Agradecemos Melissa Griffin e Jenna Rozacky para seu especialista em cuidados de peixe. PDM graças EGN para escrever assistência, generosidade e paciência. Este trabalho foi financiado pelo NIH / NIDCR R01DE020884 para JKE.

1. Pecuária e Mutant alelos <ol><li> Levantar e produzir peixe-zebra como descrito 21. </li><li> Alelos mutantes Zebrafish utilizados neste estudo foram PDGFRA b1059 16, B1100 smad5 22, e b577 smo 23. Fontes para essas cepas zebrafish incluem Zirc. </li></ol> 2. Preparação de Soluções e Implementos Nota: Todas as soluções e as ferramentas podem ser feitas com antecedência e armazenado para uso futuro. <ol><li> Adicione mídia embrião (EM) como descrito anteriormente 21. </li><li> Adicione 4 g / L de MS-222 (tricaina). Dissolve-se 4 g de fosfato dissódico (Na 2 HPO 4) em 450 ml de água estéril. Adicionar 2 g MS-222 à solução. Ajustar o pH para dentro de 7,0-7,2. Adicionar água estéril para um volume total de 500 ml. </li><li> Opcional: Faça 4 g / L de óleo de cravo. Pesar 0,2 g óleo de cravo puro em um tubo de 50 ml. Adicionar EM para um volume total de 50 ml. Armazenar a 4 ° C. </li><li> Faça 3% methylcellulosi. Traga 50 ml de EM + 0,1 M HEPES para ferver. Retire do fogo. Misture em 1,5 g de metilcelulose até que a solução é homogênea. Armazenar a 4 ° C. </li><li> Adicione 0,2% de agarose. Adicionar 0,1 g de agarose com 50 ml de EM. Traga EM para ferver no microondas ou numa placa de aquecimento e verifique se a agarose se dissolva. Alíquota em 500 volumes ul em tubos de microcentrífuga e armazenar a 4 ° C. Nota: Os volumes podem ser ajustados conforme necessário. </li><li> Faça pokers capilares. Coloque uma gota de super-cola dentro de um tubo capilar 0,9 milímetros ID. Inserir um comprimento de 4-5 cm de 6 £ de teste de linha de pesca monofilamento no interior do tubo capilar de tal modo que, aproximadamente, 3-4 mm de linha estende-se para além da extremidade do tubo. </li><li> Faça duas lamelas em ponte por espécime. Super-cola 22 x 22-1 tampa de vidro em cada extremidade de uma tampa de vidro de 24 x 60-1 deixando o meio livre. Faça singles (1 pequena tampa de vidro por fim) para os embriões com menos de um dia de idade, duplos (dois copos pequenos de cobertura em cima uns dos outros por fim) para os embriões de um a quatro days de idade, ou triplos (três pequenos copos de cobertura em cima uns dos outros por fim) para embriões cinco dias ou mais. </li><li> Encha uma seringa de 10 ml, com alta graxa de vácuo. Nota: Vácuo graxa serve como um vedante para evitar a desidratação de espécimes durante longos períodos de tempo, e tem um baixo potencial de toxicidade em comparação com os selantes mais voláteis. </li></ol> 3. Montagem embriões Zebrafish por microscopia confocal (veja a Figura 1) <ol><li> Prepare médio anestésico. Derreter-se uma alíquota de 0,2% de agarose por microondas em intervalos de 20 seg até completamente líquido. Misturar 8 ul de MS-222 em 192 uL de 0,2% de agarose ou 5 ul de 4 g / L de óleo de cravo em 195 ul de 0,2% de agarose. Manter em um bloco de aquecimento de 42 ° C. Nota: A exposição longa a MS-222 provoca atrasos de desenvolvimento mais fortes do que o óleo de cravo faz no peixe-zebra embrionária 24. </li><li> Se necessário: dechorionate manualmente embriões transgénicos não eclodidos para ser analisada imediatamente antes da análise. Utilizando uma pinça, lentamente tear o córion aberto até o embrião é liberado. </li><li> Anestesiar os embriões de peixe-zebra. Adicionar 1 ml de uma unidade de 4 g / L de MS-222-24 ml de meio de embrião. Alternativamente, adicione 390 mL de 4 g / L de óleo de cravo a 24 ml de água de peixe 24. Nota: atos óleo de cravo lentamente para realizar esta etapa, pelo menos, 15-20 minutos antes de microscopia de lapso de tempo. </li><li> Coloque uma gota de graxa de vácuo em torno do espaço centro de uma lamela de ponte para cima virada. Empurrar lentamente a gordura vácuo para fora da seringa, fazendo com que um talão suave, contínua, que é adjacente e no interior das pontes e a extremidade da lamela. </li><li> Espalhe um círculo de 4% de metilcelulose em meio da lamela em ponte usando um aplicador de madeira. </li><li> Transferência do embrião a ser trabalhada. Quando o embrião é anestesiado desenhar-lo em uma pipeta de vidro. Manter a pipeta-se verticalmente para permitir que o embrião se afundam para o fundo do líquido na pipeta. Mover a pipeta para dentro da solução de agarose e permitir que o embrião a cairem que a agarose. Não expulsar o líquido. </li><li> Colocar a amostra. Desenhar uma solução de agarose e o embrião para