The authors wish to thank T. Noguchi for helpful advice on the initial establishment of the culture technique in our laboratory. Research in the lab of R. R.-P. was funded by the DFG within the international collaborative research center TRR81.

Etica dichiarazione: Le procedure sperimentali descritte in questo protocollo si riferiscono a lavori esclusivamente con Drosophila melanogaster e non sono soggetti alle leggi sul benessere degli animali in Germania. 1 Preparazione di media, strumenti, e Flies <ol><li> Preparare modificato disponibile in commercio in polvere mezzo di crescita di M3 senza bicarbonato di potassio 17. ATTENZIONE: Irritante per gli occhi e la pelle. Supplemento del mezzo con siero fetale bovino al 10%, 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina. Utilizzare siero testato insetto-cultura-inattivato al calore e fetale bovino per i migliori risultati. Filtrare il terreno completo (di seguito come mezzo) con un 0,2 micron unità filtrante per bottiglia e conservare in aliquote a -20 ° C. Prima dell&#39;uso, il filtro (0,2 micron punta filtro siringa) il mezzo di nuovo per rimuovere precipitati. </li><li> Preparare soluzioni inibitore azionari per i saggi farmacologici. Dissolve le sostanze chimiche nel solvente e conservare adeguata in aliquote. Ad esempio, preparare una soluzione madre di 28.69 mM acido anacardic (ATTENZIONE: Irritante per gli occhi e la pelle) in dimetilsolfossido. </li><li> Preparare gli strumenti per l&#39;interruzione dei testicoli pupa sezionati e dissezione dei singoli cisti. Usare due aghi appuntiti e rigidi, piuttosto che un paio di pinze. La forza capillare che si sviluppa tra i due rami di un paio di pinze rende la dissezione dei singoli cisti in piccole quantità di mezzo molto difficile. Ad esempio, utilizzare la punta di uno spillo insetto acciaio inox inserita in un supporto ad anello inoculazione. </li><li> Al fine di ottenere pupe opportunamente invecchiato, semi di circa 10 grandi flaconi di coltura (tubi con diametro 4 cm), con un numero sufficiente di mosche adulte (circa 40-60 mosche). Per analizzare l&#39;interruttore HP, utilizzare le mosche che esprimono H2AvD-RFP e ProtamineB-eGFP nel loro modello endogeno 12,16,22. Incubare le fiale in condizioni standard a 25; ° C per circa 4-5 giorni fino terze larve instar strisciare su e iniziare a impupamento sulle pareti dei flaconcini 25. </li></ol> 2 Marcatura o Raccolta Bianco Pre-pupe ottenere 24-hr-old Pupae per dissezione <ol><li> Per verificare l&#39;influenza di alcune sostanze chimiche sullo switch HP, sezionare testicoli pupa a circa 24 ore APF 12. Per ottenere pupe in scena, prendere i flaconi di coltura fly preparati con pupating larve (vedere paragrafo 1.4) e identificare il maggior numero bianco pre-pupe possibile. Pre-pupe durante il primo passo in impupamento appaiono come immobile, non l&#39;alimentazione, larve piuttosto accorciato con spiracoli estroflessi e puparium di colore bianco. Il puparium diventa tan-marrone all&#39;interno di 30 a 60 minuti, che indica la prossima fase di sviluppo pupa 26. </li><li> Segnare le posizioni del pre-pupe con un pennarello indelebile sulla parte esterna delle fiale. Incubare le fiale a 25 ° C per circa 24 ore. <ol><li> Alternativamente,accompagnamento pre-pupe dal lato delle fiale con un pennellino inumidito con tampone PBS. Poi il trasferimento pre-pupe al lato di un tubo di reazione 50 ml fresco e incubare a 25 ° C per circa 24 ore. </li></ol></li></ol> 3. dissezione di pupa testicoli a circa 24 ore dopo puparium Formazione <ol><li> Distribuire alcune gocce (circa 80 ml ​​ciascuna) di media su un 10 centimetri di coltura cellulare di plastica o una scatola Petri. Utilizzando una vasta paio di pinze o un pennello inumidito con il mezzo, prendere le pupe in fase di APF 24 ore dai flaconcini incubate (vedere paragrafo 2). Trasferire una pupa ad ogni goccia di terreno sul piatto. </li><li> Per la dissezione, utilizzare uno stereo-microscopio equipaggiato con un illuminatore a fibre ottiche. Non riscaldare i testicoli sopra RT durante la dissezione in quanto ciò potrebbe impedire un corretto sviluppo della cultura. <ol><li> Sezionare pupe con due coppie di n ° 5 pinze. Con una coppia, afferrare la pupa al suo più posterioreparte (i spiracoli posteriori) e tenerlo in posizione. </li><li> Prendete le spiracoli anteriori con l&#39;altra coppia di pinze e aprire l&#39;opercolo pupa alla sua estremità anteriore. Staccare il caso pupa fino a quando almeno una parte del torace è esposto. </li><li> Continuare a tenere la pupa in posizione per la sua fine più posteriore. Per rilasciare la pressione interna della pupa, inserire entrambe le braccia di un paio di pinze nella regione della testa della pupa. </li><li> Strappare la pupa aperta aprendo la pinza e muovendo la pinza nella direzione anteriore. Assicurarsi che l&#39;apertura generata con questo movimento è il più grande possibile nel primo tentativo. Evitare di danneggiare la pupa alla sua estremità posteriore, prima che la pressione è stata rilasciata in quanto ciò potrebbe comportare testicoli spinti direttamente attraverso la piccola apertura e più spesso di essere interrotti. </li><li> Si osservi che una volta che la pupa è aperto, la pressione interna liberato della pupa preme fuori agglomerati di cellule di grasso e tessuto