The authors wish to thank T. Noguchi for helpful advice on the initial establishment of the culture technique in our laboratory. Research in the lab of R. R.-P. was funded by the DFG within the international collaborative research center TRR81.

Ethik-Anweisung: Die in diesem Protokoll beschriebenen experimentellen Verfahren beinhalten ausschließlich mit Drosophila melanogaster arbeiten und unterliegen nicht der Tierschutzgesetze in Deutschland. 1. Herstellung der Medien, Tools und Fliegen <ol><li> Bereiten modifizierten handelsüblichen pulverförmigen M3-Wachstums-Medium ohne Kaliumbicarbonat 17. ACHTUNG: Reizt die Augen und die Haut. Ergänzung des Mediums mit 10% fötalem Rinderserum, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin. Verwenden Sie hitzeinaktiviert und insekten Kultur-geprüft fetales Rinderserum für beste Ergebnisse. Filtern des Vollmedium (nachstehend als Medium bezeichnet), durch ein 0,2 um-Flaschenaufsatz-Filter-Einheit und Speicher in Aliquots bei -20 ° C. Vor Gebrauch Filter (0,2 um Spritzenfilter Spitze) das Medium erneut auf Niederschläge zu entfernen. </li><li> Bereiten Inhibitor-Stammlösungen für die pharmakologischen Tests. DISSOLve die Chemikalien in dem entsprechenden Lösungsmittel und Speicher in Teilmengen. Zum Beispiel wird eine Stammlösung von 28,69 mM Anacardsäure (ACHTUNG: Reizt die Augen und die Haut) in Dimethylsulfoxid. </li><li> Werkzeuge vorzubereiten für die Störung der Puppen seziert Hoden und Präparation der einzelnen Zysten. Verwenden Sie zwei scharfe und steife Nadeln, anstatt einer Pinzette. Die Kapillare Kraft, die zwischen den beiden Armen einer Zange entwickelt macht die Präparation der einzelnen Zysten in kleinen Mengen Medium sehr schwierig. Verwenden Sie zum Beispiel die Spitze eines Edelstahl Insektenstift in einer Impföse Halter eingesetzt. </li><li> Um angemessene Alter Puppen, Samen ca. 10 große Kulturfläschchen (Rohre mit 4 cm Durchmesser) mit einer ausreichenden Anzahl von erwachsenen Fliegen (ca. 40-60 Linie) zu erhalten. Um die HP Switch analysieren, verwenden Fliegen H2AvD-RFP und ProtamineB-eGFP exprimieren in ihrer endogenen Muster 12,16,22. Die Fläschchen unter Standardbedingungen bei 25 inkubieren; ° C für ca. 4-5 Tage bis dritten Larvenstadium kriechen und starten Verpuppung an den Wänden der Fläschchen 25. </li></ol> 2. Kennzeichnung oder Sammel Weiß Pre-Puppen für Dissection Erhalten 24 h alten Puppen <ol><li> Um den Einfluss von bestimmten Chemikalien auf der HP-Schalter zu testen, Puppen sezieren Hoden bei ca. 24 h APF 12. Inszeniert Puppen zu erhalten, nehmen die vorbereiteten Flugkulturfläschchen mit Verpuppung Larven (siehe Abschnitt 1.4) und zu identifizieren, wie viele weiße Pre-Puppen wie möglich. Pre-Puppen während der erste Schritt in der Verpuppung erscheinen als unbeweglich, nicht-Fütterung, sondern verkürzt Larven mit umgestülpten Luftlöcher und weiß gefärbte Puppenhülle. Die Puppenhülle wird tan-braun innerhalb von 30 bis 60 min, die die nächste Stufe der Puppenentwicklung 26 zeigt. </li><li> Markieren die Positionen der Pre-Puppen mit einer dauerhaften Markierung auf der Außenseite der Phiolen. Die Fläschchen Inkubation bei 25 ° C für ca. 24 h. <ol><li> Alternativwählen Sie die Pre-Puppen von der Seite der Fläschchen mit einem kleinen Pinsel mit PBS-Puffer befeuchtet. Dann überweisen Sie den Pre-Puppen an der Seite ein frisches 50 ml Reaktionsgefäß und Inkubation bei 25 ° C für ca. 24 h. </li></ol></li></ol> 3. Präparation Pupal Hoden bei ca. 24 Stunden nach der Pupariumbildung <ol><li> Verteilen Sie einige Tropfen (ca. 80 ul jeder) des Mediums auf einem 10 cm Kunststoffzellkultur oder eine Petrischale. Mit einer breiten Pinzette oder einem Pinsel mit mittlerer befeuchtet, nehmen die Puppen an der 24-Stunden-APF Bühne aus den Fläschchen inkubiert (siehe Abschnitt 2). Übertragen einer Puppe zu jedem Mediumtropfen auf dem Teller. </li><li> Für die Präparation, verwenden Sie ein Stereo-Mikroskop mit einer Faseroptik-Lichtquelle ausgestattet. Die Hoden oben RT während der Präparation nicht erhitzen, da dies die richtige Entwicklung in der Kultur zu verhindern. <ol><li> Sezieren Puppen mit zwei Paaren von Nr. 5 Pinzette. Mit einem Paar, greifen die Puppe an seinem hinterstenTeil (die hinteren Luftlöcher) und halten sie in Position. </li><li> Besorgen Sie sich die vorderen Luftlöcher mit der anderen Pinzette und öffnen Sie das Puppenkiemendeckel an seinem vorderen Ende. Ziehen Sie die Puppenhülle, bis zumindest ein Teil des Brustkorbs ausgesetzt ist. </li><li> Weiterhin die Puppe in Position durch seine hintersten Ende zu halten. Um den Innendruck der Puppe zu lösen, legen Sie beide Arme einer Zange in den Kopfbereich der Puppe. </li><li> Rippen der Puppe durch Öffnen der Zange und Bewegen der Zange in der vorderen Richtung offen. Stellen Sie sicher, dass die mit dieser Bewegung erzeugt Öffnung so groß wie möglich im ersten Versuch ist. Um eine Beschädigung der Puppe an ihrem hinteren Ende, bevor der Druck freigegeben worden, da dies in die Hoden, die direkt durch die kleine Öffnung geschoben und am häufigsten gestört führen. </li><li> Beachten Sie, dass, sobald die Puppe geöffnet wird, drückt die freiInnenDruck der Puppe aus Agglomeraten von Fettkörperzellen und Gewebe durch die large Öffnung in der Kopfregion. Prüfen, ob die Puppen Hoden haben bereits von der Puppe mit diesem Material geschoben worden; Dies erfolgt in einigen Fällen. Die Hoden sind nicht auf andere Gewebe nach 24 Stunden APF verbunden sind und deshalb leicht von der Puppe 23 ausgestoßen werden. </li><li> Vermeiden Sie drückte die Puppe mit der Zange, da dies die Hoden beschädigen, wenn sie in der Puppe bleiben. Erhöhen Sie die Größe der Öffnung mit einer Pinzette. </li><li> Halten Sie dann die Puppe an seinem hintersten Ende. Schließen Sie die anderen Pinzette und sanft Strähne aus dem Inhalt der Puppe von posterior nach anterior der Hoden aus der Puppe zu lösen. </li></ol></li><li> Sammeln Sie die Hoden, indem Sie sie in eine vorgeschnitten 200 ul Pipettenspitze. Versuchen, nur eine sehr kleine Menge des Mediums zu übertragen, um die Anzahl der Fettkörperzellen mit den Hoden übertragen verringern. Legen Sie die Hoden in das Medium in einer frischen Kulturschale. Mehrmals mit Medium waschen die Hoden, bis nur noch wenige Fettkörperzelles bleiben. </li><li> Für Live-Bildgebung, übertragen Hoden zu einem Glasbodenkulturschale mit mittleren und verwenden eine umgekehrte Imaging Mikroskop. Für pharmakologische Tests, mit Schritt 5 fortfahren. </li></ol> 4. Präparation der männlichen Keim Online-Zysten und Live-Imaging <ol><li> Übertragen eine oder mehrere Puppen Hoden auf einem Glasbodenkulturschale. </li><li> Verwenden Sie ein Stereo-Mikroskop mit Glasfaserbeleuchtung und zwei Edelstahl-Nadeln (siehe Abschnitt 1.3) für die Dissektion der männlichen Keimbahn-Zysten. <ol><li> Mit einer Nadel vorsichtig versuchen zu fassen ein Hoden an seinem vorderen oder hinteren Ende. Halten Sie es in Position. Stecken Sie das andere Nadel in den Hoden und stören die Hoden Mantel durch Bewegen der Nadel seitwärts. Viele der Zysten aus dem Hoden durch diese Bewegung freigegeben werden. </li><li> Weiterhin die Hoden in der Position mit einer Nadel zu halten. Sanft Serie aus den verbleibenden Zysten aus dem Hoden mit der anderen Nadel. </li><li> Separate aggregiert Zysten entweder durch Gently Verschieben einer Nadel seitlich durch die Cluster von Zysten oder durch die Übertragung der Zysten in ein frisches Kulturschale mit Medium mit einer 200 ul Pipettenspitze. </li></ol></li><li> Bewegen Sie die Kulturschale mit einem invertierten Mikroskop für Live-Imaging-Abbildung einzelner Zysten. Dispergieren Zysten wieder mit einer Nadel, falls erforderlich. <ol><li> Identifizieren Sie die Stufe der Zysten durch Verwendung Phasenkontrast-und Fluoreszenzmikroskopie. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf eine Zyste der gewünschten Bühne. Ausrichtung und Lage der Zyste bestätigen häufig während längerer Abbildungsexperimente, wie die Zysten nicht auf dem Boden der Kulturschale anhaften, und neigen daher dazu, unscharf zu schweben. HINWEIS: Die Beschichtung der Schale mit Poly-L-Lysin zur Immobilisierung ist nachteilig für die Entwicklung der frühen Keimbahn-Zysten. Stattdessen können einzelne Zysten isoliert werden. Mit etwas Übung ist es möglich, einzelne aus einer bestimmten Zyste durch sehr sanftes Drücken Sie es mit der Nadel. Dadurch wird die Übertragung einzelner Zysten separate Kult erlaubenUre Gerichte mit einem Glas Pasteur-Pipette mit einer gezogenen Spitze, die in das Sichtfeld des Mikroskops passt. Die isolierten Zysten dann leicht in den Kulturschalen auch nach langfristiger Inkubation verlegt werden. </li></ol></li></ol> 5. Pharmakologische Assay mit intakten Pupal Hoden <ol><li> Füllen Sie jede Vertiefung einer 24-Well-Zellkulturplatte mit 500 ul Medium für einen Versuch von 12 Wiederholungen. Transfer eines Puppen Hoden in jede Vertiefung, mit einem vorgeschnitten 200 ul Pipettenspitze. <ol><li> Erfragen Gegenwart Protamine in den isolierten Hoden mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop. Die Hoden sollten frei von ProtamineB-eGFP-Signal, das anzeigt, dass die HP Schalter nicht in einem der Zysten getroffen werden. Ersetzen Hoden, die bereits ProtamineB-eGFP-positive Zysten zeigen. </li><li> Auf die ersten 12 Wells, 500 ul Medium, das verdünnt Inhibitorverbindung (Anacardinsäure), um die gewünschte Endkonzentration zu erreichen(150 uM) in 1 ml Medium pro Well. Verwenden Sie die restlichen Brunnen als unbehandelte Kontrollen; Add 500 ul Medium mit der gleichen Menge des Lösungsmittels so mit dem Inhibitor-Verbindungen verwendet. Hinweis: Wenn viele Verbindungen und Lösemittel verwendet werden, kann es effizienter sein, Medium alleine als Kontrolle verwendet und um den Einfluss der Erhöhung der Lösungsmittelkonzentrationen in getrennten Experimenten getestet. </li></ol></li><li> Inkubieren der Platte bei 25 ° C für 24 Stunden im Dunkeln. </li><li> Überprüfen erneut auf die Gegenwart von Protamine in den Hoden inkubiert, wie oben beschrieben. Die Steuer Hoden sollte nun eine oder mehrere ProtamineB-eGFP-positive Zysten, die durch den Übergang HP Schalter zeigt. </li><li> Mit einer Pipette mit einer 200 ul Spitze, übertragen Sie die Hoden zu Poly-L-Lysin-beschichtete Objektträger, stellen Squash Vorbereitungen und Fleck mit geeigneten fluoreszierenden Antikörpern wie anderswo 12,27,28 beschrieben. </li></ol>

