Este trabalho foi apoiado por subsídios do projeto # 1010395 (BQ e PB) e # 525431 (CR), e um Programa de Grant # 455395 (CP) do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica da Austrália, um Centro Australiano para Hepatite e HIV Virologia EOI 2012 bolsa (CR e RJJ) e uma bolsa da Fundação Bootes Gordon and Gretel (BQ e CR). Queremos agradecer Harpreet Vohra e Michael Devoy por sua excelente manutenção do laboratório JCSMR FACS, a Facilidade Australian Cancer Research Foundation Biomolecular Resource, JCSMR, ANU, para síntese de peptídeos, e Dr. David Boyle, CSIRO Animais Laboratórios de Saúde, Geelong, Austrália por fornecer os estoques de vacinas HIV pais.

<ol>
	<li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+target+array+killing+assay:+A+multiplex+cytotoxic+T-cell+assay+to+measure+detailed+T-cell+antigen+specificity+and+avidity+in+vivo.">Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo.</a> Cytometry A. 81, 679-690 (2012).</li><li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+target+array+T+helper+assay:+a+multiplex+flow+cytometry+assay+to+measure+antigen-specific+CD4++T+cell-mediated+B+cell+help+in+vivo.">Fluorescent target array T helper assay: a multiplex flow cytometry assay to measure antigen-specific CD4+ T cell-mediated B cell help in vivo.</a> J Immunol Methods. 387, 181-190 (2013).</li><li>Quah, B. J., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+methods+for+measuring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+using+CFSE-like+fluorescent+dyes.">New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes.</a> J Immunol Methods. 379, 1-14 (2012).</li><li>Mata, M., Paterson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th1+T+cell+responses+to+HIV-1+Gag+protein+delivered+by+a+Listeria+monocytogenes+vaccine+are+similar+to+those+induced+by+endogenous+listerial+antigens.">Th1 T cell responses to HIV-1 Gag protein delivered by a Listeria monocytogenes vaccine are similar to those induced by endogenous listerial antigens.</a> J Immunol. 163, 1449-1456 (1999).</li><li>Earl, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+evaluation+of+multi-gene,+multi-clade+HIV-1+MVA+vaccines.">Design and evaluation of multi-gene, multi-clade HIV-1 MVA vaccines.</a> Vaccine. 27, 5885-5895 (2009).</li><li>Wild, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+evaluation+of+the+immunogenicity+of+C-type+HIV-1-based+DNA+and+NYVAC+vaccines+in+the+Balb/C+mouse+model.">Preclinical evaluation of the immunogenicity of C-type HIV-1-based DNA and NYVAC vaccines in the Balb/C mouse model.</a> Viral Immunol. 22, 309-319 (2009).</li><li>Takeshita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+the+same+HIV+peptide+functionally+binding+to+both+a+class+I+and+a+class+II+MHC+molecule.">Molecular analysis of the same HIV peptide functionally binding to both a class I and a class II MHC molecule.</a> J Immunol. 154, 1973-1986 (1995).</li><li>Krutzik, P. O., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+cell+barcoding+in+flow+cytometry+allows+high-throughput+drug+screening+and+signaling+profiling.">Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling.</a> Nature Methods. 3, 361-368 (2006).</li><li>Gilbert, D. F., Wilson, J. C., Nink, V., Lynch, J. W., Osborne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+labeling+of+viable+cells+for+high-throughput+analysis+of+glycine+receptor+function+using+flow+cytometry.">Multiplexed labeling of viable cells for high-throughput analysis of glycine receptor function using flow cytometry.</a> Cytometry A. 75, 440-449 (2009).</li><li>Quah, B. J., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester+(CFSE)+to+monitor+lymphocyte+proliferation.">The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester.">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).</li><li>Durward, M., Harms, J., Splitter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+specific+killing+assay+using+CFSE+labeled+target+cells.">Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Hermans, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+VITAL+assay:+a+versatile+fluorometric+technique+for+assessing+CTL-+and+NKT-mediated+cytotoxicity+against+multiple+targets+in+vitro+and+in+vivo.">The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL- and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo.</a> J Immunol Methods. 285, 25-40 (2004).</li><li>Busch, D. H., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+affinity+maturation+by+selective+expansion+during+infection.">T cell affinity maturation by selective expansion during infection.</a> J Exp Med. 189, 701-710 (1999).