attraverso il laapertura rge nella regione della testa. Controllare se i testicoli pupe sono già stati spinti fuori dalla pupa con questo materiale; ciò si verifica in alcuni casi. I testicoli non sono collegati a qualsiasi altro tessuto a 24 ore APF e, pertanto, potrebbero essere espulsi facilmente dalla pupa 23. </li><li> Evitare di schiacciare la pupa con le pinze in quanto questo potrebbe danneggiare i testicoli se rimangono in pupa. Aumentare la dimensione dell&#39;apertura utilizzando un paio di pinze. </li><li> Quindi tenere la pupa alla sua estremità più posteriore. Chiudere l&#39;altra coppia di pinze e delicatamente striscia fuori il contenuto della pupa da posteriore a anteriore a rilasciare i testicoli dalla pupa. </li></ol></li><li> Raccogliere i testicoli tirandoli in una punta di pipetta 200 microlitri pre-tagliati. Provate a trasferire solo una piccola quantità di mezzo per ridurre il numero delle cellule del corpo grasso trasferiti con i testicoli. Posizionare i testicoli in media in un piatto di coltura fresco. Lavare i testicoli più volte con mezzo fino a che solo poche cellule di grasso corporeos rimangono. </li><li> Per l&#39;imaging dal vivo, trasferire testicoli a un piatto di cultura con fondo di vetro con i media e utilizzare un microscopio invertito di imaging. Per i saggi farmacologici, continuare con il passaggio 5. </li></ol> 4 dissezione Maschile cisti Germ-line e dal vivo Imaging <ol><li> Trasferire uno o più testicolo pupa ad un piatto di cultura con fondo di vetro. </li><li> Utilizzare un impianto stereo-microscopio con illuminazione a fibre ottiche e due aghi di acciaio inossidabile (vedi sezione 1.3) per la dissezione dei maschi cisti germinali. <ol><li> Con un ago, cercare con attenzione da definire un testicolo al suo anteriore o estremità posteriore. Tenerlo in posizione. Inserire l&#39;altro ago nel testicolo e disturbare la guaina testicolo spostando l&#39;ago lateralmente. Molte delle cisti sarà rilasciato dal testicolo da questo movimento. </li><li> Continuare a tenere il testicolo in posizione con un ago. Striscia delicatamente i restanti cisti del testicolo con l&#39;altro ago. </li><li> Cisti aggregati separati sia da gently lo spostamento di un ago lateralmente attraverso il cluster di cisti o trasferendo le cisti ad un piatto di coltura fresco con supporto utilizzando un puntale 200 microlitri. </li></ol></li><li> Spostare il piatto cultura di un microscopio invertito di imaging per l&#39;imaging dal vivo di singole cisti. Disperse nuovamente cisti con un ago, se necessario. <ol><li> Identificare la fase delle cisti mediante contrasto di fase e microscopia a fluorescenza. </li><li> Concentrarsi su una cisti del palco desiderato. Confermare la messa a fuoco e la posizione della cisti frequentemente durante gli esperimenti di imaging più lunghi, come le cisti non aderiscono al fondo del piatto cultura e quindi tendono a galleggiare fuori fuoco. NOTA: Rivestimento il piatto con poli-L-lisina per immobilizzazione è dannosa per lo sviluppo dei primi cisti germinali. Al contrario, le singole cisti possono essere isolati. Con una certa pratica, è possibile individuare una particolare cisti spingendo molto delicatamente con l&#39;ago. Ciò consentirà il trasferimento di singole cisti al culto separatopiatti ure con una pipetta Pasteur di vetro con una punta protratta che si inserisce nel campo visivo del microscopio. Le cisti isolate quindi possono essere facilmente trasferiti nelle piastre di coltura anche dopo incubazione a lungo termine. </li></ol></li></ol> 5. farmacologica Assay con Intact pupa Testicoli <ol><li> Riempire ciascun pozzetto di una piastra di coltura cellulare di 24 pozzetti con 500 ml di mezzo per un esperimento di 12 repliche. Trasferimento di una pupa testicolo in ogni pozzetto, usando un puntale 200 microlitri pre-tagliati. <ol><li> Verificare la presenza di protamine nei testicoli isolate utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito. I testicoli dovrebbero essere liberi di segnale ProtamineB-eGFP, che indica che l&#39;interruttore HP non ha avuto luogo in una delle cisti. Sostituire testicoli che mostrano già cisti ProtamineB-eGFP-positivi. </li><li> Per i primi 12 pozzetti, aggiungere 500 ml di terreno contenente composto inibitore diluito (acido anacardic) per raggiungere la concentrazione finale desiderata(150 mM) in 1 ml di terreno per pozzetto. Utilizzare i restanti pozzi come controlli non trattati; aggiungere 500 ml di terreno con la stessa quantità di solvente utilizzato come con i composti inibitori. Nota: Se si utilizzano molti composti e solventi diversi, potrebbe essere più efficace utilizzare solo come mezzo di controllo e di testare l&#39;influenza di concentrazioni crescenti di solventi in esperimenti separati. </li></ol></li><li> Incubare la piastra a 25 ° C per 24 ore al buio. </li><li> Verificare nuovamente la presenza di protamine nei testicoli incubati come descritto sopra. I testicoli di controllo dovrebbero ora mostrare cisti uno o più ProtamineB-eGFP-positivi, che indica il passaggio attraverso lo switch HP. </li><li> Usando una pipetta con una punta di 200 microlitri, trasferire i testicoli per vetrini poli-L-lisina rivestite, fare i preparativi da squash e macchia con anticorpi fluorescenti appropriate come descritto altrove 12,27,28. </li></ol>

