Os autores gostariam de agradecer Brogan Visitante, Michelle Weaver e Kristen Lippert. O financiamento para este estudo foi fornecido pelo NIH Grant R03EB009237, bem como bolsas de formação NIH T32EB001026-06 do Instituto Nacional de Imagem Biomédica e Bioengenharia e T32HL076124-05.

1. Preparação de tecidos e Experimento Setup <ol><li> Colheita de órgãos suínos imediatamente após a eutanásia de um abatedouro ou de pesquisa e enxaguar o excesso de sangue. Aparar o coração do excesso de gordura e de tecido, mantendo os átrios e aorta intacta. Aparar a gordura para separar a artéria pulmonar da aorta. Se houver quaisquer cortes no tecido, descartar adequadamente. </li><li> Enrole cada coração individualmente em papel freezer e armazenar todo o tecido em um congelador -80 ° C durante pelo menos 24 horas para garantir a congelação completa. </li><li> Quando pronto para uso (geralmente menos do que 3 meses), descongelar um coração porcino intacto congelado em água do tipo 1 durante a noite submersa num copo de L 4 a 4 ° C. </li><li> Depois que o coração está completamente descongelado, pat o coração seco, pesar no coração, e registrar o peso. O coração de um porco peso de mercado deve pesar cerca de 375-450 g. </li><li> Ligue tamanho 18 tubulação Masterflex a ¼ final &quot;de um redutor de farpado. Insira o redutor farpado etubo no interior da aorta. Braçadeiras de mangueira coloque 2 ou laços zip seguras ao redor da aorta, logo abaixo do tronco braquiocefálico. O redutor e tubo deve permanecer acima da válvula da aorta, para as artérias coronárias podem ser perfundidos (Figura 1). </li><li> Use uma seringa de 30 ou 60 ml para encher o tubo com água Tipo I. Inserir o tubo no interior do cartucho de uma bomba Masterflex rolo no seu ponto médio aproximado. Submerge final do fluxo de entrada da tubagem no fundo de um copo de L 4 preenchido com 2,5 L de água e fixar o tubo. </li><li> Colocar o coração no copo cheio de água, e a bomba principal para remover bolhas de ar. Se forem observadas bolhas provenientes da aorta onde o tubo é inserido, a aorta pode precisar de ser reposicionada ou protegido com laços adicionais. Uma vedação estanque ao ar é importante para manter a pressão adequada durante o processo de descelularização (Figura 2). </li><li> Colocar o copo L 4 contendo 3 L de uma 0,2% NaN Trypsin/0.05% EDTA/0.05%3 Solução de agitar placa e aquecê-la a 37 ° C em preparação para o processo de descelulação. </li></ol> 2. Lava tecido <ol><li> Definir a bomba a uma taxa de fluxo de 400 ml / min, assegurando que a dimensão da mangueira correcto está seleccionado. Lave o coração com água tipo I para 15-25 min. Como a bomba é iniciado, o coração deve inchar e derramar o sangue dos ventrículos. Solução fresca deve ser substituído a cada 5-10 minutos, ou conforme necessário, com base na quantidade de sangue removido a partir do coração. Se o sangue não é emanada a partir do coração, ajustar o tubo e as braçadeiras conforme necessário. </li><li> Parar a bomba e transferir o coração para uma proveta separada cheio com Solução Salina Tamponada com Fosfato 2X (PBS). Depois o tubo é imerso em solução, o arranque da bomba e aumentar a taxa de fluxo de 700 ml / min. O coração deve permanecer em solução durante 15 minutos, a mudança da solução a cada 5 min. Cada alteração solução requer que a bomba seja interrompido temporariamente, enquanto o tecido e tubo é movidopara o copo de novo. </li><li> Transferir o coração ao Tipo I de água durante 10 minutos e aumentar a taxa de fluxo de 750 ml / min. </li></ol> 3. Perfusão decelularização e solução <ol><li> Transferir o coração ao copo contendo 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN3 a 37 ° C. Aumentar a velocidade da bomba de 1200 ml / min e ligar a bomba. Use uma barra de agitação colocados na parte inferior do copo para fazer circular solução no copo. O coração deve permanecer na Trypsin/0.05% EDTA/0.05% 0,2% NaN3 solução a 37 ° C durante um total de três horas. Depois de 1 hora, aumentar a velocidade da bomba de 1500 ml / min. Depois de uma hora adicional, aumentar a