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	<li>Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+cell+proliferation+and+differentiation+in+Drosophila+spermatogenesis.">Genetic control of cell proliferation and differentiation in Drosophila spermatogenesis.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 9 (4), 433-444 (1998).</li><li>de Cuevas, M., Matunis, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stem+cell+niche:+lessons+from+the+Drosophila+testis.">The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis.</a> Development. 138 (14), 2861-2869 (2011).</li><li>Tokuyasu, K. T., Peacock, D. W. J., Hardy, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+spermiogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Dynamics of spermiogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 124 (4), 479-506 (1972).</li><li>Noguchi, T., Miller, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+dynamics+in+individualization+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Development. 130 (9), 1805-1816 (2003).</li><li>Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can&#8217;t+live+without+them,+can+live+with+them:+roles+of+caspases+during+vital+cellular+processes.">Can&#8217;t live without them, can live with them: roles of caspases during vital cellular processes.</a> Apoptosis. 14 (8), 980-995 (2009).</li><li>Govin, J., Caron, C., Lestrat, C., Rousseaux, S., Khochbin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+histones+in+chromatin+remodelling+during+mammalian+spermiogenesis.">The role of histones in chromatin remodelling during mammalian spermiogenesis.</a> Eur. J. Biochem. 271 (17), 3459-3469 (2004).</li><li>Hecht, N., Behr, R., Hild, A., Bergmann, M., Weidner, W., Steger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+common+marmoset+(Callithrix+jacchus)+as+a+model+for+histone+and+protamine+expression+during+human+spermatogenesis.">The common marmoset (Callithrix jacchus) as a model for histone and protamine expression during human spermatogenesis.</a> Hum. Reprod. 24 (3), 536-545 (2009).</li><li>Kanippayoor, R. L., Alpern, J. H. M., Moehring, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protamines+and+spermatogenesis+in+Drosophila+and+Homo+sapiens.">Protamines and spermatogenesis in Drosophila and Homo sapiens.</a> Spermatogenesis. 3 (2), (2013).</li><li>Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+dynamics+during+spermiogenesis.">Chromatin dynamics during spermiogenesis.</a> Biochim. Biophys. Acta. , (2013).</li><li>Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+remodelling+and+epigenetic+features+of+germ+cells.">Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells.</a> Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).</li><li>Rathke, C., Baarends, W. M., Jayaramaiah-Raja, S., Bartkuhn, M., Renkawitz, R., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transition+from+a+nucleosome-based+to+a+protamine-based+chromatin+configuration+during+spermiogenesis+in+Drosophila.">Transition from a nucleosome-based to a protamine-based chromatin configuration during spermiogenesis in Drosophila.</a> J. Cell Sci. 120 (9), 1689-1700 (2007).</li><li>Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H4+acetylation+is+essential+to+proceed+from+a+histone-+to+a+protamine-based+chromatin+structure+in+spermatid+nuclei+of+Drosophila+melanogaster.">Histone H4 acetylation is essential to proceed from a histone- to a protamine-based chromatin structure in spermatid nuclei of Drosophila melanogaster.</a> Syst. Biol. Reprod. Med. 56 (1), 44-61 (2010).</li><li>Olivieri, G., Olivieri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoradiographic+study+of+nucleic+acid+synthesis+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Autoradiographic study of nucleic acid synthesis during spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Mutat. Res. Fund. Mol. Mech. Mut. 2 (4), 366-380 (1965).</li><li>Gould-Somero, M., Holland, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+timing+of+RNA+synthesis+for+spermiogenesis+in+organ+cultures+ofDrosophila+melanogaster+testes.">The timing of RNA synthesis for spermiogenesis in organ cultures ofDrosophila melanogaster testes.</a> Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 174 (2), 133-148 (1974).</li><li>Barreau, C., Benson, E., Gudmannsdottir, E., Newton, F., White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-meiotic+transcription+in+Drosophila+testes.">Post-meiotic transcription in Drosophila testes.</a> Development. 135 (11), 1897-1902 (2008).</li><li>Barckmann, B., Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+levels+of+regulation+lead+to+protamine+and+Mst77F+expression+in+Drosophila.">Three levels of regulation lead to protamine and Mst77F expression in Drosophila.</a> Dev. Biol. 377 (1), 33-45 (2013).</li><li>Cross, D. P., Shellenbarger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis+in+in+vitro+cultures.">The dynamics of Drosophila melanogaster spermatogenesis in in vitro cultures.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 53 (1), 345-351 (1979).</li><li>Rebollo, E., Gonz&#225;lez, C., Henderson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Lapse+Imaging+of+Male+Meiosis+by+Phase-Contrast+and+Fluorescence+Microscopy.">Time-Lapse Imaging of Male Meiosis by Phase-Contrast and Fluorescence Microscopy.</a> Drosophila Cytogenetics Protocols. , 77-87 (2004).</li><li>Kawamoto, T., Kawai, K., Kodama, T., Yokokura, T., Niki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+differentiation+of+Drosophila+spermatogonia+in+vitro.">Autonomous differentiation of Drosophila spermatogonia in vitro.</a> Dev. Growth Differ. 50 (7), 623-632 (2008).</li><li>Sheng, X. R., Matunis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+Drosophila+spermatogonial+stem+cell+niche+reveals+novel+mechanisms+regulating+germline+stem+cell+output.">Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output.</a> Development. 138 (16), 3367-3376 (2011).</li><li>Leser, K., Awe, S., Barckmann, B., Renkawitz-Pohl, R., Rathke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bromodomain-containing+protein+tBRD-1+is+specifically+expressed+in+spermatocytes+and+is+essential+for+male+fertility.">The bromodomain-containing protein tBRD-1 is specifically expressed in spermatocytes and is essential for male fertility.</a> Biol. Open. 1 (6), 597-606 (2012).</li><li>Jayaramaiah Raja, S., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replacement+by+Drosophila+melanogaster+Protamines+and+Mst77F+of+Histones+during+Chromatin+Condensation+in+Late+Spermatids+and+Role+of+Sesame+in+the+Removal+of+These+Proteins+from+the+Male+Pronucleus.">Replacement by Drosophila melanogaster Protamines and Mst77F of Histones during Chromatin Condensation in Late Spermatids and Role of Sesame in the Removal of These Proteins from the Male Pronucleus.</a> Mol. Cell. Biol. 25 (14), 6165-6177 (2005).</li><li>Bodenstein, D., Demerec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+postembryonic+development+of+Drosophila.">The postembryonic development of Drosophila.</a> Biology of Drosophila. , 275-367 (1950).</li><li>Susic-Jung, L., Hornbruch-Freitag, C., Kuckwa, J., Rexer, K. H., Lammel, U., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multinucleated+smooth+muscles+and+mononucleated+as+well+as+multinucleated+striated+muscles+develop+during+establishment+of+the+male+reproductive+organs+of+Drosophila+melanogaster.">Multinucleated smooth muscles and mononucleated as well as multinucleated striated muscles develop during establishment of the male reproductive organs of Drosophila melanogaster.</a> Dev. Biol. 370 (1), 86-97 (2012).</li><li>Ashburner, M., Roote, J., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+Culture+of+Drosophila.">Laboratory Culture of Drosophila.</a> Drosophila Protocols. , 585-599 (2000).</li><li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 66 (1), 57-80 (1981).</li><li>Hime, G. R., Brill, J. A., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+ring+canals+in+the+male+germ+line+from+structural+components+of+the+contractile+ring.">Assembly of ring canals in the male germ line from structural components of the contractile ring.</a> J. Cell Sci. 109, 2779-2788 (1996).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M., W, S. u. l. l. i. v. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+analysis+of+spermatocyte+growth+and+male+meiosis+in+Drosophila+melanogaster.">Cytological analysis of spermatocyte growth and male meiosis in Drosophila melanogaster.</a> Drosophila Protocols. , 87-109 (2000).</li><li>Stern, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+of+testes+in+Drosophila.+I.+The+relation+between+vas+deferens+and+testis+within+various+species.">The growth of testes in Drosophila. I. The relation between vas deferens and testis within various species.</a> J. Exp. Zool. 87 (1), 113-158 (1941).</li><li>Lim, J. G. Y., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+cell+lineage+is+required+for+differentiation+and+not+maintenance+of+germline+stem+cells+in+Drosophila+testes.">Somatic cell lineage is required for differentiation and not maintenance of germline stem cells in Drosophila testes.</a> PNAS. 109 (45), 18477-18481 (2012).</li><li>Fuller, M. T., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis.">Spermatogenesis.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 71-147 (1993).</li><li>Braun, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+paternal+chromosomes+with+protamine.">Packaging paternal chromosomes with protamine.</a> Nature Genet. 28 (1), 10-12 (2001).</li><li>G&#246;risch, S. M., Wachsmuth, M., T&#243;th, K. F., Lichter, P., Rippe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+increases+chromatin+accessibility.">Histone acetylation increases chromatin accessibility.</a> J. Cell Sci. 118 (24), 5825-5834 (2005).</li><li>Demerec, M., Kaufmann, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila Guide: Introduction to the Genetics and Cytology of Drosophila melanogaster. , (1996).</li><li>Wang, W., Yoder, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Pupal+Abdomen+Immunohistochemistry.">Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry.</a> J. Vis. Exp. (56), (2011).</li><li>Sang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Quantitative+Nutritional+Requirements+of+Drosophila+Melanogaster.">The Quantitative Nutritional Requirements of Drosophila Melanogaster.</a> J. Exp. Biol. 33 (1), 45-72 (1956).</li><li>Meynadier, G., Vago, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Aseptic rearing of invertebrates for tissue culture. In: Invertebrate tissue culture. 1, (1971).</li><li>Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Price, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+histone+acetyltransferase+activity+by+anacardic+acid+sensitizes+tumor+cells+to+ionizing+radiation.">Inhibition of histone acetyltransferase activity by anacardic acid sensitizes tumor cells to ionizing radiation.</a> FEBS Lett. 580 (18), 4353-4356 (2006).</li><li>Aldaz, S., Escudero, L. M., Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+imaginal+disc+development.">Live imaging of Drosophila imaginal disc development.</a> PNAS. 107 (32), 14217-14222 (2010).</li><li>Niki, Y., Yamaguchi, T., Mahowald, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+stable+cell+lines+of+Drosophila+germ-line+stem+cells.">Establishment of stable cell lines of Drosophila germ-line stem cells.</a> PNAS. 103 (44), 16325-16330 (2006).</li><li>Church, K., Lin, H. P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+microtubules+and+chromosome+movement+during+prometaphase+in+Drosophila+melanogaster+spermatocytes+studied+in+life+and+with+the+electron+microscope.">Kinetochore microtubules and chromosome movement during prometaphase in Drosophila melanogaster spermatocytes studied in life and with the electron microscope.