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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+microtubules+and+chromosome+movement+during+prometaphase+in+Drosophila+melanogaster+spermatocytes+studied+in+life+and+with+the+electron+microscope.">Kinetochore microtubules and chromosome movement during prometaphase in Drosophila melanogaster spermatocytes studied in life and with the electron microscope.</a> Chromosoma. 92 (4), 273-282 (1985).</li><li>Rebollo, E., Gonz&#225;lez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+spindle+checkpoint+in+Drosophila+spermatocytes.">Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes.</a> EMBO rep. 1 (1), 65-70 (2000).</li><li>Cheng, J., Hunt, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Live+Imaging+of+Stem+Cells+in+Drosophila+Testis.">Time-lapse Live Imaging of Stem Cells in Drosophila Testis.</a> Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 11, 2E.2.1-2E.2.8 (2009).</li></ol>

Gli autori non hanno interessi in competizione.

Il protocollo presentato descrive due diverse applicazioni basate sia sulla capacità di sezionare testicoli Drosophila e cisti singola linea germinale in un determinato stadio di sviluppo e sulla ex vivo sviluppo di queste cellule e tessuti in un piatto di cultura. Una applicazione è la manipolazione farmacologica dei processi vitali durante lo sviluppo dello sperma. È importante sottolineare che, questo permette l&#39;accesso alla spermatogenesi post-meiotico che non è facilmente ottenuto con analisi funzionali basate sulla genetica mosca. L&#39;altra applicazione è l&#39;osservazione microscopica di vivere e sviluppare le cellule germinali e testicoli. Soprattutto questa applicazione beneficia la capacità delle cellule di Drosophila e organi nella cultura di sopravvivere e sviluppare a temperatura ambiente e sotto atmosfera normale. Quindi, un microscopio invertito di imaging dotato di uno stadio riscaldato (riscaldamento alla temperatura di allevamento standard di 25 ° C) è sufficiente per ottenere risultati significativi in ​​esperimenti di live-imaging. Ulteriormenteesistono più, molti ceppi mosca transgenici che esprimono proteine ​​proteine ​​fluorescenti-tag per l&#39;imaging dal vivo o possono essere facilmente stabilite. Per ottenere testicoli pupa o cisti linea germinale di una fase di sviluppo specifico, è fondamentale che si ha familiarità con i tempi di sviluppo di Drosophila. La tempistica esatta per ogni fase può variare tra laboratori, condizioni di coltura, e volare ceppi e deve essere stabilita empiricamente. Come indicato in precedenza, questo è particolarmente importante per i saggi farmacologici che, per esempio, prendono di mira l&#39;interruttore HP. Per tali esperimenti, si consiglia di verificare sempre di spermatidi con un segnale ProtamineB-eGFP prima della prova reale inibitore perché il momento può variare leggermente anche all&#39;interno di una popolazione. A seguito del protocollo di cui sopra dovrebbe consentire lo sperimentatore di sezionare testicoli da stadi precoci pupa come organi intatti gratuiti di tessuto grasso corporeo in allegato. Questi testicoli e, ancor più, isolati gecisti rm-linea sono molto fragili. Quindi, è fondamentale sviluppare la manualità e l&#39;esperienza necessarie per la gestione e il trasferimento di testicoli e cisti usando pinze, aghi, e pipette. Soprattutto studi mirati allo sviluppo di germi-cellula post-meiotico meiotica e l&#39;inizio trarrebbero beneficio da questo. Mentre è relativamente facile da sezionare cisti di spermatidi in ritardo con lunghi flagelli da testicoli adulti, è difficile ottenere fasi precedenti. Dissezione queste cisti dai primi testicoli pupa che seguono questo protocollo è molto più efficiente. Tenete a mente che in un ceppo mosca al solito, solo circa il 50% delle pupe sarà maschio. Pertanto, si preparano a sezionare almeno il doppio di pupe come il numero di testicoli richiesti. In alternativa, è possibile identificare maschio larve L3 utilizzando uno stereo-microscopio, come i testicoli possono essere identificati organi rotondi come traslucide incorporati nei tessuti del corpo grasso laterali della larva intatto 23,34, e di raccoglierle in flaconi di coltura fresco che lattinaessere utilizzato per raccogliere pre-pupe per la stadiazione e dissezioni. È anche possibile identificare maschio pre-pupe 35. Abbiamo notato che sia le cisti isolate linea germinale e testicoli pupa intatti nella cultura sono sensibili alla luce, come è stato anche segnalato in precedenza 18. Questa sensibilità alla luce potrebbe anche tenere premuto per alcuni composti chimici utilizzati nei test farmacologici. Pertanto, è meglio tenere i piatti della cultura di un test al buio durante l&#39;incubazione. Allo stesso modo, quando si pianifica esperimenti di imaging time-lapse con testicoli in via di sviluppo e, in particolare, le cisti isolate, tenere presente che i tempi di esposizione troppo lungo e / o troppo alti tassi di campionamento possono inibire ex vivo sviluppo. La frequenza di campionamento appropriata deve essere determinata sperimentalmente. Infezioni batteriche e / o fungine e over-crescita nei piatti della cultura pone un problema grave. Piatti della cultura infettati con troppi batteri non supportano ex vivo sviluppo dei testicoli e cisti. Pertanto, il mezzo di coltura descritto contiene penicillina e streptomicina (vedi punto 1.1), ma durante l&#39;incubazione a lungo termine, questi antibiotici possono essere degradati e la loro attività potrebbero diminuire. Questo potrebbe essere uno dei motivi per il tempo limitato di sopravvivenza (max. 72 ore) di cisti in coltura osservate quando si utilizza il protocollo di cui sopra. Eppure, questo lasso di tempo non può essere esteso da regolare sostituzione del terreno di coltura nei piatti. Concludiamo che altri fattori potrebbero influenzare la sopravvivenza della cultura, come la mancanza di segnali di crescita provenienti da altri tessuti del tratto genitale. D&#39;altra parte, lo sviluppo post-meiotica è più veloce in Drosophila che nei mammiferi. In Drosophila, spermiogenesi richiede circa 90 ore, e l&#39;interruttore HP si svolge tra 50 e 60 ore dopo la meiosi 9,12. Così, alla solita ora sopravvivenza di circa 48 ore si ottiene con questo protocollo si adatta bene a seguire