Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de la Regione Veneto (Ricerca Sanitaria Finalizzata n.292/2008 y Ricerca Sanitaria Finalizzata 2009). Los autores agradecen al Dr. C. Griffoni para los datos de 2009/2010 de resumen sobre el uso de globos oculares humanos.

1. En escisión in situ de la córnea a partir de globos oculares <ol><li> Conectar la campana de flujo laminar de aire de aproximadamente 15 minutos antes de su uso. Limpie la campana de flujo laminar utilizando el 70% de alcohol isopropílico. Ponga en la ropa de protección personal como gorro quirúrgico y la máscara. Frote las manos y los antebrazos y seque con una toalla estéril. Use guantes estériles y bata o mangas utilizando una técnica aséptica. </li><li> Configure el campo estéril, colocando una bandeja de instrumental estéril de forma aséptica. Verificar que los instrumentos son estériles. Abra el paquete de instrumentos estériles y dar la vuelta en el campo estéril para evitar cualquier contaminación. </li><li> Coloque todos los materiales e instrumentos estériles (Tabla 2) junto con botellas (frascos oculares) que contienen los globos oculares de modo que son adyacentes al borde del campo estéril para facilidad de uso. </li><li> Etiquete las botellas con preservación previamente preparado / medio de almacenamiento como se indica en la Tabla 3 y colocar elm en la superficie de la campana de flujo laminar de aire junto con I-PVP (yodo-polivinilpirrolidona), tiosulfato de sodio y una solución salina estéril PBS (solución salina de tampón fosfato). </li><li> Permita que los tejidos oculares y soluciones para alcanzar la temperatura ambiente normal, ya que se conservan en frigorífico a 4 º C. Evitar una repetición de calentamiento / enfriamiento de los ciclos. Mantenga las tapas de la solución y los tarros con la cara interna del ojo hacia arriba al lado de sus respectivos frascos. </li><li> Retirar gasas y esponjas de la jarra de ojo utilizando unas pinzas estériles. Sumerja el mundo en estériles I-PVP 0,5% durante 2 minutos para descontaminar los globos oculares. Coloque las dos pinzas en la tapa de la bandeja estéril, fuera del campo estéril. Transferir el mundo en tiosulfato de sodio al 0,1% durante 1 minuto con otro par de pinzas estériles. Usando las pinzas mismas, la transferencia del globo a la botella que contiene una solución salina estéril (PBS) y se deja hasta que se opera. Repita el mismo procedimiento para el globo ocular otra a partir de tque un mismo donante. </li><li> Trabajo por debajo de la campana de flujo laminar de aire, envolver el mundo con una gasa estéril (vendas), dejando la córnea y la esclerótica de aproximadamente 5 mm de la córnea al descubierto. El bulbo del ojo podría ser simplemente en la mano se mantiene la presión adecuada. El tejido debe mantenerse húmeda durante toda la cirugía. </li><li> Los fórceps se utilizan junto con las tijeras para eliminar todos los restos posibles de la conjuntiva. Mantenga los instrumentos utilizados para la operación anterior por separado de otros instrumentos. Utilizar una hoja de bisturí para realizar una incisión escleral de 3-4 mm de la región de limbo, a continuación, extender la incisión por 360 °, evitando perforar el tejido uveal subyacente o causar cualquier deformación de curvatura normal de la córnea. Corte cuatro incisiones grandes que salen de cuatro pequeños huecos evitando la secreción del cuerpo vítreo. Las cuatro lagunas están cortadas asegurando que no la eliminación de cualquier otro tejido. </li><li> La presencia de pequeñas placas esclerales puede dificultar el corte, así que asegúrese de borradorlete la escisión escleral con tijeras de microcirugía. Esta operación debe realizarse sin dañar el cuerpo de la coroides, la retina y el vítreo. </li><li> Revise la incisión para asegurarse de que se haya completado. Si la incisión se ha realizado correctamente las corneo-escleral se adhiere a los órganos del borde ciliar sólo en el punto en correspondencia con la córnea. </li><li> Ajuste el globo ocular hacia abajo envuelta cerca del centro del campo estéril. Completar la eliminación de córnea utilizando fórceps para sujetar el borde escleral estacionaria y la mano del utilizado para la escisión para tirar del cuerpo ciliar-coroides hacia abajo y lejos del botón córneo-escleral. </li><li> Suavemente separar las adherencias restantes del botón córneo-escleral. Ni sacar la llanta corneo-escleral en una forma que podría causar la cruz-corneal tensión ni la deje caer hacia abajo en la cámara anterior. </li><li> La densidad de las células endoteliales de la córnea se comprueba mediante una solución hipotónica y la mortalidad celular se comprueba utilizando un trypuna tinción con azul de alrededor de 1 min y las células se cuentan entonces bajo un microscopio óptico y se mide como células / mm 2. La cámara anterior debe hacer frente a la tapa, mientras que el posterior debe hacer frente a la parte inferior de la placa de Petri. La densidad de células endoteliales podrían ser contados manualmente usando una rejilla en el objetivo en un aumento de 100X. El mínimo número de aceptados para el trasplante de células en Italia es de 2200 células endoteliales / mm 2. </li><li> Transferir el borde córneo-escleral utilizando una garra córnea a medio previamente preparado almacenamiento corneal conservado a temperatura ambiente (temperatura ambiente) como se muestra en la Tabla 3. </li><li> Examine la cámara posterior de una lente cristalino natural. Si la esclerótica se prepara, eliminar todos los residuos de la úvea y el humor vítreo del globo. Desenrolle cuidadosamente y devolver el resto del segmento posterior del ojo a su bote correspondiente, utilizando una técnica aséptica. Repita el procedimiento para el mundo sí mediante nuevos instrumentos. Fijar el ingenio de la córneah córnea garra y preservar en los medios de almacenamiento (cultivo de órganos) a 31 ° C. La córnea extirpada, como se muestra en la Figura 1a, a continuación, se puede utilizar para queratoplastia o de investigación. </li><li> Deseche