Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health dos EUA concede HL082798 e HL111580.

1. Rim Tecido Seções <ol><li> Fixadas em formalina (10%) secções de rim embebidas em parafina são cortados em lâminas de microscópio a 5 mm de espessura usando um Microm HM 355 S. As lâminas podem ser armazenadas durante vários meses, antes da análise. </li></ol> 2. Preparação de Solução <ol><li> Prepare 1 litro de PBS 1x em DDH 2 O em um parafuso de garrafa top autoclave. Encha uma garrafa com 1 L de DDH 2 O. Adicionar 1 ml de DEPC para cada garrafa, tampa e agitar vigorosamente. Deixe a solução assentar durante a noite à temperatura ambiente, para destruir ARNases e, em seguida, autoclave. Adicionar 400 ml de Tween-20 a 1 L de 1x PBS para fazer PBS-T. </li><li> Preparar tampão de proteinase K (50 mMTris-HCl, pH 8,0 e 1 mM de CaCl2 em água tratada com DEPC). </li><li> Prepara-se uma solução de 0,2% de glicina em PBS-T. </li></ol> 3. Preparação Tissue <ol><li> Prepara-se uma grande quantidade de tampão de hibridação (50-100 ml), composto de 50% de formamida, 5x SSC, 0,1% de Tween, 9,2mM de ácido cítrico para o ajuste de pH de 6, 50 ug / ml de heparina, e 500 ug / ml de ARN de levedura em DEPC tratados ddH 2 O. Divida em 1 ml alíquotas e armazenar a -80 º C. </li><li> Retirar a parafina do tecido por lavagem 3x em xileno fresco, durante 5 minutos cada. </li><li> Re-hidratar as secções de tecido por 5 min em incubações concentrações decrescentes de etanol (100%, 75%, 50% e 25%) em ddH 2 O. </li><li> Tratar as lâminas com DEPC suficiente para cobrir completamente as secções de tecidos (cerca de 0,4-0,5 ml) durante 1 min. Fazer tecidos certeza não sequem. </li><li> Enxaguar as lâminas em DEPC tratados PBS-T duas vezes por 5 min, recolhendo o DEPC contendo resíduos para o descarte adequado. Todos os reagentes devem ser tratados DEPC para eliminar RNAses a partir deste ponto. </li><li> Pré-aquecer proteinase K e adicionar tampão de proteinase K para uma concentração final de 10 ug / ml. Cobrir as secções de tecido com uma solução de proteinase K e incubar a 37 º C durante 5 min. </li><li> Remover rapidamente as proteinassolução de e K e adicionar 0,2% de glicina em PBS-T, durante 30 seg. </li><li> Lavar as lâminas em DEPC tratados PBS-T duas vezes por 30 segundos cada. </li><li> Fix seções acabado de fazer paraformaldeído 4% por 10 min. </li></ol> 4. Hibridização <ol><li> Adicionar 50 ul de tampão de hibridação (formamida a 50%, 5x SSC, 0,1% de Tween, ácido cítrico 9,2 mM, para o ajuste de pH de 6, 50 ug / ml de heparina, 500 ug / ml de ARN de levedura) por secção de tecido e cobrir com RNAse HybriSlips livres corte maior do que as secções de tecido. </li><li> Secções Prehybridize em humidade controlada forno de hibridação durante 2 horas à temperatura de hibridização para determinar a extremidade 3 &#39;da sonda marcada com digoxigenina (usualmente ADN Tm da sonda de -21 ° C, (isto é, 54 ° C durante o miR-382, a sonda de DNA Tm = 75 ° C ), usando lenços de laboratório tecido embebido em 50% formamide/50% 5x SSC para manter a câmara úmida. </li><li> Diluir a sonda miRNA, controle positivo (U6, RNA nuclear pequeno) e controle negativo (mexidossequência) a 40 nM em tampão de hibridação (75 ul de tampão é necessária por secção). </li><li> Aquece-se a sonda em tampão de hibridação a 65 º C durante 5 min. </li><li> Retirar as lâminas do forno de hibridização e remover lamelas e tampão de hibridação excesso de pré-hibridização. </li><li> Adicionar 75 ul de tampão sonda contendo por secção de tecido, directamente para o tecido. Cubra com tecido HybriSlips apenas grandes o suficiente para cobrir os cortes de tecido. </li><li> Manutenção do nível de suporte de slides, voltar ao forno de hibridização para incubação durante a noite à temperatura do passo 4.2 (aproximadamente 16 horas). </li></ol> 5. Lavagem rigorosa <ol><li> Adicionar 200 ul de 2xSSC, aquecida à temperatura de hibridação, pouco menos de uma borda das lamelas para ajudar a libertar a lamela do tecido. Retirar as lamelas pela inclinação do slide. </li><li> Lavar as lâminas em 200 ul de 50% de formamida, 50% 2x SSC à temperatura de hibridação 3x durante 30 minutos cada. </li><li> Enxaguaras lâminas 5x em PBS-T a temperatura ambiente durante 5 min cada, num agitador orbital de velocidade baixa. </li></ol> 6. Detecção <ol><li> Incubar corrediça em tampão (2% de soro de cabra ou cavalo, 2 mg / ml de BSA em PBS-T) de bloqueio, durante 1 hora à temperatura ambiente num agitador orbital de velocidade baixa. </li><li> Dilui-se os fragmentos de anti-DIG-AP Fab em tampão de bloqueio a 1:100. Adicionar 100 l por secção de tecido e cubra com HybriSlips cortado apenas suficientemente grande para cobrir a seção. </li><li> Incubar anticorpo numa câmara humidificada a 4 ° C durante a noite (aproximadamente 16 horas). </li><li> Lavar as lâminas em PBS-T 7x, durante 5 min cada, num agitador orbital a uma velocidade baixa. </li><li> Lavar as lâminas em tampão de AP (100 mM Tris-HCl pH 9,5, 50 mM de MgCl 2, 100 mM de NaCl, 0,1% de Tween 20) 3x, durante 5 minutos cada. </li><li> Adicionar solução de NBT / BCIP de tampão AP (200 μl/10 tampão ml) </li><li> Adicionar 400-500 ml de solução diluída de NBT / BCIP a cada slide para cobrir completamente todas as seções do tecido. Desenvolver em um escuro, nível, humidifcâmara de IED para 4-5 horas. </li></ol> 7. Slides de montagem <ol><li> Desidratar secções em concentrações crescentes de etanol (25%, 50%, 75%, 100%) durante 5 minutos cada. </li><li> Incubar em 5x xileno para limpar seções. </li><li> Monte desliza Permount montagem médio e secar durante a noite. </li></ol>