i processi di sviluppo cardine in spermatogenesis, come ad esempio le divisioni meiotica o lo switch HP. Anche se la contaminazione batterica o fungina può essere evitato utilizzando strumenti puliti e media, il protocollo presentato non fa uso di condizioni di lavoro rigorosamente sterili perché le mosche e volare testicoli già contengono batteri quando sollevato in condizioni standard. Tuttavia, alcune applicazioni di questa tecnica di coltura possono beneficiare di mosche sezionati o addirittura allevati in condizioni asettiche (per i protocolli, vedere 17,36,37). Saggi farmacologici dipendono dall&#39;uso di composti chimici che agiscono come inibitori o attivatori di vari enzimi. I composti comunemente utilizzati in tali esperimenti spesso sono molto diverse nella loro specificità di destinazione. Come un vantaggio, questo offre la possibilità di colpire intere classi di enzimi, per esempio, con acido anacardic p300 inibitori / CBP, PCAF, e membri della famiglia MYST di cappelli 38. L&#39;aspetto negativo di questo potrebbe essere il potenziale off-bersaglio o effetti citotossici Induccato da tali composti. Pertanto, ogni composto usato in un test con testicoli pupa o cisti dovrebbe essere testato per la sua citotossicità e l&#39;effetto specifico a diverse concentrazioni. Inoltre, piccole variazioni nelle condizioni di coltura, concentrazione di composti o di attività, e variazioni nella permeabilità cellulare potrebbe portare alla variabilità degli effetti indotti. Pertanto, è necessario monitorare il successo del trattamento in ogni esperimento. Ad esempio, quando abbiamo usato l&#39;acido anacardic a 150 micron, abbiamo osservato una leggera variabilità nella forza del fenotipo condensazione della cromatina tra e talvolta all&#39;interno di alcuni testicoli, mentre acetilazione dell&#39;istone H4 è diminuita consistentemente. Test farmacologici con testicoli di Drosophila della cultura sono stati utilizzati per analizzare i meccanismi di pre e post-meiotici della spermatogenesi 4,12,14,21. Dal momento che è difficile accedere spermatogenesi post-meiotico con strumenti genetici per giocatori con essentia bersagliofunzioni l pre-meiotica e meiotiche, questo approccio ex vivo costituisce un&#39;alternativa. Inoltre, in linea di principio, il metodo potrebbe essere adattato a pulse-chase esperimenti per seguire lo sviluppo delle cellule germinali trattate nel corso del tempo. Tuttavia, non abbiamo ancora testato questa possibilità. Facendo uso di precoce testicoli pupa è un vantaggio in saggi farmacologici. In primo luogo, la guaina esterna sottile dei giovani testicoli pupa (circa 24 ore APF) potrebbe consentire una migliore permeabilità dei composti chimici. In secondo luogo, quando si studia l&#39;interruttore post-meiotico HP, i testicoli pupa sezionati a 24 ore APF dalla linea fly-protamina-GFP che esprimono consentono una lettura diretta del fatto che lo switch HP è stata colpita o meno. Ad oggi, sono stati sviluppati diversi protocolli per la coltivazione ex vivo di organi e tessuti, tra cui testicoli e cisti germinali di Drosophila (ad esempio, vedi 4,14,17,20,39,40). Il mezzo di coltura e le condizioni generali utilizzatinel protocollo presentato qui sono stati istituiti nel 1979 17. Il sistema di coltura è stato successivamente adattato per imaging in vivo del meccanismo di individualizzazione nel tardo cisti post-meiotico isolate da testicoli adulti 4. In precedenza, abbiamo riportato che queste condizioni supportano anche la sopravvivenza e la differenziazione delle cellule germinali meiotica e post-meiotici primi nelle loro cisti per circa 48 ore 12. A differenza di altri sistemi di coltura 19 i tempi di sviluppo osservato in queste culture è stato di circa coerente con la tempistica stabilita dai campioni fissi (per i dettagli, vedi 12). Segnali di fluorescenza H2AvD-RFP e protamina-GFP può essere utilizzato per visualizzare la morfologia e la composizione della cromatina nucleare delle cellule germinali in coltura. Abbiamo scoperto che per una chiara identificazione delle fasi di sviluppo della cultura, questo è vantaggioso rispetto ad altri criteri, come l&#39;avvolgimento di cisti. È importante sottolineare che il protocollo presentato non comporta aggiunta di mosca extfattori di crescita RACT o altri diversi dal siero fetale bovino. Inoltre, mostriamo qui che le condizioni siano compatibili con la microscopia a fluorescenza imaging divisioni meiotica ex vivo nella cultura. Le immagini possono essere ottenuti con ragionevole risoluzione in un mezzo facile da usare che supporta lo sviluppo a lungo termine. Questo è in contrasto con protocolli per osservazioni a breve termine (circa 3 ore) in Voltalef olio 41,42. Le procedure sopra descritte per la coltivazione e il trattamento farmacologico dei testicoli pupa e singoli maschi cisti germinali sono facilmente adattabili ai molti genetica, epigenetica, cellule biologiche, o le domande di sviluppo che può essere ricercato in Drosophila spermatogenesi. Ciò comprende in particolare la ricerca incentrata sulle cellule staminali germinali. E &#39;stato dimostrato che lo sviluppo di cellule staminali può essere seguita da immagini dal vivo di coltura adulto testicoli 20,43. Tuttavia, il movimento peristaltico del testicolo maturo guainah interferisce con l&#39;acquisizione dell&#39;immagine. Pertanto, sia l&#39;imaging viene fatto usando testicoli frammentati 43 o il numero di esperimenti di imaging effettuati deve essere aumentato per tenere conto di perdita di dataset 20. Testicoli pupa primi (24 ore APF) non sono ancora chiusi con le cellule muscolari. Anche un po &#39;testicoli più anziani (36-45 h APF) sembrano mostrare alcuni movimenti peristaltici (confronta figura 3 e il video supplementare 1). Pertanto, la coltivazione di giovani testicoli pupa come organi intatti potrebbe servire come alternativa. Inoltre, una volta imparato, la capacità di sezionare testicoli pupa ed eventualmente isolate cisti germinali consentiranno ulteriori applicazioni che utilizzano singole cisti come fonte di un omogeneo, anche se piccola, popolazione di cellule. Ad esempio, è quindi possibile effettuare RT-qPCR per analizzare la regolazione trascrizionale di geni specifici durante le fasi definite di spermatogenesi, come è già stato dimostrato <sup&gt; 15.