</a> Chromosoma. 92 (4), 273-282 (1985).</li><li>Rebollo, E., Gonz&#225;lez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+spindle+checkpoint+in+Drosophila+spermatocytes.">Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes.</a> EMBO rep. 1 (1), 65-70 (2000).</li><li>Cheng, J., Hunt, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Live+Imaging+of+Stem+Cells+in+Drosophila+Testis.">Time-lapse Live Imaging of Stem Cells in Drosophila Testis.</a> Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 11, 2E.2.1-2E.2.8 (2009).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Das vorgestellte Protokoll beschreibt zwei verschiedene Anwendungen sowohl auf der Basis der Fähigkeit, Drosophila Hoden und Einzelkeimbahn-Zysten bei einer gegebenen Entwicklungsstufe und auf die ex-vivo-Entwicklung der Zellen und Gewebe in der Kulturschale zu sezieren. Eine Anwendung ist die pharmakologische Manipulation der Lebensvorgänge während Spermienentwicklung. Wichtig ist, ermöglicht dies den Zugang zu postmeiotischen Spermatogenese, die nicht einfach mit Hilfe der funktionellen Analysen auf der Basis Fliegengenetik gewonnen wird. Die andere Anwendung ist die mikroskopische Beobachtung lebender und Entwicklung von Keimzellen und Hoden. Gerade diese Anwendung profitiert von der Fähigkeit der Drosophila-Zellen und Organe in Kultur, um zu überleben und zu entwickeln, bei RT und unter normaler Atmosphäre. Daher ist eine invertierte Abbildungsmikroskop mit einem Heiztisch (Erhitzen auf Standardzüchtungstemperatur von 25 ° C) ausgestattet ist ausreichend, um sinnvolle Ergebnisse in Live-Imaging Experimente erhalten. Weitermehr, viele transgenen Fliegen Stämme, fluoreszierende Protein-markierte Proteine ​​für die Live-Darstellung vorhanden oder kann leicht festgestellt werden. Um Puppen Hoden oder Keimbahn-Zysten von einer bestimmten Entwicklungsstufe zu erhalten, ist es wichtig, dass man mit dem Timing der Drosophila-Entwicklung vertraut ist. Der genaue Zeitpunkt für jede Stufe kann zwischen den Laboratorien, Kulturbedingungen variieren und fliegen Stämme und muss empirisch ermittelt werden. Wie oben dargelegt, ist dies besonders wichtig für pharmakologische Tests, die beispielsweise gezielt die HP-Schalter. Für solche Experimente, ist es ratsam, immer überprüfen, für Spermatiden mit einem ProtamineB-eGFP-Signal vor der eigentlichen Hemmstofftest, da der Zeitpunkt kann etwas auch innerhalb einer Population variieren. Nach dem Protokoll über den Experimentator sollte ermöglichen, Hoden vom frühen Puppenstadien als intakte Organe frei von Fett angebracht Körpergewebe zu sezieren. Diese Hoden und, mehr noch, isoliert germ-line Zysten sind sehr zerbrechlich. Daher ist es entscheidend, die manuelle Geschicklichkeit und Erfahrung für den Umgang mit und die Übertragung Hoden und Zysten mit einer Pinzette, Nadeln, und Pipetten notwendig zu entwickeln. Insbesondere Studien Targeting meiotischen und frühen post-meiotischen Keimzellentwicklung würde davon profitieren. Zwar ist es vergleichsweise einfach, Zysten späten Spermatiden mit langen Geisseln von erwachsenen Hoden zerlegen, ist es schwierig zu früheren Stadien zu erhalten. Sezieren diese Zysten von der frühen Puppen Hoden nach diesem Protokoll ist viel effizienter. Beachten Sie, dass in einer üblichen Fliegenstamm, nur ca. 50% der Puppen wird männlich. Daher herzustellen, mindestens doppelt so viele Puppen wie die Anzahl der Hoden erforderlich sezieren. Alternativ ist es möglich, männlich L3 Larven zu identifizieren unter Verwendung eines Stereomikroskops, wie die Hoden kann als durchscheinende runde Organe in den seitlichen Fettkörpergewebe des intakten Larve 23,34 eingebettet identifiziert werden, und sie in frisches Kulturflaschen sammeln, könnenverwendet werden, um vor-Puppen für die Inszenierung und Dissektionen holen werden. Es ist auch möglich, männliche vorge Puppen 35 identifizieren. Wir haben festgestellt, dass sowohl die isolierten Keimbahn-Zysten und die intakten Puppen Hoden in Kultur sind lichtempfindlich, was auch schon zuvor 18 berichtet. Diese Lichtempfindlichkeit könnte auch für einige in der pharmakologischen Tests verwendeten chemischen Verbindungen halten. Daher ist es am besten, die Kulturschalen eines Tests in der Dunkelheit während der Inkubation zu halten. Ebenso bei der Planung Zeitraffer-Imaging Experimente mit der Entwicklung der Hoden und vor allem, isoliert Zysten, bedenken Sie, dass zu lange Belichtungszeiten und / oder zu hohe Abtastraten können ex vivo Entwicklung hemmen. Die entsprechende Abtastrate sollte experimentell ermittelt werden. Bakterien und / oder Pilzinfektionen und Überwachstum in den Kulturschalen stellt ein schwerwiegendes Problem. Infizierte Kulturschalen mit zu vielen Bakterien nicht unterstützt ex vivo devewicklung der Hoden und Zysten. Daher enthält das beschriebene Kulturmedium Penicillin und Streptomycin (siehe Schritt 1.1), aber während der Langzeit-Inkubation, können diese Antibiotika abgebaut werden und ihre Aktivität kann abnehmen. Dies könnte einer der Gründe für die begrenzte Zeit des Überlebens (max. 72 h) bei Verwendung des obigen Protokolls beobachtet kultiviert Zysten. Doch dieses Zeitrahmens nicht durch regelmäßige Erneuerung des Kulturmediums in den Schalen verlängert. Wir schließen, dass andere Faktoren das Überleben in Kultur beeinflussen, wie beispielsweise einen Mangel an Wachstumssignale aus anderen Geweben des Genitaltraktes. Auf der anderen Seite, ist postmeiotischen Entwicklung in Drosophila schneller als bei Säugetieren. Bei Drosophila nimmt Spermiogenese etwa 90 Stunden, und der HP-Schalter zwischen 50 und 60 Stunden nach der Meiose stattfindet 9,12. Somit ist die übliche Überlebenszeit von etwa 48 Stunden mit diesem Protokoll erreicht gut geeignet, um die Schwenkentwicklungsprozesse in spe folgenrmatogenesis wie meiotischen Teilungen oder der HP-Schalter. Obwohl bakterielle oder Pilzbefall kann mit sauberem Werkzeug und Medien vermieden werden kann, hat das vorgestellte Protokoll nicht strikt Verwendung von sterilen Arbeitsbedingungen, weil Fliegen machen und fliegen Hoden enthalten bereits Bakterien, wenn sie unter Standardbedingungen erhöht. Dennoch könnten einige Anwendungen dieser Kulturtechnik von Fliegen seziert profitieren oder sogar unter aseptischen Bedingungen erhöht (für Protokolle, siehe 17,36,37). Pharmakologische Tests hängen von der Verwendung von chemischen Verbindungen, die als Inhibitoren oder Aktivatoren von verschiedenen Enzymen wirkt. Die üblicherweise in solchen Experimenten verwendeten Verbindungen oft sehr unterschiedlich in ihrer Zielspezifität. Als Vorteil bietet diese das Potenzial, ganze Enzymklassen zielen, zum Beispiel mit Anacardsäure Hemmung p300 / CBP, PCAF und MYST Familienmitglieder von HATs 38. Die Kehrseite der Medaille könnten mögliche Off-Target-oder zytotoxische Effekte INDUC seinvon solchen Verbindungen hrsg. Daher sollte jede Verbindung in einem Assay mit Puppen Hoden oder Zysten verwendet für seine Zytotoxizität und spezifische Wirkung bei verschiedenen Konzentrationen getestet werden. Darüber hinaus können leichte Abweichungen in den Kulturbedingungen, die Konzentration der Verbindung oder Aktivität, und Variationen in der Zelldurchlässigkeit, um die Variabilität der induzierten Effekten führen. Daher ist es notwendig, den Erfolg der Behandlung in jedem Experiment überwacht. Zum Beispiel, wenn wir verwendet Anacardinsäure bei 150 uM, beobachteten wir geringe Variabilität in der Festigkeit der Chromatin-Kondensation zwischen Phänotyp und manchmal innerhalb einiger Hoden, während die Acetylierung von Histon H4 konsequent verringert. Pharmakologische Tests mit Drosophila Hoden in Kultur wurden verwendet, um vor und nach der Meiose Mechanismen der Spermatogenese 4,12,14,21 analysieren. Da es schwierig ist, postmeiotischen Spermatogenese mit genetischen Werkzeuge zugreifen, um Spieler mit Essentia Ziell Vor-und Reife meiotischen Funktionen, stellt diese ex vivo Ansatz eine Alternative. Weiterhin Im Prinzip könnte das Verfahren angepasst ist, um Experimente-Chase-Impuls, um die Entwicklung von behandeltem Keimzellen über die Zeit zu verfolgen. Allerdings haben wir noch nicht diese Möglichkeit geprüft. Die Nutzung der frühen Puppen Hoden ist ein Vorteil in der pharmakologischen Tests. Erstens könnte die dünne Außenhülle der jungen Puppen Hoden (ca. 24 h APF) verbesserte Durchlässigkeit von chemischen Verbindungen zu ermöglichen. Zweitens, wenn die Untersuchung der postmeiotischen HP-Schalter, die Puppen Hoden bei 24 Stunden von der APF Protamin-GFP-exprimierenden Fliegenschnur seziert ermöglichen einen direkten Auslesen, ob der HP-Schalter betroffen war oder nicht. Bis heute mehrere Protokolle für die Ex-vivo-Kultivierung von Drosophila Organen und Geweben einschließlich Hoden und Keimbahn-Zysten sind entwickelt worden (siehe zB 4,14,17,20,39,40). Die Kultivierungsmedium und die allgemeinen Bedingungenin der hier vorgestellten wurden im Jahr 1979 gegründet Protokoll 17. das Kultursystem wurde später auf in vivo-Bildgebung des Mechanismus Individualisierung im Spät postmeiotischen Zysten aus adulten Hoden isoliert 4 angepasst. Bisher haben wir berichtet, dass diese Bedingungen Überleben und die Differenzierung der meiotischen und frühen post-meiotischen Keimzellen unterstützt auch in ihrer Zysten für rund 48 HR 12. Im Gegensatz zu anderen Kultursystemen 19 war der beobachtete Entwicklungszeitpunkt in diesen Kulturen etwa im Einklang mit der von Festproben bestimmt (für Details siehe 12) Timing. H2AvD-RFP und Protamin-GFP-Fluoreszenz-Signale können verwendet werden, um die Kernmorphologie und Chromatin Zusammensetzung der Keimzellen in Kultur zu visualisieren. Wir fanden, dass zur eindeutigen Identifizierung von Entwicklungsstufen in der Kultur, das ist gegenüber anderen Kriterien wie Wickeln von Zysten vorteilhaft. Wichtig ist, dass das vorgestellte Protokoll nicht Zusatz von Flug ext beinhaltenract oder anderen als fetales Rinderserum Wachstumsfaktoren. Darüber hinaus zeigen wir hier, dass die Bedingungen mit der Fluoreszenzmikroskopie Bildgebung von meiotischen Teilungen ex vivo in Kultur kompatibel sind. Bilder können mit hinreichender Auflösung in einem einfach zu bedienenden Medium, das langfristige Entwicklung unterstützt, erhalten werden. Dies steht im Gegensatz zu Protokollen ermöglicht kurzfristig (ca. 3 h) Beobachtungen in Voltalef Öl 41,42. Die oben für den Anbau und pharmakologische Behandlung von Hoden und Puppen einzigen männlichen Keimbahn-Zysten beschriebenen Verfahren sind leicht an den vielen genetischen, epigenetischen und zellbiologischen, oder Entwicklungs Fragen, die in Drosophila Spermatogenese erforscht werden kann. Dies umfasst insbesondere die Forschung mit Schwerpunkt auf Keimbahn-Stammzellen. Es hat sich gezeigt, dass Stammzellen Entwicklung kann durch die Bildgebung von kultivierten adulten folgen Hoden 20,43. Allerdings ist die peristaltische Bewegung der reifen Hoden sheath stört Bildaufnahme. Daher wird entweder Bildgebung mit fragmentierten Hoden 43 oder die Anzahl der Bilderzeugungsversuche durchgeführt, muss erhöht werden, um die verlorene Datensätzen 20 Konto erfolgen. Frühe Puppen Hoden (24 h APF) sind noch nicht mit Muskelzellen umgeben. Auch etwas ältere Hoden (36-45 h APF) scheinen einige Peristaltik zeigen (vergleiche Abbildung 3 und Supplemental Video 1). Daher könnte Anbau von jungen Puppen Hoden als intakte Organe als Alternative dienen. Darüber hinaus einmal gemeistert, die Fähigkeit, Puppen Hoden sezieren und schließlich isoliert Keimbahn-Zysten weitere Anwendungen mit einzelnen Zysten als Quelle von einer homogenen, wenn auch klein, Zellpopulation zu ermöglichen. Zum Beispiel ist es somit möglich, RT-qPCR durchführen, um die transkriptionelle Regulation spezifischer Gene in definierten Stufen der Spermatogenese zu analysieren, wie bereits gezeigt, <sup&gt; 15.