los materiales innecesarios y los residuos biológicos peligrosos en los contenedores de desechos apropiados. Limpie el área de trabajo una vez que el trabajo se completa con un 70% aspersión de alcohol isopropílico. </li><li> Si, después de 28 días la córnea mantiene todos los parámetros de evaluación [tales como la morfología, conteo de células, la transparencia, el grosor y las pruebas de microbiología - bacterias y hongos usando Bactec 9240 instrumento (Becton Dickinson, Milán, Italia)], que puede ser transportado a la los hospitales, utilizando el medio de transporte se muestra en la Tabla 4. La córnea debe ser retirado y colocado en el almacenamiento para transportar medio bajo campana de flujo laminar de aire. </li><li> Como, durante el almacenamiento, la córnea se hace más gruesa que su tamaño usual requerido para el trasplante, los bancos de ojos utilizar dispositivos hinchables en agentes para reducir el espesor. Nosotrosel 6% de dextrano T500 para conseguir la córnea vuelve a su tamaño normal en un medio de transporte. Aunque 4-8% de dextrano T500 podría ser utilizado, el 6% ha servido mejor por nosotros. Esto hace que sea más fácil para los cirujanos de trasplante de la córnea tan pronto como lo reciba. </li></ol> 2. La evisceración de la retina del globo ocular después de la eliminación de la córnea <ol><li> Tras la escisión, la córnea se selecciona para el trasplante o de investigación en base a su morfología y la densidad de células endoteliales y se coloca en el medio de almacenamiento o conservación a 31 ° C. El restante del globo ocular se procesa a continuación para su uso posterior como el aislamiento esclerótica para fines quirúrgicos, la retina para investigación, etc </li><li> Antes de la escisión de retina, asegurarse de que el globo ocular está intacta y sólo la córnea con una parte de la esclerótica se elimina. Si el cuerpo vítreo gelatinoso es secretar a cabo se hace difícil eliminar un tejido de la retina. </li><li> Si el donante está por debajo de 65 años de edad, la esclerótica esconservado en PBS estéril para uso quirúrgico después de las pruebas serológicas. En este caso, la esclerótica no se corta, sólo el cuerpo vítreo se retira y la esclerótica entera se conserva. </li><li> Para la escisión de retina, comenzar con un pequeño corte o incisión del lado de la córnea de la esclera avanzar hacia el nervio óptico, utilizando pinzas y tijeras estériles. Sostenga la parte de la esclerótica con las pinzas y cortar con las tijeras en línea recta hacia el nervio óptico cortar parte por parte para evitar daños en el cuerpo vítreo. </li><li> Placas coroideas debe ser separado de la esclerótica, ya que están pegadas. Cortar la esclerótica entero para exponer el tejido coroides. Una vez que la esclerótica se corta completamente, separar la esclerótica con el resto del cuerpo vítreo cortándolo cerca del nervio óptico. Una bola de todo el cuerpo vítreo cubierto de coroides será visible, como se muestra en la Figura 2a. </li><li> El uso de dos pinzas estériles quitar la capa de la coroides con cuidado al escoger para arriba con unapar de fórceps y retirarla con la otra. Alternativamente, la capa de la coroides se pueden eliminar con unas tijeras pero que idealmente deberían evitarse ya que puede causar daños a la retina. Retire la capa de la coroides y la cortó en parte para facilitar la eliminación. </li><li> Una vez que la capa coroidea se elimina, una capa transparente de la retina se verá claramente como se muestra en la Figura 2b. La capa de la coroides tiene una membrana de Bruch interior, que también podría ser eliminado, pero es difícil de identificar a simple vista. </li><li> Asimismo, el uso de dos pinzas para eliminar la capa retiniana como se muestra en la Figura 2c. Es fácil de aislar alta cantidad de retina si extirpado cerca del nervio óptico. Todas las capas del ojo puede ser visto ahora como se muestra en la Figura 2d. </li><li> Una vez que el tejido de la retina se ha eliminado, podría ser usada para fines diferentes y por lo tanto, los pasos subsiguientes y condiciones utilizados para la conservación puede variar en consecuencia. Por ejemplo,el tejido de la retina se puede colocar en tubos que contienen ARN reactivos estabilización (como RNAlater) o tampón de lisis (para la extracción de ARN o ADN), dispasa / tripsina (para el aislamiento de las células), las soluciones de fijación (antes de incrustar los tejidos en parafina o octubre para inmunohistoquímica). </li><li> Borrar todo el área de trabajo y limpiar el área con el 70% de pulverización alcohol isopropílico. </li></ol> 3. Los resultados representativos El borde córneo-escleral como se ve en la Figura 1a es una córnea correctamente escindió con la cantidad requerida de borde escleral y morfología endotelial, este tipo de córnea se usa generalmente para queratoplastia penetrante. Si el estroma anterior de la córnea dañada se escindió con la presencia de opacidad, la córnea se podría utilizar para queratoplastia endotelial / queratoplastia lamelar posterior (endotelio con una parte de estroma). Considerando que, si la capa endotelial está dañada o si la densidad de células endoteliales es &lt;2200 células / mm 2 It (Alian estándar), la córnea se podría utilizar para queratoplastia lamelar anterior (epitelio con una parte de estroma anterior). Si el recuento de células endoteliales es menor que la requerida, la córnea se podría utilizar para queratoplastia lamelar anterior o de investigación que, si la córnea está dañada por completo, que podría ser utilizado para la investigación como se muestra en la Figura 1b, 3b y 3c o desechado. El daño podría ser una causa de mal manejo del tejido, antes de cirugías de cataratas que conducen a cicatrices endoteliales del estroma o Descemet, el desarrollo de lesiones físicas durante etc la vida del paciente Por lo tanto, se hace necesario comprobar todos los tejidos con lámpara de hendidura y luego bajo microscopio óptico para cicatrices finas o pliegues o desprendimientos. La córnea suele estar conservada bajo dos condiciones