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H., Mourelatos, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAKE+and+LNA-ISH+reveal+microRNA+expression+and+localization+in+archival+human+brain+tissue.">RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain tissue.</a> RNA. 12 (2), 187-191 (2006).</li><li>Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locked+nucleic+acid-based+in+situ+detection+of+microRNAs+in+mouse+tissue+sections.">Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1508-1514 (2007).</li><li>Kriegel, A. J., Liu, Y., Cohen, B., Usa, K., Liu, Y., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-382+targeting+of+kallikrein+5+contributes+to+renal+inner+medullary+interstitial+fibrosis.">MiR-382 targeting of kallikrein 5 contributes to renal inner medullary interstitial fibrosis.</a> Physiol. Genomics. 44 (4), 259-267 (2012).</li></ol>

Não há nada a divulgar.

O objetivo deste artigo foi descrever um protocolo para miRNA hibridização in situ que funciona bem em tecidos renais formol fixos. Enquanto trabalham fora deste protocolo várias fontes importantes de artefato coloração foram identificados. Atenção especial para estes pontos podem ajudar a evitar manchas artefato e aumentar a probabilidade de uma corrida ISH bem sucedida. Uma das causas mais evitáveis ​​de artefato coloração pode ocorrer quando cortes de tecidos tornam-se secos durante incubações longas. Quando isto ocorre, a parte do tecido que fica seca mancha muito escura durante o desenvolvimento de NBT / BCIP (Figura 1). Ao longo deste protocolo, é fundamental que as secções de tecido permanecem completamente cobertas pelo líquido ao longo de todas as incubações, e que as lâminas são mantidos completamente nivelada. Além disso, as secções de tecido deve permanecer completamente coberto por HybriSlips durante incubações longas, tais como os passos de hibridação e<html> a incubação do anticorpo, para ajudar a impedir a perda de líquido. Se a secagem total ou parcial de uma secção de tecido é observado, é improvável que as amostras produzirá coloração óptima, o que não irá permitir a expressão miARN para ser interpretado nas amostras. Outros passos do protocolo em que a cobertura líquida é essencial são durante a digestão com proteinase K e tratamento de paraformaldeído. Esta digestão é necessário para permitir o acesso da sonda miARN para dentro das células. Se a cobertura de tecido é incompleta durante este curto de incubação, as áreas que não estão expostas à digestão enzimática não irá permitir que tanto a sonda entra e se ligam, e em última análise, não manchará, como escura como outros como outras áreas do tecido. Ao aplicar este protocolo para outros tipos de tecidos, a duração da proteinase K digestão pode precisar de ser otimizado. A fixação paraformaldeído posterior também é essencial para evitar a perda de miRNAs seguinte permeabilização. nt &quot;&gt; A duração do desenvolvimento NBT / BCIP também é uma variável importante para o controle. Descobrimos que incubações NBT / BCIP de mais de 4 ou 5 horas significativo artefato fundo começa a desenvolver-se nos tecidos sondado com as sondas de controle mexidos-miR ( Figura 2A). Quatro horas de desenvolvimento de NBT / BCIP é suficiente para a detecção de alvos de sondagem expressos em abundância relativamente elevada, como por exemplo o pequeno U6 ARN de controlo positivo (Figura 2B). incubações mais longas não aparecem para permitir a expressão de baixo nível adicional ser detectado, e isso pode simplesmente resulta em maior fundo artefato. Isso leva à importante questão da detectabilidade de miRNAs expressos inferiores. Embora tenhamos encontrado sondas conjugadas digoxigenina 5 &#39;para fornecer-nos com a sensibilidade de detecção suficiente para as nossas aplicações no rim. O desenvolvimento de cor com base fosfatase alcalina permite múltiplas partículas de sinais a serem medidos para each molécula de sonda, no entanto alguns baixo nível miRNA ainda não pode ser detectável. Exiqon tinham desenvolvido sondas miRNA que estão marcadas em ambas as extremidades 5 &#39;e 3&#39; permitindo que o potencial para o desenvolvimento colorimétrico duas vezes, por molécula de microRNA. Enquanto o nosso laboratório não testou estas sondas, o seu uso em tecidos renais com um protocolo semelhante foi relatado 8. Este protocolo de base pode ser adaptado a outros tipos de tecidos e sondas miRNA através da optimização do tempo de digestão de proteinase K, as concentrações de sonda miARN, as temperaturas de hibridação, e o tempo de desenvolvimento de NBT / BCIP. Também é possível utilizar a primeira parte do protocolo em combinação com anticorpos fluorescentes em tecidos onde a autofluorescência é apropriadamente baixo.