Die Entwicklung der männlichen Keimzellen vieler Arten ist eine sequentielle Verfahren. Es wird von einer Reihe von entscheidenden Ereignisse, die in der Bildung von morphologisch und epigenetically hoch spezialisierte Spermatozoen gipfelt gekennzeichnet. In Drosophila melanogaster, Keimbahn-Stammzellen an der Spitze des Hodens Kluft asymmetrisch zu einer neuen Stammzelle und der Spermatogonie, dh die Tochterzelle, die Differenzierung verpflichtet ist (siehe Abbildung 1 für eine Übersicht) geben 1,2 . Die Spermatogonie erfährt vier Runden mitotische Teilungen und mit dem Beginn der Meiose, eine Phase des Wachstums und der eindrucksvollen Transkriptionsaktivität genannt Spermatozyten Bühne. Die Zellen aus einer Ursprungs Spermatogonie bleiben miteinander verbunden und zu entwickeln als Synchronbündel durch zwei somatische Zellen-Struktur als eine Zyste bezeichnet gewickelt. Nach Beendigung der Meiose ist die Morphologie der männlichen Keimzellen völligreorganisiert (schematisch in 1 gezeigt). Zunächst runden Spermatiden länglich, um die hydrodynamische Kopfstruktur bilden, und die Geißel entwickelt. 5 - schließlich werden die Spermazellen, die voneinander durch einen Komplex, der Apoptose-verwandten Mechanismus genannt Individualisierung 3 getrennt. In vielen Spezies, einschließlich Drosophila melanogaster und Säugerspezies, die morphologischen Veränderungen der Keimzellen sind durch eine bemerkenswerte epigenetische Umlagerung des haploiden männlichen Keimbahn-Chromatin begleitet, genannt die Histon-zu-Protamin Schalter (Druckschalter) 6 - 9. Eventuell fast alle kanonischen Histon und viele Histon-Variante Moleküle aus der DNA abgezogen und durch kleine basische Proteine, Protamine, was zu der sehr kompakten nucleoprotamine spezifische Struktur des Chromatins von reifem Sperma ersetzt. Allgemeine Eigenschaften der HP-Schalter sind Ter Ersatz von kanonischen Histone zuerst Histonvarianten, dann durch Übergangs Proteine ​​und schließlich durch Protamine. 12 - all das wird durch mehrere Änderungen an epigenetischen Markierungen, wie zB ein Anstieg der Acetylierung von Histon H4 Ebenen kurz vor Histon Entfernung 7,10 begleitet. Die meisten, wenn nicht alle der oben genannten Verfahren sind für die Entwicklung von reifen, vollständig fruchtbare Samen. Dies gilt nicht nur in Drosophila, sondern auch bei Menschen, wie Säuger Spermatogenese teilt eine beträchtliche Ähnlichkeit mit dem wirbellosen System 1,8,9. Studium männlichen Keimzellentwicklung wird stark in der Drosophila-Modellsystem erleichtert. Fliegen sind genetisch sehr gut zugänglich. Der Erzeugung von Mutanten sowie die Einrichtung von Flug Stämme, die Fusionsgene oder RNA-Interferenz-Konstrukte nimmt wenig Aufwand. Jedoch in der Studie von postmeiotischen Spermatogenese, die Verwendung von Mutanten einesd einfachen genetischen Werkzeuge könnte eine Grenze zu erreichen. In Drosophila Spermatogenese, hört Transkription fast vollständig mit dem Eintritt in meiotischen Teilungen. 16 - So wird postmeiotischen Spermatogenese vor allem auf translational drückt und gespeichert mRNAs in einer erweiterten meiotischen Prophase 13 synthetisiert basiert. Daher Tools wie RNA-Interferenz oder die Verwendung von nicht-bedingte Mutanten sind nicht geeignet für die Untersuchung speziell auf die post-meiotischen Rollen von Gen-Produkte, die auch wesentliche Funktionen in der Vor-oder meiotischen Reifekeimzellentwicklung zu erfüllen. Ein Vorteil von Drosophila, die in solchen Fällen ausgenutzt werden kann, ist die Fähigkeit des intakten Hoden seziert und sogar Zysten von Keimzellen ex vivo in einem Kulturmedium zu entwickeln 4,12,17 - 20. Die Präparation und Kultivierung von Hoden oder Keimbahn-Zysten lassen sich nicht nur mikroskopische Beobachtung der Keimzellentwicklung in lebenden Zellen, sondern einelso die Verwendung pharmakologischer Tests mit beispielsweise Inhibitoren der Enzymkomplexe, wie Histonacetyltransferasen (Hut), Histon-Deacetylasen (HDACs), Topoisomerasen, oder das Proteasom. So ist es möglich, während der enzymatischen Funktionen postmeiotischen Spermatogenese zu manipulieren und die Entwicklungsergebnisse unabhängig von embryonalen, Pre-meiotischen oder meiotischen Funktionen 4,12 überwachen. In pharmakologischen Tests, die wir zuvor analysierten die Acetylierung abhängige Lokalisation eines Proteins während der Meiose Bromodomäne Prophase sowie die Relevanz der Histon-Acetylierung Stufen für die epigenetischen Schalter in HP postmeiotischen Spermatogenese durch spezifische Inhibitoren Targeting Hüte und HDACs 12,21. Zur Förderung der Druckschalter in diesen Assays wurde unter Verwendung eines Flug Stamm, der das Fusionsgene histone2AvD-RFP und protamineB-eGFP 12,22 in den endogenen Muster ausdrückt möglich gemacht, und die Beobachtung, dassdie ersten Spermatiden in Puppen Hoden passieren die HP-Schalter zwischen 24 und 48 h APF 12. Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Präparation der Hoden und Zysten von Drosophila Puppen, den Kulturbedingungen und pharmakologischer Test mit intakten Puppen Hoden. Zu diesem Zweck Puppen Hoden bei rund 24 Stunden nach der Pupariumbildung (APF) seziert werden (siehe Abbildungen 1 und 2). Zu diesem Zeitpunkt wurden die Hoden nicht Verbindungen zu anderen Geweben und sind nur von einer dünnen äußeren Hülle, die eine bessere Penetration durch die Inhibitorverbindungen ermöglicht 23,24 umgeben. Die Hoden Bohnen- oder birnenförmige Organe, die leicht in Kultur genommen werden kann. Diese Hoden seziert, kultiviert und mit spezifischen Inhibitoren behandelt. Anschließend werden die Wirkungen der Inhibitoren mittels Immunfluoreszenz analysiert und Fluoreszenzmikroskopie von Fusionsproteinexpressions überwacht, und durch Vergleich der Kern Morphollogie der behandelten Keimzellen, um die von unbehandelten Keimzellen. Die in diesem Protokoll vorgeBedingungen erlauben auch die Live-Darstellung der Entwicklung von Hoden und Keimbahn-Zysten in der Kultur.