diferentes tales como el cultivo de órganos (aproximadamente 31 ° C) suelen utilizar en los países de Europa o las condiciones de hipotermia (aproximadamente 4 ° C) por lo general utilizados en los EE.UU.. Nuestro método de cultivo de órganos, ya que ayuda a regenerar la presaedad las células epiteliales, para revitalizar las células endoteliales de verificación con un alto cargo el tiempo mortem, un período de almacenamiento de 4 semanas, lo que da la ventana suficiente para planificar una cirugía, le da tiempo suficiente para los análisis microbiológicos (bacterias y hongos) y serológicos, etc La córnea puede ser bien conservados en el medio de transporte durante 7 días. La esclerótica se podía cortar parte por parte asegurar la eliminación suave de todas las placas de la coroides. El líquido vítreo pueden excretar cuando el nervio óptico, la coroides o de la retina se corta bruscamente como se muestra en la Figura 4. Retinas si extirpados para el análisis de ARN debe ser preservada en RNAlater tan pronto como los tejidos son extirpados. Por lo general, 1X1 cm de la coroides y la retina se extirpa la capa y después de mantenerla en RNAlater durante 24 horas a 4 ° C se mantiene en -80 ° C en tubos Eppendorf frescas (Safe-Lock tubos de 2 ml) hasta su uso o que se expidan con la seca hielo. El tejido de la retina debe ser extirpado mediante dos pinzas de cerca del nervio óptico fuera de iriso margen ciliar para evitar la contaminación con otras estructuras pigmentadas y debe ser transferido al recipiente preservar inmediatamente como ARN obtiene inestable al recuperar la retina. <img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 Comparación entre una buena y una mala calidad de la córnea: a.) Una córnea correctamente extirpado. Esta córnea suele estar conservada en cultivo de órganos durante 4 semanas. Microbiológicos (usando Bactec 9240 instrumentos) y morfológica (tinción de las células con azul tripán para la determinación de la mortalidad celular y la observación de las células bajo un microscopio óptico con un aumento de 100X) el examen se lleva a cabo antes de transportarlo al hospital (Figura 3a), b) una córnea doblada , que finalmente conduce a un rechazo del injerto debido a los pliegues de alta de Descemet y el daño de las células endoteliales de alta examinados con un microscopio con lámpara de hendidura. Esta córnea se usa generalmente para resolución deearch o se desecha. <img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Método utilizado para garantizar una escisión precisa del tejido de la retina. A) La disección de la esclera del globo ocular con hoja de 24 mm con 95 mm de curva o tijeras de punta roma finales estériles y 100 mm 11x2 gobernados por 0.70 mm pinza de dientes estériles. La esclerótica se debe cortar por sosteniendo un lado con las pinzas que cortar en línea recta hacia el nervio óptico con las tijeras. La capa coroidea ahora se ve fácilmente, b) El uso de dos de 100 mm 11x2 gobernados por 0.70 mm de los dientes con fórceps estériles, la coroides se separa por destrozarlo, lo que pone de manifiesto la subyacente capa de la retina transparente; c) la capa de la retina transparente se extirpa con mucho cuidado cerca de el nervio óptico sin excreción de fluido vítreo utilizando las pinzas mismos. Tanto las pinzas debe sostener cada lado de la retina y el tejido suavemente debe ser retirado starting cerca del nervio óptico en movimiento hacia la córnea, para obtener una buena cantidad de tejido de la retina. El tejido puede ser cortado en diferentes tamaños y utilizado para los experimentos de análisis, d) las diferentes capas del ojo tras la retirada de córnea se puede ver en esta figura. El cuerpo coroides se elimina primero seguido de la retina sin dañar las otras partes del ojo. <img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Comparación de los diferentes tipos de densidad celular y la morfología se observa bajo un aumento de 100X de un microscopio óptico. Una) buena densidad de células endoteliales (&gt; 2200 células / mm 2) y la morfología (menos polimorfismo, la degeneración baja, distrofia no y 0% mortalidad) en una córnea que es adecuado para el trasplante, b) la densidad de células endoteliales pobre (aproximadamente 1200 - 1400 células / mm 2) y la morfología (polimorfismo muy alta y Degenración de las células), junto con aproximadamente el 30-40% de mortalidad general se observan después de tinción con azul de tripano, c) Una parte de las células endoteliales se dañan debido al desprendimiento de una capa de endotelio, mientras que la recuperación de la córnea del globo ocular. Esto se confirma por la observación de la mortalidad de las células en la región por manchado azul de tripano, d) El pliegues de Descemet se forman debido al uso indebido de la córnea por la flexión, creando una tensión córnea transversal, utilizando los instrumentos, etc intensamente en el momento de la escisión. La figura muestra los gruesos pliegues desarrollados iatrogénicas se encuentran entre la periferia y zona óptica de la córnea. <img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Daños Figura 4. A la coroides, la retina y los tejidos, mientras que la escisión de la córnea con el tiempo conduce a la excreción de líquido vítreo. La retina se implicado en el cuerpo vítreo lo que hace difícil para escindir una buena calidad de los tejidos wiThout contaminación. <img src="/files/ftp_upload/3765/3765table1.jpg" alt="Tabla 1" /> Tabla 1. Resumen de la gama de actividades realizadas con globos oculares humanos durante 2009 y 2010 a la Fundación Banca Degli Occhi (Venezia, Italia). Aproximadamente el 60% de los tejidos se utilizan para el trasplante, dejando así un gran número de globos oculares (40%) para la investigación científica y médica. <img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig1sup.jpg" alt="Complementario Figura 1" /> Complementario Figura 1. Anatomía del ojo humano 5. Diferentes partes de ojo humano se indican en esta figura, utilizado para seguir la posición exacta de los tejidos.