</li><li>Savage, P. A., Boniface, J. J., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+basis+for+T+cell+receptor+repertoire+selection+during+an+immune+response.">A kinetic basis for T cell receptor repertoire selection during an immune response.</a> Immunity. 10, 485-492 (1999).</li><li>Wang, X. L., Altman, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveats+in+the+design+of+MHC+class+I+tetramer/antigen-specific+T+lymphocytes+dissociation+assays.">Caveats in the design of MHC class I tetramer/antigen-specific T lymphocytes dissociation assays.</a> J Immunol Methods. 280, 25-35 (2003).</li><li>von Essen, M. R., Kongsbak, M., Geisler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+behind+functional+avidity+maturation+in+T+cells.">Mechanisms behind functional avidity maturation in T cells.</a> Clin Dev Immunol. , (2012).</li><li>Prussin, C., Metcalfe, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intracytoplasmic+cytokine+using+flow+cytometry+and+directly+conjugated+anti-cytokine+antibodies.">Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies.</a> J Immunol Methods. 188, 117-128 (1995).</li><li>Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intracellular+cytokines+by+flow+cytometry.">Detection of intracellular cytokines by flow cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. , (2007).</li><li>Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+solid-phase+enzyme-linked+immunospot+(ELISPOT)+assay+for+enumeration+of+specific+antibody-secreting+cells.">A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells.</a> J Immunol Methods. 65, 109-121 (1983).</li><li>Klinman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELISPOT+assay+to+detect+cytokine-secreting+murine+and+human+cells.">ELISPOT assay to detect cytokine-secreting murine and human cells.</a> Curr Protoc Immunol. , (2008).</li><li>Yerly, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+cytotoxic+T-lymphocyte+epitope+variant+cross-recognition+and+functional+avidity+are+associated+with+hepatitis+C+virus+clearance.">Increased cytotoxic T-lymphocyte epitope variant cross-recognition and functional avidity are associated with hepatitis C virus clearance.</a> J Virol. 82, 3147-3153 (2008).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A vantagem de ensaios baseados em TLC é que eles permitem a discriminação de&gt; 250 populações de células alvo viável e completamente funcional a partir de um único animal hospedeiro por citometria de fluxo. Isso proporciona um nível de complexidade para in vivo fluem ensaios baseados citometria de que não foi possível antes. Isto é realçado nas duas experiências com animais mostradas acima, em que as respostas aos epítopos virais 7 distintas em 6 concentrações poderiam ser monitorizadas em replicados de 6, simultaneamente, num único animal permitindo que os parâmetros tais como a AUC e EC 50 para ser determinada para as respostas de células T in vivo . Além de medir as respostas das células T in vivo, os ensaios baseados em TLC pode ser modificada para medir as respostas in vitro 1. Isto essencialmente envolve a adição de FTAs às células T em cultura para medir as respostas ao longo de várias horas in vitro. Uma limitação potencial em ensaios baseados em vitro utilizando FTAs é tele tendência para as células marcadas dentro do FTA para transferir o corante rotulagem para células vizinhas 1, 3. Isso pode resultar numa diminuição da resolução de cachos de células FTA como sua fluorescência torna-se menos distintas entre cada população. Isto é mais aparente em ensaios in vitro, em comparação com ensaios in vivo, porque as células estão em estreita proximidade para os longos períodos de tempo em ensaios in vitro. Esta perda de resolução de populações de células FTA pode ser minimizada em ensaios in vitro, através da redução do tempo de cultura de células T com TLCs efectoras e usando TLCs que têm uma menor população de células alvo que possuem uma maior quantidade de &quot;espaço fluorescente&quot; entre eles de modo que a transferência de corante tem menos impacto. Também notaram perda de resolução de populações de células FTA quando ALCs foram colocadas in vivo por 48 horas 1. Isto parece ser o resultado de células alvo B no prolife TLCclassificação e reduzindo, assim, a intensidade de fluorescência do corante. Isto é provavelmente um resultado de células B que apresentam o antigénio cognato para efectoras específicas de antigénio de células T CD4 +, que resultaram na estimulação das células B. Por conseguinte, recomenda-se que o ensaio de ser limitada a ~ 24 horas ou menos, quando os alvos de células B estão a ser monitorizados. A capacidade de rotular várias (&gt; 96) grupos de células únicas fluorescente foi relatado anteriormente o uso de células não viáveis ​​fixas 8. A coloração das células vivas, no entanto, tem sido mais problemática com a disponibilidade de corantes vitais compatíveis, e apenas 8-12 células viáveis ​​aglomerados foi conseguido anteriormente 9. A capacidade de gerar&gt; 250 unicamente marcados com fluorescência de células viáveis ​​e funcionamento aqui relatados, baseia-se nas propriedades de CFSE como corantes vitais. Vários desses corantes, como o CTV e CPD, apenas recentemente se tornaram disponíveis. Estes corantes têm as características de ser capaz demarcação das células com uma alta intensidade de fluorescência, que é de longa vida e de baixa variação 3. Estas propriedades, juntamente com o facto de que existe uma relação linear (em particular no caso de CFSE e CTV) entre a concentração do corante utilizado para a rotulagem e a intensidade da fluorescência das células marcadas, significa que as células podem ser marcadas com vários (se a 7 mostrado aqui) intensidades de cada tipo de corante que pode ser facilmente distinguido por citometria de fluxo. Além disso, uma vez que a emissão de fluorescência de CFSE, CPD e CTV ter uma sobreposição espectral mínima, podem ser utilizados em combinação para identificar células, permitindo, assim, até&gt; 250 assinaturas de células fluorescentes para ser detectada por citometria de fluxo. Deve notar-se que, a fim de alcançar a marcação das células com este número de assinaturas fluorescentes discernível, é importante que a marcação das células é realizada rapidamente 10, 11 (para gerar baixa variação da fluorescência) e num tampão apropriado contendoaminas livres 3 (para tamponar a toxicidade do corante que de outro modo pode ocorrer com estas tintas em altas concentrações). Também é fundamental que durante a aquisição de ACL por citometria de fluxo que as flutuações errôneas em evento de fluorescência são monitorados (por exemplo através da medição CFSE, CTV e / ou CPD intensidade de fluorescência ao longo do tempo). Isto é importante porque essas flutuações evento fluorescência que são devido a máquina apresentou erros podem resultar em má interpretação correta posicionamento do conjunto célula-alvo que por sua vez pode resultar em erros nas medidas finais da T efetoras função celular. Tal citómetro erros introduzidos pode ser limitado, assegurando amostras de alta qualidade são preparados (especialmente prestando atenção para filtrar as células através de uma malha de 70 um para minimizar a obstrução das linhas de fluidos no citómetro de fluxo por grandes agregados de células) e que o citómetro de fluxo é mantida a alto padrão. Medição das respostas de células T in vivofoi realizado durante muitos anos utilizando corantes vitais, tais como CFSE para monitorar a morte as células alvo in vivo 12. Normalmente estes ensaios, no entanto, só foram capazes de monitorar até 7-8 células-alvo diferentes de uma só vez 13 e assim fornecer uma capacidade limitada para avaliar assassinato de alvos que expressam várias concentrações de múltiplos epitopos que são normalmente necessários para gerar uma avaliação detalhada dos parâmetros como a avidez funcional de respostas de células T. A este respeito, os ensaios de tetrâmero de dissociação pode ser usado para fornecer uma medida de T avidez células isoladas de fresco a partir de células T efectoras 14-16. Esta técnica, no entanto, mede MHC / TCR avidez de ligação, e por isso não é uma reflexão completa de avidez funcional, que também pode depender de mudanças na estrutura da sinapse imunológica eo estado de células T sinalização componentes 17. Portanto, idealmente, a avidez funcional requer experiências de dose-resposta para ser executada. Estefoi realizado anteriormente utilizando técnicas in vitro tais como o ensaio de 51 Cr de libertação, o ensaio de coloração de citocinas intracelulares 18, 19 ou o ensaio ELISPOT 20, 21. Estas técnicas, no entanto, muitas vezes requerem que as células T efectoras de ser estimuladas in vitro, o que pode alterar a avidez funcional global da população 22. Os ensaios de TLC, por isso, apresenta uma melhoria em relação às técnicas existentes, medindo células T CD4 + e CD8 + T célula dose-resposta in situ, em tempo real contra múltiplos epitopos em simultâneo, e proporcionando assim uma adição valiosa às técnicas existentes para medir a célula T função efetora. Prevemos que o uso de tecnologia de TLC pode tornar-se útil em estratégias de imunoterapia de rastreio concebidos para gerar respostas de alta qualidade de células T, tais como as vacinas dirigidas contra o HIV-1 e hepatite C.