<table><tbody><tr><td>Anacardic acid</td><td>Merck Millipore</td><td>172050</td><td>brand: Calbiochem (EMD Millipore)</td></tr><tr><td>Anti-acetyl-Histone H4</td><td>Merck Millipore</td><td>06-598</td><td>brand: Upstate</td></tr><tr><td>AxioCam MRm&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioObserver.Z1 inverted microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 5-Inox forceps</td><td>Dumont</td><td></td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Fiber optical&amp;nbsp; illuminator</td><td></td><td></td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Glass Bottom Microwell Dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG (H+L)-Cy5</td><td>Dianova</td><td>711-175-152</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Sigma</td><td>B1155</td><td></td></tr><tr><td>Inoculation loop or pin holder</td><td></td><td></td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Austerlitz INSECT PINS stainless steel needles, size 0</td><td>Plano GmbH</td><td>N5018</td><td>In our hands both of these pin sizes worked well in the dissections. The minutiens are less rigid but have a smaller tip diameter.</td></tr><tr><td>Austerlitz INSECT PINS stainless steel minutiens, diam. 0.1 mm</td><td>Plano GmbH</td><td>N5014</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell plates, 24-wells</td><td>Becton Dickinson</td><td>351147</td><td>brand: Falcon</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>invitrogen</td><td>15070</td><td>brand: Gibco</td></tr><tr><td>Shields and Sang M3 Insect Medium</td><td>Sigma</td><td>S8398</td><td></td></tr><tr><td>Stemi SV6 binocular</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo culture of drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment

Während der Spermatogenese bei Säugetieren und in Drosophila melanogaster, entwickeln männlichen Keimzellen in einer Reihe von grundlegenden Entwicklungsprozessen. Dazu gehört die Differenzierung von einer Stammzellpopulation, mitotische Verstärkung, und Meiose. Darüber hinaus postmeiotischen Keimzellen durchlaufen eine dramatische morphologische Umformung sowie eine globale epigenetische Rekonfiguration der Keimbahn Chromatin-Histon-zu-Protamin-Schalter. Untersuchung der Rolle von einem Protein in postmeiotischen Spermatogenese Mutagenese oder andere genetische Werkzeuge oft von wesentlicher embryonalen, vorge meiotischen oder meiotischen Funktionen des untersuchten Proteins behindert. Die postmeiotischen Phänotyp einer Mutante eines solchen Proteins kann durch einen früheren Entwicklungs Block verdeckt werden oder die Interpretation des Phänotyps kompliziert werden könnte. Der Modellorganismus Drosophila melanogaster bietet einen Bypass für dieses Problem: intakte Hoden undsogar Zysten von Keimzellen von der frühen Puppen seziert der Lage sind, ex vivo in Kulturmedium zu entwickeln. Die Nutzung von solchen Kulturen ermöglicht mikroskopische Abbildung von lebenden Keimzellen in den Hoden und der Keimbahn-Zysten. Wichtig ist, dass die kultivierten Hoden und Keimzellen auch zugänglich pharmakologische Inhibitoren werden, wodurch Manipulation der enzymatischen Funktionen erlauben während der Spermatogenese, einschließlich postmeiotischen Stufen. Das vorgestellte Protokoll beschreibt, wie man sezieren und zu pflegen Puppen Hoden und Keimbahn-Zysten. Informationen über die Entwicklung des Puppen Hoden und Kulturbedingungen werden neben Mikroskop-Bilddaten des lebenden Hoden und Keimbahn-Zysten in Kultur bereitgestellt. Wir beschreiben auch eine pharmakologische Assays zu postmeiotischen Spermatogenese, durch einen Test zur Förderung der Histon-zu-Protamin-Schalter mit dem Histon-Acetyltransferase-Inhibitor Anacardsäure beispielhaft zu studieren. Im Prinzip könnte diese Kultivierungsmethode angepasst werden, um viele O-Adressether Forschungsfragen in Pre-und Post-meiotischen Spermatogenese.