a pipeta. Expelir o embrião de uma gota da solução de agarose no topo da metilcelulose. Use um atiçador capilar para empurrar o embrião para baixo na metilcelulose e orientar o embrião como desejado para a imagem latente. </li><li> Selar o espécime. <ol><li> Coloque uma lamela em ponte na parte superior da montagem de um, virado para baixo. Aplique pressão uniforme para ambos os lados das lamelas imprensado até as pontes fazer contato direto e os selos gota de agarose a ambos lamelas. Verifique se o embrião está orientado corretamente. </li><li> Esfregue um aplicador de madeira ao longo do vidro para suavizar rachaduras e falhas no talão de graxa de vácuo. Limpe o excesso de graxa das bordas. </li></ol></li></ol> 4. Time-lapse confocal de Transgênicos Zebrafish embriões (Este protocolo foi otimizado para uma Zeiss LSM 710 microscópio confocal nosing software de imagem ZEN, e pode ser modificado para ser utilizado com outros sistemas.) <ol><li> Ative equipamento. Ligue o microscópio confocal a laser e todos os dispositivos externos. Ligue o computador conectado ao microscópio confocal. Abra o software de imagem confocal e selecione &quot;Sistema Start&quot; para ativar os controles de aquisição de imagem. </li><li> Prepare palco aquecida. Abaixe a plataforma de teste do microscópio confocal e mover as lentes objetivas fora de posição. Substitua o estágio padrão com uma fase aquecida eletrônico. Ligue o controlador para a fase aquecida e ajustar a temperatura para 29,5 ° C. </li><li> Coloque a amostra no campo de visão. Coloque as amostras montadas no palco. Mova a lente objetiva de 20X para a posição e elevar a plataforma de teste. Ative o emissor de luz visível e olhar através das oculares. Centralize a cabeça do embrião no campo de visão. </li><li> Definir configurações da experiência. <ol><li> Ative canais de fluorescência, selecionandoo comprimento de onda fluorescente para ser detectado e escolher tabelas de pesquisa de cores (LUT) para cada canal. Se necessário, use os controles manuais no software para ligar os lasers necessárias (por exemplo, 561 nm para RFP). Para cada canal de fluorescência, a intensidade do laser definido para 10,0 e a voltagem do fotomultiplicador (HV ou ganho) entre 600-700. Defina a média a 4 e a profundidade de bits para 16 bits. </li><li> Ative os módulos da série Z-stack e time. Defina o pinhole para uma resolução Z-5 mm ou menor, e definir o Z-intervalo para a distância ideal sugerido. Nota: Geralmente, 5 mm Z-resolução permite que cada imagem Z-stack a recolher rapidamente o suficiente para um &quot;instantâneo&quot; do embrião em um ponto de tempo específico e ao mesmo tempo resolver células individuais. Baixando a média também reduz a quantidade de tempo por imagem. </li><li> Definir o intervalo de tempo desejado entre imagens (geralmente 10-20 minutos) e o comprimento total do experimento. </li></ol></li><li> Definir posicionalinformações. <ol><li> Ligue a câmera para o modo de viver. Ajuste o foco e aumentar a intensidade do laser se necessário, para ver a fluorescência. Defina o zoom digital de 0,6 para uma visão mais ampla, se desejar. </li><li> Posicione o palco de tal forma que todas as estruturas de interesse são visíveis e há espaço no campo de visão para dorsal conseqüência e anteriormente. Concentre-se através do embrião para os limites superiores e inferiores de fluorescência. Defina as primeiras e últimas posições fatia Z-stack, no mínimo, 100 mm ou mais para além destes limites. </li></ol></li><li> Otimizar intensidade de fluorescência. <ol><li> Defina a LUT exibição para variar indicador. Estruturas fluorescentes agora deve aparecer branco, e no resto do campo de visão deve ser azul (sem detecção) ou preto. </li><li> Aumentar HV / ganho para um nível logo abaixo de onde saturada (vermelho) pixels aparecer. Se necessário, ajuste compensar assim a maior parte do fundo não é detectado (azul). Nota: diâmetro pinhole menor e aumento da intensidade do laser, tanto melhorar a imagem defrial, mas a intensidade do laser deve ser mantida baixa para preservar os tecidos vivos. Aumento HV / ganho e diâmetro do furo de pino (&lt;5 mm) são geralmente preferidas para o aumento da intensidade do laser. </li><li> Mantenha o diâmetro pinhole grande o suficiente para coletar imagens em tempo hábil, com média de sets a 4. O intervalo de-Z deve sempre ser definida para a distância ideal sugerido para o diâmetro pinhole. Realizar exames de curta duração (média = 1) com configurações diferentes, e usar a intensidade mínima de laser que atinge resolução desejada. </li></ol></li><li> Executar