MicroRNA são pequenos (cerca de 22 nucleótidos de comprimento) que não de codificação RNAs que são produzidos endogenamente. Eles geralmente funcionam para suprimir a expressão da proteína através da repressão de translação ou degradação do mRNA. miRNAs ligam a alvos de RNAm com complementaridade incompleta, tornando possível que um único miRNA para suprimir múltiplos alvos. Entendimento que tipos e estruturas celulares expressar miRNAs é uma parte importante da compreensão dos mecanismos através dos quais alterações miRNA celular influência expressão e fenótipos de tecido. Enquanto os métodos tais como a sequenciação de miARN, qPCR e Northern blotting pode ser usado para a detecção de miRNAs em tecidos completos, esta abordagem não permitem determinar qual o tipo de célula específico que veio a partir de um determinado tecido. Dissecção de componentes celulares e estruturais antes da análise usando estes métodos pode ser muito difícil, e as condições necessárias para atingir isolamentos adequados pode levar a alterações na expressão de genes ou a degradação de ARN. microRNA hibridação in situ é um método usado para visualizar a localização microRNA e os níveis de expressão em tecidos. Esta técnica é especialmente valiosa em tecidos compostos de estruturas heterogéneas, tais como o rim. MicroRNAs demonstraram desempenhar um papel regulador no desenvolvimento do rim 2,3 e fisiologia 4. Alterações de expressão microRNA também têm sido mostrados para ser envolvido com a patologia renal, tais como fibrose 5-10, nefropatia diabética 7, carcinoma renal, 11,12, e lesão renal aguda 13. Em nossa pesquisa, descobrimos que a otimização microRNA hibridização in situ para os tecidos renais foi valioso para determinar os locais exatos estruturais de expressão de miRNA em saúde e na doença 14. Determinação da expressão tubular e celular de diferentes microRNAs é importante porque a sua regulação de targets pode ser dependente de funções celulares. No estado de doença, é também importante para determinar como as alterações na expressão de miARN pode ser afectar a função. O objetivo do método descrito aqui foi a de construir sobre metodologias ISH existentes desenvolvidos por 15 Kloosterman et al., Outros pesquisadores 16,17, e os sugeridos pela Exiqon 1 e otimizar o método para tecidos renais fixados em formalina. Temos utilizado com sucesso este método para identificar as diferenças regionais distintos na expressão renal microRNA miR-382 com obstrução ureteral unilateral 18. Esta abordagem pode ser utilizada com outros tecidos, bem como, com optimização adicional.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl Pyrocarbonate</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>Sigma</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Ultra Pure</td><td>200CSPTP</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Life Technologies</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C2536</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>J.T. Baker</td><td>4059-00</td><td></td></tr><tr><td>Citric Acid</td><td>Sigma</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>15557-044</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>SAGENT</td><td>25021-400-30</td><td></td></tr><tr><td>Yeast RNA</td><td>Life Technologies</td><td>AM7118</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M8266-1004</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>4058-01</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Fermentas</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>3&amp;rsquo; DIG- miRNA probe</td><td>Exiqon</td><td>miR dependent-05</td><td></td></tr><tr><td>3&amp;rsquo; DIG- Scrambled miR probe</td><td>Exiqon</td><td>99004-05</td><td></td></tr><tr><td>3&amp;rsquo; DIG- U6 miR probe</td><td>Exiqon</td><td>99002-05</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-Ab Fab</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>Roche</td><td>11681451001</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher</td><td>Fit to tissue size</td><td></td></tr><tr><td>Microtom HM 355 S</td><td>Thermo Scientific</td><td>23-900-672</td><td></td></tr><tr><td>In-slide Out Hybridization Oven</td><td>Boekel</td><td>241000</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum Tray Assembly</td><td>Boekel</td><td>C2403973</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Rack Insert</td><td>Boekel</td><td>C2403754</td><td></td></tr></tbody></table>

