Este artigo foi financiado por concessões do NIH para JER. Gostaria de agradecer ao Dr. Alex Gottschalk para fornecer os vermes transgênicos expressando canal de rodopsina em neurônios colinérgicos do motor usado em uma das manifestações de gravação.

A. Preparação das ferramentas utilizadas para a dissecção. <ol><li> A câmara de dissecção / gravação: Nós normalmente construímos nossa câmara de gravação de um 1 / 16 ª folha polegadas magnético, com um furo circular perfurado no centro que é grande o suficiente para acomodar a 22 mm de diâmetro tampa de vidro circular. As dimensões externas da câmara vai depender do estágio do microscópio usado para fazer as gravações. No verso da folha magnética, damos um 48 x 60 lamínula mm, qual aderimos à câmara pela colocação de um pellet de baixa cera derreter tecido Paraplax incorporação em cada canto da tampa de deslizamento imprensado entre o vidro ea câmara . A cera é então derreteu em uma chapa quente, chapa de vidro voltada para cima, até formar uma camada contínua de colagem da lamínula para a câmara. Não deixe esta etapa autônoma como a cera se derrete rapidamente. A câmara deve ser retirado e resfriado, logo que a cera derreter. Excesso de cera que se infiltrou ao longo da borda interna da cavidade 22 milímetros circular pode ser removido usando uma lâmina de barbear. </li><li> Desliza Sylgard revestido compreende: A dissecção é realizada em uma 22 mm, revestido Sylgard lamínula que é colocado dentro da cavidade circular da câmara de gravação. A pelagem Sylgard ajuda a cola cyanoacrylic aderir à tampa de deslizamento quando os vermes colagem para baixo e também atua como uma almofada sobre a qual a quebrar novamente a cola pipeta ponta quando se torna ligado. Sylgard é composta frescas de acordo com as instruções de fabrica (10 base de silicone partes para 1 parte agente de cura em peso). Uma pequena gota de Sylgard é então colocado em cada lamínula e manchada em todo usando uma borda lâmina de barbear para fazer uma superfície uniforme. O lamínulas revestido são colocados em grande plano recipientes cobertos e deixados em um forno de 65 ° graus durante a noite para a cura. </li><li> Pipetas: Normalmente, nós usamos o mesmo 1 milímetro de diâmetro exterior de filamentos de vidro de borosilicato para gerar as pipetas para worms colagem para baixo, fazendo incisões cutícula e gravação de músculos, utilizando um extrator de eletrodo. É aconselhável para puxar um pote de pipetas antes de tentar uma dissecção como esta etapa pode exigir várias trocas rápidas de pipetas. </li><li> Aplicador de cola: Glue é carregada e aplicada desde a ponta de uma pipeta de cola, pela boca de pressão. A pipeta de colagem é inserido em uma extremidade de um pedaço de 2 pés de tubos de polietileno com um diâmetro interno que coincide com o diâmetro externo do vidro pipeta (geralmente 1 mm). A outra extremidade do tubo possui um eppendorf ponteira, que atua como um pedaço na boca. </li><li> Extração de pipeta: As vísceras verme deve ser removido da cavidade verme uma vez que a incisão cutícula foi feita. Isto é conseguido com um pedaço de tubo ligado a uma ponteira eppendorf similar à de aplicação da cola, mas neste caso o vidro extração ponta da pipeta é quebrado para trás o suficiente para permitir ovos e vísceras para ser facilmente aspirados para fora da cavidade worm. </li></ol> B. A dissecção <ol><li> Na câmara de gravação de uma linha circular de cera caneta é desenhada perto do perímetro da secção a que uma lamínula Sylgard revestido é pressionado firmemente no local (Sylgard revestimento virado para cima). Esta linha de cera imobiliza o lamínula e impede a solução de gravação de vazar debaixo e desalojar a lamínula durante a dissecção e gravação. A câmara é então preenchido com solução de gravação extracelular e worms várias são colocados no centro usando uma picareta worm. Worms vai nadar em solução, no entanto com a prática, estes worms podem ser colados para baixo, sem quaisquer procedimentos adicionais, tais como de refrigeração para evitar o movimento. Durante a fase de treinamento, ele pode ajudar para a prática de worms colagem mutante em que a natação é prejudicada (como unc-31 mutantes). </li><li> Um recipiente de cola feita com uma tampa de PCR realizada em cera ou massa de modelar, é usado para manter um estoque de trabalho da cola cyanoacrylic. Pipetas cola com dimensões ponta semelhante ao pipetas de gravação (normalmente resistência ~ 4 megohms) são usados ​​para aplicar cola. Usando o aplicador de cola, uma pequena quantidade de cola é sugado para dentro da pipeta cola, usando o escopo de dissecação para visualizar a ponteira como a cola é sugado para cima. </li><li> A cola cyanoacrylic (HistoacrylBlue, Aesulap) polimeriza em contato com