 horas APF partir da linha de fly Protamine expressando-GFP permitir uma leitura direta de saber se o interruptor HP foi afetado ou não. Até à data, vários protocolos para a cultura ex vivo de órgãos e tecidos, incluindo os testículos e os cistos de linha de germe de Drosophila têm sido desenvolvidos (por exemplo, ver 4,14,17,20,39,40). O meio de cultura e as condições gerais usadasno protocolo aqui apresentado foram estabelecidos em 1979, 17. sistema de cultura foi mais tarde adaptado para visualização in vivo do mecanismo de individualização em cistos pós-meióticas final isoladas de testículos adultos 4. Anteriormente, relataram que estas condições também apoiar a sobrevivência e diferenciação de meiose e as células germinais pós-meióticas primeiros em seus cistos por cerca de 48 horas 12. Em contraste com outros sistemas de cultura de 19 a temporização do desenvolvimento observado nestas culturas foi de aproximadamente consistente com o tempo determinado a partir de amostras fixas (para mais detalhes, ver 12). Sinais de fluorescência H2AvD-RFP e de protamina-GFP pode ser utilizado para visualizar a morfologia e composição da cromatina nuclear das células germinais em cultura. Descobrimos que para a identificação clara dos estágios de desenvolvimento da cultura, isso é vantajoso em relação a outros critérios, como enrolando de cistos. É importante ressaltar que o protocolo apresentado não envolve adição de fly extalém do soro fetal bovino ract factores de crescimento ou outros. Além disso, mostramos aqui que as condições sejam compatíveis com a microscopia de fluorescência de imagem de divisões meióticas ex vivo na cultura. As imagens podem ser obtidas com resolução razoável em um meio fácil de usar que suporta o desenvolvimento de longo prazo. Isto está em contraste com os protocolos que permite observações a curto prazo (cerca de 3 horas) em Voltalef óleo 41,42. Os procedimentos acima descritos para o cultivo e tratamento farmacológico da testículos pupa e individuais germinativas masculinas cistos são facilmente adaptáveis ​​a muitos genética, epigenética, célula biológica, ou questões de desenvolvimento que pode ser pesquisado em Drosophila espermatogênese. Isso inclui principalmente pesquisa com foco em células-tronco germinativas. Foi demonstrado que o desenvolvimento das células estaminais pode ser seguido por meio de imagens ao vivo de adulto cultivadas testículos 20,43. No entanto, o movimento peristáltico do testículo madura bainhah interfere na aquisição de imagem. Portanto, ou de imagem é feita usando testes fragmentados 43 ou o número de experimentos de imagem realizados tem que ser aumentada para dar conta perdidos conjuntos de dados 20. Testículos pupa precoce (24 horas APF) ainda não está fechado com células musculares. Mesmo um pouco mais velhos (36-45 testículos hr APF) parecem mostrar alguns movimentos peristálticos (comparar Figura 3 e vídeo Suplementar 1). Assim, o cultivo de jovens testículos pupa como órgãos intactos poderia servir como uma alternativa. Além disso, uma vez dominada, a capacidade de dissecar testículos pupa e, eventualmente, isolados em células germinais cistos permitirá novas aplicações usando cistos simples como fonte de uma homogênea, embora pequena população de células. Por exemplo, é assim possível realizar a RT-qPCR para analisar a regulação da transcrição de genes específicos em fases definidas da espermatogénese, como já foi demonstrado <sup&gt; 15.