microrna in situ hybridization for formalin fixed kidney tissues

Neste artigo descrevemos um método de detecção colorimétrica de miRNA no rim através de hibridização in situ com sondas marcadas com digoxigenina microRNA. Este protocolo, desenvolvido originalmente por Kloosterman e colegas para amplo uso com sondas Exiqon miRNA 1, foi modificado para superar os desafios inerentes à análise de miRNA em tecidos renais. Estes incluem questões como a identificação da estrutura e difícil de remover sonda residual e de anticorpos. Utilização de relativamente fina, espessura de 5 mm, as secções de tecido permitido para melhor visualização das estruturas do rim, ao passo que um sinal forte de sonda foi retido nas células. Além disso, as condições de concentração de sonda e de incubação foram otimizados para facilitar a visualização da expressão do microRNA com baixa de fundo e um sinal não específico. Aqui, o protocolo optimizado é descrito, cobrindo a recolha inicial de preparação de tecidos e, através da montagem das lâminas, no final do procedimento. O compone básiconts deste protocolo pode ser alterado por aplicação de outros tecidos e modelos de cultura de células.

As áreas de uma secção de tecido que se tornam secas durante as hibridações, as incubações ou passos de lavagem geralmente acabam coloração mais escura, durante o desenvolvimento de NBT / BCIP. Figura 1 mostra uma porção de uma secção de rim em que o HybriSlip escorregou da borda o tecido, permitindo tornar-se parcialmente desidratado. Apesar de re-hidratação e de cobertura nas etapas restantes, o sinal na porção desidratado é artificialmente elevada. A importância de controlar o tempo de desenvolvimento de NBT-BCIP é demonstrada nas Figuras 2A e 2B. Períodos de desenvolvimento de mais de 4-5 resultado hr em pronunciado desenvolvimento da cor inespecífica em mexidos-miR controle tecidos sondadas em todo o rim (Figura 2A). Rins sondado para alvos alta abundância, como o U6 pequeno controle RNA nuclear, não apresentam sinais de melhoria com incubações mais do que 4-5 horas (Fig<html> ure 2B). A aplicabilidade do método descrito aqui ISH para detecção miARN no tecido do rim é demonstrado na Figura 3, uma figura reproduzida de Kriegel et al. 18 Neste estudo verificou-se que a obstrução uretral unilateral (UUO) induziu um aumento de quase 3 vezes na qPCR detectada expressão de miR-382 em tecido renal homogeneizado quando comparado ao sham operado animais. Este aumento foi bloqueado por injecção intravenosa de fornecer anti-miR-382 (dados não mostrados). O uso de ISH nesses tecidos renais indicou que a detecção de miR-382 fornecida por esta sonda foi sensível o suficiente para proporcionar resultados quantificáveis ​​que espelhados análise de expressão baseado qPCR. Além disso, ISH nos permitiu medir as diferenças regionais distintos na expressão de miRNA dentro do rim. 600px &quot;/&gt; Figura 1. O efeito da desidratação parcial de uma seção de rim de ratos durante a etapa de hibridização. Barra de Calibração = 100 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50785/50785fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50785/50785fig2.jpg" width="600px" /> Figura 2. Otimização da duração do desenvolvimento NBT / BCIP. Permitindo o desenvolvimento NBT / BCIP para continuar por mais de 4-5 resultados de RH em coloração de fundo significativa em mexidos-miR sondado tecidos (Figura 2A), ao fornecer mais nenhuma melhoria na o sinal do controlo positivo, de ARN nuclear pequeno U6 amostras sondadas (Figura 2B). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50785/50785fig2highres.jpg" target="_blank">clique aqui para visualizar</a>Ampliar Imagem. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50785/50785fig3.jpg" width="600px" /> Figura 3. Imagens representativas da expressão de miR-382 em secções de rim de ratinho obtidos por hibridação in situ de barras de calibração. = 50 um. (B) a expressão de miR-382 por cento como IOD média de sham + camundongos tratados anti-mexidos. Esta figura foi modificado a partir de Kriegel et al., (Figura 5), o qual descreve os detalhes de grupos de tratamento, os métodos e os resultados de 18. Anti-mexidos tratados n = 10/grupo, anti-miR-382 n = 8/grupo, * significativamente diferente de ratinhos tratados com anti-mexidos mesma cirurgia (P &lt;0,05), # significativamente diferente de falsos operado animais que receberam o mesmo anti miR-tratamento. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50785/50785fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui</a>para ver a imagem maior.

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MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

Este artigo descreve um protocolo de hibridização in situ em otimizado para detecção colorimétrica de expressão de microRNA em seções renais fixados em formalina.

MicroRNA<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridização de tecidos de rim fixadas em formalina

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

microrna-in-situ-hybridization-for-formalin-fixed-kidney-tissues

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

14.9K visualizações.  Medical College of Wisconsin.  Este artigo descreve um protocolo de hibridização in situ em otimizado para detecção colorimétrica de expressão de microRNA em seções renais fixados em formalina. 

Vídeo: MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of cancer development. By using non-invasive or pre-malignant lesions from patients who later develop invasive disease, gene expression analyses may help identify early molecular alterations that predispose to cancer risk. It has been well described that nucleic acids recovered from FFPE tissues have undergone severe physical damage and chemical modifications, which make their analysis difficult and generally requires adapted assays. MicroRNAs (miRNAs), however, which represent a small class of RNA molecules spanning only up to ~18&#8211;24 nucleotides, have been shown to withstand long-term storage and have been successfully analyzed in FFPE samples. Here we present a 3&#39; barcoded complementary DNA (cDNA) library preparation protocol specifically optimized for the analysis of small RNAs extracted from archived tissues, which was recently demonstrated to be robust and highly reproducible when using archived clinical specimens stored for up to 35 years. This library preparation is well adapted to the multiplex analysis of compromised/degraded material where RNA samples (up to 18) are ligated with individual 3&#39; barcoded adapters and then pooled together for subsequent enzymatic and biochemical preparations prior to analysis. All purifications are performed by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), which allows size-specific selections and enrichments of barcoded small RNA species. This cDNA library preparation is well adapted to minute RNA inputs, as a pilot polymerase chain reaction (PCR) allows determination of a specific amplification cycle to produce optimal amounts of material for next-generation sequencing (NGS). This approach was optimized for the use of degraded FFPE RNA from specimens archived for up to 35 years and provides highly reproducible NGS data.

Formalin-fixed paraffin-embedded specimens represent a valuable source of molecular biomarkers of human diseases. Here we present a laboratory-based cDNA library preparation protocol, initially designed with fresh frozen RNA, and optimized for the analysis of archived microRNAs from tissues stored up to 35 years.