velocidade da bomba de 1800 ml / min. O tecido é sujeito a lentamente velocidades de perfusão aumentado para condicionar os tecidos e prevenir a ruptura dos vasos. O coração vai inchar e quase o dobro em tamanho durante esta etapa do protocolo. O tecido vai perder a sua cor natural, progredindo a partir do átrio para o ápice durante todo diae protocolo (Figura 3). </li><li> Depois de cada solução de perfusão, de um de dois passos lavagem é realizada para remover os restos celulares, resíduos químicos, e a lise das células de ajuda. Cada lavagem é constituída por uma lavagem de 10 min em água de Tipo I, seguido por uma lavagem de 10 min com 2X solução de PBS à temperatura ambiente. Cada lavagem consiste na remoção da solução a partir do recipiente original, a adição de soluções de lavagem, e fazer circular o perfusato no copo contendo o coração submerso. Após a 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN3 solução de água, perfundir a 1.900 ml / min e, em seguida, perfundir 2X PBS a 1950 ml / min. </li><li> Transferir o coração para uma solução de 3% de Triton% X-100/0.05 EDTA/0.05% NaN3 à temperatura ambiente. Aumentar a velocidade da bomba de 2000 ml / min e uma solução de perfundir durante uma hora. Remover a solução a partir do recipiente e substituir com solução fresca, aumentar a velocidade da bomba a 2100 ml / min, e perfundir a solução fresca durante mais uma hora e meia, trazendo o tempo total em3% de Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN 3-2,5 h. </li><li> Enxaguar o tecido em água do tipo I em 2150 ml / min e em PBS 2x 2180 ml / min, durante 10 min cada. </li><li> Transferir o coração para uma solução de desoxicolato de sódio a 4%, à temperatura ambiente. Aumentar a velocidade da bomba de 2200 ml / min e uma solução de perfundir durante 3 hr. </li><li> Enxaguar o tecido em água e de tipo I em 2X PBS a 2200 ml / min durante 15 minutos cada, depois de alterar as soluções de 5-10 min para cada solução. Os passos descritos de perfusão pode ser dividida em vários dias por realizar a etapa de lavagem duas vezes e armazenando o coração com tubagem ligado durante a noite a 4 ° C e submersos em água do tipo I. </li><li> No dia seguinte, executar a 5 minutos, lavar com água de Tipo I, a 750 ml / min, seguida por uma lavagem de 5 minutos em PBS 1X a 1,500 ml / min. O protocolo pode então ser continuada a uma taxa de fluxo descrito na solução apropriada. </li></ol> 4. Desinfecção e Processamento Final <ol><li> Transferir o coração a uma perac 0,1%ácido etic / solução de etanol a 4% e solução perfundir durante 1,5 horas a 2200 ml / min. </li><li> As enxaguaduras finais para o tecido são todos realizados a 2.200 ml / min. Perfundir o tecido com 1X PBS durante 15 min, seguido por duas lavagens de 5 min em água de tipo I. Esta série de lavagens é repetido mais uma vez, a fim de completar o procedimento de perfusão de solução. </li><li> Desligar a bomba e retirar o coração da solução para drenar o coração. Cortar os laços da aorta, remover todos os tubos, e colocar o coração em um copo vazio para drenar durante 1 h. O excesso de líquido terá de ser drenado periodicamente. Deite o coração de uma almofada absorvente para drenar completamente o coração (Figura 4). </li><li> Depois de a maior parte da água é removida, registrar o peso da matriz extracelular cardíaca (C-ECM). O coração pode ser esperado para perder cerca de 20-25% do seu peso inicial, durante o processo de descelulação. </li><li> Dissecar os ventrículos direito e esquerdo, bem como do septo ventricular para DNA quantificatie no processamento histológico, a fim de confirmar a descelularização completa do tecido (Figura 5). </li><li> Congele o C-ECM a -80 ° C durante pelo menos 2 horas antes da liofilização. </li></ol>

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Dr. Gilbert estava no Conselho Consultivo Científico em ACell, Inc. enquanto o estudo estava sendo feito, e, recentemente, tornou-se o vice-presidente de Pesquisa e Desenvolvimento. ACell, Inc. vende matriz bexiga urinária e não tem interesse comercial no presente estudo.