O desenvolvimento de células germinativas masculinas de muitas espécies é um processo sequencial. Caracteriza-se por uma série de eventos cruciais que culmina na formação de espermatozóides morfologicamente e epigeneticamente altamente especializada. Em Drosophila melanogaster, as células-tronco de linha germinal na ponta da divisão testículo assimetricamente para dar origem a uma nova célula-tronco ea spermatogonium, ou seja, a célula-filha que está comprometida com a diferenciação (ver Figura 1 para uma visão geral) 1,2 . O spermatogonium sofre quatro rondas de divisões de mitose e, com o início da meiose, uma fase de crescimento impressionante e actividade de transcrição denominado a fase de espermatócitos. As células provenientes de um spermatogonium permanecem ligados uns aos outros e desenvolver-se como um feixe sincronizado envolto por duas células somáticas uma estrutura referida como um cisto. Após a conclusão da meiose, a morfologia das células germinais masculinas é completamentereorganizado (esquematicamente mostrado na Figura 1). Inicialmente, espermatídeos redondos alongados para formar a estrutura de cabeça hidrodinâmico, e o flagelo desenvolve. Eventualmente, as células do esperma são separados um do outro por um mecanismo complexo, relacionados com a apoptose chamado individualização 3-5. Em muitas espécies, incluindo Drosophila melanogaster e espécies de mamíferos, as alterações morfológicas das células germinativas são acompanhados por um rearranjo epigenética notável da haplóides masculino germinal cromatina, chamado o interruptor histona-to-protamina (interruptor HP) 6-9. Possivelmente, a quase totalidade da histona canónica e várias moléculas de variantes de histona-são retirados a partir do ADN e são substituídas por pequenas proteínas básicas, as protaminas, resultando na estrutura altamente compacta nucleoprotamine específico para a cromatina de esperma maduro. Características gerais do interruptor HP são tele substituição de histonas canónicas primeiro por variantes de histona, em seguida, por proteínas de transição, e, finalmente, por protaminas. Tudo isto é acompanhada por várias mudanças a epigenética marcas, tais como um aumento nos níveis de acetilação da histona H4, imediatamente antes da remoção da histona 7,10 - 12. A maioria, se não todos, os processos acima mencionados são essenciais para o desenvolvimento de maturidade, esperma completamente férteis. Isto é verdade não apenas em Drosophila, mas também em seres humanos, com as ações da espermatogênese de mamíferos uma quantidade considerável de similaridade com o sistema 1,8,9 invertebrados. Estudo do desenvolvimento de células germinativas do sexo masculino é facilitada no sistema do modelo de Drosophila. As moscas são geneticamente muito acessível. A geração de mutantes, assim como o estabelecimento de linhagens de moscas expressando genes de fusão ou construções de interferência RNA leva pouco esforço. No entanto, no estudo de pós-meiótica espermatogénese, a utilização de mutantes de umad ferramentas genéticas simples poderia chegar a um limite. Em Drosophila espermatogênese, transcrição cessa quase completamente com entrada em divisões meióticas. Assim, a espermatogênese pós-meiótica é baseado principalmente em mRNAs traducionalmente reprimidos e armazenados sintetizadas em uma prófase meiótica estendida 13-16. Portanto, como ferramentas de interferência de ARN ou a utilização de mutantes não-condicionadas, não são adequados para estudar os papéis especificamente pós-meióticas de produtos de genes que desempenham funções essenciais também no desenvolvimento de células germinativas pré-meiótica ou meiose. Uma vantagem de Drosophila que pode ser explorada em tais casos, é a capacidade de testículos dissecados intactas e até cistos de células germinativas para desenvolver ex vivo, em meio de cultura 4,12,17 - 20. A dissecção e cultivo de testes ou cistos germinativas permite não só a observação microscópica do desenvolvimento de células germinativas em células vivas, mas umlso a utilização dos ensaios farmacológicos, por exemplo, inibidores de complexos de enzimas, tais como histona-acetiltransferases (HATs), histona desacetilases (HDACs), topoisomerases, ou o proteassoma. Assim, é possível manipular funções enzimáticas durante a espermatogênese pós-meiótica e monitorar os resultados de desenvolvimento, independentemente do embrionárias, pré-meióticas, ou meiose funções 4,12. Em ensaios farmacológicos, que previamente analisadas a localização dependente de acetilação de uma proteína bromodomain durante a prófase meiótica, bem como a relevância dos níveis de acetilação das histonas para o interruptor epigenético HP na espermatogênese pós-meiótica utilizando inibidores específicos visando chapéus e HDAC 12,21. Visando o interruptor HP nestes ensaios foi tornada possível pelo uso de uma estirpe da mosca que expressa os genes de fusão histone2AvD-RFP e protamineB-eGFP 12,22 nos padrões endógenos, e a observação de queos primeiros espermátides nos testículos pupa passar pelo interruptor HP entre 24 e 48 horas APF 12. O protocolo apresentado descreve a dissecção dos testículos e cistos de Drosophila pupas, as condições de cultura, e um ensaio farmacológico com testículos pupa intactas. Para esta finalidade, os testículos pupa em aproximadamente 24 horas após a formação pupário (APF) são dissecados (ver Figuras 1 e 2). Neste momento, os testículos não foram feitas ligações a outros tecidos e estão rodeados por apenas uma bainha externa fina, o que permite uma melhor penetração dos compostos inibidores de 23,24. Os testículos são órgãos bean- ou em forma de pêra que podem ser facilmente levados em cultura. Estes testes são dissecados e cultivados e tratados com inibidores específicos. Subsequentemente, os efeitos dos inibidores são monitorados utilizando imunofluorescência e microscopia de fluorescência de expressão de proteína de fusão, e por comparação da morfol nucleargia das células germinais tratados para que não tratados de células germinais. As condições apresentadas neste protocolo também permite que imagens ao vivo de desenvolver testículos e cistos germinativas em cultura.