Sequenciação de MicroRNA retrospectiva: Biblioteca de DNA complementar preparação protocolo usando amostras de RNA de parafina fixada em formol

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Genética

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To date, miRNAs have been implicated in a large number of biological and disease processes, which has signified the need for the reliable detection methods of miRNA transcripts. Here, we describe a detailed protocol for digoxigenin-labeled (DIG) Locked Nucleic Acid (LNA) probe-based miRNA detection, combined with protein immunostaining on mouse heart sections. First, we performed an in situ hybridization technique using the probe to identify miRNA-182 expression in heart sections from control and cardiac hypertrophy mice. Next, we performed immunostaining for cardiac Troponin T (cTnT) protein, on the same sections, to co-localize miRNA-182 with the cardiomyocyte cells. Using this protocol, we were able to detect miRNA-182 through an alkaline phosphatase based colorimetric assay, and cTnT through fluorescent staining. This protocol can be used to detect the expression of any miRNA of interest through DIG-labeled LNA probes, and relevant protein expression on mouse heart tissue sections.

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are short and highly homologous RNA sequences, serving as post-transcriptional regulators of messenger RNAs (mRNAs). Current miRNA detection methods vary in sensitivity and specificity. We describe a protocol that combines in situ hybridization and immunostaining for concurrent detection of miRNA and protein molecules on mouse heart tissue sections.

Tecido-específica miRNA Expression Profiling Mouse coração seções usando em hibridação in Situ

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction

MicroRNAs (miRNAs) are single stranded, non-coding RNA molecules that typically regulate gene expression at the post-transcriptional level by binding to partially complementary target sites in the 3&#39; untranslated region (UTR) of messenger RNA (mRNA), which reduces the mRNA&#39;s translation and stability. The miRNA expression profiles in various organs and tissues of mice have been investigated, but standard methods for the purification and quantification of miRNA in mouse kidney have not been available. We have established an effective and reliable method for extracting and evaluating miRNA expression in mouse kidney with renal interstitial fibrosis by quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). The protocol required five steps: (1) creation of sham and unilateral ureteral obstruction (UUO) mice; (2) extraction of kidney samples from the UUO mice; (3) extraction of total RNA, which includes miRNA, from the kidney samples; (4) complementary DNA (cDNA) synthesis with reverse transcription from miRNA; and (5) qRT-PCR using the cDNA. Using this protocol, we successfully confirmed that compared to the controls, the expression of miRNA-3070-3p was significantly increased and those of miRNA-7218-5p and miRNA-7219-5p were significantly decreased in the kidneys of a mouse model of renal interstitial fibrosis. This protocol can be used to determine the miRNA expression in the kidneys of mice with UUO.

We describe a method for evaluating the microRNA expression in the kidneys of mice with unilateral ureteral obstruction (UUO) by quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction. This protocol is suitable for studying kidney microRNA expression profiles in mice with UUO and in the context of other pathological conditions.

Avaliação quantitativa de PCR em tempo real de expressões de microRNA no rim do rato com obstrução ureteral unilateral

MicroRNAs (miRNAs) are single stranded, non-coding RNA molecules that typically regulate gene expression at the post-transcriptional level by binding to ...

miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, diagnosis, prognosis and treatment. In recent years, microRNAs (miRNAs) have emerged as promising alternate biomarkers for prostate cancer diagnosis and prognosis. However, the development of miRNAs as effective biomarkers for prostate cancer heavily relies on their accurate detection in clinical tissues. miRNA analyses in prostate cancer clinical specimens is often challenging owing to tumor heterogeneity, sampling errors, stromal contamination etc. The goal of this article is to describe a simplified workflow for miRNA analyses in archived FFPE or fresh frozen prostate cancer clinical specimens using a combination of quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH). Within this workflow, we optimize the existing methodologies for miRNA extraction from FFPE and frozen prostate tissues and expression analyses by Taqman-probe based miRNA RT-PCR. In addition, we describe an optimized method for ISH analyses formiRNA detection in prostate tissues using locked nucleic acid (LNA)- based probes. Our optimized miRNA ISH protocol can be applied to prostate cancer tissue slides or prostate cancer tissue microarrays (TMA).

Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

As análises de expressão de miRNA no câncer de próstata tecidos clínicos

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

Medicina

Clinicopathological Analysis of miRNA Expression in Breast Cancer Tissues by Using miRNA In Situ Hybridization

In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA (Locked Nucleic Acid) probe. The probe was recognized by anti-DIG alkaline phosphatase antibodies and later developed using alkaline phosphatase substrate producing fluorescence signals. Here we utilized miRNA in situ hybridization (MISH) technique to analyze expression of miR-489 in tissues from breast cancer patients. This technique can detect the localization of miRNA of interest in individual tissue samples. This technique can be used to compare the expression of desired miRNA in tumor tissue with that in adjacent normal tissue and to identify the specific structures responsible for expressing this miRNA. This technique can be very useful in answering certain clinical questions, such as role of specific miRNA in the development of cancer. Our results indicate that mammary epithelial cells express significantly higher levels of miR-489 than adjacent tumor cells.

