MA foi apoiado por uma bolsa de Schrödinger do Fundo austríaco Science (FWF, J3086-B11) e graças a Max-Planck-Sociedade de apoio financeiro e administrativo. GS e JH foram apoiados pelo Fundo de Ciência e Tecnologia de Viena (WWTF, LS13-030).

<ol>
	<li>Garcia, K. C., Adams, J. J., Feng, D., Ely, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+TCR+germline+bias+for+MHC+is+surprisingly+simple.">The molecular basis of TCR germline bias for MHC is surprisingly simple.</a> Nat Immunol.. 10, 143-147 (2009).</li><li>Huppa, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR-peptide-MHC+interactions+in+situ+show+accelerated+kinetics+and+increased+affinity.">TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.</a> Nature.. 463, 963-967 (2010).</li><li>Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interdisciplinary+science+of+T-cell+recognition.">The interdisciplinary science of T-cell recognition.</a> Advances in immunology.. 119, 1-50 (2013).</li><li>Axmann, M., Schuetz, G. J., Huppa, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Molecule+Microscopy+on+Planar+Supported+Bilayers.">Single Molecule Microscopy on Planar Supported Bilayers.</a> Journal of Vizualized Experiments J. Vis. Exp.. 101, e53158 (2015).</li><li>Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocrosslinkable+pMHC+monomers+stain+T+cells+specifically+and+cause+ligand-bound+TCRs+to+be+preferentially+transported+to+the+cSMAC.">Photocrosslinkable pMHC monomers stain T cells specifically and cause ligand-bound TCRs to be preferentially transported to the cSMAC.</a> Nat Immunol. 13, 674-680 (2012).</li><li>Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+imaging.">FRET imaging.</a> Nat Biotechnol. 21, 1387-1395 (2003).</li><li>Toebes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+use+of+conditional+MHC+class+I+ligands.">Design and use of conditional MHC class I ligands.</a> Nat Med. 12, 246-251 (2006).</li><li>Tsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+recovery+of+functional+single-chain+Fv+fragments+from+inclusion+bodies+overexpressed+in+Escherichia+coli+by+controlled+introduction+of+oxidizing+reagent--application+to+a+human+single-chain+Fv+fragment.">Highly efficient recovery of functional single-chain Fv fragments from inclusion bodies overexpressed in Escherichia coli by controlled introduction of oxidizing reagent--application to a human single-chain Fv fragment.</a> J Immunol Methods. 219, 119-129 (1998).</li><li>Ruegg, U. T., Rudinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reductive+cleavage+of+cystine+disulfides+with+tributylphosphine.">Reductive cleavage of cystine disulfides with tributylphosphine.</a> Methods Enzymol. 47, 111-116 (1977).</li><li>Ruprecht, V., Brameshuber, M., Sch&#252;tz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+single+molecule+tracking+combined+with+photobleaching+for+the+detection+of+rare+molecular+interactions+in+fluid+biomembranes.">Two-color single molecule tracking combined with photobleaching for the detection of rare molecular interactions in fluid biomembranes.</a> Soft Matter. 6, 568-581 (2010).</li><li>Dustin, M. L., Bromley, S. K., Davis, M. M., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+self+through+two-dimensional+chemistry+and+synapses.">Identification of self through two-dimensional chemistry and synapses.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 133-157 (2001).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence.">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> The Journal of cell biology. 89, 141-145 (1981).</li><li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285, 221-227 (1999).</li><li>Kaizuka, Y., Douglass, A. D., Varma, R., Dustin, M. L., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+for+segregating+T+cell+receptor+and+adhesion+molecules+during+immunological+synapse+formation+in+Jurkat+T+cells.">Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 20296-20301 (2007).</li><li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor-proximal+signals+are+sustained+in+peripheral+microclusters+and+terminated+in+the+central+supramolecular+activation+cluster.">T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster.</a> Immunity. 25, 117-127 (2006).</li><li>Purbhoo, M. A., Irvine, D. J., Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+killing+does+not+require+the+formation+of+a+stable+mature+immunological+synapse.">T cell killing does not require the formation of a stable mature immunological synapse.</a> Nat Immunol. 5, 524-530 (2004).</li><li>Binz, H. K., Stumpp, M. T., Forrer, P., Amstutz, P., Pluckthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+repeat+proteins:+well-expressed,+soluble+and+stable+proteins+from+combinatorial+libraries+of+consensus+ankyrin+repeat+proteins.">Designing repeat proteins: well-expressed, soluble and stable proteins from combinatorial libraries of consensus ankyrin repeat proteins.</a> J Mol Biol. 332, 489-503 (2003).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