a solução de gravação extracelular, por isso é importante para manter a pressão positiva sobre a pipeta de cola quando entra a solução da câmara para evitar a cola de endurecimento e entupimento da pipeta. Assim que a pipeta cola é na solução de câmara, um fluxo pequeno, mas constante de cola deve ser aplicada sobre a superfície Sylgard sob pressão boca-controle para evitar entupimento. Se a pipeta torna-se conectado às vezes pode ser desbloqueado batendo a ponta no vidro Sylgard revestido. É recomendável que você pratique antes de tentar colar worms cola. Se você pode rotineiramente escrever seu nome na cola na Sylgard, com letras feitas de linhas mais finas do que a largura worms você está pronto para proceed para colagem a cutícula worm. </li><li> Para colar um verme, use pressão positiva para anexar uma pequena quantidade de cola para a cabeça ou a cauda do verme rapidamente e tirar o worm para baixo sobre a superfície Sylgard. Tentar anexar o worm perto do centro da câmara como worms colados muito próximo à borda será difícil de alcançar com pipetas de gravação. Em seguida, aplique um fluxo constante de cola ao longo da borda dorsal da cutícula do verme da penhora de partida, forçando o worm em uma posição C-com a vulva virado (para as gravações do músculo ventral). Eventuais lacunas nesta linha de cola devem ser preenchidos para que o worm é fortemente ligados, para evitar que o worm de destacar durante a etapa de incisão cutícula. </li><li> Para fazer a incisão cutícula, mudar para uma pipeta de dissecção de mão. Esta pipeta precisa ser mais acentuada do que a cola / gravação de pipetas e têm um eixo curto, resistente. Usando a maior ampliação, sobre o âmbito de dissecação, alinhar a pipeta paralelo ao eixo longitudinal do worm e insira a ponta sobre o ponto médio ao longo do worm (perto da vulva) fazer a incisão na interface cutícula / cola. Esta incisão libera a pressão hidrostática worms forçando os ovos e os intestinos para fora através do ponto de incisão. Continue cortando a cutícula para a cabeça do verme com um movimento de corte semelhante a abrir uma carta, até chegar à faringe. Mudar para a pipeta de extração a vácuo com os órgãos internos do worm. Depois de limpar a incisão, a cutícula aberta irá manter a sua forma cilíndrica. Use uma pipeta colagem fresco a ponto de solda da borda de corte da cutícula para baixo sobre a superfície Sylgard. É importante o uso de pontos de cola mínima nesta fase para evitar danos ou obscurecendo a NMJs. O nervo ventral músculos da parede cabo e corpo estão agora expostos. </li><li> Para remover a membrana basal que cobre a NMJs, chupam a solução de gravação extracelular da câmara e aplicar colagenase (0.4mg/ml na solução de gravação extracelular) por cerca de 10-20 segundos, remova e lave várias vezes com solução de gravação fresco extracelular. Passar à fase de gravação. </li></ol> C. gravação de patch-clamp <ol><li> Posição da câmara de gravação em um estágio do microscópio até a direita usando uma objetiva de 10X para o centro do worm. Mudar para um objectivo de água emersão-40X com DIC e verifique se os músculos do corpo de parede e cordão nervoso estão intactos. Posição o worm modo que o eixo longitudinal do worm é paralela com a borda frontal do escopo, permitindo que os eletrodos para ser introduzido a partir de ambos os lados esquerdo e direito. </li><li> Corrigir o músculo usando o padrão patch-fixação técnicas. Eletrodos de registro de cerca de resistência megohms 4 funcionam bem. Uma vez que o eletrodo toca a membrana muscular, aumento da pressão negativa, até um selo gigohm é obtido. Para o modo de gravação de célula inteira tensão-clamp, aplicar mais de sucção e zap da membrana até o selo gigohm é rompido. Em uma boa gravação, os músculos do corpo muro de worms tipo selvagem adultos normalmente têm uma capacitância da membrana da célula de pF ~ 70 e pode ser estavelmente gravado durante pelo menos 10 minutos em um potencial de realização de -60 mV com o mínimo de correntes de exploração (~ 50 pA). </li><li> A solução consiste em gravar extracelular (em mM): NaCl 150, KCl 5, CaCl 2 5, MgCl 2 4, glicose 10, sacarose 5, HEPES 15 (pH 7,3, 330mOsm ~). A pipeta patch contém (em mM): KCl 120, KOH 20, MgCl 2 4, (N-tris [Hidroximetil] mthyl-2-aminoetanotiol-ácido sulfônico) TES 5, Dihidratado CaCl 2 0,25, Na 2 ATP 4, sacarose 36 , EGTA 5 (pH 7,2, ~ 312 mOsm). Nota: Estas soluções artificialmente carga células musculares com cloreto, de modo que o receptor GABA-mediada correntes são para dentro devido ao efluxo de cloreto em um potencial de realização de -60 mV. Variações sobre estas soluções têm sido utilizadas (ver publicações para detalhes). </li><li> Evocado lançamento. Normalmente coloca-se um segundo eletrodo contendo