Clinicopathological Analysis of miRNA Expression in Breast Cancer Tissues by Using miRNA In Situ Hybridization

Here we present a protocol to detect miRNA expression in breast cancer patient samples using miRNA in situ hybridization.

Análise clínico-patológico de miRNA Expressão em cancro da mama tecidos usando miRNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização

In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA ...

Detection of MicroRNA Expression in the Kidneys of Immunoglobulin A Nephropathic Mice

Immunoglobulin A (IgA) nephropathy is a type of primary glomerulonephritis characterized by the abnormal deposition of IgA, leading to the end-stage renal failure. In recent years, the involvement of microRNAs (miRNAs) has been reported in the pathogenesis of IgA nephropathy. However, there is no established method for profiling miRNAs in IgA nephropathy using small animal models. Therefore, we developed a reliable method for analyzing miRNA in the kidney of an IgA mouse model (HIGA mouse). The goal of this protocol is to detect the altered expression levels of miRNAs in the kidneys of HIGA mice when compared with the levels in kidneys of control mice. In brief, this method consists of four steps: 1) obtaining kidney samples from HIGA mice; 2) purifying total RNA from kidney samples; 3) synthesizing complementary DNA from total RNA; and 4) quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) of miRNAs. Using this method, we successfully detected the expression levels of several miRNAs (miR-155-5p, miR-146a-5p, and miR-21-5p) in the kidneys of HIGA mice. This new method can be applied to other studies profiling miRNAs in IgA nephropathy.

microRNAs are involved in the pathogenesis of IgA nephropathy. We have developed a reliable method for detecting microRNA expression levels in the kidneys of an IgA nephropathy mouse model (HIGA mice). This new method will facilitate to check for miRNAs involvement in IgA nephropathy.

Detecção da Expressão de MicroRNA nos Rins de Camundongos Nefropáticos com Imunoglobulina A

Immunoglobulin A (IgA) nephropathy is a type of primary glomerulonephritis characterized by the abnormal deposition of IgA, leading to the end-stage renal ...

Imunologia e Infecção

A Quantitative Detection Method for MicroRNAs in the Kidney of an Ischemic Kidney Injury Mouse Model

MicroRNAs (miRNAs) are involved in various disease states and are effective biomarkers for the early diagnosis of diseases and treatment in mice. However, standard protocols for the purification of miRNAs and detection of their expression in the kidneys of acute kidney injury (AKI) mice have not been well established. This study developed an effective and simple protocol to purify and quantify miRNAs in the kidneys of an AKI mouse model induced by renal ischemia-reperfusion using quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). This protocol comprises five steps: 1) induction of AKI by renal ischemia-reperfusion, 2) harvesting of kidneys, 3) purification of total RNA, including miRNAs, from kidneys, 4) cDNA synthesis by reverse transcription of miRNA, and 5) qRT-PCR to detect miRNA expression. Using this protocol, the renal ischemia-reperfusion injury model can be generated with mild to severe forms of AKI. Additionally, if the procedure is followed properly, a consistent AKI model with minimal individual differences can be obtained. This qRT-PCR assay shows a very wide dynamic range and enables the discrimination of mature miRNAs, which can be accurately quantified with high specificity. This protocol can be used to study the miRNA expression profile in AKI kidneys.

This article presents a protocol for detecting microRNA expression in the kidneys of an acute kidney injury mouse model using quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction. This protocol emphasizes an ischemic kidney injury mouse model and the careful extraction of microRNA samples.

MicroRNAs (miRNAs) are involved in various disease states and are effective biomarkers for the early diagnosis of diseases and treatment in mice. However, ...

Delivery of Exogenous Artificially Synthesized miRNA Mimic to the Kidney Using Polyethylenimine Nanoparticles in Several Kidney Disease Mouse Models

microRNAs&#160;(miRNAs), small noncoding RNAs (21-25 bases) that are not translated into proteins, inhibit lots of target messenger RNAs (mRNAs) by destabilizing and inhibiting their translation in various kidney diseases. Therefore, alternation of miRNA expression by exogenous artificially synthesized miRNA mimics is a potentially useful treatment option for inhibiting the development of many kidney diseases. However, because serum RNAase immediately degrades systematically administered exogenous miRNA mimics in vivo, delivery of miRNA to the kidney remains a challenge. Therefore, vectors that can protect exogenous miRNA mimics from degradation by RNAase and significantly deliver them to the kidney are necessary. Many studies have used viral vectors to deliver exogenous miRNA mimics or inhibitors to the kidney. However, viral vectors may cause an interferon response and/or genetic instability. Therefore, the development of viral vectors is also a hurdle for the clinical use of exogenous miRNA mimics or inhibitors. To overcome these concerns regarding viral vectors, we developed a nonviral vector method to deliver miRNA mimics to the kidney using tail vein injection of polyethylenimine nanoparticles (PEI-NPs), which led to significant overexpression of target miRNAs in several mouse models of kidney disease.