<table><tbody><tr><td>Anacardic acid</td><td>Merck Millipore</td><td>172050</td><td>brand: Calbiochem (EMD Millipore)</td></tr><tr><td>Anti-acetyl-Histone H4</td><td>Merck Millipore</td><td>06-598</td><td>brand: Upstate</td></tr><tr><td>AxioCam MRm&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioObserver.Z1 inverted microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 5-Inox forceps</td><td>Dumont</td><td></td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Fiber optical&amp;nbsp; illuminator</td><td></td><td></td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Glass Bottom Microwell Dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG (H+L)-Cy5</td><td>Dianova</td><td>711-175-152</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Sigma</td><td>B1155</td><td></td></tr><tr><td>Inoculation loop or pin holder</td><td></td><td></td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Austerlitz INSECT PINS stainless steel needles, size 0</td><td>Plano GmbH</td><td>N5018</td><td>In our hands both of these pin sizes worked well in the dissections. The minutiens are less rigid but have a smaller tip diameter.</td></tr><tr><td>Austerlitz INSECT PINS stainless steel minutiens, diam. 0.1 mm</td><td>Plano GmbH</td><td>N5014</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell plates, 24-wells</td><td>Becton Dickinson</td><td>351147</td><td>brand: Falcon</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>invitrogen</td><td>15070</td><td>brand: Gibco</td></tr><tr><td>Shields and Sang M3 Insect Medium</td><td>Sigma</td><td>S8398</td><td></td></tr><tr><td>Stemi SV6 binocular</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo culture of drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment

Durante a espermatogénese em mamíferos e em Drosophila melanogaster, as células germinais masculinas em desenvolver uma série de processos de desenvolvimento essenciais. Isso inclui a diferenciação de uma população de células-tronco, a amplificação de mitose e meiose. Além disso, as células germinativas de pós-meióticas submetido a um processo de remodelação morfológica dramático, bem como uma reconfiguração epigenética mundial da cromatina a opção de linha de germe de histona-a-protamina. O estudo do papel da proteína na espermatogénese pós-meiótica usando mutagénese ou outras ferramentas genéticas é muitas vezes impedida por embrionário essencial, a pré-meiótica, meiose ou funções da proteína em estudo. O fenótipo de pós-meiótica de um mutante de uma tal proteína pode ser obscurecidos por meio de um bloco anterior de desenvolvimento, ou a interpretação do fenótipo pode ser complicado. O organismo modelo Drosophila melanogaster oferece um bypass para este problema: testículos intactos emesmo cistos de células germinativas dissecados a partir de pupas cedo são capazes de desenvolver ex vivo, em meio de cultura. Fazendo uso de tais culturas permite imagens microscópicas de células germinativas vivendo em testículos e de cistos de linha germinal. É importante ressaltar que os testículos cultivadas e células germinativas também tornar-se acessível a inibidores farmacológicos, permitindo assim a manipulação de funções enzimáticas durante a espermatogênese, incluindo as etapas de pós-meióticas. O protocolo apresentado descreve como dissecar e cultivar testículos pupa e cistos em células germinais. Informações sobre o desenvolvimento dos testículos pupa e condições de cultura são apresentadas juntamente com dados de imagens de microscópio de testículos ao vivo e cistos germinativas em cultura. Os requerentes também descrevem um ensaio farmacológico para estudar a espermatogénese pós-meiótica, exemplificado por um ensaio de direccionamento do comutador de histona-a-protamina usando o ácido anacárdico inibidor de histona-acetiltransferase. Em princípio, este método de cultivo pode ser adaptado para tratar o muitosquestões de pesquisa utras na espermatogênese pré e pós-meiótica.