o experimento para o período de tempo desejado. Depois, retire do embrião a partir da fase aquecida e lentamente separar as lamelas. Mergulhe a lamela e embrião em EM em um 30 milímetros placa de Petri. Usando uma pipeta de vidro lavar cuidadosamente o embrião fora da lamela e remover as lamelas da placa de Petri. Coloque o embrião para uma incubadora de 28,5 ° C para continuar a desenvolver-se. </li><li> Comparar crescimento. No fim do experimento, tomar Zs indivíduotack imagens de embriões irmão montado na agarose que foram similarmente encenadas para a amostra no início da experiência, mas foram levantadas em EM numa incubadora 28,5 ° C. </li><li> Meça arcos faríngeos, conforme necessário. As medições podem ser realizadas em alguns conjuntos de software confocal. Medidas encontrados aqui foram realizadas utilizando Fiji25 importando e Z-projetando arquivos. LSM de quadros individuais. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Microscopia confocal Time-lapse é uma ferramenta poderosa para a análise do desenvolvimento. Aqui, nós demonstramos a utilidade do método no estudo da faringe arco morfogênese no peixe-zebra, que são mutantes por vias de sinalização importantes usando um transgênico que rotula células da crista neural. Além do nível de tecido análises, análises de lapso de tempo também são aplicáveis ​​para análises de uma escala celular 28. Muitos métodos de peixe-zebra amplamente utilizados também podem ser incorporados em experimentos de microscopia de lapso de tempo, incluindo a microinjecção de morfolinos, mRNAs, ou construções transgénicas, bem como transplantes entre embriões. Análise de múltiplos tecidos em desenvolvimento é limitada apenas pela capacidade de os tecidos da etiqueta fluorescente e pela capacidade de um microscópio confocal para detectar o número desejado de fluoróforos diferentes, sem interferência. O número de indivíduos que podem ser visualizados a partir de uma embreagem de embriões de peixe-zebra é severamente restringida, mas técnicas avançadaspermitir imagens automatizada de vários embriões no mesmo período de tempo. Isto é especialmente útil quando se pretende realizar uma análise de lapso de tempo de um mutante que não é facilmente identificado em momentos iniciais. Ao realizar medições de time-lapse imagens confocal, é importante considerar que algum atraso de desenvolvimento é causada pelo processo. Atrasos no desenvolvimento não são incomuns em embriões mutantes, bem como, de modo de imagem de irmão controles é necessário que ambos os embriões mutantes / manipulados, bem como os controles do tipo selvagem. Mesmo depois de controlado para o estadiamento, a medição comparativa das estruturas marcados com fluorescência é difícil. A intensidade de fluorescência podem ser altamente variáveis ​​entre indivíduos e entre as partes separadas da mesma estrutura. Assim, medições quantitativas nondiscrete têm um grau de subjetividade, e recomendamos que mais de um indivíduo realizar medições para assegurar a consistência. Os investigadores também deve ser disciplinado na orientação embriõespara medição comparativa de forma consistente, como não fazê-lo vai causar o aparecimento de diferenças morfológicas onde pode haver nenhum. Movimentos de embriões de amostras pode outright arruinar uma experiência, e nós achamos que a adição de anestésico após a agarose as microondas foi autorizado a engrossar reduz sua eficácia em sedativo embriões. Embora difícil de adquirir, os dados de microscopia de lapso de tempo tem vantagens óbvias sobre imagens estáticas em comparação morfogênese qualitativamente. As imagens estáticas, muitas vezes, permitem fácil medição de estruturas em um determinado ponto do tempo, mas não dão nenhuma indicação de comportamentos de tecido que antecederam ou após essa fase. Essa informação é crucial quando se estuda as interações de dois ou mais tecidos diferentes submetidos a morfogênese. A fim de obter a melhor caracterização geral da morfogénese, é benéfico para executar ambas as análises de tempo decorrido-estática e de melhor utilizar as vantagens de cada método. No tempo decorrido analise, os comportamentos de células e tecido dinâmico pode ser analisada e, em análises estáticas, grandes números de embriões podem ser examinados para obter a melhor compreensão da variabilidade. O crescente número de linhagens transgênicas de peixe-zebra e avanço de outras técnicas fará microscopia confocal de lapso de tempo de vários tecidos comuns, como em tempo real de dados vivo torna-se o padrão-ouro entre os pesquisadores morfogênese.