O presente estudo descreve a metodologia para a descelularização consistente e eficaz de um coração porcino. O protocolo foi uma modificação de um relatório publicado anteriormente 1, e inclui uma exposição mais longa ao fluxo e pressão elevada, o que proporcionou resultados mais reprodutíveis. O tecido resultante descelularizado atendeu a todos os critérios publicados para a descelularização sucesso de tecido 2. Solução muda frequentes foram realizadas para limitar a reintrodução do material celular para o tecido, e da duração da exposição a cada agente descelularização foi minimizado, para reduzir os efeitos nocivos para a ECM. Durante as fases iniciais do protocolo, a taxa de perfusão foi aumentada gradualmente para a condição do tecido e permite maiores taxas de fluxo, durante os estágios posteriores do protocolo. Sem o condicionamento do tecido nas fases iniciais, a vasculatura do coração pode romper, fazendo a perfusão do coração, impossível. O protocol foi usado devido a sua eficiência, e não as reivindicações são feitas para a sua superioridade sobre outros protocolos. A composição exacta dos agentes descelularização e taxas de perfusão pode concebivelmente ser variado para se obter um protocolo com melhores características mecânicas, ou biológica, mas os princípios gerais para a entrega de agentes para o coração são aplicáveis. A preservação da estrutura tridimensional nativa do coração foi atribuída a vários procedimentos realizados em todo o protocolo de descelularização. Primeiro, o tecido foi cortado e congelado no momento da chegada. Congelamento promovido a lise das células e foi importante para o pré-condicionamento do tecido para os ciclos de perfusão. O tecido foi cuidadosamente examinada para cortes e 2 cm na aorta intacta intacta superiores à válvula aórtica. Se qualquer pericárdio ou epicárdio foi cortada, o órgão foi descartada porque o perfusato não atingiram as regiões a jusante do coração, e o coração não foi totalmente descelularizado.Em seguida, o tecido foi completamente descongelada em água tipo I antes da utilização. A água permitiu o tecido a relaxar e descongelado uma vez que também ajudou a remoção de coágulos de sangue dentro do coração residuais. Finalmente, como o tubo foi inserido, foi tomado cuidado para assegurar que a válvula aórtica permaneceram intactos, de modo que se formou uma vedação estanque em torno do tubo, de modo que uma pressão adequada foi mantida e que a solução penetrasse nas artérias coronárias. Depois de cada protocolo descelularização foi completada, uma série de medidas de controlo de qualidade foram completadas para assegurar a remoção completa do material celular. O presente estudo verificou-se que o protocolo de coloração histológica eliminada para os núcleos das células, mostrou que menos de 50 ng de DNA estava presente por mg de peso seco de tecido, e que qualquer ADN era inferior a 200 pb de tamanho 6. Métodos previamente publicados para descelularização cardíaco apresentaram níveis semelhantes de descelularização de coloração e quantificação de ADN2,5,9,10. Decelularização completa foi realizada nestes estudos utilizando tratamentos semelhantes das enzimas e dos detergentes. No entanto, no presente estudo, o tempo de exposição a cada químico foi aumentada, houve mais mudanças de solução, e as taxas de fluxo foram aumentados. O presente protocolo também aumentou o comprimento das lavagens químicas, levando potencialmente a mais eficiente remoção de resíduos de produtos químicos a partir da matriz extracelular. Recellularization de corações de ratos descelularizados com cardíacas células específicas produziu resultados promissores in vitro 2,5. Perfusão de órgãos descelularização todo permitido para a manutenção da vasculatura nativa, o que é crítico na recellularization do tecido. Os fatores de crescimento inerentes, proteínas e tridimensional arquitetura de fibra também promoveu a fixação das células adequada, migração, e sinalização para reconstituir o tecido contrátil do miocárdio. Suínos cardíaca extracelularlar matriz será mais difícil de recellularize devido ao tamanho do andaime e o número de células necessárias para a comunicação de célula adequada e transporte de nutrientes. No entanto, os remendos cortados a partir da matriz cardíaca, pode ser útil para aplicações in vivo. Vários estudos têm mostrado o potencial vantagem de utilizar uma matriz específica do local para a reconstrução do tecido danificado em modelos animais 11-13. Assim, uma matriz extracelular derivada de andaime tecido cardíaco é desejável para aplicações de reconstrução do miocárdio. A arquitectura inerente do tecido cardíaco podem apresentar vantagens relativamente a um andaime ECM derivada de um outro órgão ou um biomaterial artificial. Um sítio específico de andaime pode apoiar a infiltração da célula hospedeira e promover uma resposta de remodelação construtiva, em oposição à formação de tecido cicatricial. Até à data, os adesivos cardíacas ECM foram investigadas in vivo para reconstruir um defeito criado na parede do miocárdio 14. Futuro stumatrizes serão realizados in vitro para analisar a capacidade do andaime para suportar as células cardíacas semeadas e cultivadas na matriz. Os métodos descritos aqui podem também ser aplicável a decelularização dos corações humanos. Em conclusão, suínos decelularização coração é possível e os métodos são simples. Investigação contínua deste material irá fornecer informações sobre o seu potencial para a utilização clínica.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Material </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Gibco </td><td> 15090 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Pescador </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> NaN3 </td><td> Sigma </td><td> S2002-500G </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> X100-1L </td><td></td></tr><tr><td> PBS 10X </td><td> Pescador </td><td> BP399-20 </td><td></td></tr><tr><td> Deoxicolato de sódio </td><td> Sigma </td><td> D6750-500G </td><td></td></tr><tr><td> Ácido Peracético </td><td> Pfaltz e Bauer </td><td> P05020 </td><td> 35% CAS # 79-21-0 </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Pharmco </td><td> 111000200 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Masterflex bomba de acionamento </td><td> Cole Parmer </td><td> SI-07524-50 </td><td></td></tr><tr><td> Tubulação Masterflex </td><td> Cole Parmer </td><td> 96400-18 </td><td> Tamanho 18 </td></tr><tr><td> Redutor farpado </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-30612-20 </td><td></td></tr><tr><td> Beaker 4L </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-540T </td><td></td></tr></tbody></table>

procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion

Perfusão baseado descelularização órgão inteiro recentemente ganhou interesse no campo da engenharia de tecidos, como um meio de criar locais específicos andaimes de matriz extracelular, enquanto que em grande parte preservando a arquitectura nativa do andaime. Até à data, esta abordagem tem sido utilizada para uma variedade de sistemas de órgãos, incluindo o coração, pulmão, fígado e 1-5. Métodos anteriores para a descelularização de tecidos, sem uma rede de fácil acesso vascular têm contado após a exposição prolongada do tecido a soluções de detergentes, ácidos, ou tratamentos enzimáticos, como um meio para remover os componentes celulares e nucleares a partir do ambiente circundante extracelular 6-8. No entanto, a eficácia destes métodos articulada sobre a capacidade das soluções para permear o tecido por meio de difusão. Em contraste, a perfusão de órgãos por meio do sistema natural vascular reduzido eficazmente a distância de difusão e transporte facilitado de decellularizatiem agentes para o tecido e os componentes celulares para fora do tecido. Aqui, nós descrevemos um método para a plena decellularize um coração suíno intacta através de perfusão coronariana retrógrada. O protocolo produziu uma totalmente descelularizado cardíaca matriz extracelular (ECM-c) de andaime com a estrutura tridimensional do coração intacto. O nosso método de uso de uma série de enzimas, ácidos e detergentes, juntamente com enxaguamentos hipertónicas e hipotónico para ajudar na remoção e lise de células. O protocolo utilizado uma solução de Tripsina a separar as células da matriz seguido de soluções de Triton X-100 e desoxicolato de sódio para ajudar na remoção do material celular. O protocolo descrito também utiliza velocidades de perfusão superiores a 2 L / min, por períodos de tempo prolongados. A taxa de fluxo elevada, juntamente com a solução muda de agentes de transporte autorizados para o tecido, sem contaminação de detritos celulares e eficaz assegurada a lavagem do tecido. O método descrito removido todo o material nuclear da native tecido cardíaco porcino, criando um local específico cardíaco ECM andaime que pode ser utilizado para uma variedade de aplicações.