Medição de interacções proteína-proteína in situ é altamente desejável, especialmente quando se lida com as interacções de baixa afinidade, tais como ligação de TCR-pMHC 11. Isto é porque a taxa de sobre-, bem como a estabilidade de tais interacções são significativamente influenciadas pelas circunstâncias particulares sob as quais ligação ocorre. Abordagens de imagem baseados em FRET minimamente invasivos são, portanto, em princípio, perfeitamente adequado para tais tarefas, ainda envolver uma série de obstáculos que devem ser superados primeiro. O ruído gerado por autofluorescência celular limita a sensibilidade das medidas e deve, portanto, ser mantidos a um mínimo. Microscopia TIRF serve essa necessidade muito bem 12, mas exige a funcionalização de vidro-slides, idealmente sob a forma de uma bicamada lipídica planar suportada em vidro decorado com proteínas de escolha 13-15. Outra vantagem de uma abordagem que é parcialmente reconstitutive parceiros FRET recombinantes bicamada residente pode ser muito mminério facilmente marcada em um, local específico forma quantitativa e racional com fluoróforos menores e mais brilhantes do que seria possível com proteínas expressas na superfície de células. TCRs são marcados com scFv recombinante s, que não influenciam o reconhecimento de células T, como foi anteriormente testada 2. Além disso, a composição de proteína do SLB, por exemplo, a densidade de pMHCs e a escolha dos factores de acessório pode ser ajustado para a necessidades específicas. Temos experiências previamente realizada com diferentes densidades de pMHCs estimulantes, mas não detectaram diferenças significativas em 2D-koff e 2D-K D 2. Até agora aqui o reconhecimento de moléculas do MHC da classe II tem sido tratado com apenas, principalmente por causa da natureza da sua fenda de ligação peptídeo, que é aberto em ambas as extremidades e, assim, acomoda péptidos maiores, incluindo um ligante para a fixação fluoróforo. Em alguns casos, esta abordagem pode também trabalhar para a rotulagem MHC class I moléculas 16, mas grande cuidado deve ser tomado para verificar a sua utilização em experiências. A sensibilidade das células T contra os antigénios, os quais podem ser medidos através de ensaios de proliferação de células T, assim como a cinética de ligação pMHC-TCR tal como medido in vitro por ressonância de plasma de superfície não deve ser afectada pela adição do ligante e fluoróforo para o péptido. Alternativamente, MHC de classe I próprias moléculas podem ser marcados de uma maneira específica do local, com a introdução de uma cisteína não emparelhado no interior da sequência da cadeia pesada (observações não publicadas). Com a utilização de sondas moleculares apropriados qualquer interacção proteína-proteína sináptica pode, em princípio, ser estudados de uma forma aqui descrita. Essas sondas, por exemplo, Proteínas Projetado Ankyrin Repetir (DARPins) 17, a SCF V s ou deveria ser monovalente e deve vincular seu alvo de forma estável, sem afetar a interação de interesse. Claro, informatio estruturaln é altamente desejável para a concepção racional de sonda, mas não absolutamente necessário. Ao estabelecer um novo par de FRET parceiros, recomenda-se para gravar e analisar FRET em grandes quantidades em primeiro lugar. Locais de ligação da etiqueta pode variar consideravelmente para maximizar o sinal de FRET e também para verificar que os rendimentos medidos FRET variar em função da distância inter-corante. Uma vez que o sistema é otimizado, única molécula FRET sinais podem ser gravados através da limitação da rotulagem do FRET parceiro alta abundância de 10-30% e branqueamento da FRET parceiro baixa abundância até moléculas individuais são resolvidos no campo da iluminação. Por último, mas não menos importante, deverá ser notado que SLBS aproximar alguns, mas não todos os aspectos da membrana plasmática fisiológico. Qualidades tais como curvatura da membrana e flexibilidade, domínio compartimentalização, rearranjos do citoesqueleto e a motilidade celular, bem como uma elevada variedade de proteínas de membrana de superfície não-expressos são representados por SLBS mas pode influenciar tele processar sob investigação. Muito esforço terá de ser investido para estabelecer modalidades de imagem que permitem a monitorização interações proteína-proteína com resolução molécula única em sinapses fisiológicas, que são inacessíveis a imagem TIRF.

