Este trabalho foi financiado em parte através de doações da Regione Veneto (Ricerca Sanitaria Finalizzata n.292/2008 e Ricerca Sanitaria Finalizzata 2009). Os autores agradecem o Dr. C. Griffoni para os dados de 2009/2010 de síntese sobre o uso de globos oculares humanos.

1. Na excisão in situ da córnea de globos oculares <ol><li> Ligue o câmara de fluxo laminar de ar de aproximadamente 15 minutos antes da utilização. Limpar a câmara de fluxo laminar usando 70% de álcool isopropílico. Coloque roupas de proteção pessoal, como touca cirúrgica e máscara. Esfregue as mãos e os antebraços e secar com uma toalha estéril. Usar luvas estéreis e vestido de mangas ou usando uma técnica asséptica. </li><li> Configure o campo estéril, colocando uma bandeja instrumento esterilizado assepticamente. Verifique se os instrumentos são esterilizados. Abra o pacote de instrumentos estéreis e virar para o campo estéril evitar qualquer contaminação. </li><li> Posicionar todos os materiais estéreis e instrumentos (Tabela 2) juntamente com garrafas (frascos oculares) contendo globos oculares de modo que eles são adjacentes à borda do campo estéril para facilidade de utilização. </li><li> Rotular as garrafas com preservação previamente preparada / meio de armazenamento, tal como indicado na Tabela 3 e colocar om sobre a superfície da câmara de fluxo laminar de ar, juntamente com I-PVP (polivinilpirrolidona-iodo), tiossulfato de sódio e uma solução salina estéril de PBS (fosfato de solução salina de tampão). </li><li> Permitir que os tecidos oculares e soluções para atingir a temperatura ambiente normal, tal como eles são preservados em frigoríficos, a 4 ° C. Evite a repetição de aquecimento / arrefecimento ciclos. Manter as tampas da solução e os frascos oculares com lado interior virada para cima ao lado de seus respectivos frascos. </li><li> Remover gazes e esponjas do frasco olho usando uma pinça estéril. Mergulhe o globo em estéril I-PVP 0,5% para 2 minutos para descontaminar os globos oculares. Colocar as duas pinças na tampa do tabuleiro estéril, fora do campo esterilizado. Transfira o mundo em sódio% de tiossulfato 0,1 para 1 minuto usando um par de pinças esterilizadas. Usando as mesmas fórceps, transferir o globo para o frasco contendo uma solução salina estéril (PBS) e deixá-la até que é operado. Repita o mesmo procedimento para o outro globo ocular de tele mesmo dador. </li><li> Trabalhando por baixo da câmara de fluxo laminar de ar, envolva o globo com gaze estéril (ligaduras) deixando a córnea e cerca de 5 mm a partir de esclerótica da córnea descoberto. A lâmpada olho poderia ser simplesmente realizada na mão, mantendo a pressão adequada. O tecido deve ser mantido úmido durante toda a cirurgia. </li><li> Pinças são usadas junto com uma tesoura para remover todos os restos eventuais da conjuntiva. Mantenha os instrumentos utilizados para a operação acima separada de outros instrumentos. Usar uma lâmina de bisturi para realizar uma incisão escleral de 3-4 mm a partir da região limbo, em seguida, estender a incisão por ° 360, evitando a perfurar o tecido subjacente uveal ou causar qualquer deformação da curvatura normal da córnea. Corte quatro grandes incisões, deixando quatro pequenos espaços, evitando a secreção do corpo vítreo. Todos os quatro aberturas são cortadas garantir a ausência de remoção de qualquer outro tecido. </li><li> Presença de pequenas placas esclerais pode dificultar o corte, então certifique-se de compnar a excisão escleral com uma tesoura de microcirurgia. Esta operação deve ser realizada sem danificar o corpo retina coróide e vítreo. </li><li> Inspecione a incisão para garantir que ele está completo. Se a incisão foi efectuado correctamente os adere córneo-esclerais aro para os corpos ciliares apenas no ponto em correspondência com a córnea. </li><li> Ajuste o globo ocular enrolado para baixo perto do centro do campo esterilizado. Completar a remoção da córnea utilizando fórceps para segurar o aro escleral estacionária ea mão usado para a excisão para puxar o corpo ciliar coróide-baixo e para longe do botão córneo-escleral. </li><li> Gentilmente separe as adesões restantes do botão córneo-escleral. Nem puxar o aro córneo-escleral de uma maneira que poderia causar transversal da córnea tensão nem permitir que a cair de volta para a câmara anterior. </li><li> A densidade de células endoteliais da córnea é verificada utilizando uma solução hipotónica e da mortalidade das células é verificada utilizando um trypuma coloração azul para cerca de 1 min e as células são então contadas sob um microscópio óptico e medido como células / mm 2. A câmara anterior deve enfrentar a tampa enquanto a parte posterior deve enfrentar o fundo da placa de Petri. A densidade de células endoteliais podem ser contados manualmente, utilizando uma grade no objetivo em aumento de 100X. A contagem de células mínimo aceito para transplante na Itália é de 2200 células endoteliais / mm 2. </li><li> Transferir o aro córneo-escleral usando uma garra da córnea para meio de armazenamento corneal previamente preparada preservada a RT (temperatura ambiente), como mostrado na Tabela 3. </li><li> Examinar a câmara posterior para uma lente natural cristalino. Se a esclerótica é preparado, remover todos os resíduos de úvea e humor vítreo do globo. Com cuidado, desembrulhe e devolver o restante segmento posterior ao seu respectivo jar olhos, utilizando técnica asséptica. Repita o procedimento para o mundo outro utilizando novos instrumentos. Fixe o humor córneah garra da córnea e preservar sob a mídia de armazenamento (cultura de órgão) em 31 ° C. A córnea excisado, como mostrado na Figura 1a, pode então ser utilizado para ceratoplastia ou investigação. </li><li> Descarte os materiais desnecessários e bio-resíduos