O efeito da descelularização sobre corações porcinos inteiros naturalmente varia devido a diferenças no tamanho, pressões e arranjo do vaso. Portanto, a composição exacta dos derivados scaffolds da matriz extracelular não será o mesmo de coração para coração. A realização do protocolo descrito produzirá um coração que parece branca ou translúcida, o que indica a perda de material celular. No entanto, é geralmente aceite que um tecido, pode ser considerado como &quot;descelularizado&quot; com base na combinação de alguns parâmetros quantitativos mais 8. Um protocolo de descelularização bem sucedido irá produzir uma matriz com menos de 50 ng de ADN de cadeia dupla por mg de tecido (Figura 6). A fim de evitar a resposta imune do hospedeiro após implantação da matriz, o ADN remanescente deve também conter menos de 200 pares de bases (Figura 7). Para confirmar estes resultados, coloração Hematoxilina e Eosina deve revelar a ausência de nuclearcoloração em secções representativas dos ventrículos e do septo ventricular (Figura 8). Trichrome Masson confirma ainda mais a perda de feixes musculares cardíacas e de retenção das redes de colagénio (Figura 9). <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. O fim farpado do tubo é inserido na aorta do coração nativo. A tubulação deve ser fixada com braçadeiras ou laços zip acima da válvula aórtica para garantir a perfusão através das artérias coronárias. <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. O coração é imerso em água numa proveta de 4L e as bolhas de ar tem de ser removida do tubo. Se as bolhas são observadas emergindo da aorta perto da tubagem, os laços adicionais devem ser usados ​​para fixar o tubo de t<html> ele aorta, a fim de manter uma pressão adequada no tecido. <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Como soluções são perfundidas nas artérias coronárias, o coração vai perder a sua cor natural, progredindo a partir das aurículas para o vértice do coração e localizada em torno das coronárias. <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Depois de completada a desinfecção e enxaguamento passos do protocolo, o tubo é removido e o coração é colocado sobre uma almofada absorvente para permitir que o excesso de água drene para fora do coração. Isto assegura uma medição precisa, quando a pesagem do tecido e permite também que o tecido a relaxar antes de seccionamento. pg &quot;alt =&quot; Figura 5 &quot;/&gt; Figura 5. O ventrículo esquerdo (VE), do ventrículo direito (RV) e do septo ventricular são removidos a partir do coração descelularizado para processamento histológico de congelação e liofilização e quantificação de ADN. <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig6.jpg" alt="Figura 6" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50059/50059fig6highres.jpg"/> Figura 6. Análise quantitativa do teor de ADN, utilizando um ensaio de verde Pico. Os ventrículos dos corações cECM mostram uma redução significativa no conteúdo de ADN, quando comparada com ventrículos nativos. Os valores observados de DNA a partir deste protocolo são observadas no ou abaixo do padrão de 50 ng / mg para os tecidos descelularizados. <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig7.jpg" alt="Figura 7"/> Figura 7. Tamanho do fragmento de DNA, como determinado por ethidium brometo de gel, mostrou DNA residual pouco nos ventrículos descelularizados, quando comparado a uma matriz de bexiga urinária (UBM) padrão. <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig8.jpg" alt="Figura 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50059/50059fig8highres.jpg"/> Figura 8. Hematoxilina-eosina mostrou a completa remoção de material nuclear dos ventrículos após a conclusão do protocolo de decelularização. <img src="/files/ftp_upload/50059/50059fig9.jpg" alt="Figura 9" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50059/50059fig9highres.jpg"/> Figura 9. Coloração Tricrômico de Masson de A) nativo e B) ventrículo decelularizado.