Uma compreensão mais fundamental de como as células T reconhecem os antígenos requer olhar para o lugar certo, ou seja, dentro da sinapse imunológica formado entre a célula T e do APC. Aqui, a cinética de ligação molecular não são apenas determinadas pelas propriedades bioquímicas intrínsecas dos parceiros de interacção envolvidos, mas dependem em grande medida dos parâmetros celulares, que incluem forças celulares, a arquitectura da membrana e das interacções laterais entre as proteínas da membrana, bem como as restrições geométricas específicas da sinapse 3. Abordagens bioquímicas são limitados em potência de resolução como eles exigem a disrupção de, pelo menos, uma das membranas sinápticas envolvidas. Por esta razão, uma metodologia de imagem baseados em FRET foi desenvolvido para monitorar a ligação do TCR para pMHCs antigênicas 2. Aqui as células T são decorados com um recombinante e de site especificamente rotulado TCRβ-reativa de cadeia simples fragmento de anticorpo (SCF V) e confrontados com plano<html> AR bicamadas lipídicas suportada em vidro (SLBS), que abrigam as moléculas MHC de classe II carregadas com um péptido antigénico marcado por fluorescência, moléculas co-estimulatórias e proteínas de adesão. Synaptic ligação entre TCR e corante marcado marcadas com corante de resultados pMHC em FRET, que podem ser monitorados em um único volume e nível molécula pela Total Internal Reflection fluorescência microscopia (TIRF). Neste artigo é explicado em detalhe como utilizar SLBS para ensaiar sinapses das células T, verificar sua integridade através de um ensaio de cálcio-flux de células T funcional, conduta FRET medições a granel e com sensibilidade única molécula, e analisar os dados adquiridos. Recomendações são oferecidas para a produção de proteínas adequadamente conformado necessários para bicamada funcionalização. Para obter informações mais específicas sobre a formação de bicamada e configuração de um microscópio TIRF adequado, consulte a uma publicação JoVE acesso público adicional publicada volta para trás 4. tenda &quot;&gt; Nature de SLBS SLBS functionalizable pode ser prontamente gerado a partir de vesículas unilamelares (SUVs) que contém os dois lípidos 1-palmitoil-2-oleoil-sn-gylcero-3-fosfocolina (curto: POPC, 90-99%) e 1,2-sn dioleoyl- - glicero-3 - {[N- (5-amino-1-carboxipentil) ácido iminodiacético] succinil} (curto: DGS NTA-Ni, 1-10%). SUVs, distribuídos em lâminas de vidro limpas para formar uma bicamada planar contígua 4. DGS-NTA-Ni serve para ancorar proteínas marcadas com poli-histidina-complexo através de formação mediada por poli-histidina, com o NTA-Ni que contém um grupo de cabeça (Figura 1A) sintético. Para uma associação estável substitui tipicamente o domínio transmembranar e a cauda citoplasmática nativa da proteína de adesão ICAM-1 e a molécula co-estimuladora B7-1 com uma etiqueta contendo doze histidinas (ICAM-1-12H, -12H B7-1) (Figura 1B) . O péptido carregado-classe II K IE molécula contém duas cadeias polipéptido incorporado-membrana (α e β)s. Os transmembranares / domínios citoplásmicos de ambas as cadeias têm que ser substituídos com uma etiqueta de seis histidinas contendo cada (IE k α 6H β 6H k -2x6H ou IE). Como uma alternativa, que se prolonga a cadeia com doze α histidinas e deixando o domínio extracelular da cadeia β não marcado (dando origem a IE k α 0H 12H β ou IE k -12H) dá origem a resultados satisfatórios (Figura 1B). Rotulagem específica do local de pMHCs É importante para marcar o local e pMHC estequiometricamente-especificamente, a fim de ser capaz de converter os rendimentos medidos em FRET constantes de ligação de equilíbrio significativas. Isto pode ser conseguido pela marcação química de um péptido sintético que é carregado para a fenda de ligação ao péptido de recombinante marcada com histidina moléculas MHC de classe II 2,5. O péptido inclui todos os resíduos do epitopo de célula T como well como um curto C-terminal ligante (GGS) seguido por cisteína (por exemplo, a traça do citocromo c (MCC) péptido ANERADLIAYLKQATK- GGSC, o ligante é marcado em negrito). Esta cisteína é utilizado para marcar o péptido estequiometricamente com o uso de derivados de maleimida com corante. Neste ponto, cuidado extra deve ser dedicada à verificação quantitativa corante de acoplamento para o peptídeo contendo cisteína. HPLC de purificação do aducto de péptido-corante é recomendado e deve ser seguido por espectroscopia de massa por ionização por electropulverização. Quaisquer massas gravados correspondentes ao educto peptídeo (sem corante) refletem rotulagem incompleta. Se isto é verdade, o péptido purificado por HPLC-deve ser submetido a ciclos consecutivos de-marcação com corante até que a rotulagem é considerada quantitativa. Note-se que a espectroscopia de massa MALDI-TOF deve ser evitada dado que este método envolve a radiação laser para uma amostra de ionização. Este tratamento se desintegra as fluorophores sensíveis ligados antes de massa peptídeo é lido e, portanto, underrepre<html> graus Sents de dye-conjugação. Ainda marcação indirecta do local específico de TCR ligado de células com a utilização de fragmentos de cadeia simples Fv monovalente Ele ainda é um desafio para anexar corantes para celular proteínas associadas à superfície de células vivas de uma maneira específica do local. Para superar este obstáculo para TCRs expostos à superfície, uma versão monovalente de cadeia única (scFv) a partir dos genes do anticorpo monoclonal TCRβ Reativo H57-197 2 foi construído. A estrutura cristalina deste anticorpo em complexo com o TCR permite conceber racionalmente uma versão, na qual um resíduo de serina em estreita proximidade com o terminal C do péptido associado MHC (em que o corante parceiro de FRET correspondente está ligado) é substituído por um resíduo de cisteína. Este mutante de cisteína, em seguida, serve como um aceitador para a conjugação de corantes (Figura 2). Metodologias para gravar FRET nt &quot;&gt; valores FRET em massa são os mais adequados para verificar a relação entre as distâncias inter-dye escolhidos e FRET eficiências medidos neste TCR-pMHC sistema 2 vinculativa. Além disso, as medições FRET granel revelar diferenças qualitativas e quantitativas na sinápticas afinidades TCR-pMHC ( ver abaixo e secção protocolo 3.2). Várias abordagens para quantificar a eficiência FRET foram introduzidos na literatura 6. Neste artigo é registada por meio de FRET (a) doador recuperação após aceitante de branqueamento, e via (b) emissão de aceitador FRET sensibilizados. O primeiro método (a) exige a utilização de um aceitador FRET que pode ser facilmente Foto-descoloração, e um doador, a qual é bastante fotoestável. Além disso, é importante assegurar que o aceitador de Foto-descoloração não é mais capaz de extinguir a fluorescência do dador. À medida que o mesmo canal de detecção (doador) é usado para a quantificação, sem factores de correcção umd há aberrações cromáticas devem ser considerados, o que torna esta metodologia simples e confiável. No entanto, as medidas quantitativas não pode