solução extracelular sobre a anterior ventral do nervo para o músculo cabo remendado. Esta configuração de patch solta requer grandes estímulos despolarizantes (da ordem de 10s de volts) de curta duração (1-2ms) para alcançar máxima respostas evocadas (tipicamente nA 2,0-2,5) no tipo selvagem worms. As limitações desta abordagem são: 1) Apenas algumas respostas evocadas pode ser entregue antes do cordão nervoso está irreversivelmente danificado e 2) Por razões desconhecidas, apenas colinérgicos respostas evocadas pode ser obtida usando esta configuração de estimulação. </li><li> Luz ativada canais rodopsina estimulação. Recentemente, o laboratório Gottschalk gerou worms transgênicos expressando derivado de algas rodopsinas canal que despolarizar a membrana sobre luz-estimulação em subconjuntos de neurônios, dependendo do promotor usado para acionar expressão 4. No caso do C. elegans MNJ, linhas integradas expressar canal de rodopsina em ambos os neurônios motores colinérgicos ou neurônios motores GABAérgicos estão agora available. Desde canal rodopsina só responde a luz quando all-trans retinal é associado com a metade opsina, worms utilizado para esta aplicação deve ser cultivada em bactéria guarnecida com retina. Um pulso de luz verde pode então ser usada para ativar a rodopsina repetidamente canal causando a liberação evocada de qualquer ACh ou GABA, dependendo de qual vermes transgênicos são utilizados. Esses vermes transgênicos podem ser cruzadas em cepas mutantes. A vantagem desta técnica sobre a estimulação elétrica anteriores incluem: 1) Ativação por luz não causa danos neuronais, permitindo repetir muitos estímulos a serem executadas e 2) Evocados liberação de ambos os neurônios motores GABAérgicos ou colinérgicos podem ser independentemente estudados. </li><li> Hiperosmótico induzida por liberação. Para medir o tamanho do pool de vesículas prontamente liberável (refletindo a piscina resumiu de vesículas preparadas a partir de todos os do MNJ para o músculo gravada), a pressão da pipeta contendo solução extracelular hiperosmótico (ajustado para ~ mOsm 850 por adição de sacarose adicional) é usado. Pressão de pulso de aplicações de segundos 1-3 produzir uma barragem de assíncrona pós-sinápticos eventos usando as soluções padrão descrito acima. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/old/1165_2009_1_22_3/figure1.png" alt="" width="600" height="449" /> Figura 1: Visão esquemática do C. elegans dissecção e configuração de gravação neuromuscular A lamela Sylgard revestidos constituídos por uma queda de manchas de Sylgard através do vidro durante a noite e cura é colocado na cavidade circular da câmara de gravação pré-fabricadas e cobertas com solução de gravação. Um worm colocada no centro é colada à superfície Sylgard a partir da cabeça ou cauda, ​​aplicação de cola para o lado dorsal do worm, com uma pipeta, cola. Uma vez que a colagem está completa, uma incisão junto à vulva, na interface entre a cutícula e cola é feita com uma agulha de vidro e estendeu em direção à cabeça (ver linha perfurada vermelho). Após a extracção de vísceras e ovos da cavidade do corpo, a borda do corte da incisão é o ponto-soldados com cola à Sylgard expondo o nervo ventral (verde) e os músculos do corpo de parede (vermelho). O músculo ventro-medial anterior à vulva é patch-fixada eo eletrodo é colocado estimulando a montante sobre o cabo dos nervos. Resultados representativos <img src="/files/ftp_upload/1165/Reprensentative.png" alt="Figura Represenative" width="600" height="404" /> De célula inteira, tensão muscular fixada corpo gravações de parede são mostrados para cada um dos três protocolos de estimulação descrito acima (eletricamente evocado, light-evocado e respostas hiperosmótico). Em todos os casos, o ventro-medial do músculo parede do corpo é fixada em -60 mV. Células A. Wild-musculares tipo geralmente apresentam altas taxas de endógenos em miniatura dentro correntes sinápticas nas nossas soluções de gravação padrão. B. A despolarização 2ms do cordão nervoso ventral anterior provoca a liberação síncrona de várias sinapses, resultando em uma grande resposta evocada de cerca de 2-2,5 nA no tipo selvagem worms. Traços representante para o direito dos traços do tipo selvagem, em A, B e mostrar liberação sináptica em um mutante severamente descoordenada (unc-18). Painel C mostra uma resposta clara evocadas a partir da junção neuromuscular de um verme selvagem expressar canal de rodopsina em neurônios colinérgicos. Um pulso de luz 2ms geralmente produz uma resposta de 1,5-1,8 nA. D. pressão de ejeção de 850 mOsm hiperosmótico salino sobre o músculo para 1s, produz uma barragem assíncrona de miniatura correntes sinápticas que representam a piscina prontamente liberável de vesículas.