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Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Um método para rápida e completamente remover componentes celulares a partir de um coração porcino intacta através da perfusão retrógrada é descrito. Este método produz um sítio específico cardíaco matriz extracelular andaime que tem o potencial para uso em várias aplicações clínicas.

Procedimento para decelularização do Coração Suínos por perfusão coronariana retrógrada

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

23.8K visualizações.  McGowan Institute for Regenerative Medicine. Um método para rápida e completamente remover componentes celulares a partir de um coração porcino intacta através da perfusão retrógrada é descrito. Este método produz um sítio específico cardíaco matriz extracelular andaime que tem o potencial para uso em várias aplicações clínicas.

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Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to recreate or mimic the liver microstructure with grounds up approach using tissue engineering and microfabrication techniques have not been successful so far due to this design challenge. In addition, synthetic biomaterials used to create scaffolds for liver tissue engineering applications have been limited in inducing tissue regeneration and repair in large part due to the lack of specific cell binding motifs that would induce the proper cell functions2. Decellularized native tissues such blood vessels3and skin4on the other hand have found many applications in tissue engineering, and have provided a practical solution to some of the challenges. The advantage of decellularized native matrix is that it retains, to an extent, the original composition, and the microstructure, hence enhancing cell attachment and reorganization5.
In this work we describe the methods to perform perfusion-decellularization of the liver, such that an intact liver bioscaffold that retains the structure of major blood vessels is obtained. Further, we describe methods to recellularize these bioscaffolds with adult primary hepatocytes, creating a liver graft that is functional in vitro, and has the vessel access necessary for transplantation in vivo.

Perfusion decellularization is a novel technique to produce whole liver scaffolds that retains the organ's extracellular matrix composition and microarchitecture. Herein, the method of preparing whole organ scaffolds using perfusion decellularization and subsequent repopulation with hepatocytes is described. Functional and transplantable liver grafts can be generated using this technique.

Decelularização e Recellularization de Fígados inteiros

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Bioengenharia

Procedure for Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths annually; chronic obstructive pulmonary disease is currently the fourth leading cause of death in the United States1. Contributing to this mortality is the fact that lungs do not generally repair or regenerate beyond the microscopic, cellular level. Therefore, lung tissue that is damaged by degeneration or infection, or lung tissue that is surgically resected is not functionally replaced in vivo. To explore whether lung tissue can be generated in vitro, we treated lungs from adult rats using a procedure that removes cellular components to produce an acellular lung extracellular matrix scaffold. This scaffold retains the hierarchical branching structures of airways and vasculature, as well as a largely intact basement membrane, which comprises collagen IV, laminin, and fibronectin. The scaffold is mounted in a bioreactor designed to mimic critical aspects of lung physiology, such as negative pressure ventilation and pulsatile vascular perfusion. By culturing pulmonary epithelium and vascular endothelium within the bioreactor-mounted scaffold, we are able to generate lung tissue that is phenotypically comparable to native lung tissue and that is able to participate in gas exchange for short time intervals (45-120 minutes). These results are encouraging, and suggest that repopulation of lung matrix is a viable strategy for lung regeneration. This possibility presents an opportunity not only to work toward increasing the supply of lung tissue for transplantation, but also to study respiratory cell and molecular biology in vitro for longer time periods and in a more accurate microenvironment than has previously been possible.

We have developed a decellularized lung extracellular matrix and novel biomimetic bioreactor that can be used to generate functional lung tissue. By seeding cells into the matrix and culturing in the bioreactor, we generate tissue that demonstrates effective gas exchange when transplanted in vivo for short periods of time.