As células T desempenham um papel central na resposta imune adaptativa e são frequentemente alvo de manipulação em imunoterapia. As células CD4 + T efectoras responder ao antigénio estranho pela secreção de citocinas que regulam muitos aspectos da imunidade e também podem ajudar directamente as células B para fabricar anticorpos. As células T citotóxicas CD8 + (CTLs) podem também responder ao antigénio estranho pela secreção de citocinas, bem como desempenha um papel central em matar directamente as células que expressam um antigénio estranho. A interacção fundamental que inicia estas funções efectoras de células T envolve a interacção do receptor de células T (TCR) com peptídeos estranhos apresentados em moléculas de MHC na superfície das células. As células CD4 + T reconhecem péptidos apresentados em moléculas de MHC de classe II nas células que apresentam os antigénios e células T CD8 + reconhecem péptidos apresentados em moléculas de MHC de classe I que são normalmente apresentadas em células microbianas infectado. Em ordempara avaliar o papel de células T desempenham na resposta imune, é essencial que as suas funções efectoras são medidos por técnicas fiáveis ​​e sensíveis. Os métodos comuns de avaliação de resposta das células T incluem; MHC class-I/II/peptide tetramer reatividade; produção de citocinas por ELISPOT e coloração de citocinas intracelulares; e matando a capacidade em 51 ensaios de Cr-lançamento. Estes ensaios, no entanto, são tipicamente realizados ex vivo com estimulação in vitro, ou fornecer uma visão limitada em função das células T. Idealmente, ao medir as respostas das células T, seria benéfico para os avaliar in situ, in vivo à medida que ocorrem, sem a manipulação de células T, de modo a evitar alterações nos parâmetros funcionais que podem ocorrer através de estimulação in vitro. Alguns dos mais vulgarmente usados ​​em células T ensaios funcionais in vivo são baseados na medição de morte por CTL mediada de células alvo pulsadas com péptidos do MHC de classe I de ligação, que são enumerados in vivovia sua detecção através de marcação fluorescente com corantes vitais como CFSE. Embora estes tipos de ensaios podem monitorar morte mediada por CTL de metas quando acontecem in vivo, eles já tinham uma capacidade relativamente limitada para avaliar a morte de múltiplos alvos que apresentam diferentes concentrações e tipos diferentes de epítopos peptídicos, que é necessário para permitir que os parâmetros qualitativos, tais avidez tão funcional e variante epítopo reatividade cruzada a ser avaliado. Estes ensaios também não fornece nenhuma informação sobre as respostas mediadas por células T CD4 +. Para superar muitas das limitações com os métodos atuais usados ​​para avaliar as respostas das células T, que recentemente desenvolveu um ensaio multiplex com base em matrizes fluorescentes alvo (ACL), que permite o monitoramento de respostas de células T contra&gt; 250 células alvo simultaneamente em um animal por citometria de fluxo 1, 2. FTAs são compostas de linfócitos marcados com SEVeral concentrações e combinações de corantes vitais como CFSE, CTV e CPD permitindo&gt; 250 grupos de células de fluorescência único a ser gerado. Uma vez que estas células permanecem viáveis ​​e completamente funcional, que pode ser injectado no animal para permitir a monitorização da sua interacção com células T efectoras in vivo 3. Por exemplo, os agregados de células FTA podem ser pulsadas com péptidos do MHC-I de ligação à classe para permitir a avaliação de morte por CTL específica de antigénio mediada por células-alvo 1. Além disso, os agregados de células FTA também podem ser pulsadas com péptidos de MHC de classe II de ligação, permitindo a avaliação do antigénio específico para a célula T auxiliar (T H), avaliando a actividade de activação (por avaliação de marcadores de activação, como CD69, CD44 e / ou CD62L) de células B dentro do FTA rolamento peptídeo cognato 2. Uma vez que mais de 250 alvos pode ser detectado em simultâneo, é possível medir as respostas de CTL e de T H contra muitos grupos de células alvo pulsadas com npeptídeos umerous em diferentes concentrações ea inclusão de muitas repetições. Por isso, o ensaio FTA fornece um nível sem precedentes de avaliação da resposta das células T efetoras in vivo. Aqui, descrevemos em pormenor a construção de um FTA e mostram como podem ser aplicados para avaliar as respostas de células T in vivo. O processo descreve a construção de um FTA composta de 252 agrupamentos de células discerníveis por meio da utilização de três corantes vitais, composta de seis repetições de 42 conjuntos de células pulsadas com o MHC de classe I e II, os péptidos de ligação. A rotulagem de 42 conjuntos de células ocorre em 10 ml de fundo cónico de tubos e que é útil para colocar estes em um suporte para tubos, conforme ilustrado na Tabela 1. Esse método pode ser ajustado para um número menor de aglomerados discerníveis como requerido ao reduzir a quantidade de rotulagem de cada corante realizada 1. Destaca-se a utilidade do ensaio, mostrando como ele pode medir responses geradas pela vacinação pox-vírus recombinante contra múltiplos epitopos em um pequeno grupo de ratos. Isto mostra como o ensaio de TLC pode ser usado para medir as respostas cumulativas e avidez funcional através de, respectivamente, o uso da área sob a curva (AUC) de avaliações e medições da concentração de péptido eficaz necessária para produzir respostas máximas metade (EC 50).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">RPMI</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R8758</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:71px;">Serana</td>
			<td style="width:119px;">FCS-500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">CTV</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C34557</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">CFDA, SE</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C1157</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">CPD</td>
			<td style="width:71px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">65-0840-90</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">anti-B220 PerCp-Cy5.5</td>
			<td style="width:71px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">110730</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">anti-CD69 brilliant violet 605</td>
			<td style="width:71px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">104529</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">PKH-26</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">PKH26GL-1KT</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">EQUIPMENT:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Material Name</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Vortex</td>
			<td style="width:71px;">Scientific Industries Inc&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Flow cytometer (Fortessa or equivalent with blue, red and violet laser source)</td>
			<td style="width:71px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of fluorescent target arrays for assessment of t cell responses in vivo