ser repetida no mesmo local de amostra e mudanças na FRET não podem ser gravadas ao longo do tempo. Para evitar efeitos causados ​​pela difusão molecular ou motilidade celular um passo de branqueamento rápido deve ser orientado para, o que minimiza o tempo que passa entre o primeiro doador FRET (antes receptor de branqueamento) e a segunda aquisição de imagens FRET doador (depois de FRET receptor de branqueamento). É recomendado empregar uma poderosa fonte de luz laser do comprimento de onda de excitação aceitador FRET, a fim de minimizar a iluminação e de branqueamento vezes. Em contraste, na abordagem da medição das emissões de FRET sensibilizado (b) o dador FRET é animado e a emissão do aceitador FRET é observado no canal aceitador FRET. Alterações na sinal aceitador FRET pode ser gravado, mas ao longo do tempo de emissão do doador FRET para o canal receptor vermelho-deslocada (termed exsudação) e FRET aceitante cross-excitação via doador excitação tem que ser determinado com exactidão e subtraído do canal receptor de FRET gravado. Para isso as imagens correspondentes aceitador FRET doador e traste tem que ser espacialmente alinhados. A detecção de única molécula (sm) FRET eventos Com o uso de lasers como fonte de excitação, uma câmara sensível e microscopia TIRF-ruído atenuado a fluorescência de fluoróforos individuais podem ser facilmente rastreada ao longo do tempo. Semelhante é verdadeiro para a detecção de eventos smFRET intermoleculares. No entanto, as complicações podem ser causados ​​por FRET exsudação dador e trans-excitação do aceitador FRET, e, assim, grande cuidado deve ser tomado ao ajustar as densidades fluoróforo na experiência smFRET. No protocolo fornecido abaixo (seção de protocolo 4) a TCR foi escolhido como FRET doadores em alta abundância e pMHC como FRET aceitante em baixa abundância. Para atenuar FRET doador suficientemente exsudação, decorar 10-30% dos TCRs com FCE fluorescente V e 90-70% dos TCRs com FCE não fluorescente V. Aqui, o canal de aceitador FRET foi escolhido como único canal molécula porque é confocal com a única molécula FRET canal. Isto ajuda a alinhar com eventos smFRET molécula única aceitadores de FRET, que é a base de validação smFRET. Extraindo-off taxas sinápticas através de medições smFRET Fotodegradação de ambos FRET doador e receptor FRET tem que ser contabilizado ao extrair a meia-vida de interações de única molécula FRET vestígios. O número de sinais observáveis ​​FRET no início da sua aparência como par dador-aceitador individuais n (0) é reduzido ao longo do tempo, tanto unbinding do fotobranqueamento e complexo ligando-receptor. O número de sobreviventes complexos num dado momento N (t) pode ser expresso matematicamente como se segue: No termo fotobranqueamento exp (-t / τ lixívia) o tempo t é descrita pelo produto do número de observações N e o tempo de iluminação t mal por causa da observação de modo não-contínua, discreta (isto é, de branqueamento ocorre apenas durante a iluminação ). Dentro do termo cinética exp- (t / τ desligado) o tempo t é o produto do número de observações n e t o intervalo de tempo para uma única observação FRET (isto é, acontece continuamente unbinding cinética). Equação 1 pode ser expressa como: <img alt="Equação 2" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq2.jpg" /> O termo τ lixívia / τ doente describes o número de observações até branqueamento ocorre e é definido como o valor esperado &lt;n branquear&gt; da sua função exponencial. A equação 2 pode ser simplificada, como se segue: <img alt="Equação 3" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq3.jpg" /> O valor esperado &lt;N (t lag)&gt; do número de quadros de N (t) com FRET eventos observáveis ​​após o tempo t é determinado directamente a partir da experiência. Depende do tempo ajustável entre as observações (t lag) escolhidos no experimento e os valores desconhecidos para τ off (o inverso da taxa de off k off) e &lt;n branquear&gt;, o valor esperado do número de observações antes de ocorrer branqueamento . Assim, o cálculo do valor esperado &lt;N (t lag)&gt; para, pelo menos, dois valores de t <sub&gt; lag permite a determinação experimental de &lt;n branquear&gt; e τ off. Extraindo valores sinápticas 2D-K D através de medições baseadas em FRET Medindo uma ocupação de TCR, isto é, a razão entre os TCRs e ligados no total TCR, é fundamental para a determinação dos valores de K-sinápticos 2D d. De acordo com a equação 4 este termo é directamente proporcional à medida FRET produzir TCR, desde que serve como dadores e aceitantes pMHCs como FRET FRET. <img alt="Equação 4" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq4.jpg" /> com uma ocupação = TCR, C = fator de conversão C é uma constante, que depende do sistema de FRET e os fluoróforos utilizado. Ele pode ser determinado experimentalmente, conforme mostrado abaixo. um pode ser convertido num 2D-K D de acordo com a equação 5, quando odensidade inicial de ligandos de TCR, antes da adição de células T para a bicamada é conhecido. Isto é devido à grande mobilidade das proteínas SLB-inscritos e também porque SLBS fornecer um reservatório quase inesgotável de ligantes 2. <img alt="Equação 5" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq5.jpg" /> com [pMHC inicial] = densidade inicial de pMHC antes da adição de células T Com equações 4 e 5 pode-se agora facilmente determinar o sináptica 2D-K D entre TCR e pMHC. Isso é feito mais com medições FRET com base na recuperação de doadores após o clareamento receptor (ver seção de protocolo 3.1). No entanto, à medida C a relação entre a intensidade de FRET FRET I (corrigido para o fundo, de FRET exsudação dador e aceitador FRET cruzada excitação) e TCR ocupação um tem de ser determinado. Para isso, umaprecisa de saber a relação R entre a intensidade média de fluorescência de fluoróforos individuais TCR-associados FRET doadores (por exemplo, Cy3 ou AF555) sm I doador FRET e a intensidade média de molécula única FRET FRET I sm eventos. R depende do sistema de FRET em questão, e filtros de emissão de câmara utilizada para a detecção de fluorescência. A ocupação de um TCR pode então ser determinado directamente de acordo com a equação 6. <img alt="Equação 6" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq6.jpg" /> com R = sm I FRET doador / sm I FRET R foi determinado como 1,45 para o sistema de scFv H57 Cy3 / pMHC-Cy5 leva a: a = massa I FRET / bulk I TCR-cy3 • 1,45 A relação entre a ocupação de TCR a e o rendimento de FRET pode ser determinado por doador FRET recuperary aceitador após branqueamento. Para esta dois parâmetros são representados graficamente contra o outro para um número de TCR microclusters como mostrado na Figura 4A .A inclinação do ajuste linear indica o factor de conversão C (a partir da equação 4). Como demonstrado na Figura 4A, C ascende para (a) o V H57 scF - Cy3 / pMHC-Cy5 sistema FRET e (b) a configuração do sistema de microscópio aplicado a 1.995. A ocupação de um TCR pode ser facilmente deduzido da seguinte forma: A ocupação de um TCR = FRET produzir 1,995 •