perigosos em lixeiras apropriadas. Limpe a área de trabalho uma vez que o trabalho seja concluído usando spray de álcool isopropílico a 70%. </li><li> Se, depois de 28 dias a córnea mantém todos os parâmetros de avaliação [tais como morfologia, contagem de células, a transparência, a espessura e testes de microbiologia - bactérias e fungos usando instrumento Bactec 9240 (Becton Dickinson, Milão, Itália)], então ele pode ser transportado para os hospitais, utilizando o meio de transporte mostrada na Tabela 4. A córnea deve ser removido e colocado a partir do armazenamento para transportar meio sob laminar câmara de fluxo de ar. </li><li> Como, durante o armazenamento, a córnea se torna mais espesso do que o seu tamanho habitual necessária para o transplante, os bancos oculares usar de-inchaço agentes para reduzir a espessura. Nósusar 6% dextrano T500 para obter a córnea volta a seu tamanho normal em meio de transporte. Embora 4-8% de dextrano T500 poderia ser utilizado, 6% tem melhor servidas por nós. Isto torna mais fácil para os cirurgiões para transplantar a córnea, logo que o recebe. </li></ol> 2. A evisceração de Retina do globo ocular após o corte da Córnea <ol><li> Após a excisão, a córnea é seleccionado para transplante ou pesquisa com base na sua morfologia e da densidade de células endoteliais e é colocado no armazenamento ou meio de preservação a 31 ° C. O restante do globo ocular é então processado para utilização posterior, tais como isolamento esclerótica para fins cirúrgicos, a retina para a pesquisa etc </li><li> Antes de excisão da retina, certifique-se que o globo ocular está intacto e apenas a córnea com uma parte da esclera é removido. Se o corpo vítreo gelatinosa é secretando para fora, torna-se difícil de remover um tecido da retina. </li><li> Se o dador é inferior a 65 anos de idade, a esclerótica épreservada sob PBS estéril para fins cirúrgicos após o teste sorológico. Neste caso, a esclerótica não é cortado, apenas o corpo vítreo é removido ea esclerótica inteira é preservada. </li><li> Para a excisão da retina, começar com um pequeno corte ou incisão do lado da córnea da esclera movendo em direção ao nervo óptico usando uma pinça e tesouras estéreis. Segure a parte da esclera com a pinça e corte com a tesoura reta em direção ao nervo óptico cortando parte por parte evitando danos ao corpo vítreo. </li><li> Placas coróide deve ser separada da esclerótica como eles estão presos em conjunto. Cortar o esclera inteiro para expor o tecido coróide. Uma vez que a esclerótica é completamente cortado, separar a esclerótica com o restante do corpo vítreo, cortando-a perto do nervo óptico. Uma bola de todo o corpo vítreo coberto com coróide será visível, como mostrado na Figura 2a. </li><li> Usando duas pinças estéreis remover a camada coróide suavemente por pegá-la com umpar de pinças e removê-lo com o outro. Alternativamente, a camada coróide pode ser removida utilizando uma tesoura, mas isso deve idealmente ser evitado uma vez que pode causar danos na retina. Retirar a camada coróide parcialmente e cortá-la para facilitar a remoção. </li><li> Uma vez que a camada coróide é removida, uma camada transparente de retina irá ser visto claramente como mostrado na Figura 2b. A camada coróide tem uma membrana de Bruch interior do qual pode também ser eliminado, mas é difícil de identificá-lo com um olho nu. </li><li> Do mesmo modo, utilizar duas pinças para remover a camada da retina, como mostrado na Figura 2c. É fácil isolar quantidade elevada de retina se excisado perto do nervo óptico. Todas as camadas do olho pode ser visto agora como mostrado na Figura 2d. </li><li> Uma vez que o tecido da retina foi removido, pode ser utilizado para fins diferentes e, portanto, os passos subsequentes e condições utilizadas para a preservação podem diferir em conformidade. Por exemplo,o tecido da retina podem ser colocados em tubos contendo RNA estabilização reagentes (tais como RNAlater) ou tampão de lise (para a extracção de RNA ou DNA), dispase / tripsina (para o isolamento de células), as soluções de fixação (antes de incorporar os tecidos em parafina ou outubro para imuno-histoquímica). </li><li> Limpar toda a área de trabalho e limpe a área usando spray de álcool isopropílico a 70%. </li></ol> 3. Os resultados representativos O aro córneo-escleral como visto na Figura 1a é uma córnea adequadamente excisado com a quantidade necessária de aro escleral e morfologia endotelial, este tipo de córnea é geralmente utilizado para transplante de córnea. Se o estroma anterior da córnea excisado está danificado com a presença de opacidade, a córnea poderiam ser usados ​​para ceratoplastia endotelial / queratoplastia lamelar posterior (endotélio com uma parte de estroma). Considerando que, se a camada endotelial é danificado ou se a densidade de células endoteliais é menor que 2200 células / mm 2 (Italian padrão), a córnea poderiam ser usados ​​para queratoplastia lamelar anterior (epitélio com uma parte de estroma anterior). Se a contagem de células endoteliais é menor que o requerido, a córnea poderiam ser usados ​​para queratoplastia lamelar anterior ou de investigação que, se a córnea é danificado completamente, ela pode ser usada para pesquisa, como mostrado na Figura 1b, 3b e 3c ou descartados. O dano pode ser uma causa de mau uso do tecido, cirurgias de catarata antes que conduzem a estromais ou endoteliais Descemet cicatrizes, o desenvolvimento de lesões corporais durante etc de vida do paciente Portanto, torna-se necessário verificar todos os tecidos com lâmpada de fenda e, em seguida, ao microscópio óptico para cicatrizes finas dobras / / destacamentos. A córnea é geralmente preservada em duas condições diferentes, tais como a cultura de órgãos (aproximadamente 31 ° C) normalmente