Lo sviluppo delle cellule germinali maschili di molte specie è un processo sequenziale. Essa è caratterizzata da una serie di eventi cruciali che culmina nella formazione di spermatozoi morfologicamente e epigeneticamente altamente specializzato. In Drosophila melanogaster, le cellule staminali della linea germinale sulla punta della divisione testicolo asimmetricamente per dare origine ad una nuova cellula staminale e la spermatogonio, vale a dire, la cellula figlia che si impegna per la differenziazione (vedi Figura 1 per una panoramica) 1,2 . Il spermatogonio subisce quattro turni di divisioni mitotiche e, con l&#39;inizio della meiosi, una fase di notevole crescita e l&#39;attività trascrizionale chiamato la fase spermatocita. Le cellule provenienti da un spermatogonio rimangono collegati tra loro e si sviluppano come un fascio sincronizzato avvolto da due cellule somatiche-una struttura denominata una cisti. Dopo il completamento della meiosi, la morfologia delle cellule germinali maschili è completamenteriorganizzati (schematicamente illustrato in figura 1). Inizialmente, spermatidi rotondi allungano per formare la struttura testa idrodinamico, e il flagello sviluppa. Infine, le cellule spermatiche sono separate l&#39;una dall&#39;altra da un complesso meccanismo di apoptosi connesse chiamato individualizzazione 3 - 5. In molte specie, tra cui Drosophila melanogaster e specie di mammiferi, i cambiamenti morfologici delle cellule germinali sono accompagnati da una notevole riarrangiamento epigenetico del aploide maschile germinale cromatina, chiamato interruttore istone-a-protamina (switch HP) 6-9. Forse quasi tutti istone canonico e molte molecole di istone-variante vengono rimossi dalla DNA e sono sostituiti da piccole proteine ​​di base, le protamine, con conseguente struttura nucleoprotamine estremamente compatto specifico per la cromatina degli spermatozoi maturi. Caratteristiche generali dello switch HP sono tegli sostituzione degli istoni canonici prima da varianti istoniche, poi da proteine ​​di transizione, e infine da protamine. Il tutto è accompagnato da diverse modifiche segnali epigenetici, come ad esempio un aumento dei livelli di acetilazione dell&#39;istone H4 appena prima della rimozione istone 7,10 - 12. La maggior parte, se non tutti, dei processi sopra menzionati sono essenziali per lo sviluppo di una matura, sperma interamente fertili. Questo è vero non solo in Drosophila, ma anche negli esseri umani, come le azioni spermatogenesi mammiferi una notevole quantità di somiglianza con il 1,8,9 sistema di invertebrati. Studiare lo sviluppo cellula germinale maschile è molto facilitato nel sistema modello Drosophila. Le mosche sono geneticamente altamente accessibile. La generazione di mutanti, nonché la creazione di ceppi mosca esprimere geni di fusione o costrutti di interferenza RNA richiede poco sforzo. Tuttavia, nello studio di spermatogenesi post-meiotica, l&#39;uso di mutanti und semplici strumenti genetici potrebbero raggiungere un limite. In Drosophila spermatogenesi, trascrizione cessa quasi completamente con l&#39;entrata in divisioni meiotica. Così, la spermatogenesi post-meiotico si basa principalmente su mRNA traslazione repressi e memorizzati sintetizzati in una profase meiotica esteso 13 - 16. Pertanto, strumenti come RNA interference o l&#39;uso di mutanti non condizionali non sono adatti per studiare specificatamente i ruoli post-meiotici di prodotti genici che soddisfano anche funzioni essenziali per lo sviluppo delle cellule germinali pre-meiotica o meiosi. Un vantaggio di Drosophila che può essere sfruttato in questi casi è la capacità di testicoli intatti sezionati e anche cisti di cellule germinali di sviluppare ex vivo di cultura medio 4,12,17 - 20. La dissezione e la coltivazione dei testicoli o cisti germinali permette non solo l&#39;osservazione microscopica di sviluppo germinale delle cellule in cellule viventi, ma unaLSO l&#39;uso di dosaggi farmacologici con, ad esempio, gli inibitori dei complessi enzimatici, come istone acetiltransferasi (copricapo), istone deacetilasi (HDAC), topoisomerasi, o il proteasoma. Quindi, è possibile manipolare le funzioni enzimatiche durante la spermatogenesi post-meiotico e per monitorare i risultati di sviluppo a prescindere embrionali, pre-meiotica o meiosi funzioni 4,12. In saggi farmacologici, abbiamo già analizzato la localizzazione acetilazione-dipendente di una proteina bromodomain durante la profase meiotica, nonché la rilevanza dei livelli di acetilazione degli istoni per lo switch HP epigenetico nella spermatogenesi post-meiotico utilizzando inibitori specifici di targeting cappelli e HDAC 12,21. Targeting l&#39;interruttore HP in questi test è stato reso possibile utilizzando un ceppo mosca che esprime i geni di fusione histone2AvD-RFP e protamineB-eGFP 12,22 nei modelli endogeni, e l&#39;osservazione chei primi spermatidi in testicoli pupa passano attraverso lo switch HP tra 24 e 48 ore APF 12. Il protocollo presentato descrive la dissezione dei testicoli e cisti di Drosophila pupe, le condizioni di coltura, e un test farmacologico con testicoli pupa intatti. A questo scopo, testicoli pupa a circa 24 ore dopo la formazione puparium (APF) sono sezionati (vedi figure 1 e 2). In questo momento, i testicoli non hanno collegamenti con altri tessuti e sono circondato solo da una guaina esterna sottile, che permette una migliore penetrazione dei composti inibitori 23,24. I testicoli sono organi bean- oa forma di pera che possono essere facilmente presi in cultura. I testicoli sono sezionati, colta, e trattati con inibitori specifici. Successivamente, gli effetti degli inibitori sono monitorati con analisi di immunofluorescenza e microscopia a fluorescenza di espressione della proteina di fusione, e confrontando la Morphol nuclearelogia delle cellule germinali trattate a quella delle cellule germinali non trattate. Le condizioni presentate in questo protocollo permette anche l&#39;imaging dal vivo di sviluppare testicoli e cisti della linea germinale in cultura.