Procedimento para a Engenharia de pulmão

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

Successful tissue engineering involves the combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo. Scaffolds may be synthetic, naturally-derived or derived from tissues/organs. The latter are obtained using a technique called decellularization. Decellularization may involve a combination of physical, chemical, and enzymatic methods. The goal of this technique is to remove all cellular traces whilst maintaining the macro- and micro-architecture of the original tissue.
Intestinal tissue engineering has thus far used relatively simple scaffolds that do not replicate the complex architecture of the native organ. The focus of this paper is to describe an efficient decellularization technique for rat small intestine. The isolation of the small intestine so as to ensure the maintenance of a vascular connection is described. The combination of chemical and enzymatic solutions to remove the cells whilst preserving the villus-crypt axis in the luminal aspect of the scaffold is also set out. Finally, assessment of produced scaffolds for appropriate characteristics is discussed.

The article describes a methodology for the production of an acellular matrix from rat intestine. The derivation of intestinal scaffolds is important for future applications in tissue engineering, stem cell biology and drug testing.

A Metodologia Decelularização para a produção de um Intestinal Matrix Natural Acellular

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent liver decellularization have already been published. We aimed to improve the decellularization process by construction of a proprietary perfusion device enabling selective perfusion via the portal vein and/or the hepatic artery. Furthermore, we sought to perform perfusion under oscillating surrounding pressure conditions to improve the homogeneity of decellularization. The homogeneity of perfusion decellularization has been an underestimated factor to date. During decellularization, areas within the organ that are poorly perfused may still contain cells, whereas the extracellular matrix (ECM) in well-perfused areas may already be affected by alkaline detergents. Oscillating pressure changes can mimic the intraabdominal pressure changes that occur during respiration to optimize microperfusion inside the liver. In the study presented here, decellularized rat liver matrices were analyzed by histological staining, DNA content analysis and corrosion casting. Perfusion via the hepatic artery showed more homogenous results than portal venous perfusion did. The application of oscillating pressure conditions improved the effectiveness of perfusion decellularization. Livers perfused via the hepatic artery and under oscillating pressure conditions showed the best results. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

Procedimento para Decelularização de fígados de rato em uma Perfusão dispositivo oscilante pressão

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor biocompatibility, and cost. Plant tissues have favorable characteristics that make them uniquely suited for use as scaffolds, such as high surface area, excellent water transport and retention, interconnected porosity, preexisting vascular networks, and a wide range of mechanical properties. Two successful methods of plant decellularization for tissue engineering applications are described here. The first method is based on detergent baths to remove cellular matter, which is similar to previously established methods used to clear mammalian tissues. The second is a detergent-free method adapted from a protocol that isolates leaf vasculature and involves the use of a heated bleach and salt bath to clear the leaves and stems. Both methods yield scaffolds with comparable mechanical properties and low cellular metabolic impact, thus allowing the user to select the protocol which better suits their intended application.

Here we present, and contrast two protocols used to decellularize plant tissues: a detergent-based approach and a detergent-free approach. Both methods leave behind the extracellular matrix of the plant tissues used, which can then be utilized as scaffolds for tissue engineering applications.

Dois métodos para Decellularization de tecidos vegetais para aplicações de engenharia de tecidos

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and poor patency. Tissue engineering offers a novel solution to generate personalized grafts with a natural extracellular matrix containing the recipient&#39;s cells using the method of decellularization and recellularization. We show a detailed method for performing decellularization of the human saphenous vein and recellularization by perfusion of peripheral blood. The vein was decellularized by perfusing 1% Triton X-100, 1% tri-n-butyl-phosphate (TnBP) and 2,000 Kunitz units of deoxyribonuclease (DNase). Triton X-100 and TnBP were perfused at 35 mL/min for 4 h while DNase was perfused at 10 mL/min at 37 &#176;C for 4 h. The vein was washed in ultrapure water and PBS and then sterilized in 0.1% peracetic acid. It was washed again in PBS and preconditioned in endothelial medium. The vein was connected to a bioreactor and perfused with endothelial medium containing 50 IU/mL heparin for 1 h. Recellularization was performed by filling the bioreactor with fresh blood, diluted 1:1 in Steen solution, and adding endocrine gland-derived vascular endothelial growth factors (80 ng/mL), basic fibroblast growth factors (4 &#181;L/mL), and acetyl salicylic acid (5 &#181;g/mL). The bioreactor was then moved into an incubator and perfused for 48 h at 2 mL/min while maintaining glucose between 3 - 9 mmol/L. Later, the vein was washed with PBS, filled with endothelial medium and perfused for 96 h in the incubator. Treatment with Triton X-100, TnBP and DNase decellularized the saphenous vein in 5 cycles. The decellularized vein looked white in contrast to normal and recellularized veins (light red). The hematoxylin &#38; eosin (H&#38;E) staining showed the presence of nuclei only in normal but not in decellularized veins. In the recellularized vein, H&#38;E-staining showed the presence of cells on the luminal surface of the vein.