utilizados em países europeus ou condições hipotérmicos (aproximadamente 4 ° C) normalmente usado nos EUA. Usamos a cultura de órgãos, pois ajuda a regenerar a barragemidade células epiteliais, para revitalizar a seleção de células endoteliais com um alto tempo post mortem, um período de armazenamento de 4 semanas que dá janela suficiente para o planejamento de uma cirurgia, dá tempo suficiente para os testes microbiológicos (bactérias e fungos) e sorológico, etc A córnea pode ser bem preservado no meio de transporte durante 7 dias. A esclera pode ser cortada parte por parte assegurar a remoção suave de todas as placas da coróide. O líquido pode excretar vítreo quando o nervo óptico coróide, ou retina é cortado acentuadamente como mostrado na Figura 4. Retinas se excisadas para análise de RNA deve ser preservada, RNAlater logo que os tecidos são excisados. Geralmente 1X1 cm da coróide e camada da retina é excisada e depois, mantendo-o em RNAlater durante 24 horas a 4 ° C é preservada sob -80 ° C em tubos de Eppendorf frescos (segura-bloqueio tubos, 2 ml) até ser utilizado ou transportado com seco gelo. O tecido da retina deve ser excisada utilizando duas pinças de perto do nervo óptico de distância a partir de írisou margem ciliar para evitar a contaminação com outras estruturas pigmentadas e deve ser transferido para o recipiente de preservar imediatamente como RNA obtém instável durante a recuperação da retina. <img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig1.jpg" alt="A Figura 1" /> Figura 1 Comparação entre uma boa e uma má qualidade da córnea:. A) A córnea adequadamente excisadas. Tal córnea é geralmente um preservados sob cultura de órgãos durante 4 semanas. Microbiológica (usando Bactec instrumento 9240) e morfológicas exame (coloração das células com azul de tripano para a determinação da mortalidade das células e observando as células sob um microscópio óptico com uma ampliação de 100X) é realizada antes transportá-lo para o hospital (Figura 3a), b) uma córnea dobrada , que eventualmente leva à rejeição do enxerto devido a dobras de Descemet alta e os danos célula endotelial alta examinadas em um microscópio com lâmpada de fenda. Tal córnea é usualmente utilizada para research ou é descartado. <img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig2.jpg" alt="A Figura 2" /> Figura 2. Método usado para assegurar uma excisão precisa do tecido da retina. A) Dissecting a esclerótica do globo ocular usando lâmina 24 milímetros com 95 milímetros curvo ou tesoura rombas estéreis e 100 mm 11X2 governado por 0,70 mm fórceps estéreis dentes. A esclera deve ser cortado por um lado, segurando com a pinça de corte em linha reta em direção ao nervo óptico usando a tesoura. A camada coróide vai agora ser facilmente visto, b) utilizando dois 100 11X2 mm governados por 0,70 mm dentes pinças estéreis, coróide é removido por desmanchá-lo, o que revela a camada transparente subjacente da retina; c) camada da retina transparente é retirado com muito cuidado perto o nervo óptico sem excreção de fluido vítreo usando as mesmas fórceps. Tanto os fórceps deve segurar cada lado da retina e no tecido deve ser removido suavemente starting perto do nervo óptico movendo no sentido da córnea, para se obter uma boa quantidade de tecido da retina. O tecido pode ser cortada em tamanhos diferentes e utilizados para experiências de análise; d) diferentes camadas do olho após a remoção da córnea pode ser visto nesta figura. O corpo coróide é removido primeiro seguido por retina sem danificar as outras partes do olho. <img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig3.jpg" alt="A Figura 3" /> Figura 3. Comparação dos diferentes tipos de densidade celular e morfologia visualizada sob a ampliação de 100X de um microscópio óptico. A) densidade celular endotelial Bom (&gt; 2200 células / mm 2) e morfologia (menos polimorfismo, degeneração baixo, nenhum distrofia e 0% mortalidade) de uma córnea, que é adequado para o transplante, b) densidade celular endotelial Pobre (aproximadamente 1200 - 1400 células / mm 2) e morfologia (polimorfismo muito elevada e Degenperação de células), juntamente com aproximadamente 30-40% de mortalidade global são observados após coloração com azul de tripano, c) Uma parte das células endoteliais são danificados devido ao descolamento de uma folha de endotelial durante a recuperação da córnea de globo ocular. Isto é confirmado pela observação da mortalidade das células na região manchada por azul de tripano, d) pregas O Descemet são formados devido ao uso incorrecto da córnea por flexão, criar uma tensão da córnea cruz, utilizando os instrumentos intensamente etc, no momento da excisão. A figura mostra as grossas dobras desenvolvidos iatrogênicas encontrados entre a periferia e zona óptica da córnea. <img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig4.jpg" alt="A Figura 4" /> Figura 4. Danos na coróide e tecidos da retina, enquanto excisão da córnea, eventualmente, leva à excreção de fluido vítreo. A retina fica implicada no corpo vítreo tornando difícil para excisar um boa qualidade do tecido wiThout contaminação. <img src="/files/ftp_upload/3765/3765table1.jpg" alt="Tabela 1" /> Tabela 1. Resumo da gama de atividades realizadas com globos oculares humanos ao longo de 2009 e 2010, Fondazione Banca Degli Occhi (Venezia, Itália). Aproximadamente 60% dos tecidos foram utilizados para o transplante, deixando assim um elevado número de globos oculares (cerca de 40%) de investigação científica e médica. <img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig1sup.jpg" alt="Figura Complementar 1" /> Figura Suplementar 1. Anatomia do olho humano 5. Diferentes partes olho humano são indicadas nesta figura, utilizado para seguir a posição exacta dos tecidos.