Morfogênese craniofacial é um processo multi-passo complexo que requer interações coordenadas entre vários tipos de células. A maior parte do esqueleto craniofacial é derivada a partir de células da crista neural, muitas das quais devem migrar a partir do tubo neural dorsal em estruturas transientes chamados arcos faringe 1. Tal como acontece com muitos tecidos, morfogênese do esqueleto craniofacial é mais complicado do que pode ser entendido por imagens estáticas de embriões em pontos específicos de tempo de desenvolvimento. Embora seja para realizar demorado, in vivo, a microscopia de lapso de tempo proporciona uma aparência contínua em células e tecidos de um embrião em desenvolvimento. Cada imagem em uma série de lapso de tempo dá contexto para os outros, e ajuda a um movimento em direção investigador deduzir por que um fenômeno ocorre, em vez de deduzir o que está ocorrendo naquele momento. Na imagem in vivo é, portanto, uma poderosa ferramenta descritiva de abordagens experimentais paradesconstruir os caminhos que guiam morfogênese. O Danio rerio peixe-zebra é um modelo genético popular de desenvolvimento embrionário dos vertebrados, e é particularmente bem adaptado para imagiologia in vivo de morfogénese. Modern, métodos convenientes para transgenia e genômica modificação estão avançando rapidamente o número de ferramentas disponíveis para pesquisadores peixe-zebra. Estas ferramentas de melhorar os métodos já robustos para manipulação genética e microscopia. Imagem in vivo de praticamente qualquer tecido em quase qualquer contexto genético desejado é mais próximo da realidade do que a fantasia. Movimentos morfogenéticos dos arcos faríngeos são guiados por sinalização interações entre a crista neural e do epitélio adjacente, tanto ectoderma e endoderma. Existem inúmeras moléculas sinalizadoras expressas pelo epitélio que são necessários para accionar a morfogénese dos elementos esqueléticos craniofaciais. Entre essas moléculas sinalizadoras, Sonic Hedgehog (Shh) é extremamente importante fou desenvolvimento craniofacial 2-8. Shh é expressa tanto pelo ectoderma oral e faringe endoderme 2,6,9,10. A expressão de Shh em endoderme regula movimentos morfogenéticas dos arcos 10, padronização de crista neural dentro dos arcos 10, e o crescimento do esqueleto craniofacial 11. Bmp sinalização também é extremamente importante para o desenvolvimento craniofacial 12 e pode alterar a morfogênese dos arcos faríngeos. Sinalização Bmp regula dorsal / ventral padronização de crista dentro dos arcos faríngeos 13,14. Rompimento de smad5 em zebrafish provoca graves defeitos palatais e um fracasso das cartilagens de Meckel para fundir de forma adequada na linha média 15. Além disso, os mutantes também exibem reduções e fusão dos elementos de cartilagem ventrais, com o 2 o, 3 o, e, por vezes, os elementos do arco 4 º faringe fundidos na linha média 15. Estas fusões sugerem fortemente que a sinalização BMP dirige a morfogênese destes elementos da faringe. Sinalização PDGF é necessário para o desenvolvimento craniofacial, mas tem papéis desconhecidos em arco faríngeo morfogênese. Ambos rato e mutantes PDGFRA peixe-zebra tem profunda clefting terço médio da face 16-18. Pelo menos, no peixe-zebra este clefting média facial é devido a uma falha de migração de células da crista neural apropriado 16. Células da crista neural continuam a expressar PDGFRA depois de terem entrado os arcos faríngeos. Além disso, os ligandos de PDGF são expressos por epitélios facial e dentro dos arcos da faringe 16,19,20, assim sinalização PDGF pode também desempenhar um papel importante na morfogénese dos arcos da faringe após a migração. No entanto, as análises da morfogênese dos arcos faríngeos em mutantes PDGFRA não foram realizadas. Aqui, nós demonstramos em microscopia confocal in vivo de pharyngulum estágio zebrafish transgênicos e descrever a morfogênese dos arcos faríngeos dentro deste período. Demonstramos mais comportamentos de tecido que são afetados por mutações que perturbam a BMP, PDGF, e Shh vias de sinalização.