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Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Ex-vivo-Kultur von Drosophila Pupal Hoden und Single männlichen Keim Online-Zysten: Dissection, Imaging und pharmakologische Behandlung

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

ex-vivo-culture-drosophila-pupal-testis-single-male-germ-line-cysts

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

17.4K Aufrufe.  Philipps-Universität Marburg. This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Serie: Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for investigating the cell biology and development of central brain structures by allowing acute pharmacological interventions and live imaging of cellular processes. As an example of the technique, prior work from our lab1 has shown that a previously unrecognized subcellular compartment lies between the axonal and somatodendritic compartments of axons of the Drosophila central brain. The development of this compartment, referred to as the axon initial segment (AIS)2, was shown genetically to depend on the neuron-specific cyclin-dependent kinase, Cdk5. We show here that ex vivo treatment of wild-type Drosophila larval brains with the Cdk5-specific pharmacological inhibitors roscovitine and olomoucine3 causes acute changes in actin organization, and in localization of the cell-surface protein Fasciclin 2, that mimic the changes seen in mutants that lack Cdk5 activity genetically.
A second example of the ex vivo culture technique is provided for remodeling of the connections of embryonic mushroom body (MB) gamma neurons during metamorphosis from larva to adult. The mushroom body is the center of olfactory learning and memory in the fly4, and these gamma neurons prune their axonal and dendritic branches during pupal development and then re-extend branches at a later timepoint to establish the adult innervation pattern5. Pruning of these neurons of the MB has been shown to occur via local degeneration of neurite branches6, by a mechanism that is triggered by ecdysone, a steroid hormone, acting at the ecdysone receptor B17, and that is dependent on the activity of the ubiquitin-proteasome system6. Our method of ex vivo culturing can be used to interrogate further the mechanism of developmental remodeling. We found that in the ex vivo culture setting, gamma neurons of the MB recapitulated the process of developmental pruning with a time course similar to that in vivo. It was essential, however, to wait until 1.5 hours after puparium formation before explanting the tissue in order for the cells to commit irreversibly to metamorphosis; dissection of animals at the onset of pupariation led to little or no metamorphosis in culture. Thus, with appropriate modification, the ex vivo culture approach can be applied to study dynamic as well as steady state aspects of central brain biology.