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Os autores não têm conflito de interesse.

Tanto a excisão, correta e boa conservação dos tecidos da córnea e da retina são críticos como defeitos menores, tais como lesão endotelial ou elevado número de dobras de Descemet pode levar à falência do enxerto da córnea enquanto que alterações de temperatura ou manuseio incorreto pode comprometer a integridade dos tecidos da retina. O objetivo deste trabalho é mostrar como os tecidos da córnea e da retina pode ser isolado da melhor maneira, sem induzir danos ou alterações que possam comprometer sua utilização para transplante ou fins de pesquisa. A densidade de células mínimo requerido (&gt; 2200 células / mm 2), boa morfologia, tais como o tamanho da célula, degeneração estrutura, de baixo das bordas intercelulares e ausência de distrofia juntamente com boa transparência e espessura adequada da córnea são características que tornam um tecido adequado para transplante. Se a lâmina de bisturi é utilizado aproximadamente ou outros instrumentos são utilizados intensamente, não só danificar a córnea, mas também do corpo vítreo que torna Furtsua excisão de outros tecidos mais difícil (Figura 4). Retina é um tecido transparente e, portanto, difíceis de identificar se o líquido vítreo é libertado com ele, isto normalmente faz excisão do tecido da retina mais complicado. Se excisado com o corpo vítreo, a qualidade do tecido da retina ou RNA extraído será muito pobre devido à contaminação com outras partes oculares. Assim, uma técnica apropriada para um consumo córnea ou retina é muito importante para recuperar um tecido de qualidade superior. Os nossos dados anteriores dos dois últimos anos (Tabela 1) indicam que aproximadamente 60% ​​de córneas que recolhem dos globos oculares são adequados para vários tipos de transplante. Esta é mais uma demonstração de que a técnica de excisão da córnea descrito neste trabalho é um bom método para a recolha de tecidos de alta qualidade da córnea dos globos oculares. As córneas podem, é claro, ser inadequado para transplante devido a outros parâmetros such como anormalidades do estroma, a contaminação, a densidade endotelial / morfologia, a aptidão do dador e trauma mecânico / físico causado, mantendo a córnea. No entanto, se os parâmetros acima são muito bem, a técnica que descrevemos aqui permite a recuperação de tecidos de boa qualidade a ser utilizado para transplante em pacientes com doenças da superfície ocular. Enquanto que a informação sobre evisceração de tecidos da retina de modelos animais está amplamente disponível 11,12, para o nosso conhecimento, este é a primeira vez que uma tal técnica é descrita para o isolamento de tecidos da retina dos globos oculares humanos. De fato, pesquisa sobre a literatura, não deu qualquer resultado em trabalhos que discutem esse tema. Acreditamos que se dissecção globo ocular humano é efectuada tal como descrito, os investigadores seria capaz de ter tecidos de boa qualidade a ser utilizado para seus projectos de investigação. Muitos bancos de olhos ao redor do mundo são susceptíveis de receber lâmpadas olho (córnea, mas também) que não são suitable para transplante. No nosso caso, cerca de 40% de córneas e lâmpadas (olho) que recolher e processar não pode ser transplantada (devido a uma grande variedade de causas), mas ainda pode ser utilizado para fins de investigação. A técnica descrita neste artigo permite que a coleção de tecidos de alta qualidade. Isto foi recentemente demonstrado por nosso grupo quando a análise de RNA com T &lt;24hrs extraído de tecidos da retina que foram colhidos usando a técnica descrita no presente documento 10. Acreditamos que a mesma técnica pode ser usada para isolar os tecidos da retina para muitas outras finalidades diferentes, tais como (i) para estudos transcritoma da retina, (ii) para estudar e avançar o uso de células estaminais pluripotentes induzidas em medicina personalizada 8, (iii ) para desenvolver RNA expressão de genes atlas pigmentosa retinite em retinas humana 9, (iv) para optimizar o método de extracção de RNA, (v) Os estudos de células-tronco para regenerar tecidos da retina, etc Esta técnica wdoente ser benéfico para aqueles que querem realizar essas excisões ou experiências, mas possuem informações limitadas sobre o método a utilizar córneas humanas ou retinas.