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Los autores no tienen conflicto de intereses.

Ambos, la escisión correcta y adecuada conservación de los tejidos de la córnea y la retina son críticos, como los defectos de menor importancia tales como el daño endotelial o elevado número de pliegues de Descemet puede conducir al fracaso del injerto de córnea, mientras que las alteraciones de temperatura o mal manejo puede poner en peligro la integridad de los tejidos retina. El objetivo de este trabajo es mostrar cómo los tejidos corneales y retinianas se pueden aislar de manera óptima, sin provocar daños o alteraciones que puedan comprometer su uso para trasplantes o para fines de investigación. La densidad mínima requerida en la celda (&gt; 2200 células / mm 2), buena morfología, tales como tamaño de la célula, la estructura, la degeneración de baja de las fronteras intercelulares y la ausencia de la distrofia, junto con buena transparencia y el grosor de la córnea son las características que hacen que un tejido adecuado para trasplante. Si la hoja de bisturí se usa aproximadamente u otros instrumentos se utilizan intensamente, no sólo dañan la córnea, sino también el cuerpo vítreo que hace Furtsu escisión de otros tejidos más difícil (Figura 4). La retina es un tejido transparente y por lo tanto difíciles de identificar si el líquido vítreo se lanzó con ella, lo que normalmente hace que la extirpación del tejido de la retina más complicado. Si escindió con el cuerpo vítreo, la calidad del tejido de la retina o ARN extraído será muy pobre debido a la contaminación con partes oculares otros. Así, una técnica adecuada para escindir una córnea o retina es muy importante para recuperar un tejido de calidad superior. Nuestros datos previos de los dos últimos años (Cuadro 1) indican que aproximadamente el 60% de las córneas que recogemos de los globos oculares son adecuadas para diferentes tipos de trasplante. Esta es una demostración más de que la técnica de resección corneal descrito en este artículo es un buen método para la recolección de alta calidad, tejidos de la córnea a partir de los globos oculares. Las córneas pueden, por supuesto, ser inadecuados para el trasplante debido a otros parámetros sran como anormalidades del estroma, la contaminación, la densidad endotelial / morfología, la idoneidad de los donantes y los traumatismos mecánicos / físicos causados ​​durante el mantenimiento de la córnea. Sin embargo, si los parámetros anteriores están bien, la técnica que hemos descrito aquí permite la recuperación de los tejidos de buena calidad para ser utilizado para el trasplante en pacientes con enfermedades de la superficie ocular. Aunque la información sobre la evisceración de los tejidos retina de modelos animales está ampliamente disponible 11,12, a nuestro entender esta es la primera vez que se describe una técnica para el aislamiento de los tejidos retina de los globos oculares humanos. De hecho, la investigación sobre la literatura, no dió ningún resultado en los documentos de discusión sobre este tema. Creemos que si la disección humana globo ocular se lleva a cabo como se describe, los científicos de investigación sería capaz de tener tejidos de buena calidad para ser utilizado para proyectos de investigación. Muchos bancos de ojos de todo el mundo son susceptibles de recibir los bulbos oculares (córneas, sino también) que no son spto para el trasplante. En nuestro caso, casi el 40% de las córneas de los ojos (y los bulbos) que recogemos y el proceso no puede ser trasplantado (debido a una amplia gama de causas), pero aún podría ser utilizado para fines de investigación. La técnica descrita en este artículo no permite la colección de tejidos de alta calidad. Esto quedó demostrado recientemente por nuestro grupo en el análisis de ARN con T &lt;24 horas extraído de tejidos retina que fueron recolectadas utilizando la técnica descrita en este artículo 10. Creemos que la misma técnica podría utilizarse para aislar los tejidos de la retina para muchos otros propósitos diferentes, tales como (i) para los estudios del transcriptoma de la retina, (ii) para estudiar y avanzar en el uso de células madre pluripotentes inducidas en la medicina personalizada 8, (iii ) para desarrollar la expresión del RNA de los genes atlas de la retinosis pigmentaria en la retina humana 9, (iv) para optimizar el método de extracción de ARN, (v) los estudios con células madre para regenerar tejidos retina, etc Esta técnica wenfermedad sea beneficiosa para aquellos que quieren llevar a cabo tales escisiones o experimentos, pero tienen poca información sobre el método a utilizar córneas humanas o la retina.