<table><tbody><tr><td>Anacardic acid</td><td>Merck Millipore</td><td>172050</td><td>brand: Calbiochem (EMD Millipore)</td></tr><tr><td>Anti-acetyl-Histone H4</td><td>Merck Millipore</td><td>06-598</td><td>brand: Upstate</td></tr><tr><td>AxioCam MRm&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioObserver.Z1 inverted microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 5-Inox forceps</td><td>Dumont</td><td></td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Fiber optical&amp;nbsp; illuminator</td><td></td><td></td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Glass Bottom Microwell Dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG (H+L)-Cy5</td><td>Dianova</td><td>711-175-152</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Sigma</td><td>B1155</td><td></td></tr><tr><td>Inoculation loop or pin holder</td><td></td><td></td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Austerlitz INSECT PINS stainless steel needles, size 0</td><td>Plano GmbH</td><td>N5018</td><td>In our hands both of these pin sizes worked well in the dissections. The minutiens are less rigid but have a smaller tip diameter.</td></tr><tr><td>Austerlitz INSECT PINS stainless steel minutiens, diam. 0.1 mm</td><td>Plano GmbH</td><td>N5014</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell plates, 24-wells</td><td>Becton Dickinson</td><td>351147</td><td>brand: Falcon</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>invitrogen</td><td>15070</td><td>brand: Gibco</td></tr><tr><td>Shields and Sang M3 Insect Medium</td><td>Sigma</td><td>S8398</td><td></td></tr><tr><td>Stemi SV6 binocular</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo culture of drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment

Durante la spermatogenesi nei mammiferi e in Drosophila melanogaster, cellule germinali maschili si sviluppano in una serie di processi di sviluppo essenziali. Questo include differenziazione da una popolazione di cellule staminali, l&#39;amplificazione mitotico, e meiosi. Inoltre, le cellule germinali post-meiotica subiscono un drammatico processo riconfigurazione morfologica e una riconfigurazione epigenetica globale della cromatina-switch linea germinale istone-a-protamina. Studiare il ruolo di una proteina nella spermatogenesi post-meiotico mediante mutagenesi o altri strumenti genetici è spesso ostacolata da embrionale essenziale, pre-meiotica, o funzioni meiotiche della proteina in esame. Il fenotipo post-meiotica di un mutante di una tale proteina potrebbe essere oscurato tramite un blocco dello sviluppo precedente, o l&#39;interpretazione del fenotipo potrebbe essere complicata. L&#39;organismo modello Drosophila melanogaster offre un bypass a questo problema: testicoli intatti eanche le cisti di cellule germinali sezionati dai primi di pupe sono in grado di sviluppare ex vivo in mezzo di coltura. Facendo uso di tali colture permette l&#39;imaging microscopico di vivere cellule germinali nei testicoli e cisti germinali. È importante sottolineare che i testicoli coltivati ​​e le cellule germinali diventano accessibili anche agli inibitori farmacologici, consentendo così la manipolazione delle funzioni enzimatiche durante la spermatogenesi, comprese le fasi post-meiotico. Il protocollo presentato descrive come sezionare e coltivare testicoli pupa e cisti germinali. Le informazioni sullo sviluppo di testicoli pupa e condizioni di coltura sono forniti insieme di dati di immagini al microscopio di testicoli live e cisti germinali in coltura. Descriviamo anche un saggio farmacologico per studiare la spermatogenesi post-meiotico, esemplificato da un saggio mira l&#39;interruttore istone-to-protamina utilizzando l&#39;inibitore acido anacardic istone acetiltransferasi. In linea di principio, questo metodo di coltivazione potrebbe essere adattato per affrontare molti odomande di ricerca Ther spermatogenesi in pre e post-meiotico.

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Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Ex vivo Cultura della Drosophila pupa testicolo e singolo maschio cisti germinale: Dissezione, Imaging, e trattamento farmacologico

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

17.4K Views.  Philipps-Universität Marburg. This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Video: Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for investigating the cell biology and development of central brain structures by allowing acute pharmacological interventions and live imaging of cellular processes. As an example of the technique, prior work from our lab1 has shown that a previously unrecognized subcellular compartment lies between the axonal and somatodendritic compartments of axons of the Drosophila central brain. The development of this compartment, referred to as the axon initial segment (AIS)2, was shown genetically to depend on the neuron-specific cyclin-dependent kinase, Cdk5. We show here that ex vivo treatment of wild-type Drosophila larval brains with the Cdk5-specific pharmacological inhibitors roscovitine and olomoucine3 causes acute changes in actin organization, and in localization of the cell-surface protein Fasciclin 2, that mimic the changes seen in mutants that lack Cdk5 activity genetically.
A second example of the ex vivo culture technique is provided for remodeling of the connections of embryonic mushroom body (MB) gamma neurons during metamorphosis from larva to adult. The mushroom body is the center of olfactory learning and memory in the fly4, and these gamma neurons prune their axonal and dendritic branches during pupal development and then re-extend branches at a later timepoint to establish the adult innervation pattern5. Pruning of these neurons of the MB has been shown to occur via local degeneration of neurite branches6, by a mechanism that is triggered by ecdysone, a steroid hormone, acting at the ecdysone receptor B17, and that is dependent on the activity of the ubiquitin-proteasome system6. Our method of ex vivo culturing can be used to interrogate further the mechanism of developmental remodeling. We found that in the ex vivo culture setting, gamma neurons of the MB recapitulated the process of developmental pruning with a time course similar to that in vivo. It was essential, however, to wait until 1.5 hours after puparium formation before explanting the tissue in order for the cells to commit irreversibly to metamorphosis; dissection of animals at the onset of pupariation led to little or no metamorphosis in culture. Thus, with appropriate modification, the ex vivo culture approach can be applied to study dynamic as well as steady state aspects of central brain biology.

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

This article describes a method by which one can mimic in vivo development of the Drosophila mushroom body in an ex vivo culture system.

Ex coltura vivo di Whole, in via di sviluppo Brains Drosophila

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

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Neuroscienze

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

Imaging e analisi dell'orientamento dei tessuti e delle dinamiche di crescita nell'epiteliale della Drosophila in via di sviluppo durante le fasi pupali

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Biologia dello sviluppo

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

Preparazione dei test di Drosophila Larval e Pupal per l'analisi della divisione cellulare in live, tessuto intatto

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, germ cell development, piRNA biology, and niche formation. Here, we present a dissection technique to live-image the gonad ex vivo during a period when in vivo live-imaging is highly ineffective. This protocol outlines how to transfer embryos to an imaging dish, choose appropriately-staged male embryos, and dissect the gonad from its surrounding tissue while still maintaining its structural integrity. Following dissection, gonads can be imaged using a confocal microscope to visualize dynamic cellular processes. The dissection procedure requires precise timing and dexterity, but we provide insight on how to prevent common mistakes and how to overcome these challenges. To our knowledge this is the first dissection protocol for the Drosophila embryonic gonad, and will permit live-imaging during an otherwise inaccessible window of time. This technique can be combined with pharmacological or cell-type specific transgenic manipulations to study any dynamic processes occurring within or between the&#160;cells in their natural gonadal environment.