Materiais para excisão da córnea e retina. <table border="1"><tbody><tr><td> Descrição do produto </td><td> Dimensões </td><td> Empresa / Instituto </td></tr><tr><td> Guardado descartável bisturi </td><td> Tamanho de lâmina 15 </td><td> Swann-Morton </td></tr><tr><td> Ataduras estéreis </td><td> 5 cm x 5 cm, 8 camadas, 5 unid </td><td> Artsana </td></tr><tr><td> Toalha descartável estéril médica </td><td> 35 X 50 cm </td><td> U.Jet </td></tr><tr><td> Tesoura estéril </td><td> Blades 24 mm / comprimento total. 95 mm curvo, sem corte </td><td> e.janach </td></tr><tr><td> Pinças esterilizadas </td><td> Aço inoxidável de 11 mm -100 X 2 governado por 0,70 mm de dentes </td><td> e.janach </td></tr><tr><td> Garra da córnea - dispositivo médico descartável </td><td></td><td> NIIOS (Hippocratech) </td></tr&gt; <tr><td></td><td> Preparativos </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> 100 ml de PBS [10x] em 900 ml d / w (água destilada) </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Na-tiossulfato </td><td> 1 gm de Na-tiossulfato em 1 litro de PBS [1x] </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> I-PVP </td><td> 5 gm I-PVP em 1 litro d / w </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr></tbody></table> Tabela 2. A tabela descreve os materiais utilizados para a excisão de córnea e da retina e da empresa que são recebidas a partir de. Materiais para meio de armazenamento (2000 ml). <table border="1"><tbody><tr><td> Componentes </td><td> Fornecedor </td><td> Número de catálogo </td><td> Concentração </td><td> Quantidade </td></tr><tr><td> MEM(1X) líquido </td><td> Invitrogen </td><td> 32360-034 </td><td></td><td> 1900 ml </td></tr><tr><td> Piruvato de sódio </td><td> Invitrogen </td><td> 11360-039 </td><td> 1 mM (10 ml / l) </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-032 </td><td> 2mM (10 ml / l) </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> Antibiótico / antimicótico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5955-20ML </td><td> 10 ml / l </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> De soro de vitelo recém-nascido </td><td> Invitrogen </td><td> 26010-74 </td><td> 2% (20 ml / l) </td><td> 40 ml </td></tr></tbody></table> Tabela 3. Materiais para meio de armazenamento. Preparação de meio de armazenamento Adicionar todos os ingredientes, usando as concentrações específicas como dadas acima em um frasco e misturar bem. Filtrá-losusando tamanho de poro de 0,2 micron de filtro (Millipore, Milão, Itália), com a ajuda de uma bomba peristáltica. Preservar o meio nas garrafas à RT. Materiais para meio de transporte (2000 ml). <table border="1"><tbody><tr><td> Componentes </td><td> Fornecedor </td><td> Número de catálogo </td><td> Concentração </td><td> Quantidade </td></tr><tr><td> MEM líquido (1X) </td><td> Invitrogen </td><td> 32360-034 </td><td></td><td> 1800 ml </td></tr><tr><td> Piruvato de sódio </td><td> Invitrogen </td><td> 11360-039 </td><td> 1 mM (10 ml / l) </td><td> 20ml </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-032 </td><td> 2mM (10 ml / l) </td><td> 20ml </td></tr><tr><td> De soro de vitelo recém-nascido </td><td> Invitrogen </td><td> 26010-74 </td><td> 2% (20 ml / l) </td&gt; <td> 40 ml </td></tr><tr><td> Dextran t500 </td><td> Pharmacosmos </td><td> 551005004007 </td><td> 6% (60 g / litro) </td><td> 120 g / l </td></tr></tbody></table> Tabela 4. Material para o meio de transporte. Preparação de meio de transporte Adicionar dextrano 6% em ~ 1,5 litros de MEM e deixe durante a noite. Adicionar o resto dos ingredientes nos meios de comunicação e filtrar através de filtro de 0,2 micron (Millipore, Milão, Itália), utilizando uma bomba de vácuo. Preservar o meio nas garrafas à RT.

a simplified technique for in situ excision of cornea and evisceration of retinal tissue from human ocular globe