Materiales para la escisión de la córnea y la retina. <table border="1"><tbody><tr><td> Descripción del producto </td><td> Dimensiones </td><td> Empresa / Instituto </td></tr><tr><td> Vigilado bisturí desechable </td><td> Hoja tamaño 15 </td><td> Swann-Morton </td></tr><tr><td> Vendajes estériles </td><td> 5 cm x 5 cm, 8 capas, 5 piezas </td><td> Artsana </td></tr><tr><td> Estéril toalla médica desechable </td><td> 35 X 50 cm </td><td> U.Jet </td></tr><tr><td> Tijeras estériles </td><td> Hojas de 24 mm / longitud total. 95 mm de curvas, romas </td><td> e.janach </td></tr><tr><td> Pinzas estériles </td><td> De acero inoxidable de 11 mm -100 x 2 gobernado por los dientes de 0.70 mm </td><td> e.janach </td></tr><tr><td> Corneal garras - de dispositivos médicos desechables </td><td></td><td> NIIOS (Hippocratech) </td></tr&gt; <tr><td></td><td> Preparativos </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> 100 ml de PBS [10x] en 900 ml de D / W (agua destilada) </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Na-tiosulfato </td><td> 1 g de Na-tiosulfato en 1 litro de PBS [1x] </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> I-PVP </td><td> 5 g de PVP-I en 1 litro D / W </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr></tbody></table> Tabla 2. La tabla se describen los materiales utilizados para la escisión de la córnea y la retina y la compañía son recibidos desde. Materiales para medio de almacenamiento (2000 ml). <table border="1"><tbody><tr><td> Componentes </td><td> Proveedor </td><td> Número de catálogo </td><td> Concentración </td><td> Cantidad </td></tr><tr><td> MEM(1X) líquida </td><td> Invitrogen </td><td> 32360-034 </td><td></td><td> 1900 ml </td></tr><tr><td> Piruvato de sodio </td><td> Invitrogen </td><td> 11360-039 </td><td> 1mM (10 ml / l) </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-032 </td><td> 2 mM (10 ml / l) </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> Antibiótico / antimicótico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5955-20ML </td><td> 10ml / l </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> Suero de ternero recién nacido </td><td> Invitrogen </td><td> 26010-74 </td><td> 2% (20 ml / l) </td><td> 40 ml </td></tr></tbody></table> Tabla 3. Materiales para soporte de almacenamiento. Preparación del medio de almacenamiento Añadir todos los ingredientes que utilizan las concentraciones específicas dadas anteriormente en un frasco y mezcle bien. Filtrarlosusando tamaño de poro de 0,2 micras (Millipore, Milán, Italia) con ayuda de una bomba peristáltica. Preservar el medio en las botellas a temperatura ambiente. Materiales para el medio de transporte (2000 ml). <table border="1"><tbody><tr><td> Componentes </td><td> Proveedor </td><td> Número de catálogo </td><td> Concentración </td><td> Cantidad </td></tr><tr><td> MEM (1X) líquida </td><td> Invitrogen </td><td> 32360-034 </td><td></td><td> 1800 ml </td></tr><tr><td> Piruvato de sodio </td><td> Invitrogen </td><td> 11360-039 </td><td> 1mM (10 ml / l) </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-032 </td><td> 2 mM (10 ml / l) </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> Suero de ternero recién nacido </td><td> Invitrogen </td><td> 26010-74 </td><td> 2% (20 ml / l) </td&gt; <td> 40 ml </td></tr><tr><td> El dextrano T500 </td><td> Pharmacosmos </td><td> 551005004007 </td><td> 6% (60 g / litro) </td><td> 120 g / l </td></tr></tbody></table> Tabla 4. El material para el medio de transporte. Preparación del medio de transporte Añadir dextrano al 6% en alrededor de 1,5 litro de MEM y deja toda la noche. Añadir el resto de ingredientes en los medios de comunicación y filtrar con filtro de 0,2 micras (Millipore, Milán, Italia), utilizando una bomba de vacío. Preservar el medio en las botellas a temperatura ambiente.

a simplified technique for in situ excision of cornea and evisceration of retinal tissue from human ocular globe