<table><tbody><tr><td>6 lb Test monofilament line</td><td>Cortland Line Company</td><td>SLB16</td><td></td></tr><tr><td>Agarose I</td><td>Amresco</td><td>0710</td><td></td></tr><tr><td>Argon laser</td><td>LASOS Lasertechnik GmbH</td><td>LGN 3001</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID</td><td>FHC</td><td>30-31-0</td><td></td></tr><tr><td>Clove oil</td><td>Hilltech Canada, Inc.</td><td>HB-102</td><td></td></tr><tr><td>High vacuum grease</td><td>Dow Corning</td><td>2021846-0807</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp dry-bath incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>2050FS</td><td></td></tr><tr><td>Laser scanning microscope</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>LSM 710</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Microscope cover glass, 22 x 22-1</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Microscope cover glass, 24 x 60-1</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-M</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-11321</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-11624</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>TempController 2000-2</td><td>PeCon GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Western Chemical, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analyzing craniofacial morphogenesis in zebrafish using 4d confocal microscopy

Imagiologia de lapso de tempo é uma técnica que permite a observação directa do processo de morfogénese, ou a geração de forma. Devido à sua claridade óptica e responsabilidade para com a manipulação genética, o embrião de peixe-zebra tornou-se um organismo modelo popular com a qual para realizar a análise de lapso de tempo de morfogênese em embriões vivos. Imagem confocal de um embrião do peixe-zebra vivos exige que um tecido de interesse é persistentemente marcado com um marcador fluorescente, tal como um transgene ou corante injectado. O processo exige que o embrião é anestesiado e mantido no lugar, de tal maneira que o desenvolvimento prossegue normalmente saudável. Parâmetros para a imagem deve ser ajustado para ter em conta o crescimento tridimensional e para equilibrar as exigências da resolução de células individuais ao obter fotos rápidas de desenvolvimento. Os nossos resultados demonstram a capacidade de executar a longo prazo in vivo de imagens de embriões de peixes-zebra marcados com fluorescência para detectar e comportamentos de tecidos em variadasda crista neural cranial que causam anomalias craniofaciais. Atrasos de desenvolvimento causados ​​pela anestesia e montagem são mínimos, e os embriões são ileso pelo processo. Embriões temporizadoP fotografada pode ser devolvido ao meio líquido e subsequentemente visualizados ou fixado em pontos mais tarde no desenvolvimento. Com um aumento da abundância de linhas de peixes-zebra transgénicos e mapeamento de destino bem caracterizados e as técnicas de transplante, imagiologia qualquer tecido desejado é possível. Como tal, de lapso de tempo em imagem in vivo combina poderosamente com métodos genéticos peixe-zebra, incluindo análises de embriões mutantes e microinjetados.