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >LB-media</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >10000713</td>
			<td >bacterial expression</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sf900 II</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >10227402</td>
			<td>insect cell media for baculo virus production</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Insect-XPRESS with L-glutamine (Lonza)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >10564038</td>
			<td>insect cell media for baculo virus expression</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sf9 cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11496-015</td>
			<td>cells for virus production and expansion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High Five Cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>B855-02</td>
			<td>cells for potein expression</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LB-media</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >10000713</td>
			<td>bacterial expression</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centramate System</td>
			<td>Pall</td>
			<td></td>
			<td>protein concentartion from large volumes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centramate cassette 10kDa cutoff</td>
			<td>Pall</td>
			<td>OS010T12</td>
			<td>protein concentartion from large volumes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC900308</td>
			<td>protein concentartion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC800308</td>
			<td>protein concentartion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amicon Stirred Ultrafiltration Cell Model 200 mL</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td >5123</td>
			<td>protein concentartion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#196;kta pure 25L</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td>29-0182-24</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superdex 200 10/300 GL</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5175-01</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superdex 75 10/300 GL</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5174-01</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mono Q 5/50GL</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5166-01</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ni Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5318-01</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tricorn 10/20 column</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >28-4064-13</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gilson HPLC system</td>
			<td >Gilson</td>
			<td ></td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pursuit XRs C18, 5 &#181;m particle size, 21.2*250mm column size</td>
			<td >Agilent</td>
			<td >A6000250X212</td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pursuit XRs C18, 5 &#181;m particle size, 21.2*50 mm column size</td>
			<td >Agilent</td>
			<td >A6000050G212</td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tricorn 10/20 column&#160;</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >28-4064-13</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gilson HPLC system</td>
			<td >Gilson</td>
			<td ></td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pursuit XRs C18, 5 &#181;m particle size, 21.2*250mm column size</td>
			<td >Agilent</td>
			<td >A6000250X212</td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pursuit XRs C18, 5 &#181;m particle size, 21.2*50 mm column size</td>
			<td >Agilent</td>
			<td >A6000050G212</td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 maleimide</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td>PA23031</td>
			<td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy5 maleimide</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td>PA25031</td>
			<td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 555 C2 Maleimide</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td>A-20346</td>
			<td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >A-20347</td>
			<td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fura-2, AM, cell permeant</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >F-1221</td>
			<td>calcium-sensitive dye for cell labeling</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dimethyl sulfoxide</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >151874</td>
			<td>for dissolving fura-2 am</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hank&#39;s Balanced Salt Solution plus calcium/magnesium</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >10225362</td>
			<td>imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin lyophilized powder</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >A2153</td>
			<td>supplement for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >14-4-4S antibody</td>
			<td >affimetrix eBioscience</td>
			<td >14-5980-81</td>
			<td>blocking antibody for H2-I-Ek (recognized by the 5c.c7, 2B4 and AND TCR)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 ml polypropylene round-bottom tube</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >FALCON 352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.22 &#956;m Ultrafree-MC centrifugal filter unit</td>
			<td >EMD Millipore</td>
			<td >UFC30GV0S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringe filter 0.2&#181;m</td>
			<td >Millipore</td>
			<td >GVWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TetraSpeck Microspheres, 0.1 &#181;m, fluorescent blue/green/orange/dark red</td>
			<td >Life technologies</td>
			<td >T-7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope for fura-2-based calcium measurements&#160;</td>
			<td >LEICA</td>
			<td >DMI4000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope for (single molecule) FRET measurements</td>
			<td >LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS</td>
			<td >for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >planar supported lipid bilayers</td>
			<td ></td>
			<td >for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640, with L-Glutamine</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >11554416</td>
			<td>T-cell media</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >non-essential amino acid 100X</td>
			<td >Hyclone</td>
			<td >SH30238.01</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >penicillin/streptomycin/L-glutamine 100x</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >12000226</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2-mercaptoethanol</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >M6250</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mouse interleukin-2 recombinant protein</td>
			<td >BPS Bioscience</td>
			<td >90185-B</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Research Grade Fetal Bovine Serum</td>
			<td >Hyclone</td>
			<td >SV30160.03</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Origin (analysis program)</td>
			<td >OrigenLab</td>
			<td >http://www.originlab.com/</td>
			<td>non-linear fitting of two parameters (tauoff, [ntlag])</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring tcr-pmhc binding in situ using a fret-based microscopy assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