La enucleación es el proceso de recuperar el globo ocular de un donante cadáver, dejando el resto del mundo sin ser molestados. La escisión se refiere a la recuperación de los tejidos oculares, especialmente la córnea, cortándolo separado del globo ocular. La evisceración es el proceso de eliminación de los órganos internos a que se refiere aquí como la retina. El globo ocular está formado por la córnea, la esclera, el cuerpo vítreo, el cristalino, el iris, la retina, la coroides, etc músculos (Figura Suplemento 1). Cuando un paciente sufre de daños en la córnea, la córnea debe ser eliminado y una sana debe ser trasplantados por cirugías queratoplástico. Los trastornos genéticos o defectos en la función retiniana puede comprometer la visión. Globos oculares humanos puede ser utilizado para diversos procedimientos quirúrgicos, como la banca del ojo, el trasplante de córnea humana o de la esclerótica y la investigación sobre los tejidos oculares. Sin embargo, existe poca información disponible sobre la escisión humana la córnea y la retina, probablemente debido a la laccesibilidad imited a los tejidos humanos. La mayoría de los estudios que describen procedimientos similares se realizan en modelos animales. Los investigadores científicos se basan en la disponibilidad de los tejidos oculares correctamente disecados y bien conservada con el fin de ampliar el conocimiento sobre el desarrollo humano los ojos, la homeostasis y la función. Al recibir gran cantidad de globos oculares fuera de las cuales aproximadamente el 40% (Tabla 1) de ellos se utilizan con fines de investigación, que son capaces de realizar gran cantidad de experimentos en estos tejidos, la definición de las técnicas de los impuestos especiales y preservar de forma regular. La córnea es un tejido avascular que permite la transmisión de luz en la retina y para este propósito debe mantener siempre un buen grado de transparencia. Dentro de la córnea, la región limbo, que es un depósito de las células madre, ayuda a la reconstrucción de las células epiteliales y restringe el sobrecrecimiento de la conjuntiva mantener la transparencia corneal y la claridad. El tamaño y TH<html> ickness de la córnea son fundamentales para la visión clara, como los cambios en cualquiera de ellos podría dar lugar a distraerse, visión borrosa. La córnea comprende de 5 capas; una) epitelio, b) la membrana de Bowman, c), estroma, d), la membrana de Descemet y e) endotelio. Todas las capas deben funcionar adecuadamente para garantizar una visión clara 4,5,6. La coroides es la túnica intermedia entre la esclerótica y la retina, limita al interior por la membrana de Bruch y es responsable del flujo de sangre en el ojo. El coroides también ayuda a regular la temperatura alimento y suministros a las capas externas de la retina 5,6. La retina es una capa de tejido nervioso que cubre la parte posterior del globo ocular (Figura Supl. 1) y consta de dos partes: una parte fotorreceptora y una parte no receptiva. La retina ayuda a recibir la luz de la córnea y el cristalino y la convierte en la energía química eventualmente en el cerebro con la ayuda del nervio óptico 5,6. ove_content &quot;&gt; El objetivo de este documento es proporcionar un protocolo para la disección de los tejidos de la córnea y la retina de los globos oculares humanos. Evitar la contaminación cruzada con los tejidos adyacentes y la preservación de la integridad del ARN es de una importancia fundamental como tales tejidos son indispensables para fines de investigación dirigidos en (i) la caracterización del transcriptoma de los tejidos oculares, (ii) el aislamiento de células madre para los proyectos de medicina regenerativa, y (iii) la evaluación de las diferencias histológicas entre los tejidos normales del / los sujetos afectados. En este trabajo se describe la técnica que actualmente se utiliza para eliminar la córnea, la coroides, la retina y los tejidos de un globo ocular. A continuación presentamos un protocolo detallado para la disección del globo ocular humano y la escisión de tejidos de la córnea y la retina. El vídeo que acompaña ayudará a los investigadores a aprender una técnica apropiada para la recuperación de preciosos tejidos humanos que son difíciles de encontrar regularmente.

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A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

El artículo describe una técnica simplificada para extirpar la córnea y la retina para destripar los tejidos del globo ocular de donantes cadavéricos humanos. La técnica descrita aquí ayudará a tejidos especiales de buena calidad para ser utilizadas para el trasplante, con fines quirúrgicos o de investigación, sin dañar otros tejidos del globo ocular.

Una técnica simplificada para<em&gt; In situ</em&gt; La escisión de la Córnea y la evisceración del tejido de la retina del globo ocular humano

Enucleation is the process of retrieving the ocular globe from a cadaveric donor leaving the rest of the globe undisturbed. Excision refers to the ...

a-simplified-technique-for-situ-excision-cornea-evisceration-retinal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

20.8K vistas.  Fondazione Banca Degli Occhi del Veneto O.N.L.U.S.. El artículo describe una técnica simplificada para extirpar la córnea y la retina para destripar los tejidos del globo ocular de donantes cadavéricos humanos. La técnica descrita aquí ayudará a tejidos especiales de buena calidad para ser utilizadas para el trasplante, con fines quirúrgicos o de investigación, sin dañar otros tejidos del globo ocular.

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Technique to Collect Fungiform (Taste) Papillae from Human Tongue

The sense of taste is critical for human life. It informs the body about the quality of food that will be potentially ingested and stimulates metabolic processes that prepare the alimentary canal for digestion. Steady progress is being made towards understanding the early biochemical and molecular events underlying taste transduction (for a review, Breslin and Spector, 20081). However, progress to date has largely resulted from animal models. Yet, since marked differences in receptor specificity and receptor density vary among species, human taste transduction will only be understood by using human taste tissue. Here we describe a biopsy technique to collect human fungiform papillae, visible as rounded pink anterior structures, about 0.5 mm in diameter that contain taste buds. These biopsied papillae are used for several purposes including the isolation of viable taste bud cells, in situ hybridization, immunohistochemistry and, through techniques of molecular biology, the identification of taste-specific novel proteins.

Technique to Collect Fungiform Taste Papillae from Human Tongue

Knowledge of molecular mechanisms underlying gustatory transduction has recently enjoyed significant advances, largely due to using animal models. However, the wide diversity in taste sensitivity and specificity among mammals warrants studies in human tissue. We describe a biopsy technique to collect living taste cells from the papillae on human tongue.

Técnica para recopilar fungiformes (gusto) Las papilas de la lengua humana

The sense of taste is critical for human life. It informs the body about the quality of food that will be potentially ingested and stimulates metabolic ...