Em embriões do tipo selvagem, seguindo população crista neural, os arcos da faringe alongar ao longo dos anterior / posterior e dorsal / ventral eixos enquanto se move em uma direção rostral (Filme 1). Aos 30 horas após a fertilização (hpf), a duração anterior / posterior do primeiro arco faríngeo é entre 1,8-1,9 vezes o seu dorsal / altura ventral. Dorsal / alongamento ventral procede de forma constante, mais rápido do que a extensão anterior / posterior até 36,5 hpf. A partir daqui, dorsal / ventral planaltos altura cerca de 104 mM a 48 hpf. Extensão anterior / posterior continua até 48 hpf, com comprimento total anterior / posterior aumentando de menos de 1,5 vezes a altura dorsal / ventral de 36,5 HPF a 1,95 vezes o dorsal / ventral altura em 48 hpf. Na sua extremidade anterior, o primeiro arco faríngeo forma superior (dorsal) e mandibular domínios (ventral) separados por ectoderma oral. O domínio maxilar do primeiro arco faríngeo é medido from a sua ponta distal ao vértice posterior da ectoderme oral. Ela cresce a uma taxa aproximada por regressão linear de 4,6 mM / h (r 2 = 0,9374) entre 30-48 hpf e é cerca de 104 mM longo de 48 hpf (Filme 1). Arcos faríngeos 3-7 todas as formas a partir da segmentação de uma única massa de células da crista neural através da endoderme da faringe 26. Entre 30-38 hpf, o 5 º a 7 º arcos faríngeos separar a massa, os 3 º e 4 º arcos já ter separado. Cerca de 37 hpf, a faringe arco 3 º começa a se mover medialmente ao arco 2 ª. Lateralmente, o 7 º faríngeo arco ultrapassa as 5 ª e 6 ª arcos em movimento rostral por 48 hpf, deixando o 3 º a 6 º arcos medial para o 2 º e 7 º arcos (Filme 1). É importante to observar que, embora a convenção é descrever a morfologia em hpf, microscopia atrasa um pouco o crescimento do peixe-zebra em comparação com embriões semelhante encenadas cultivadas em uma incubadora de 28,5 ° C. Por exemplo, depois de 19 horas de microscopia, a distância entre o olho ea orelha de um tipo selvagem embrião trabalhada foi de aproximadamente 81,7 mM, ea distância média olho-ouvido para dois embriões irmãos fotografada logo depois foi de 71 mM. Portanto, os embriões são susceptíveis de ser ligeiramente menor do que a série de teste 27. Estes movimentos morfogenéticos são muito perturbado em mutantes smo. Como descrito anteriormente, os mutantes de peixe-zebra smo não conseguem formar uma condensação maxilar do primeiro arco, e por 48 hpf o primeiro arco faríngeo é completamente caudal para o olho 2. Movimentos arco posterior também são interrompidos 10. O arco faríngeo 3 º deixa de mover medial do arco faríngeo 2 ª, e Movie 2 </strong&gt; mostra que o 7 º arco faríngeo não migram rostralmente a sobrepor-se com mais arcos anteriores por 48 hpf. Zebrafish mutantes B1100 smad5 têm inúmeros defeitos craniofaciais, incluindo uma perda quase completa do esqueleto palatal e fusões ventral entre a 2 ª, 3 ª, e às vezes 4 º da faringe elementos arco esquelético 15, sugerindo que pode haver defeitos para faríngeo arco morfogênese . Na verdade, a imagem confocal estática demonstrou fusões nos domínios ventral do 2 º e 3 º arcos são aparentes em 32 hpf (Figura 2). Usando a microscopia confocal time-lapse, analisamos a morfogênese dos arcos faríngeos em mutantes smad5. Nas análises de lapso de tempo, fusões entre o 2 º e 3 arcos aparecem em primeiro lugar com 32 hpf, consistente com a análise estática (Filme 3, Figura 3). Adicionalmente,mutantes smad5 interromperam conseqüência do primeiro arco faríngeo (Filme 3). Em 30 hpf, o comprimento anterior / posterior do primeiro arco faríngeo (186,8 mM) é mais de 35% mais tempo do que no tipo selvagem, e é 2,5 vezes o dorsal / ventral altura do primeiro arco da faringe num mutante smad5. No entanto, como o bordo posterior se move rostral, o comprimento anterior / posterior do primeiro arco faríngeo diminui quase 40 um entre 30-39 hpf e, em seguida, recupera este comprimento por 48 HPF. O dorsal / ventral altura do primeiro arco faríngeo diminui progressivamente para 62,3 mM 30-48 hpf. Falha de extensão anterior durante este tempo está reflectido no domínio da maxila, o que é excepcionalmente longa (85 mM) em 30 hpf comparação com o tipo selvagem. Comprimento maxilar diminui a uma taxa aproximada por regressão linear de 4,4 mM / h (r 2 = 0,9032) 30-36 hpf, e fica bastante consistente depois. Aqui, a imagem time-lapse mostra ti únicassue movimentos que podem ser responsáveis ​​pela perda do esqueleto palatino observados em mutantes smad5. Enquanto a expressão de membros da família de PDGF e sugere que pode ser amplamente envolvido na faringe arco morfogénese, o movimento dos arcos posteriores parece normal nos mutantes PDGFRA. É morfogênese do primeiro arco faríngeo que aparece especificamente interrompido (Filme 4). O tamanho total do primeiro arco faríngeo é reduzida relativamente ao tipo selvagem, e o domínio maxilar parece altamente plástico, com células de condensação e retirada ao longo do tempo. Isto resulta numa falha de alongamento maxilar, que culmina em cerca de 39 hpf 56,5 mM. Aos 48 hpf, as medidas de domínio maxilares apenas 44,1 mM. Coletivamente, esses resultados mostram que as análises de lapso de tempo cuidadosa pode fornecer detalhes de morfogênese potencialmente perdidos em análises estáticas. <img alt="Figura 1"fo: content-width = &quot;5 polegadas&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51190/51190fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51190/51190fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1. Esquema de construção lamela em ponte e embrião de montagem para microscopia confocal. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51190/51190fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51190/51190fig2.jpg" /> . Figura 2 O segundo e terceiro arcos fundir em mutantes smad5 (A, B) fatias Z Único de um (A) FLI1: EGFP e (B) FLI1: egfp; smad5 embrião mutante B1100.. (A) Em embriões de tipo selvagem para smad5, células da crista neural, no segundo e terceiro arco são separados pela segunda bolsa faríngea (ponta de seta). (B) As células da crista neural no limite ventral do secoarcos ª e terceiros se misturam em mutantes smad5 (cabeça de seta). Arcos faríngeos são numerados. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51190/51190fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51190/51190fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51190/51190fig3.jpg" /> Figura 3. Perda da função resulta em smad5 interrompido faríngeo arco morfogênese. (A, B, painéis superiores) Projeções e (painéis inferiores) vistas ortogonais de fusão arco em filme 3. Fusão de dois e três arcos é evidente, seta. Arcos faríngeos são numerados. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51190/51190fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> Filme 1. Desenvolvimento da faringearcos em um tipo selvagem (FLI1: egfp) embrião 30-48 hpf. Anterior à esquerda, dorsal para o topo. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51190/Movie_1.mov" target="_blank">Clique aqui para ver filme.</a> Filme 2. Movimentos medial do arcos faríngeos falhar em mutantes smo (FLI1: EGFP; SMOB 577) anterior à esquerda, dorsal para o topo.. 30-48 hpf. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51190/Movie_2.mov" target="_blank">Clique aqui para ver filme.</a> Filme 3. Os 2 º e 3 º arcos fundir em mutantes smad5 (FLI1: egfp; B1100 smad5) anterior à esquerda, dorsal para o topo.. Série de projeções de (A), 30-48 hpf, e (B) fatias Z individuais, 30-40 hpf. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51190/Movie_3.mov" target="_blank">Clique aqui para ver filme.</a> <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; filme 4. Alongamento da região maxilar falha em mutantes PDGFRA (FLI1: EGFP; b1059 PDGFRA) anterior à esquerda, dorsal para o topo.. 30-48 hpf. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51190/Movie_4.mov" target="_blank">Clique aqui para ver filme.</a>