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Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Ex vivo Cultura de Drosophila Pupal Testículo e único macho da linha germinal Cistos: Dissection, Imaging, eo tratamento farmacológico

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

17.4K visualizações.  Philipps-Universität Marburg. This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Vídeo: Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for investigating the cell biology and development of central brain structures by allowing acute pharmacological interventions and live imaging of cellular processes. As an example of the technique, prior work from our lab1 has shown that a previously unrecognized subcellular compartment lies between the axonal and somatodendritic compartments of axons of the Drosophila central brain. The development of this compartment, referred to as the axon initial segment (AIS)2, was shown genetically to depend on the neuron-specific cyclin-dependent kinase, Cdk5. We show here that ex vivo treatment of wild-type Drosophila larval brains with the Cdk5-specific pharmacological inhibitors roscovitine and olomoucine3 causes acute changes in actin organization, and in localization of the cell-surface protein Fasciclin 2, that mimic the changes seen in mutants that lack Cdk5 activity genetically.
A second example of the ex vivo culture technique is provided for remodeling of the connections of embryonic mushroom body (MB) gamma neurons during metamorphosis from larva to adult. The mushroom body is the center of olfactory learning and memory in the fly4, and these gamma neurons prune their axonal and dendritic branches during pupal development and then re-extend branches at a later timepoint to establish the adult innervation pattern5. Pruning of these neurons of the MB has been shown to occur via local degeneration of neurite branches6, by a mechanism that is triggered by ecdysone, a steroid hormone, acting at the ecdysone receptor B17, and that is dependent on the activity of the ubiquitin-proteasome system6. Our method of ex vivo culturing can be used to interrogate further the mechanism of developmental remodeling. We found that in the ex vivo culture setting, gamma neurons of the MB recapitulated the process of developmental pruning with a time course similar to that in vivo. It was essential, however, to wait until 1.5 hours after puparium formation before explanting the tissue in order for the cells to commit irreversibly to metamorphosis; dissection of animals at the onset of pupariation led to little or no metamorphosis in culture. Thus, with appropriate modification, the ex vivo culture approach can be applied to study dynamic as well as steady state aspects of central brain biology.

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This article describes a method by which one can mimic in vivo development of the Drosophila mushroom body in an ex vivo culture system.

A cultura Ex vivo de todo, o desenvolvimento cerebral de Drosophila

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Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

Imagem e Análise da Dinâmica de Orientação e Crescimento tecidual na Epitélia Drosophila em Desenvolvimento durante os estágios pupal

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Biologia do Desenvolvimento

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

Preparação de Drosophila Larval e Pupal Testes para Análise de Divisão Celular em Tecido Vivo e Intacto

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, germ cell development, piRNA biology, and niche formation. Here, we present a dissection technique to live-image the gonad ex vivo during a period when in vivo live-imaging is highly ineffective. This protocol outlines how to transfer embryos to an imaging dish, choose appropriately-staged male embryos, and dissect the gonad from its surrounding tissue while still maintaining its structural integrity. Following dissection, gonads can be imaged using a confocal microscope to visualize dynamic cellular processes. The dissection procedure requires precise timing and dexterity, but we provide insight on how to prevent common mistakes and how to overcome these challenges. To our knowledge this is the first dissection protocol for the Drosophila embryonic gonad, and will permit live-imaging during an otherwise inaccessible window of time. This technique can be combined with pharmacological or cell-type specific transgenic manipulations to study any dynamic processes occurring within or between the&#160;cells in their natural gonadal environment.

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Here, we provide a dissection protocol required to live-image the late embryonic Drosophila male gonad. This protocol will permit observation of dynamic cellular processes under normal conditions or after transgenic or pharmacological manipulation.