A capacidade de monitorar as respostas das células T in vivo é importante para o desenvolvimento da nossa compreensão da resposta imune e da criação de imunoterapias. Aqui nós descrevemos o uso de tecnologia de matriz alvo fluorescente (FTA), que utiliza corantes vitais, tais como éster carboxifluoresceína succinimidyl (CFSE), corantes excitáveis ​​a laser violeta (violeta CellTrace: CTV) e corantes excitáveis ​​de laser vermelho (celular Proliferação Dye eFluor 670: CPD ) para combinatorialmente linfócitos etiqueta rato em&gt; 250 agrupamentos de células fluorescentes discerníveis. Aglomerados de células dentro dessas ACL pode ser pulsada com histocompatibilidade principal (MHC) de péptidos de ligação de classe I e MHC de classe II e assim actuar como células-alvo para as células CD8 + e células T CD4 +, respectivamente. Estas células FTA permanecer viável e totalmente funcional, e pode, portanto, ser administrado em ratos para permitir a avaliação de CD8 + T mediada por células morte de células alvo FTA e CD4 + T hel meditado-cellp de TLC células B alvo de células em tempo real in vivo, por citometria de fluxo. Desde&gt; 250 células alvo pode ser avaliada de uma só vez, a técnica permite o monitoramento de respostas de células T contra vários epítopos de antígeno em várias concentrações e em múltiplas repetições. Como tal, a técnica pode medir as respostas das células T, tanto a um (por exemplo, a magnitude da resposta cumulativa) quantitativa e um (por exemplo, avidez funcional. Eo epitopo de reactividade cruzada da resposta) qualitativa nível. Aqui, nós descrevemos como esses TLCs são construídos e dar um exemplo de como eles podem ser aplicados para avaliar as respostas de células T induzidas por uma vacina de vírus da varíola recombinante.