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Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse confocal de imagem é uma poderosa técnica útil para caracterizar o desenvolvimento embrionário. Aqui, descrevemos a metodologia e caracterizar morfogênese craniofacial no tipo selvagem, bem como PDGFRA, smad5, e SMO embriões mutantes.

Analisando Craniofacial morfogênese em Zebrafish Usando 4D microscopia confocal

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.0K visualizações.  The University of Texas at Austin.  Time-lapse confocal de imagem é uma poderosa técnica útil para caracterizar o desenvolvimento embrionário. Aqui, descrevemos a metodologia e caracterizar morfogênese craniofacial no tipo selvagem, bem como PDGFRA, smad5, e SMO embriões mutantes. 

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Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. Patterning of the Meckel&#39;s cartilage, a first pharyngeal arch derivative, involves the migration of cranial neural crest (CNC) cells and the progressive partitioning, proliferation and organization of differentiated chondrocytes. Several studies have described CNC migration during lower jaw&#160;morphogenesis, but the details of how the chondrocytes achieve organization in the growth and extension of Meckel&#8217;s cartilage remains unclear. The sox10 restricted and chemically induced Cre recombinase-mediated recombination generates permutations of distinct fluorescent proteins (RFP, YFP and CFP), thereby creating a multi-spectral labeling of progenitor cells and their progeny, reflecting distinct clonal populations. Using confocal time-lapse photography, it is possible to observe the chondrocytes behavior during the development of the zebrafish Meckel&#8217;s cartilage.
Multispectral cell labeling enables scientists to demonstrate extension of the Meckel&#8217;s chondrocytes.&#160;During extension phase of the Meckel&#8217;s cartilage, which prefigures the mandible, chondrocytes intercalate to effect extension as they stack in an organized single-cell layered row. Failure of this organized intercalating process to mediate cell extension provides the cellular mechanistic explanation for hypoplastic mandible that we observe in mandibular malformations.

Cell organization of craniofacial bones has long been hypothesized but never directly visualized. Multi-spectral cell labeling and in vivo live imaging allows visualization of dynamic cell behavior in zebrafish lower jaw. Here, we detail the protocol to manipulate Zebrabow transgenic fish and directly observe cell intercalation and morphological changes of chondrocytes in the Meckel&#8217;s cartilage.