Enucleação é o processo de recuperação do globo ocular de um dador de cadáver deixando o resto do globo não perturbada. Excisão refere-se à recuperação de tecidos oculares, especialmente córnea, cortando-a separada a partir do globo ocular. Evisceração é o processo de remoção dos órgãos internos referidos aqui como retina. O globo ocular consiste na córnea, a esclerótica, o corpo vítreo, a lente, a íris, a retina, a coróide, etc músculos (Suppl. Figura 1). Quando um paciente está a sofrer de lesões da córnea, a córnea precisa de ser removido e um saudável deve ser transplantado por cirurgias keratoplastic. Doenças genéticas ou defeitos na função da retina pode comprometer a visão. Globos oculares humanos pode ser utilizado para vários procedimentos cirúrgicos, tais como bancos olho, o transplante da córnea humana ou esclerótica e investigação sobre os tecidos oculares. No entanto, há pouca informação disponível sobre a excisão da córnea e da retina humana, provavelmente devido ao lacessibilidade imited para os tecidos humanos. A maioria dos estudos que descrevem procedimentos semelhantes são realizados em modelos animais. Os cientistas da pesquisa depende da disponibilidade de tecidos oculares devidamente dissecadas e bem conservada, a fim de ampliar o conhecimento sobre a homeostase humana olho, desenvolvimento e função. Como recebemos grande quantidade de globos oculares, dos quais aproximadamente 40% (Tabela 1) deles são usados ​​para fins de pesquisa, somos capazes de realizar grande quantidade de experiências sobre esses tecidos, definindo técnicas para consumo e preservá-los regularmente. A córnea é um tecido avascular, que permite a transmissão de luz na retina e para este propósito deve sempre manter um bom grau de transparência. Dentro da córnea, a região limbo, que é um reservatório das células estaminais, ajuda a reconstrução de células epiteliais e restringe o crescimento excessivo da conjuntiva manter a transparência da córnea e de clareza. O tamanho e th<html> ickness da córnea são críticos para a visão clara, como alterações em qualquer um deles pode levar a distraído visão, claro. A córnea compreende de 5 camadas, a) epitélio, b) camada de Bowman, c) estroma, d) membrana de Descemet ee) endotélio. Todas as camadas devem funcionar corretamente para garantir uma visão clara 4,5,6. A coróide é a túnica intermédia entre a esclerótica e da retina, delimitada no interior pela membrana de Bruch e é responsável para o fluxo de sangue no olho. A coróide também ajuda a regular a alimentação de temperatura e material para as camadas exteriores da retina 5,6. A retina é uma camada de tecido nervoso, que cobre a parte de trás do globo ocular (Suppl. Figura 1) e consiste de duas partes: uma parte fotorreceptor e uma parte não receptivo. A retina ajuda para receber a luz a partir da córnea e do cristalino e converte-os em a energia química, eventualmente, transmitido para o cérebro, com a ajuda do nervo óptico 5,6. ove_content &quot;&gt; O objetivo deste trabalho é fornecer um protocolo para a dissecção dos tecidos da córnea e da retina de globos oculares humanos. Evitar a contaminação cruzada com tecidos adjacentes e preservando a integridade do RNA é de fundamental importância como esses tecidos são indispensáveis ​​para fins de pesquisa voltadas em (i) caracterizar o transcriptoma dos tecidos oculares, (ii) o isolamento de células-tronco para projetos de medicina regenerativa, e (iii) avaliar diferenças histológicas entre os tecidos normais de / afetados assuntos. Neste artigo descrevemos a técnica que usamos atualmente para remover a córnea, a coróide e tecidos da retina de um globo ocular. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para a dissecção do globo ocular humano ea excisão dos tecidos da córnea e da retina. O vídeo que o acompanha vai ajudar os pesquisadores a aprender uma técnica adequada para a recuperação de preciosos tecidos humanos que são difíceis de encontrar regularmente.

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A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

O artigo descreve uma técnica simplificada de córnea especiais de consumo e eviscerar os tecidos da retina do globo ocular de humanos doadores cadavéricos. A técnica descrita aqui vai ajudar a impostos especiais de consumo tecidos de boa qualidade para ser utilizados para transplantação, cirúrgicos ou de pesquisa, sem danificar outros tecidos do globo ocular.

Uma técnica simplificada para<em&gt; In situ</em&gt; Excisão de Córnea e evisceração de tecido da retina do globo ocular humano

Enucleation is the process of retrieving the ocular globe from a cadaveric donor leaving the rest of the globe undisturbed. Excision refers to the ...

a-simplified-technique-for-situ-excision-cornea-evisceration-retinal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

20.8K visualizações.  Fondazione Banca Degli Occhi del Veneto O.N.L.U.S.. O artigo descreve uma técnica simplificada de córnea especiais de consumo e eviscerar os tecidos da retina do globo ocular de humanos doadores cadavéricos. A técnica descrita aqui vai ajudar a impostos especiais de consumo tecidos de boa qualidade para ser utilizados para transplantação, cirúrgicos ou de pesquisa, sem danificar outros tecidos do globo ocular.

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Technique to Collect Fungiform (Taste) Papillae from Human Tongue

The sense of taste is critical for human life. It informs the body about the quality of food that will be potentially ingested and stimulates metabolic processes that prepare the alimentary canal for digestion. Steady progress is being made towards understanding the early biochemical and molecular events underlying taste transduction (for a review, Breslin and Spector, 20081). However, progress to date has largely resulted from animal models. Yet, since marked differences in receptor specificity and receptor density vary among species, human taste transduction will only be understood by using human taste tissue. Here we describe a biopsy technique to collect human fungiform papillae, visible as rounded pink anterior structures, about 0.5 mm in diameter that contain taste buds. These biopsied papillae are used for several purposes including the isolation of viable taste bud cells, in situ hybridization, immunohistochemistry and, through techniques of molecular biology, the identification of taste-specific novel proteins.

Technique to Collect Fungiform Taste Papillae from Human Tongue

Knowledge of molecular mechanisms underlying gustatory transduction has recently enjoyed significant advances, largely due to using animal models. However, the wide diversity in taste sensitivity and specificity among mammals warrants studies in human tissue. We describe a biopsy technique to collect living taste cells from the papillae on human tongue.

Técnica para coletar fungiformes (Taste) papilas da língua humana

The sense of taste is critical for human life. It informs the body about the quality of food that will be potentially ingested and stimulates metabolic ...