A gravação de cálcio intracelular através do corante Fura-2 cálcio, bem como a análise celular subsequente para verificar a potência estimuladora e, consequentemente, a funcionalidade do SLBS são mostrados na Figura 4. Conforme se torna evidente, os níveis de cálcio aumentar em células T (expresso como a fura-2 340 nm razão normalizada / 380nm com linha de base sendo 1) imediatamente assim que resolver sobre as SLBS estimulantes. Os níveis de cálcio voltar aos níveis basais logo após a adição de um anticorpo que bloqueia pMHCs TCR de acoplamento e que termina a activação das células T. A Figura 6 ilustra uma experiência típica envolvendo recuperação dador FRET aceitador após o branqueamento, que é utilizado para medir o rendimento FRET e que serve para calcular os valores de 2D-K D (mostrada na Figura 4). Note que o aumento em intensidade dador FRET, que representa TCR marcado através de AF555, após ablação rápida e completa de uma a FRETespécies cceptor (aqui: AF647 associado com pMHCs). Também é evidente a redução forte no canal de FRET, ou seja, o canal de FRET-aceitador FRET sob doador de excitação, após aceitador FRET branqueamento. O sinal remanescente pouco visível corresponde a se preocupar doador exsudação. Rendimentos FRET dentro microclusters TCR individuais ou sinapses inteiras são calculados com base nos valores de intensidade medidos indicados (Figura 6B). A Figura 7 descreve uma trajectória e lapso de tempo de uma única molécula de evento de FRET visível em dois intervalos de tempo. Como descrito acima na introdução tal comportamento é causado por ambos decadência da sináptica TCR-pMHC vinculativo e fotodegradação. Para discriminar entre essas duas contribuições, os prazos de aquisição experimentais tem que ser variada de duração: enquanto fotodegradação continua a ser uma constante, mudanças na FRET comprimento evento trajetória só são causados ​​pelas cinética de ligação. Uma quantificação de tracelengths, W<html> hich constitui a base para o cálculo das taxas de fora do branqueamento e mostrados na Figura 7, são apresentados nas tabelas 1 a 3. Determinação do 2D-K D s exige a gravação de grandes quantidades FRET rendimentos para FRET doadores TCRs rotulados. Com a utilização do experimentalmente deduzida constante C (Figura 4), ​​com um rendimento de FRET medido para um microcluster TCR ou uma sinapse inteira pode ser convertido para o TCR de ocupação, um ou seja, a proporção de TCR pMHC-envolvidos e totais (Figura 4C) . Com densidades pMHC conhecidos presentes no SLB antes da adição das células-T, A valores podem ser utilizados para determinar os valores de KD 2D-sinápticos (Figura 4D). On-taxas pode ser calculado com a lei de ação de massas (2D-k on = 2D-koff / 2D-K D) da sináptica determinada off-rate e valores 2D-KD. 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 53157 / 53157fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Diagrama esquemático do contorno da bicamada lipídica do sistema suportada em vidro plano (SLB). (A) SLBS são compostos de POPC (90-99%) e o lípido sintético DGS de Ni-NTA (1-10%) e formam-se espontaneamente quando as superfícies de vidro limpas são carregadas com vesículas unilamelares pequenas (SUVs) que consiste dos lípidos correspondentes. (B) Uma vez formados, tais SLBS pode ser funcionalizado com porções marcadas com poli-histidina solúveis extracelulares derivadas de co-estimuladoras B7-1 pMHCs, proteínas e proteínas de adesão ICAM-1, para servir como APCs para células-T. Para obter mais informações sobre como preparar SLBS consulte Axmann et al. 4. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53157/53157fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig2.jpg" /> Figu<html> re 2. Energia de Förster Ressonância ensaio baseado em Transferência para quantificar a ligação de TCR-pMHC in situ. (A) Uma estrutura compósita de um TCR complexado com um fragmento de cadeia única H57 engatar um pMHC ilustra a abordagem baseada em FRET aqui descrito. Note-se a curta distância de cerca de 41a separa os dois fluoróforos correspondentes submetidos FRET. Sites receptora na fluoróforo-maleimidas são indicados em verde e vermelho. (B) O princípio de detecção de interacções TCR-pMHC in situ é ilustrada. Apenas scF V -decorated TCRs e pMHCs (IE aqui k), que formam complexos específicos, dar origem a um sinal FRET mensurável. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53157/53157fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> &quot;/&gt; Figura 3. Cromatogramas de ascensão último passo de filtração em gel para dar scFv monoméricos e s carregadas com péptido k -2x6H moléculas IE. Eixos X representam volume de retenção, em ml, eixos Y indicam absorvância a 280 nm em unidades arbitrárias (UA) . (A) Site-H57 especificamente scFv marcado com Alexa Fluor 555 maleimida foi submetido a cromatografia para separar S75 corante que não reagiu a partir da proteína (passo 1.2.5). As fracções correspondentes ao intervalo de retenção de 14 to15 ml (linhas tracejadas) representam marcado H57 scFv monomérico. (B), ou seja moléculas -2x6H k complexados com o ANP-péptido espaço titular UV clivável tinha sido irradiadas com UV, incubadas com o sítio-específico Alex 647 marcado com maleimida péptido e, finalmente, sujeito a cromatografia em S200 para separar a proteína do péptido livre (passo 1.1.2.4). O intervalo entre as linhas tracejadas contém adequadamente dobrados e pMHCs monoméricos. (A, B) </sTrong&gt; 0,7 ml da amostra foi aplicada na coluna no início do rum (0 ponto mL). As fracções recolhidas foram concentradas. A proporção entre proteína e corante foi determinada por photospectrometry antes da diálise contra PBS / glicerol a 50% (para o armazenamento a -20 °). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53157/53157fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig4.jpg" /> Figura 4. Determinação 2D-K D S e K em 2D-s. (A) A correlação entre o rendimento de FRET como determinado pela recuperação após branqueamento doador aceitador e TCR ocupação foi medida experimentalmente. TCR ocupação pode ser determinada para microclusters TCR individuais como explicado na secção 4.2. Um ajuste linear dos dados é apresentada pela linha, cuja inclinação é igual à relação entre C TCRocupação eo rendimento FRET. C é uma constante específica para o sistema FRET e os fluoróforos (aqui Cy3 e Cy5) empregados. Neste exemplo, produziu 1.988. (B) FRET dados de rendimento foram determinados por microclusters individuais TCR (N = 187, temperatura = 24 ° C) através da recuperação de doador aceitador de branqueamento. Números abaixo de barras de histograma indica o limite superior do intervalo dentro. (C) A conversão dos dados apresentados em (B) multiplicando os rendimentos medidos FRET com a constante C determinada em (a). Números abaixo de barras indicam o limite superior do intervalo dentro. (D) Histograma (semi-logarítmica, base = 4) que descreve a distribuição de 2D-K D s, medida por microclusters TCR individuais. A mediana 2D-K D é indicado no azul. Números abaixo de barras indicam o limite superior do intervalo dentro. (E) O histograma mostrado em (D) foi convertido intoa 2D-k em -histogram (semi-logarítmica, base = 4) utilizando o k sináptica off para 24 ° C (0,41 s -1). O 2D-k mediana determinado sobre o valor é indicada a azul. Os dados foram originalmente publicado em Huppa et al. 2 e são visualizados aqui em um novo formato. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53157/53157fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig5.jpg" /> Figura 5. Validação funcional de SLBS empregue para a estimulação de células T e de imagem. (A) de blastos de células T transgénicas TCR-carregadas com Fura-2 foram confrontados com estimuladora SLB abrigando pMHCs antigénicos, ICAM-1 e B-7. Foram registrados celular fura-2 emissão animado a 340 nm e 380 nm, bem como imagens DIC. Conforme indicado, os valores da relação das intensidades de emissão animado aos 34 anos0 e 380 nm são apresentados no painel da direita. A adição de pMHC anticorpos de bloqueio 14 min para o ensaio experimental resultou numa diminuição nos níveis de cálcio intracelulares, comparável ao do descanso células-T. (B) Um perfil temporal típico de índices médios Fura-2 em células T em contacto com SLBS estimuladoras é caracterizada por um aumento inicial em uma intracelular de cálcio que é de 2 a 4 vezes mais elevada em comparação com a de células T não activadas ou células T privadas de antigénio após o bloqueio mediada por anticorpos. Círculos verdes indicam pontos no tempo em ilustrados (A). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53157/53157fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig6.jpg" /> Figura 6. massa FRET rendimentos, medida através da recuperação doador FRET FRET aceitante após o clareamento. <strong&gt; (A) é mostrado um exemplo de uma medição de FRET-sináptica normal. Como está indicado no lado esquerdo e na parte superior de uma série de imagens foi adquirida com o uso de um divisor de feixe de emissão dando origem a um dador FRET e um canal de FRET aceitador (para uma informação mais detalhada sobre divisores de feixe referem-se a Axmann et ai 4). A linha mostrada na imagem DIC esquerda indica o limite da sinapse de células T. Note-se a perda de intensidade dentro do canal aceitador FRET bem é o aumento da intensidade do canal de dador FRET após FRET aceitador de branqueamento (etapa 4). (B) FRET eficiências podem ser quantificados como indicado para as regiões sinápticas individuais ou em sinapses inteiras. Para consulta, as imagens antes e depois FRET receptor de branqueamento são mostrados com o uso de duas tabelas de pesquisa (LUTs, verde e física). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53157/53157fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> </p&gt; <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig7.jpg" /> Figura 7. molécula única FRET eventos aparecem e desaparecem passos insingle e estão perfeitamente alinhados com um único fluoróforo aceitador FRET. O lapso de tempo do evento FRET única molécula é mostrado. As imagens foram obtidas utilizando uma câmara EMCCD retro-iluminado. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53157/53157fig7large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig8.jpg" /> Figura 8. Determinação τ off = 1 / k fora de trajetórias smFRET medidos. (A) As somas cumulativas normalizadas de sinais observáveis ​​(FRET derivados de H57 scF V -AF555 decorados 5c.c7 TCR blastos de células T transgênico reconhecendo IE &lt;sup&gt; K / K3-AF647 a 24 ° C) durante quatro desfasamentos de tempo diferentes (42 ms, 490 ms, 1007 ms, 1989 ms) foram representados graficamente como uma função do número total de observações. Funções de ajuste monoexponencial dar origem a que corresponde o inverso negativo dos valores esperados &lt;n (t lag)&gt;. (B) valores esperados foram plotados contra atrasos t lag e montado usando a equação &lt;n (t lag)&gt; = τ off / {(x off / &lt;n branquear&gt;) + t lag} para produzir τ off e &lt;n branquear&gt;. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53157/53157fig8large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