Dissecção e Live-Imaging do Drosophila Gonad embrionário tardio

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolamento de Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Biologia

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, cell differentiation and organogenesis 1. Correct preparation of the experimental samples is a crucial, often neglected, step. The goal of preparation is to ensure physiological relevance and to establish optimal imaging conditions. To maintain tissue viability, it is critical to avoid dehydration, hypoxia, overheating or medium deterioration 2. 
 The Drosophila egg chamber is a well established system for examining questions relating, but not limited, to body patterning, mRNA localization and cytoskeletal organization 3,4. For early- and mid-stage egg chambers, mounting in halocarbon oil is good for survival in that it allows free diffusion of oxygen, prevents dehydration and hypoxia and has superb optical properties for microscopy. Imaging of fluorescent proteins is possible through the introduction of transgenes into the egg chamber or physical injection of labeled RNA, protein or antibodies 5-7. For example, addition of MS2 constructs to the genome of animals enables real time observation of mRNAs in the oocyte 8. These constructs allow for in vivo labeling of mRNA through utilization of the MS2 bacteriophage RNA stem loop interaction with its coat protein 9. 
 Here, we present a protocol for the extraction of ovaries as well as isolating individual ovarioles and egg chambers from the female Drosophila. For a detailed description of Drosophila oogenesis see Allan C. Spradling (1993, reprinted 2009) 10.

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

The Drosophila egg chamber is an excellent model for studying the mechanisms of mRNA localization. In order to capture the dynamic events that underpin the processes of localization, rapid high resolution imaging of live tissue is required. Here, we present a protocol for dissection and imaging of live samples with minimal disruption.

Preparação Individual Drosophila Ovos Câmaras de imagens ao vivo

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Imaging Centrosomes in Fly Testes

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell differentiation. Centrosomes are essential to determine the cell division axis during mitosis and to nucleate cilia during interphase. The identity of the proteins that mediate these dynamic changes remains only partially known, and the function of many of the proteins that have been implicated in these processes is still rudimentary. Recent work has shown that Drosophila spermatogenesis provides a powerful system to identify new proteins critical for centrosome function and formation as well as to gain insight into the particular function of known players in centrosome-related processes. Drosophila is an established genetic model organism where mutants in centrosomal genes can be readily obtained and easily analyzed. Furthermore, recent advances in the sensitivity and resolution of light microscopy and the development of robust genetically tagged centrosomal markers have transformed the ability to use Drosophila testes as a simple and accessible model system to study centrosomes. This paper describes the use of genetically-tagged centrosomal markers to perform genetic screens for new centrosomal mutants and to gain insight into the specific function of newly identified genes.

Imaging of centrosomal proteins during Drosophila spermatogenesis is a powerful method to identify new proteins critical for centrosome biology as well as to elucidate the particular function of known players in this process.

Centrossomas de imagem na mosca Testículos

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

Citológica Análise da espermatogênese: Preparados ao vivo e fixo<em&gt; Drosophila</em&gt; Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and organogenesis. Immunostaining allows for the visualization of developing tissues and organs. However, a protective cuticle that forms at the end of embryogenesis prevents permeation of antibodies into late-stage embryos and larvae. While dissection prior to immunostaining is regularly used to analyze Drosophila larval tissues, it proves inefficient for some analyses because small tissues may be difficult to locate and isolate. Sonication provides an alternative to dissection in larval Drosophila immunostaining protocols. It allows for quick, simultaneous processing of large numbers of late-stage embryos and larvae and maintains in situ morphology. After fixation in formaldehyde, a sample is sonicated. Sample is then subjected to immunostaining with antigen-specific primary antibodies and fluorescently labeled secondary antibodies to visualize target cell types and specific proteins via fluorescence microscopy. During the process of sonication, proper placement of a sonicating probe above the sample, as well as the duration and intensity of sonication, is critical. Additonal minor modifications to standard immunostaining protocols may be required for high quality stains. For antibodies with low signal to noise ratio, longer incubation times are typically necessary. As a proof of concept for this sonication-facilitated protocol, we show immunostains of three tissue types (testes, ovaries, and neural tissues) at a range of developmental stages.

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

Facilitou-Sonication Imunofluorescência Coloração de Late-estágio embrionário e larval<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos<em&gt; In Situ</em

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and ...

Ex vivo Cultura de Drosophila Pupal Testículo e único macho da linha germinal Cistos: Dissection, Imaging, eo tratamento farmacológico

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