Medicina

A Simplified Technique for Producing an Ischemic Wound Model

One major obstacle in current diabetic wound research is a lack of an ischemic wound model that can be safely used in diabetic animals. Drugs that work well in non-ischemic wounds may not work in human diabetic wounds because vasculopathy is one major factor that hinders healing of these wounds. We published an article in 2007 describing a rabbit ear ischemic wound model created by a minimally invasive surgical technique. Since then, we have further simplified the procedure for easier operation. On one ear, three small skin incisions were made on the vascular pedicles, 1-2 cm from the ear base. The central artery was ligated and cut along with the nerve. The whole cranial bundle was cut and ligated, leaving only the caudal branch intact. A circumferential subcutaneous tunnel was made through the incisions, to cut subcutaneous tissues, muscles, nerves, and small vessels. The other ear was used as a non-ischemic control. Four wounds were made on the ventral side of each ear. This technique produces 4 ischemic wounds and 4 non-ischemic wounds in one animal for paired comparisons. After surgery, the ischemic ear was cool and cyanotic, and showed reduced movement and a lack of pulse in the ear artery. Skin temperature of the ischemic ear was 1-10 &deg;C lower than that on the normal ear and this difference was maintained for more than one month. Ear tissue high-energy phosphate contents were lower in the ischemic ear than the control ear. Wound healing times were longer in the ischemic ear than in the non-ischemic ear when the same treatment was used. The technique has now been used on more than 80 rabbits in which 23 were diabetic (diabetes time ranging from 2 weeks to 2 years). No single rabbit has developed any surgical complications such as bleeding, infection, or rupture in the skin incisions. The model has many advantages, such as little skin disruption, longer ischemic time, and higher success rate, when compared to many other models. It can be safely used in animals with reduced resistance, and can also be modified to meet different testing requirements.

We have developed a minimally invasive technique to create a rabbit ischemic ear wound model by dividing the central artery and nerve and the cranial neurovascular bundle. A subcutaneous tunnel then cuts all subcutaneous tissues. This procedure causes minimal skin disruption and can be safely used in diabetic animals.

Uma técnica simplificada para a produção de um modelo de ferida isquêmica

One major obstacle in current diabetic wound research is a lack of an ischemic wound model that can be safely used in diabetic animals. Drugs that work ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which disrupt normal brain function. Despite treatment with currently available antiepileptic drugs targeting neuronal functions, one third of patients with epilepsy are pharmacoresistant. In this condition, surgical resection of the brain area generating seizures remains the only alternative treatment. Studying human epileptic tissues has contributed to understand new epileptogenic mechanisms during the last 10 years. Indeed, these tissues generate spontaneous interictal epileptic discharges as well as pharmacologically-induced ictal events which can be recorded with classical electrophysiology techniques. Remarkably, multi-electrode arrays (MEAs), which are microfabricated devices embedding an array of spatially arranged microelectrodes, provide the unique opportunity to simultaneously stimulate and record field potentials, as well as action potentials of multiple neurons from different areas of the tissue. Thus MEAs recordings offer an excellent approach to study the spatio-temporal patterns of spontaneous interictal and evoked seizure-like events and the mechanisms underlying seizure onset and propagation. Here we describe how to prepare human cortical slices from surgically resected tissue and to record with MEAs interictal and ictal-like events ex vivo.

We here describe how to perform multi-electrode array recordings of human epileptic cortical tissue. Epileptic tissue resection, slice preparation and multi-electrode array recordings of interictal and ictal events are demonstrated in detail.

Multieletrodos Recordings Matriz de Human epiléptica pós-operatória Cortical Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Isolation and Excision of Murine Aorta; A Versatile Technique in the Study of Cardiovascular Disease

Cardiovascular disease is a broad term describing disease of the heart and/or blood vessels. The main blood vessel supplying the body with oxygenated blood is the aorta. The aorta may become affected in diseases such as atherosclerosis and aneurysm. Researchers investigating these diseases would benefit from direct observation of the aorta to characterize disease progression as well as to evaluate efficacy of potential therapeutics. The goal of this protocol is to describe proper isolation and excision of the aorta to aid investigators researching cardiovascular disease. Isolation and excision of the aorta allows investigators to look at gross morphometric changes as wells as allowing them to preserve and stain the tissue to look at histologic changes if desired. The aorta may be used for molecular studies to evaluate protein and gene expression to discover targets of interest and mechanisms of action. This technique is superior to imaging modalities as they have inherent limitations in technology and cost. Additionally, primary isolated cells from a freshly isolated and excised aorta can allowing researchers to perform further in situ and in vitro assays. The isolation and excision of the aorta has the limitation of having to sacrifice the animal however, in this case the benefits outweigh the harm as it is the most versatile technique in the study of aortic disease.

Pathology of the aorta can lead to severe morbidity and mortality, therefore research of disease progression and potential therapies is warranted. Here, we present a protocol to isolate and excise the murine aorta to aid researchers in their investigation of cardiovascular disease.