Here, we deliver exogenous artificially synthesized miRNA mimics to the kidney via tail vein injection of a nonviral vector and polyethylenimine nanoparticles in several kidney disease mouse models. This led to significant overexpression of target miRNA in the kidney, resulting in inhibited progression of kidney disease in several mouse models.

Entrega de miRNA exógeno sintetizado artificialmente ao rim usando nanopartículas de polietilenimina em vários modelos de doença renal em camundongos

microRNAs&#160;(miRNAs), small noncoding RNAs (21-25 bases) that are not translated into proteins, inhibit lots of target messenger RNAs (mRNAs) by ...

Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue

Gene expression analysis of human kidney tissue is an important tool to understand homeostasis and disease pathophysiology. Increasing the resolution and depth of this technology and extending it to the level of cells within the tissue is needed. Although the use of single nuclear and single cell RNA sequencing has become widespread, the expression signatures of cells obtained from tissue dissociation do not maintain spatial context. Laser microdissection (LMD) based on specific fluorescent markers would allow the isolation of specific structures and cell groups of interest with known localization, thereby enabling the acquisition of spatially-anchored transcriptomic signatures in kidney tissue. We have optimized an LMD methodology, guided by a rapid fluorescence-based stain, to isolate five distinct compartments within the human kidney and conduct subsequent RNA sequencing from valuable human kidney tissue specimens. We also present quality control parameters to enable the assessment of adequacy of the collected specimens. The workflow outlined in this manuscript shows the feasibility of this approach to isolate sub-segmental transcriptomic signatures with high confidence. The methodological approach presented here may also be applied to other tissue types with substitution of relevant antibody markers.

We describe a protocol for laser microdissection of sub-segments of the human kidney, including the glomerulus, proximal tubule, thick ascending limb, collecting duct and interstitium. The RNA is then isolated from the obtained compartments and RNA sequencing is carried out to determine changes in the transcriptomic signature within each sub-segment.

Aplicação de microdisseção a laser para descobrir transcrição regional em tecido renal humano

Gene expression analysis of human kidney tissue is an important tool to understand homeostasis and disease pathophysiology. Increasing the resolution and ...

Biologia

Traditional Medicine and PI3K/AKT Pathway Activation in Membranous Nephropathy

Mechanism of Kemeng Fang's Inhibition of Podocyte Apoptosis in Rats with Membranous Nephropathy through the PI3K/AKT Signaling Pathway

Membranous nephropathy (MN) is a common pathological type of adult nephrotic syndrome. Up to 20% of patients with MN develop end-stage renal disease (ESRD). Podocytes have an important function in maintaining the glomerular filtration barrier and play a crucial role in the occurrence and development of proteinuria and MN. PI3K/AKT signaling pathway is involved in the entire process of podocyte growth, differentiation, and apoptosis. Kemeng Fang (KMF) is a traditional Chinese medicine formula that has been used to delay kidney injury. However, the therapeutic mechanism of KMF in MN is unclear. Here, the MN rat model was established by axillary, inguinal, and tail vein injections of cationized bovine serum albumin (C-BSA), and then KMF and PI3K inhibitor (LY294002) were administered. The data of liver function, kidney function, blood lipid, renal pathology, podocyte function, expression level of PI3K/AKT signaling pathway, and transcriptomics of rats demonstrated that KMF has a protective effect on the podocytes of MN rats by activating the PI3K/AKT signaling pathway, and it can effectively prevent the progression of MN.

The present protocol describes the establishment of a membranous nephropathy (MN) animal model, and how Kemeng Fang's inhibition reduces MN rat podocyte apoptosis by activating the PI3K/AKT signaling pathway.

Membranous nephropathy (MN) is a common pathological type of adult nephrotic syndrome. Up to 20% of patients with MN develop end-stage renal disease ...

MicroRNA

Resumo

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