Como um exemplo da utilização do ensaio de TLC, um ratinho BALB / c foi imunizado com vírus vaccinia recombinante (VV) expressando epítopos de HIV-I (VV-HIV) e as respostas aos epítopos de CTL de VIH-I, Gag, mut Gag Env e Pol, o VV epitopos CTL F2L e F2L mut, e o epitopo de célula T de HIV-I H, Gag Th (tal como descrito em 2) foram avaliados utilizando um ensaio de TLC parâmetro 252 (Figura 1B). Variantes de epitopos de mordaça (mut Gag) e F2L (F2L mut) não são expressos no vector VV-HIV e, portanto, respostas contra estes epitopos são um reflexo de epitopo variante transversais respostas de células T reactivas. Camundongos normais foram também injectados com o TLC como um controlo negativo. O TLC foi discriminado a partir de células de rato hospedeiro por PKH-26 de rotulagem e as células B FTA discriminados pelo anticorpo coloração B220 via citometria de fluxo (Figuras 1A e 1B). Cada uma das 6 réplicas animais intra foi fechado com base na DPC fluorescência (Figura 1C </strong&gt;) e alvos FTA que expressam as diferentes concentrações de epitopos fechado com base na CFSE e CTV fluorescência (Figura 1D). % Killing específica de cada repetição foi avaliada comparando FTA morte celular aglomerado em animais imunizados em relação ao correspondente aglomerados FTA em animais ingênuos (Figura 1D). Atividade H T foi avaliada comparando FTA B regulação positiva de células de CD69 em animais imunizados em relação aos grupos de células B FTA em animais ingênuos (Figura 1E) correspondente. A partir desta análise, a infecção por HIV-VV geraram respostas fortes de CTL contra o epitopo imunodominante F2L VV, com 100% das células alvo pulsadas com o FTA 0,001 mM ou mais do epitopo a ser removido a partir do baço (Figura 2A). Houve também uma forte resposta gerada contra a variante de F2L, F2L mut, com 100% das células alvo pulsadas com o FTA 0,01 mM ou mais de epitopo a ser removido a partir do baço. DesdeF2L mut não está presente no vírus infectante, esta resposta indica uma resposta cruzada reactivo variante epitopo. Houve também uma resposta relativamente moderada gerado contra alvos que expressam o epitopo HIV Gag e uma ligeira resposta cruzada contra a forma variante deste epitopo, HIV Gag mut. Pareceu haver respostas insignificantes gerados para os epitopos do HIV Pol e Env do HIV CTL. Além de respostas de CTL, o ensaio de TLC exemplo mostrado também mediram as respostas H T avaliando a activação de células B expressando TLC o epitopo de classe II de ligação ao MHC de HIV HIV Gag Th (Figura 2B). Isso mostrou ocorreu a ativação de células B antígeno específico em animais imunizados, sugerindo geração de HIV Gag efetores Th específicos de células T H. Estas medidas de intensidade de resposta de células T podem ser resumidos pela área sob os valores da curva (AUC) para a geração de cada um dos epitopos (Figura 2C), que meamede a magnitude da resposta cumulativa. Além disso a magnitude das respostas de reactividade cruzada e de variantes específicas de epítopo do antigénio, o ensaio de TLC permite medições de avidez funcional a ser feito. Por exemplo, as concentrações de péptido eficazes utilizados para pulsar as células alvo FTA necessários para dar as respostas máximas metade (EC 50), é mostrado para os efectores de CTL (Figura 2D). Isso mostrou a avidez funcional para o epítopos mut F2L, HIV Gag e Gag do HIV mut, foram, aproximadamente, 10, 100 e 4000 vezes mais baixa, respectivamente, do que as respostas geradas para o F2L VV epitopo dominante. <img alt="Tabela 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51627/51627table1.jpg" width="500" /> Tabela 1. Layout de um layout de 252 parâmetro FTA. Típica de uma réplica de um 252 FTA composta de 42 amostras / tubos pulsadas com 7 diferentes epítopos peptídicos às 6 diferencialconcentrações t e incluindo uma pulsada (Nil) amostra un. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51627/51627table1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Número de metro </td><td> Volume (uL) </td><td> Estoque Dye (CTV mM) </td><td> A concentração final (M) </td></tr><tr><td> 37 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 38 </td><td> 17 </td><td> 0,053 </td><td> 0,451 </td></tr><tr><td> 39 </td><td> 17 </td><td> 0,197 </td><td> 1,48 </td></tr><tr><td> 40 </td><td> 17 </td><td> 0,73 </td><td> 6.21 </td></tr><tr><td> 41 </td><td> 17 </td><td> 2,7 </td><td> 23 </td></tr><tr><td> 42 </td><td> 17 </td><td> 10 </td><td> 85 </td></tr></tbody></table> Estoques CTV Tabela 2. Usado para rotular células. Volume de listadoEstoque CTV usado para marcar as células de 2 ml para dar a concentração final de corante de rotulagem. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Número de metro </td><td> Volume (uL) </td><td> Estoque Dye (CFSE mM) </td><td> A concentração final (M) </td></tr><tr><td> 37-42 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 31-36 </td><td> 7 </td><td> 0,022 </td><td> 0,139 </td></tr><tr><td> 25 - 30 </td><td> 7 </td><td> 0,078 </td><td> 0,492 </td></tr><tr><td> 19-24 </td><td> 7 </td><td> 0,23 </td><td> 1.45 </td></tr><tr><td> 13-18 </td><td> 7 </td><td> 0,82 </td><td> 5.17 </td></tr><tr><td> 7 - 12 </td><td> 7 </td><td> 2,9 </td><td> 18,3 </td></tr><tr><td> 1-6 </td><td> 7 </td><td> 10 </td><td> 63,1 </td></tr></tbody></table> Estoques CFSE Tabela 3. Usado para rotular células. Volume de estoque CFSE listados nosed para marcar as células em 1,11 ml para dar a concentração final de corante de rotulagem. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr><td> Número de metro </td><td> Volume (uL) </td><td> Estoque Dye (CPD mM) </td><td> A concentração final (M) </td></tr><tr><td> A </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> B </td><td> 4 </td><td> 0,053 </td><td> 0,106 </td></tr><tr><td> C </td><td> 6.3 </td><td> 0,197 </td><td> 0,62 </td></tr><tr><td> D </td><td> 7.5 </td><td> 0,73 </td><td> 2.74 </td></tr><tr><td> E </td><td> 7.3 </td><td> 2,7 </td><td> 9.86 </td></tr><tr><td> F </td><td> 7.7 </td><td> 10 </td><td> 38,5 </td></tr></tbody></table> Estoques CPD Tabela 4. Usado para marcar as células. Volume de estoque CPD listados utilizado para células em 2 ml de etiquetas para dar o Labelin definitivog concentração de corante. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Concentração de péptido (^ M) </td></tr><tr><td> Peptídeos MHC classe de ligação I </td><td> 0 </td><td> 0,00002 </td><td> 0,0002 </td><td> 0.002 </td><td> 0,012 </td><td> 0,2 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> De MHC de classe II de ligação de péptidos </td><td> 0 </td><td> 3.29 </td><td> 9.88 </td><td> 29,6 </td><td> 88,9 </td><td> 266 </td><td> 800 </td></tr></tbody></table> Tabela 5. Classe MHC I e II vinculativos concentrações de ações peptídicas. Concentrações de ações típicas 1 de epítopos peptídicos usados ​​para construir um FTA 1. Estas concentrações são 2x as concentrações finais utilizados para pulsar as células alvo. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51627/51627fig1highres.jpg" width="600"/&gt; Fluxo Figura 1. Típica análise de citometria de ACL. Esplenócitos de ratinhos BALB / c foram utilizados para construir um parâmetro 252 TLC como descrito no texto. Aglomerados FTA foram pulsadas com seis concentrações (como listado na Tabela 5) de 7 epitopos virais diferentes, incluindo os epítopos de MHC classe I de ligação, F2L (SPYAAGYDL, uma L-restritos d vírus vaccinia (VV) epitopo); F2L mut (SP G AAGYDL, uma variante do F2L), Mordaça (AMQMLKETI, um K restrição d HIV Gag epitopo 4), mut Gag (AMQMLK D TI, uma variante do HIV Gag 5), Pol (VGPTPVNII, uma D d -restrito pol epitopo HIV 6), Env (RGPGRAFVTI, uma D-d restrito HIV env epitopo 7); eo MHC classe II de ligação peptídeo Gag T H (PVGEIYKRWIILGLN, um H-2 restringe-d HIV Gag epitopo 4). ALCs foram injetados iv. num ratinho BALB / c que tinham sido infectados intranasalmente (in.) 6 dias mais cedo com recombinant VV expressando epítopos de HIV (VV-HIV, em animais sensibilizados). O TLC também foi injectado em ratinhos naive como controlo. Depois de 18 horas in vivo, as células FTA presentes em suspensões esplenócitos de camundongos hospedeiros foram analisadas por citometria de fluxo. A) estratégia de propagação progressiva típica para identificar as células FTA mostrando portões para linfócitos, camisolas interiores e PKH-26 + células FTA (ele também é útil para resolver células vivas usando um corante de viabilidade como Hoechst 33258, não apresentado). B) enredo 3D mostrando todos os clusters FTA de rato anfitrião ingênuo. c) parcelas histograma mostrando FTA CPD fluorescência marcando cada um dos 6 animais intra replica. D) parcelas 2D mostrando um da célula 6 intra-animais TLC B replica apresentando os diferentes tipos e concentrações de epítopos a partir de animais ingénuos e activadas. Isso mostra a ausência de células FTA no animal ferrado relativa ao animal ingênuo, revelando &quot;matar eventos&quot;por CTLs que formam a base da E) análise TLC matando ensaio 1. Histograma de expressão de células de TLC B do marcador de activação CD69 em animais imunizados em relação aos animais ingénuo, que forma a base do ensaio de TLC ajudante T 2. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51627/51627fig1highres.jpg" target="_blank">favor aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51627/51627fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51627/51627fig2.jpg" /> Figura 2. TLCs permitir a medição da magnitude e avidez das respostas das células T in vivo. Um parâmetro 252 TLC foi utilizado para avaliar as respostas de células T em murganhos infectados com VV-VIH, tal como descrito na Figura 1. UM)% de morte especifica foi calculada para todos os epitopos de CTL e os resultados de cada uma das seis replicates mostrados (painel da esquerda), bem como meios e erros padrão das médias (painel da direita) mostrado. B) resposta H T foi avaliada medindo a activação de células B TLC apresentando o epitopo de HIV Gag Th para cada uma das 6 réplicas animais intra ( painel da esquerda) e os meios e erros padrão das médias (painel da direita) calculado. c) AUC de morte especifica% (a), e as respostas das T auxiliares (b) foi calculado como uma medida da magnitude cumulativa. D) EC 50 medidas foram calculados para% dados matar específicas (a) como medida de avidez funcional. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51627/51627fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