Isolamento e excisão de Murino Aorta; A técnica versátil no Estudo de Doenças Cardiovasculares

Cardiovascular disease is a broad term describing disease of the heart and/or blood vessels. The main blood vessel supplying the body with oxygenated ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

Estabelecimento de epiteliais humanas Enteroids e Colonoids de tecido inteiro e biópsia

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

Trabalhando com tecidos humanos para Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to injury. In fact, the most common type of eye injury found in clinic is a corneal abrasion. Here, we utilize an ocular burr to induce an abrasion resulting in removal of the corneal epithelium in vivo on anesthetized mice. This method allows for targeted and reproducible epithelial disruption, leaving other areas intact. In addition, we describe the visualization of the abraded epithelium with fluorescein staining and provide concrete advice on how to visualize the abraded cornea. Then, we follow the timeline of wound healing 0, 18, and 72 h after abrasion, until the wound is re-epithelialized. The epithelial abrasion model of corneal injury is ideal for studies on epithelial cell proliferation, migration and re-epithelialization of the corneal layers. However, this method is not optimal to study stromal activation during wound healing, because the ocular burr does not penetrate to the stromal cell layers. This method is also suitable for clinical applications, for example, pre-clinical test of drug effectiveness.

This protocol describes a method to inflict an abrasion to the ocular surface of the mouse, and to follow the wound healing process thereafter. The protocol takes advantage of an ocular burr to partially remove the surface epithelium of the eye in anaesthetized mice.

Cicatrização de feridas abrasão epitelial da córnea com Burr Ocular como um modelo para córnea

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

Effect of Artificial Tear Formulations on the Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells after Exposure to Desiccation

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear formulations that prevent cell desiccation will result in ocular surface protection and the maintenance of cell metabolic activity. During dehydration, cells undergo the process of loss of metabolic activity and subsequently cell death. This work describes a method for assessing the efficacy of artificial tear formulations. The metabolic dye (i.e., alamarBlue) changes from a low fluorescent molecule resazurin to a fluorescent molecule resorufin in viable cells. The biological performance of an artificial tear formulation is measured as the ability of the formulation to (a) maintain cell viability and (b) provide cell protection from desiccation. Growth media and saline are used as controls for the cell viability/desiccation tests. Cells are incubated with test solutions for 30 min and then desiccated for 0 or 5 min at 37 &#176;C and 45% relative humidity. Cell metabolic activity after initial exposure and after cell desiccation is then determined. The results show the comparative effects of eye drop formulations on cell metabolic activity and desiccation protection. This method can be used to test dry eye formulations that are designed to treat individuals with evaporative dry eye.

The purpose of this protocol is to evaluate if different artificial tear formulations can protect human corneal epithelial cells from desiccation using an in vitro model. After exposure to artificial tear formulations and desiccation, human corneal epithelial cells are assessed for metabolic activity.

Efeito das formulações de lágrimas artificiais na atividade metabólica das células epiteliais da córnea humana após exposição à dessecação

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal pigment epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera, the integrity of the fragile retina can easily be compromised. The aim of this study was to develop a novel HORC model that contains the retina, RPE-choroid and sclera to maintain retinal integrity when culturing retinal explants.
After cutting circumferentially along the limbus to remove iris and lens, four deep incisions were made to flatten the eyecup. In contrast to previous HORC protocols, a trephine was used to cut through not only the retina but also the RPE-choroid and sclera. The resultant triple-layered explants were cultured for 72 h. Hematoxylin and Eosin staining (H&#38;E) was used to assess anatomical structures and retinal explants were further characterized by immunohistochemistry (IHC) for apoptosis, M&#252;ller cell integrity and retinal inflammation. To confirm the possibility of disease induction, explants were exposed to high glucose (HG) and pro-inflammatory cytokines (Cyt), to mimic diabetic retinopathy (DR). The Luminex magnetic bead assay was used to measure DR-related cytokines released into the culture medium.
H&#38;E staining revealed distinct retinal lamellae and compact nuclei in retinal explants with the underlying RPE-choroid and sclera, while retinas without the underlying structures exhibited reduced thickness and severe nuclei loss. IHC results indicated absence of apoptosis and retinal inflammation as well as preserved M&#252;ller cell integrity. The Luminex&#160;assays showed significantly increased secretion of DR-associated pro-inflammatory cytokines in retinal explants exposed to HG + Cyt relative to baseline levels at 24 h.
We successfully developed and characterized a novel HORC protocol in which retinal integrity was preserved without apoptosis or retinal inflammation. Moreover, the induced secretion of DR-associated pro-inflammatory biomarkers when exposing retinal explants to HG + Cyt suggests that this model could be used for clinically translatable retinal disease studies.

This study aims to develop a novel human organotypic retinal culture (HORC) model that prevents compromising retinal integrity during explant handling. This is achieved by culturing the retina with the overlying vitreous and the underlying retinal pigment&#160;epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera.

Caracterização de uma nova técnica de cultura de retina organotipípica humana

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to differentiate into all types of retinal cells, even mini-retinal tissues, hold huge promises for patients with these diseases and many opportunities in disease modeling and drug screening. However, the induction process from hPSCs to retinal cells is complicated and time-consuming. Here, we describe an optimized retinal induction protocol to generate retinal tissues with high reproducibility and efficiency, suitable for various human pluripotent stem cells. This protocol is performed without the addition of retinoic acid, which benefits the enrichment of cone photoreceptors. The advantage of this protocol is the quantification of EB size and plating density to significantly enhance the efficiency and repeatability of retinal induction. With this method, all major retinal cells sequentially appear and recapitulate the main steps of retinal development. It will facilitate downstream applications, such as disease modeling and cell therapy.

Here we describe an optimized retinal organoid induction system, which is suitable for various human pluripotent stem cell lines to generate retinal tissues with high reproducibility and efficiency.

Sistema de indução organoide da retina para derivação de tecidos retinais 3D de células-tronco pluripotentes humanas

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to ...

Uma técnica simplificada para

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