Investigación

Medicina

A Simplified Technique for Producing an Ischemic Wound Model

One major obstacle in current diabetic wound research is a lack of an ischemic wound model that can be safely used in diabetic animals. Drugs that work well in non-ischemic wounds may not work in human diabetic wounds because vasculopathy is one major factor that hinders healing of these wounds. We published an article in 2007 describing a rabbit ear ischemic wound model created by a minimally invasive surgical technique. Since then, we have further simplified the procedure for easier operation. On one ear, three small skin incisions were made on the vascular pedicles, 1-2 cm from the ear base. The central artery was ligated and cut along with the nerve. The whole cranial bundle was cut and ligated, leaving only the caudal branch intact. A circumferential subcutaneous tunnel was made through the incisions, to cut subcutaneous tissues, muscles, nerves, and small vessels. The other ear was used as a non-ischemic control. Four wounds were made on the ventral side of each ear. This technique produces 4 ischemic wounds and 4 non-ischemic wounds in one animal for paired comparisons. After surgery, the ischemic ear was cool and cyanotic, and showed reduced movement and a lack of pulse in the ear artery. Skin temperature of the ischemic ear was 1-10 &deg;C lower than that on the normal ear and this difference was maintained for more than one month. Ear tissue high-energy phosphate contents were lower in the ischemic ear than the control ear. Wound healing times were longer in the ischemic ear than in the non-ischemic ear when the same treatment was used. The technique has now been used on more than 80 rabbits in which 23 were diabetic (diabetes time ranging from 2 weeks to 2 years). No single rabbit has developed any surgical complications such as bleeding, infection, or rupture in the skin incisions. The model has many advantages, such as little skin disruption, longer ischemic time, and higher success rate, when compared to many other models. It can be safely used in animals with reduced resistance, and can also be modified to meet different testing requirements.

We have developed a minimally invasive technique to create a rabbit ischemic ear wound model by dividing the central artery and nerve and the cranial neurovascular bundle. A subcutaneous tunnel then cuts all subcutaneous tissues. This procedure causes minimal skin disruption and can be safely used in diabetic animals.

Una técnica simplificada para fabricar un modelo de lesión isquémica

One major obstacle in current diabetic wound research is a lack of an ischemic wound model that can be safely used in diabetic animals. Drugs that work ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which disrupt normal brain function. Despite treatment with currently available antiepileptic drugs targeting neuronal functions, one third of patients with epilepsy are pharmacoresistant. In this condition, surgical resection of the brain area generating seizures remains the only alternative treatment. Studying human epileptic tissues has contributed to understand new epileptogenic mechanisms during the last 10 years. Indeed, these tissues generate spontaneous interictal epileptic discharges as well as pharmacologically-induced ictal events which can be recorded with classical electrophysiology techniques. Remarkably, multi-electrode arrays (MEAs), which are microfabricated devices embedding an array of spatially arranged microelectrodes, provide the unique opportunity to simultaneously stimulate and record field potentials, as well as action potentials of multiple neurons from different areas of the tissue. Thus MEAs recordings offer an excellent approach to study the spatio-temporal patterns of spontaneous interictal and evoked seizure-like events and the mechanisms underlying seizure onset and propagation. Here we describe how to prepare human cortical slices from surgically resected tissue and to record with MEAs interictal and ictal-like events ex vivo.

We here describe how to perform multi-electrode array recordings of human epileptic cortical tissue. Epileptic tissue resection, slice preparation and multi-electrode array recordings of interictal and ictal events are demonstrated in detail.

Multi-electrodos Grabaciones variedad de epilepsia humana postoperatoria cortical del tejido

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Isolation and Excision of Murine Aorta; A Versatile Technique in the Study of Cardiovascular Disease

Cardiovascular disease is a broad term describing disease of the heart and/or blood vessels. The main blood vessel supplying the body with oxygenated blood is the aorta. The aorta may become affected in diseases such as atherosclerosis and aneurysm. Researchers investigating these diseases would benefit from direct observation of the aorta to characterize disease progression as well as to evaluate efficacy of potential therapeutics. The goal of this protocol is to describe proper isolation and excision of the aorta to aid investigators researching cardiovascular disease. Isolation and excision of the aorta allows investigators to look at gross morphometric changes as wells as allowing them to preserve and stain the tissue to look at histologic changes if desired. The aorta may be used for molecular studies to evaluate protein and gene expression to discover targets of interest and mechanisms of action. This technique is superior to imaging modalities as they have inherent limitations in technology and cost. Additionally, primary isolated cells from a freshly isolated and excised aorta can allowing researchers to perform further in situ and in vitro assays. The isolation and excision of the aorta has the limitation of having to sacrifice the animal however, in this case the benefits outweigh the harm as it is the most versatile technique in the study of aortic disease.

Pathology of the aorta can lead to severe morbidity and mortality, therefore research of disease progression and potential therapies is warranted. Here, we present a protocol to isolate and excise the murine aorta to aid researchers in their investigation of cardiovascular disease.

Aislamiento y Escisión de murino Aorta; Una técnica versátil en el Estudio de la Enfermedad Cardiovascular

Cardiovascular disease is a broad term describing disease of the heart and/or blood vessels. The main blood vessel supplying the body with oxygenated ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

Establecimiento de Human epitelial Enteroids y Colonoids de Whole Tejidos y Biopsia

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

Trabajar con Tejidos Humanos para la Investigación del Cáncer Traslacional

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to injury. In fact, the most common type of eye injury found in clinic is a corneal abrasion. Here, we utilize an ocular burr to induce an abrasion resulting in removal of the corneal epithelium in vivo on anesthetized mice. This method allows for targeted and reproducible epithelial disruption, leaving other areas intact. In addition, we describe the visualization of the abraded epithelium with fluorescein staining and provide concrete advice on how to visualize the abraded cornea. Then, we follow the timeline of wound healing 0, 18, and 72 h after abrasion, until the wound is re-epithelialized. The epithelial abrasion model of corneal injury is ideal for studies on epithelial cell proliferation, migration and re-epithelialization of the corneal layers. However, this method is not optimal to study stromal activation during wound healing, because the ocular burr does not penetrate to the stromal cell layers. This method is also suitable for clinical applications, for example, pre-clinical test of drug effectiveness.