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Here, we provide a dissection protocol required to live-image the late embryonic Drosophila male gonad. This protocol will permit observation of dynamic cellular processes under normal conditions or after transgenic or pharmacological manipulation.

Dissezione e Live-Imaging della Drosophila Gonad embrionale tardiva

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolamento di Drosophila melanogaster Testicoli

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Biologia

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, cell differentiation and organogenesis 1. Correct preparation of the experimental samples is a crucial, often neglected, step. The goal of preparation is to ensure physiological relevance and to establish optimal imaging conditions. To maintain tissue viability, it is critical to avoid dehydration, hypoxia, overheating or medium deterioration 2. 
 The Drosophila egg chamber is a well established system for examining questions relating, but not limited, to body patterning, mRNA localization and cytoskeletal organization 3,4. For early- and mid-stage egg chambers, mounting in halocarbon oil is good for survival in that it allows free diffusion of oxygen, prevents dehydration and hypoxia and has superb optical properties for microscopy. Imaging of fluorescent proteins is possible through the introduction of transgenes into the egg chamber or physical injection of labeled RNA, protein or antibodies 5-7. For example, addition of MS2 constructs to the genome of animals enables real time observation of mRNAs in the oocyte 8. These constructs allow for in vivo labeling of mRNA through utilization of the MS2 bacteriophage RNA stem loop interaction with its coat protein 9. 
 Here, we present a protocol for the extraction of ovaries as well as isolating individual ovarioles and egg chambers from the female Drosophila. For a detailed description of Drosophila oogenesis see Allan C. Spradling (1993, reprinted 2009) 10.

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

The Drosophila egg chamber is an excellent model for studying the mechanisms of mRNA localization. In order to capture the dynamic events that underpin the processes of localization, rapid high resolution imaging of live tissue is required. Here, we present a protocol for dissection and imaging of live samples with minimal disruption.

Preparazione individuale Drosophila Egg Chambers per l&#39;imaging dal vivo

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Imaging Centrosomes in Fly Testes

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell differentiation. Centrosomes are essential to determine the cell division axis during mitosis and to nucleate cilia during interphase. The identity of the proteins that mediate these dynamic changes remains only partially known, and the function of many of the proteins that have been implicated in these processes is still rudimentary. Recent work has shown that Drosophila spermatogenesis provides a powerful system to identify new proteins critical for centrosome function and formation as well as to gain insight into the particular function of known players in centrosome-related processes. Drosophila is an established genetic model organism where mutants in centrosomal genes can be readily obtained and easily analyzed. Furthermore, recent advances in the sensitivity and resolution of light microscopy and the development of robust genetically tagged centrosomal markers have transformed the ability to use Drosophila testes as a simple and accessible model system to study centrosomes. This paper describes the use of genetically-tagged centrosomal markers to perform genetic screens for new centrosomal mutants and to gain insight into the specific function of newly identified genes.

Imaging of centrosomal proteins during Drosophila spermatogenesis is a powerful method to identify new proteins critical for centrosome biology as well as to elucidate the particular function of known players in this process.

I centrosomi Imaging in Fly Testicoli

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

L&#39;analisi citologica della spermatogenesi: Preparati Live e fisse di<em&gt; Drosophila</em&gt; Testicoli

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and organogenesis. Immunostaining allows for the visualization of developing tissues and organs. However, a protective cuticle that forms at the end of embryogenesis prevents permeation of antibodies into late-stage embryos and larvae. While dissection prior to immunostaining is regularly used to analyze Drosophila larval tissues, it proves inefficient for some analyses because small tissues may be difficult to locate and isolate. Sonication provides an alternative to dissection in larval Drosophila immunostaining protocols. It allows for quick, simultaneous processing of large numbers of late-stage embryos and larvae and maintains in situ morphology. After fixation in formaldehyde, a sample is sonicated. Sample is then subjected to immunostaining with antigen-specific primary antibodies and fluorescently labeled secondary antibodies to visualize target cell types and specific proteins via fluorescence microscopy. During the process of sonication, proper placement of a sonicating probe above the sample, as well as the duration and intensity of sonication, is critical. Additonal minor modifications to standard immunostaining protocols may be required for high quality stains. For antibodies with low signal to noise ratio, longer incubation times are typically necessary. As a proof of concept for this sonication-facilitated protocol, we show immunostains of three tissue types (testes, ovaries, and neural tissues) at a range of developmental stages.

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

Sonicazione-facilitato immunofluorescenza colorazione di ritardo-fase embrionale e larvale<em&gt; Drosophila</em&gt; Tessuti<em&gt; In Situ</em

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and ...

Ex vivo Cultura della Drosophila pupa testicolo e singolo maschio cisti germinale: Dissezione, Imaging, e trattamento farmacologico

Riepilogo

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