Here, we describe a protocol for the saphenous vein decellularization using detergents and recellularization by perfusion of the peripheral blood and the endothelial medium.

Decellularization e Recellularization metodologia para as veias safena humanas

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ultimately rejection can occur. Creating a functional, autologous bio-artificial heart could solve these challenges. Biofabrication of a heart comprised of scaffold and cells is one option. A natural scaffold with tissue-specific composition as well as micro- and macro-architecture can be obtained by decellularizing hearts from humans or large animals such as pigs. Decellularization involves washing out cellular debris while preserving 3D extracellular matrix and vasculature and allowing &#34;cellularization&#34; at a later timepoint. Capitalizing on our novel finding that perfusion decellularization of complex organs is possible, we developed a more &#34;physiological&#34; method to decellularize non-transplantable human hearts by placing them inside a pressurized pouch, in an inverted orientation, under controlled pressure. The purpose of using a pressurized pouch is to create pressure gradients across the aortic valve to keep it closed and improve myocardial perfusion. Simultaneous assessment of flow dynamics and cellular debris removal during decellularization allowed us to monitor both fluid inflow and debris outflow, thereby generating a scaffold that can be used either for simple cardiac repair (e.g. as a patch or valve scaffold) or as a whole-organ scaffold.

This method enables decellularization of a complex solid organ using a simple protocol based on osmotic shock and perfusion of ionic detergent with minimal organ matrix disruption. It comprises a novel decellularization technique for human hearts inside a pressurized pouch with real-time monitoring of flow dynamics and cellular debris outflow.

Decellularization do coração humana dentro de uma bolsa pressurizada em uma orientação invertida

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ...

Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an allogeneic or xenogeneic source with human cells. A demonstration of methods for the efficient dissection, decellularization, and recellularization of porcine pancreas might benefit the field. Akin to human pancreases, porcine pancreases have a special anatomical arrangement with three lobes (splenic, duodenal, and connection) rounded by the duodenum and small intestine. The duodenal lobe of the pancreas connects to the duodenum by several small blood vessels. Tissue engineering of the pancreas is complicated because of its exocrine and endocrine nature. In this paper, we show a detailed protocol to dissect the whole porcine pancreas and decellularize it with detergents while saving its structure and some extracellular matrix components. To achieve complete perfusion, the aorta is chosen as inlet and the portal vein as outlet. The other blood vessels (hepatic artery, splenic vein, splenic artery,&#160;mesenteric artery and vein tree) and bile duct are ligated. To prevent the formation of thrombus, the pig is heparinized and, immediately after dissection, the organ is flushed with cold heparin. To inhibit the action of exocrine enzymes, the pancreas decellularization is set at 4 &#176;C. The decellularization is performed by perfusion of Triton X-100, sodium deoxycholate, and deoxyribonuclease, with an intermittent and final extensive washing. With a successful decellularization, the pancreas appears white, and a histological evaluation with hematoxylin and eosin shows an absence of nuclei with a preserved extracellular matrix structure. Thus, the proposed method can be used to successfully dissect and decellularize whole porcine pancreas.

Tissue engineering of the whole pancreas is a challenge because of its exocrine and endocrine functions. We show a method for the dissection of an intact porcine pancreas and the process of successful decellularization by perfusion of detergents Triton X-100, sodium deoxycholate, and deoxyribonuclease.

Isolamento e Decellularization de um pâncreas todo porcino

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.