This protocol describes a method to inflict an abrasion to the ocular surface of the mouse, and to follow the wound healing process thereafter. The protocol takes advantage of an ocular burr to partially remove the surface epithelium of the eye in anaesthetized mice.

Cicatrización de heridas de abrasión epitelial corneal con rebabas Ocular como un modelo de córnea

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

Effect of Artificial Tear Formulations on the Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells after Exposure to Desiccation

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear formulations that prevent cell desiccation will result in ocular surface protection and the maintenance of cell metabolic activity. During dehydration, cells undergo the process of loss of metabolic activity and subsequently cell death. This work describes a method for assessing the efficacy of artificial tear formulations. The metabolic dye (i.e., alamarBlue) changes from a low fluorescent molecule resazurin to a fluorescent molecule resorufin in viable cells. The biological performance of an artificial tear formulation is measured as the ability of the formulation to (a) maintain cell viability and (b) provide cell protection from desiccation. Growth media and saline are used as controls for the cell viability/desiccation tests. Cells are incubated with test solutions for 30 min and then desiccated for 0 or 5 min at 37 &#176;C and 45% relative humidity. Cell metabolic activity after initial exposure and after cell desiccation is then determined. The results show the comparative effects of eye drop formulations on cell metabolic activity and desiccation protection. This method can be used to test dry eye formulations that are designed to treat individuals with evaporative dry eye.

The purpose of this protocol is to evaluate if different artificial tear formulations can protect human corneal epithelial cells from desiccation using an in vitro model. After exposure to artificial tear formulations and desiccation, human corneal epithelial cells are assessed for metabolic activity.

Efecto De Las Formulaciones Artificiales De Lágrima En La Actividad Metabólica De Las Células Epiteliales Corneales Humanas Después De La Exposición A La Desecación

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal pigment epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera, the integrity of the fragile retina can easily be compromised. The aim of this study was to develop a novel HORC model that contains the retina, RPE-choroid and sclera to maintain retinal integrity when culturing retinal explants.
After cutting circumferentially along the limbus to remove iris and lens, four deep incisions were made to flatten the eyecup. In contrast to previous HORC protocols, a trephine was used to cut through not only the retina but also the RPE-choroid and sclera. The resultant triple-layered explants were cultured for 72 h. Hematoxylin and Eosin staining (H&#38;E) was used to assess anatomical structures and retinal explants were further characterized by immunohistochemistry (IHC) for apoptosis, M&#252;ller cell integrity and retinal inflammation. To confirm the possibility of disease induction, explants were exposed to high glucose (HG) and pro-inflammatory cytokines (Cyt), to mimic diabetic retinopathy (DR). The Luminex magnetic bead assay was used to measure DR-related cytokines released into the culture medium.
H&#38;E staining revealed distinct retinal lamellae and compact nuclei in retinal explants with the underlying RPE-choroid and sclera, while retinas without the underlying structures exhibited reduced thickness and severe nuclei loss. IHC results indicated absence of apoptosis and retinal inflammation as well as preserved M&#252;ller cell integrity. The Luminex&#160;assays showed significantly increased secretion of DR-associated pro-inflammatory cytokines in retinal explants exposed to HG + Cyt relative to baseline levels at 24 h.
We successfully developed and characterized a novel HORC protocol in which retinal integrity was preserved without apoptosis or retinal inflammation. Moreover, the induced secretion of DR-associated pro-inflammatory biomarkers when exposing retinal explants to HG + Cyt suggests that this model could be used for clinically translatable retinal disease studies.

This study aims to develop a novel human organotypic retinal culture (HORC) model that prevents compromising retinal integrity during explant handling. This is achieved by culturing the retina with the overlying vitreous and the underlying retinal pigment&#160;epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera.

Caracterización de una nueva técnica de cultivo de retina organotípica humana

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to differentiate into all types of retinal cells, even mini-retinal tissues, hold huge promises for patients with these diseases and many opportunities in disease modeling and drug screening. However, the induction process from hPSCs to retinal cells is complicated and time-consuming. Here, we describe an optimized retinal induction protocol to generate retinal tissues with high reproducibility and efficiency, suitable for various human pluripotent stem cells. This protocol is performed without the addition of retinoic acid, which benefits the enrichment of cone photoreceptors. The advantage of this protocol is the quantification of EB size and plating density to significantly enhance the efficiency and repeatability of retinal induction. With this method, all major retinal cells sequentially appear and recapitulate the main steps of retinal development. It will facilitate downstream applications, such as disease modeling and cell therapy.

Here we describe an optimized retinal organoid induction system, which is suitable for various human pluripotent stem cell lines to generate retinal tissues with high reproducibility and efficiency.

Sistema de inducción organoide retiniana para la derivación de tejidos retinianas 3D a partir de células madre pluripotentes humanas

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to ...

Una técnica simplificada para

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