Visualização de condrócitos Intercalation e Direcional Proliferação via Zebrabow Análise celular clonal na cartilagem de Meckel o Embryonic

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Biologia do Desenvolvimento

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

Análise de Desenvolvimento de rim Zebrafish com imagem Time-lapse Usando um microscópio de dissecação Equipado para Seccionamento Optical

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical strain. Skeletal joints are subjected to dynamic mechanical loading. Finite element analysis (FEA) is a computational method, frequently used in engineering that can predict how a material or structure will respond to mechanical input. By dividing a whole system (in this case the zebrafish jaw skeleton) into a mesh of smaller 'finite elements', FEA can be used to calculate the mechanical response of the structure to external loads. The results can be visualized in many ways including as a 'heat map' showing the position of maximum and minimum principal strains (a positive principal strain indicates tension while a negative indicates compression. The maximum and minimum refer the largest and smallest strain). These can be used to identify which regions of the jaw and therefore which cells are likely to be under particularly high tensional or compressional loads during jaw movement and can therefore be used to identify relationships between mechanical strain and cell behavior. This protocol describes the steps to generate Finite Element models from confocal image data on the musculoskeletal system, using the zebrafish lower jaw as a practical example. The protocol leads the reader through a series of steps: 1) staining of the musculoskeletal components, 2) imaging the musculoskeletal components, 3) building a 3 dimensional (3D) surface, 4) generating a mesh of Finite Elements, 5) solving the FEA and finally 6) validating the results by comparison to real displacements seen in movements of the fish jaw.

Finite Element Analysis is a frequently used tool to investigate the mechanical performance of structures under load. Here we apply its use to modeling the biomechanics of the zebrafish jaw.

Construindo Modelos de Elementos Finitos para investigar Zebrafish Jaw Biomecânica

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Um método de montagem versátil para Long Term Imagens de Desenvolvimento Zebrafish

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

Fóton multi tempo lapso imagem para visualizar o desenvolvimento em tempo real: visualização de migrar as células da crista Neural em embriões de peixe-zebra

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Biologia

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Visualizando o cérebro em desenvolvimento em zebrafish vivo usando Brainbow e Imagem Confocal de lapso de tempo

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Visualizing Ocular Morphogenesis by Lightsheet Microscopy Using rx3:GFP Transgenic Zebrafish

Vertebrate eye development is a complex process that begins near the end of embryo gastrulation and requires the precise coordination of cell migration, proliferation, and differentiation. Time-lapse imagining offers unique insight to the behavior of cells during eye development because it allows us to visualize oculogenesis in vivo. Zebrafish are an excellent model to visualize this process due to their highly conserved vertebrate eye and their ability to develop rapidly and externally while remaining optically transparent. Time-lapse imaging studies of zebrafish eye development are greatly facilitated by use of the transgenic zebrafish line Tg(rx3:GFP). In the developing forebrain, rx3:GFP expression marks the cells of the single eye field, and GFP continues to be expressed as the eye field evaginates to form an optic vesicle, which then invaginates to form an optic cup. High resolution time lapse imaging of rx3:GFP expression, therefore, allows us to track the eye primordium through time as it develops into the retina. Lightsheet microscopy is an ideal method to image ocular morphogenesis over time due to its ability to penetrate thicker samples for fluorescent imaging, minimize photobleaching and phototoxicity, and image at a high speed. Here, a&#160;protocol is&#160;provided&#160;for time-lapse imaging of ocular morphogenesis using a commercially available lightsheet microscope and an image processing workstation to analyze the resulting data. This protocol details the procedures for embryo anesthesia, embedding in low melting temperature agarose, suspension in the imaging chamber, setting up the imaging parameters, and finally analyzing the imaging data using image analysis software. The resulting dataset can provide valuable insights into the process of ocular morphogenesis, as well as perturbations to this process as a result of genetic mutation, exposure to pharmacological agents, or other experimental manipulations.

Here, a&#160;protocol is&#160;provided&#160;for time-lapse imaging of ocular morphogenesis using a commercially available lightsheet microscope and an image processing workstation to analyze the resulting data. This protocol details the procedures for embryo anesthesia, embedding in low melting temperature agarose, suspension in the imaging chamber, setting up the imaging parameters, and finally analyzing the imaging data using image analysis software.&#160;

Visualizando Morfogênese Ocular por Microscopia de Folha de Luz usando rx3:GFP Zebrafish Transgênico

Vertebrate eye development is a complex process that begins near the end of embryo gastrulation and requires the precise coordination of cell migration, ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

Imagem e Reconstrução 3D de Estruturas cerebrovasculares em Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

Visualização de Desenvolvimento Craniofacial nas SOX10: Kaede Transgênicos Zebrafish Linha Usando Time-lapse microscopia confocal

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...