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

This article describes a method by which one can mimic in vivo development of the Drosophila mushroom body in an ex vivo culture system.

Ex vivo Kultivierung von Whole, Entwickeln von Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

Forschung

Neurowissenschaften

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

Bildgebung und Analyse der Gewebeorientierung und Wachstumsdynamik in der Entwicklung drosophila Epithelia während der Pupal-Stadien

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Entwicklungsbiologie

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

Vorbereitung von Drosophila Larval und Pupal Hoden für die Analyse der Zellteilung in Leben, intaktes Gewebe

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, germ cell development, piRNA biology, and niche formation. Here, we present a dissection technique to live-image the gonad ex vivo during a period when in vivo live-imaging is highly ineffective. This protocol outlines how to transfer embryos to an imaging dish, choose appropriately-staged male embryos, and dissect the gonad from its surrounding tissue while still maintaining its structural integrity. Following dissection, gonads can be imaged using a confocal microscope to visualize dynamic cellular processes. The dissection procedure requires precise timing and dexterity, but we provide insight on how to prevent common mistakes and how to overcome these challenges. To our knowledge this is the first dissection protocol for the Drosophila embryonic gonad, and will permit live-imaging during an otherwise inaccessible window of time. This technique can be combined with pharmacological or cell-type specific transgenic manipulations to study any dynamic processes occurring within or between the&#160;cells in their natural gonadal environment.

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Here, we provide a dissection protocol required to live-image the late embryonic Drosophila male gonad. This protocol will permit observation of dynamic cellular processes under normal conditions or after transgenic or pharmacological manipulation.

Dissektion und Live-Imaging der späten embryonalen Drosophila-Gonade

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolierung von Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Biologie

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, cell differentiation and organogenesis 1. Correct preparation of the experimental samples is a crucial, often neglected, step. The goal of preparation is to ensure physiological relevance and to establish optimal imaging conditions. To maintain tissue viability, it is critical to avoid dehydration, hypoxia, overheating or medium deterioration 2. 
 The Drosophila egg chamber is a well established system for examining questions relating, but not limited, to body patterning, mRNA localization and cytoskeletal organization 3,4. For early- and mid-stage egg chambers, mounting in halocarbon oil is good for survival in that it allows free diffusion of oxygen, prevents dehydration and hypoxia and has superb optical properties for microscopy. Imaging of fluorescent proteins is possible through the introduction of transgenes into the egg chamber or physical injection of labeled RNA, protein or antibodies 5-7. For example, addition of MS2 constructs to the genome of animals enables real time observation of mRNAs in the oocyte 8. These constructs allow for in vivo labeling of mRNA through utilization of the MS2 bacteriophage RNA stem loop interaction with its coat protein 9. 
 Here, we present a protocol for the extraction of ovaries as well as isolating individual ovarioles and egg chambers from the female Drosophila. For a detailed description of Drosophila oogenesis see Allan C. Spradling (1993, reprinted 2009) 10.

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

The Drosophila egg chamber is an excellent model for studying the mechanisms of mRNA localization. In order to capture the dynamic events that underpin the processes of localization, rapid high resolution imaging of live tissue is required. Here, we present a protocol for dissection and imaging of live samples with minimal disruption.

Der Ausarbeitung der einzelnen Drosophila Ei Chambers für Live-Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Imaging Centrosomes in Fly Testes

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell differentiation. Centrosomes are essential to determine the cell division axis during mitosis and to nucleate cilia during interphase. The identity of the proteins that mediate these dynamic changes remains only partially known, and the function of many of the proteins that have been implicated in these processes is still rudimentary. Recent work has shown that Drosophila spermatogenesis provides a powerful system to identify new proteins critical for centrosome function and formation as well as to gain insight into the particular function of known players in centrosome-related processes. Drosophila is an established genetic model organism where mutants in centrosomal genes can be readily obtained and easily analyzed. Furthermore, recent advances in the sensitivity and resolution of light microscopy and the development of robust genetically tagged centrosomal markers have transformed the ability to use Drosophila testes as a simple and accessible model system to study centrosomes. This paper describes the use of genetically-tagged centrosomal markers to perform genetic screens for new centrosomal mutants and to gain insight into the specific function of newly identified genes.

Imaging of centrosomal proteins during Drosophila spermatogenesis is a powerful method to identify new proteins critical for centrosome biology as well as to elucidate the particular function of known players in this process.

Imaging Zentrosomen in Fly Hoden

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

Die zytologische Analyse der Spermatogenese: Live-und Fest Zubereitungen aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Hoden

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and organogenesis. Immunostaining allows for the visualization of developing tissues and organs. However, a protective cuticle that forms at the end of embryogenesis prevents permeation of antibodies into late-stage embryos and larvae. While dissection prior to immunostaining is regularly used to analyze Drosophila larval tissues, it proves inefficient for some analyses because small tissues may be difficult to locate and isolate. Sonication provides an alternative to dissection in larval Drosophila immunostaining protocols. It allows for quick, simultaneous processing of large numbers of late-stage embryos and larvae and maintains in situ morphology. After fixation in formaldehyde, a sample is sonicated. Sample is then subjected to immunostaining with antigen-specific primary antibodies and fluorescently labeled secondary antibodies to visualize target cell types and specific proteins via fluorescence microscopy. During the process of sonication, proper placement of a sonicating probe above the sample, as well as the duration and intensity of sonication, is critical. Additonal minor modifications to standard immunostaining protocols may be required for high quality stains. For antibodies with low signal to noise ratio, longer incubation times are typically necessary. As a proof of concept for this sonication-facilitated protocol, we show immunostains of three tissue types (testes, ovaries, and neural tissues) at a range of developmental stages.

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

Beschallung-erleichtert Immunfluoreszenzfärbungen der Late-Stage embryonalen und Larven<em&gt; Drosophila</em&gt; Gewebe<em&gt; In-situ</em

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and ...

Ex-vivo-Kultur von Drosophila Pupal Hoden und Single männlichen Keim Online-Zysten: Dissection, Imaging und pharmakologische Behandlung

Zusammenfassung

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