Medição de TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Usando a microscopia Ensaio de FRET

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

measuring-tcr-pmhc-binding-in-situ-using-a-fret-based-microscopy-assay

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

12.3K visualizações.  Vienna University of Technology. This manuscript describes how to conduct (single molecule) Förster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer. 

Vídeo: Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Quantitatively Measuring In situ Flows using a Self-Contained Underwater Velocimetry Apparatus (SCUVA)

The ability to directly measure velocity fields in a fluid environment is necessary to provide empirical data for studies in fields as diverse as oceanography, ecology, biology, and fluid mechanics. Field measurements introduce practical challenges such as environmental conditions, animal availability, and the need for field-compatible measurement techniques. To avoid these challenges, scientists typically use controlled laboratory environments to study animal-fluid interactions. However, it is reasonable to question whether one can extrapolate natural behavior (i.e., that which occurs in the field) from laboratory measurements. Therefore, in situ quantitative flow measurements are needed to accurately describe animal swimming in their natural environment.
We designed a self-contained, portable device that operates independent of any connection to the surface, and can provide quantitative measurements of the flow field surrounding an animal. This apparatus, a self-contained underwater velocimetry apparatus (SCUVA), can be operated by a single scuba diver in depths up to 40 m. Due to the added complexity inherent of field conditions, additional considerations and preparation are required when compared to laboratory measurements. These considerations include, but are not limited to, operator motion, predicting position of swimming targets, available natural suspended particulate, and orientation of SCUVA relative to the flow of interest. The following protocol is intended to address these common field challenges and to maximize measurement success.

Quantitatively Measuring In situ Flows using a Self-Contained Underwater Velocimetry Apparatus SCUVA

This protocol provides instructions on how to use a self-contained underwater velocimetry apparatus (SCUVA), which is designed for quantification of in situ animal-generated flows. In addition, this protocol addresses challenges posed by field conditions, and includes operator motion, predicting position of animals, and orientation of SCUVA.

Medir quantitativamente In situ Fluxos usando um Aparelho Autônomo de Velocimetria Underwater (SCUVA)

The ability to directly measure velocity fields in a fluid environment is necessary to provide empirical data for studies in fields as diverse as ...