A capacidade de monitorar as respostas das células T em detalhe, in vivo é importante para o desenvolvimento da nossa compreensão da resposta imune. Aqui nós descrevemos o uso de matrizes alvo fluorescentes (ACL) em um ensaio in vivo de células T em que avalia&gt; 250 parâmetros simultaneamente por citometria de fluxo.

O Uso de fluorescentes alvo Matrizes para a Avaliação de respostas de células T<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

14.3K visualizações.  Australian National University.  A capacidade de monitorar as respostas das células T em detalhe, in vivo é importante para o desenvolvimento da nossa compreensão da resposta imune. Aqui nós descrevemos o uso de matrizes alvo fluorescentes (ACL) em um ensaio in vivo de células T em que avalia> 250 parâmetros simultaneamente por citometria de fluxo. 

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Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Transdução retroviral de receptor de células T no rato células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Imunologia e Infecção

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

Preparação e Uso de HIV-1 infectados CD4 + T-Primária células como as células-alvo em Ensaios Natural Killer Celular citotóxicos

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

Indução de enxerto-versus-hospedeiro de Doenças e<em&gt; Em Vivo</em&gt; Monitoramento celular T Usando um modelo murino de MHC de correspondência

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

O transplante de pele da cauda para estudar as respostas das células T CD4 alogênico em camundongos

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms requires reliable models. Here, we describe models of tolerance to cardiac allograft in rat, induced by blockade of costimulation signals or by upregulation of immunoregulatory molecules through gene transfer. Each of these models allowed in vivo generation of regulatory cells such as regulatory T cells (Tregs), regulatory B cells (Bregs) or regulatory myeloid cells (RegMCs). In this manuscript, we describe two complementary protocols that have been used to identify and define in vitro and in vivo regulatory cell activity to determine their responsibility in tolerance induction and maintenance. First, an in vitro suppressive assay allowed rapid identification of cells with suppressive capacity on effector immune responses in a dose dependent manner, and can be used for further analysis such as cytokine measurement or cytotoxicity. Second, the adoptive transfer of cells from a tolerant treated recipient to a newly irradiated grafted recipient, highlighted the tolerogenic properties of these cells in controlling graft directed immune responses and/or converting new regulatory cells (termed infectious tolerance). These methods are not restricted to cells with known phenotypic markers and can be extended to any cell population. Furthermore, donor directed allospecificity of regulatory cells (an important goal in the field) can be assessed by using third party donor cells or graft either in vitro or in vivo. Finally, to determine the specific tolerogenic capacity of these regulatory cells, we provide protocols to assess the humoral anti-donor antibody responses and the capacity of the recipient to develop humoral responses against new or former known antigens. The models of tolerance described can be used to further characterize regulatory cells, to identify new biomarkers, and immunoregulatory molecules, and are adaptable to other transplantation models or autoimmune diseases in rodent or human.

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

Here, we present a protocol to induce tolerance in transplantation, and assess in vitro and in vivo the suppressive capacity of distinct cell subsets from the recipient and the immune status of the recipient toward donor or exogenous antigens.

In Vitro e In Vivo de avaliação da atividade supressiva, T, B e células mieloides e respostas Humoral de pacientes transplantados

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

Na Vivo Ensaio para detecção de células T antígeno-específicas função citolítica usando um modelo de vacinação

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolamento de Salmonella typhimurium-contendo Phagosomes de macrófagos

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model offers accessibility to rare populations of antigen-specific T-cells representative of the cellular memory response as well as the cytokine microenvironment in situ.
This report describes the practical procedure of a cutaneous recall, an SB induction, and a harvest of antigen-specific T-cells. To exemplify the method, the tuberculin skin test is used for antigenic recall in individuals who, prior to this study, underwent a Bacillus Calmette-Gu&#233;rin vaccination against an infection with Mycobacterium tuberculosis. Finally, examples of multiplex and flow cytometric analyses of SB specimens are provided, illustrating high fractions of antigen-specific polyfunctional CD4+ T-cells available by this sampling method compared with cells isolated from the blood.
The method described here is safe and minimally invasive, provides a unique opportunity to study both innate and adaptive immune responses in vivo, and may be beneficial to a broad community of researchers working with cell-mediated immunity and human memory responses, in the context of vaccine development.

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Here, we provide a demonstration of the suction blister cutaneous recall model. The model allows a simple access to study human in vivo adaptive immune responses, for instance in the context of vaccine development.

Um protocolo de aspiração da bolha para estudar células T humanas Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

Avaliação das respostas de células T Zika vírus específicos em órgãos Immunoprivileged de infectados Ifnar1- / - ratos

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...