Bioengenharia

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensional Optical resolução Microscopia Fotoacústica

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical sectioning of complex systems. Confocal microscopy is routinely used, for example, to study specific cellular targets1, monitor dynamics in living cells2-4, and visualize the three dimensional evolution of entire organisms5,6. Extensions of confocal imaging systems, such as confocal microendoscopes, allow for high-resolution imaging in vivo7 and are currently being applied to disease imaging and diagnosis in clinical settings8,9.
Confocal microscopy provides three-dimensional resolution by creating so-called "optical sections" using straightforward geometrical optics. In a standard wide-field microscope, fluorescence generated from a sample is collected by an objective lens and relayed directly to a detector. While acceptable for imaging thin samples, thick samples become blurred by fluorescence generated above and below the objective focal plane. In contrast, confocal microscopy enables virtual, optical sectioning of samples, rejecting out-of-focus light to build high resolution three-dimensional representations of samples.
Confocal microscopes achieve this feat by using a confocal aperture in the detection beam path. The fluorescence collected from a sample by the objective is relayed back through the scanning mirrors and through the primary dichroic mirror, a mirror carefully selected to reflect shorter wavelengths such as the laser excitation beam while passing the longer, Stokes-shifted fluorescence emission. This long-wavelength fluorescence signal is then passed to a pair of lenses on either side of a pinhole that is positioned at a plane exactly conjugate with the focal plane of the objective lens. Photons collected from the focal volume of the object are collimated by the objective lens and are focused by the confocal lenses through the pinhole. Fluorescence generated above or below the focal plane will therefore not be collimated properly, and will not pass through the confocal pinhole1, creating an optical section in which only light from the microscope focus is visible. (Fig 1). Thus the pinhole effectively acts as a virtual aperture in the focal plane, confining the detected emission to only one limited spatial location.
Modern commercial confocal microscopes offer users fully automated operation, making formerly complex imaging procedures relatively straightforward and accessible. Despite the flexibility and power of these systems, commercial confocal microscopes are not well suited for all confocal imaging tasks, such as many in vivo imaging applications. Without the ability to create customized imaging systems to meet their needs, important experiments can remain out of reach to many scientists.
In this article, we provide a step-by-step method for the complete construction of a custom, video-rate confocal imaging system from basic components. The upright microscope will be constructed using a resonant galvanometric mirror to provide the fast scanning axis, while a standard speed resonant galvanometric mirror will scan the slow axis. To create a precise scanned beam in the objective lens focus, these mirrors will be positioned at the so-called telecentric planes using four relay lenses. Confocal detection will be accomplished using a standard, off-the-shelf photomultiplier tube (PMT), and the images will be captured and displayed using a Matrox framegrabber card and the included software.

The complete construction of a custom, real-time confocal scanning imaging system is described. This system, which can be readily used for video-rate microscopy and microendoscopy, allows for an array of imaging geometries and applications not accessible using standard commercial confocal systems, at a fraction of the cost.

Vídeo taxa de microscopia de varredura confocal e Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Medir as propriedades mecânicas das células vivas Usando Microscopia de Força Atômica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluorescência-têmpera de um Fluoróforo encapsulado em lipossomas Near-infrared como ferramenta para<em&gt; In Vivo</em&gt; Imageamento óptico

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

Monitoramento em Tempo Real de intracelular Bile Ácido Dynamics usando um sensor Ácido Bile baseado em FRET codificados geneticamente

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Correlativa luz e de Microscopia Eletrônica Usando Quantum Dot Nanopartículas

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM)

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in medical diagnostics, and for life detection by robotic missions to other planets and moons of the solar system. Currently, sparse bacterial samples are counted by culture plating or epifluorescence microscopy. Culture plates require long incubation times (days to weeks), and epifluorescence microscopy requires extensive staining and concentration of the sample. Here, we demonstrate how to use off-axis digital holographic microscopy (DHM) to enumerate bacteria in very dilute cultures (100-104 cells/mL). First, the construction of the custom DHM is discussed, along with detailed instructions on building a low-cost instrument. The principles of holography are discussed, and a statistical model is used to estimate how long videos should be to detect cells, based on the optical performance characteristics of the instrument and the concentration of the bacterial solution (Table 2). Video detection of cells at 105, 104, 103, and 100 cells/mL is demonstrated in real time using un-reconstructed holograms. Reconstruction of amplitude and phase images is demonstrated using an open-source software package.

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy DHM

Digital holographic microscopy (DHM) is a volumetric technique that allows imaging samples 50-100X thicker than brightfield microscopy at comparable resolution, with focusing performed post-processing. Here DHM is used for identifying, counting, and tracking microorganisms at very low densities and compared with optical density measurements, plate count, and direct count.

Quantificação de microrganismos em baixas concentrações, utilizando microscopia holográfica Digital (DHM)

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved oxygen concentration). Nevertheless, the morphology of cells can be a suitable indicator for optimal conditions, since it changes with dependence on the growth state, product accumulation and cell stress. Furthermore, the single-cell size distribution provides not only information about the cultivation conditions, but also about the population heterogeneity. To gain such information, a photo-optical in situ microscopy device1 was developed to enable the monitoring of the single-cell size distribution directly in the cell suspension in bioreactors. An automated image analysis is coupled to the microscopy based on a neural network model, which is trained with user-annotated images. Several parameters, which are gained from the captures of the microscope, are correlated to process relevant features of the cells, like their metabolic activity. Until now, the presented in situ microscopy probe series was applied to measure the pellet size in filamentous fungi suspensions. It was used to distinguish the single-cell size in microalgae cultivation and relate it to lipid accumulation. The shape of cellular particles was related to budding in yeast cultures. The microscopy analysis can be generally split into three steps: (i) image acquisition, (ii) particle identification, and (iii) data analysis, respectively. All steps have to be adapted to the organism, and therefore specific annotated information is required in order to achieve reliable results. The ability to monitor changes in cell morphology directly in line or on line (in a by-pass) enables real-time values for monitoring and control, in process development as well as in production scale. If the off line data correlates with the real-time data, the current tedious off line measurements with unknown influences on the cell size become needless.

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

A photo-optical in situ microscopy device was developed to monitor the size of single cells directly in the cell suspension. The real-time measurement is conducted by coupling the photo-optical sterilizable probe to an automated image analysis. Morphological changes appear with dependence on the growth state and cultivation conditions.

Em Situ Microscopia para determinação em tempo real da morfologia unicelular em bioprocessos

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualizando a formação de adesão em células por meio de avançados girando a reflexão interna Total disco microscopia de fluorescência

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...