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	<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genetics. 77 (1), 71-71 (1974).</li><li>Richmond, J. E., Davis, W. S., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Neurosci. 2 (11), 959-959 (1999).</li><li>Richmond, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook. 1, (2006).</li><li>Liewald, J. F., Brauner, M., Stephens, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature methods. 5 (10), 895-895 (2008).</li><li>Lockery, S. R., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in enzymology. 293, 201-201 (1998).</li><li>Brockie, P. J., Mellem, J. E., Hills, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuron. 31 (4), 617-617 (2001).</li><li>Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Neurosci. 2 (9), 791-791 (1999).</li></ol>

O modelo genético organismo C, elegans é ideal para o estudo da transmissão sináptica, através da análise funcional de mutações em genes que codificam proteínas sinápticas. Aqui nós descrevemos uma técnica de dissecção que torna o C. elegans NMJs acessíveis para análise eletrofisiológica. O vídeo que acompanha retrata as etapas críticas na C. elegans dissecção e da configuração da gravação típico usado para medir a atividade sináptica. As três etapas que representam os maiores desafios em aprender esta técnica são: 1) a etapa de colagem worm, 2) a realização de uma incisão bem sucedido, e 3) aplicação de patches para os músculos da parede do corpo. Uma vez que estes tenham sido dominados, esta preparação é propícia para a gravação do músculo pós-sinápticos em qualquer tensão de clamp ou pinça de corrente modos. Respostas aos estímulos evocados podem ser facilmente medidos utilizando esta preparação dissecada em uma variedade de origens mutantes. Dado o tamanho já minuto do verme adulto do tipo selvagem (1 mm de comprimento), mutantes sináptica que não atingem a idade adulta ou permanecer magro pode não ser favorável a esta abordagem dissecção. Os neurônios motores da medula nervosa ventral também são muito pequenas (M célula soma de 2-5) e colocam desafios adicionais para eletrofisiologistas, embora vários laboratórios com sucesso gravado a partir de C. neurônios elegans em variações da preparação dissecada aqui descritos 5 6.

dissecting and recording from the c. elegans neuromuscular junction

Neurotransmissão é o processo pelo qual os neurônios de transferência de informação através de sinais químicos para sua pós-sinápticos metas, numa escala de tempo rápido. Esse processo complexo exige a atividade coordenada de muitas proteínas pré e pós-sinápticos para garantir a conectividade sináptica apropriada, a condução de sinais elétricos, segmentação e priming de vesículas secretoras, detecção de cálcio, fusão de vesícula, localização e função de receptores pós-sinápticos e, finalmente, a reciclagem mecanismos. Neurocientistas como é o nosso objetivo de elucidar quais as proteínas em função de cada uma dessas etapas e compreender seus mecanismos de ação. Gravações eletrofisiológicas das sinapses fornecer uma quantificáveis ​​ler fora dos eventos subjacentes elétricos que ocorrem durante a transmissão sináptica. Ao combinar esta técnica com a poderosa gama de ferramentas moleculares e genéticos disponíveis para manipular proteínas sinápticas em C. elegans, podemos analisar as mudanças resultantes funcional na transmissão sináptica. O C. elegans NMJs formadas entre neurônios motores e parede do corpo locomoção controlar os músculos, por isso, os mutantes com fenótipos descoordenada locomotora (conhecido como unc s), muitas vezes a transmissão sináptica perturbar a estes um sinapses. Desde unc mutantes são mantidos em uma fonte rica de uma fonte de alimento de bactérias, eles permanecem viáveis, desde que manter alguma capacidade de bombeamento da faringe para ingerir alimentos. Isto, juntamente com o fato de que C. elegans existir como hermafroditas, lhes permite passar progênie mutante sem a necessidade de comportamentos de acasalamento elaborado. Estes atributos, juntamente com nossa capacidade de gravar recentes do worms NMJs 2,3,7 tornar este organismo modelo excelente para abordar precisamente como unc neurotransmissão impacto mutantes. O método envolve a dissecção vermes adultos imobilizando usando uma cola cyanoacrylic, a fim de fazer uma incisão na cutícula verme expondo a NMJs. Desde C. adultos elegans são apenas 1 mm de comprimento a dissecção é realizada com o uso de um microscópio de dissecação e requer coordenação olho-mão excelente. MNJ gravações são feitas por toda célula de tensão de aperto individuais corpo células da parede muscular e liberação do neurotransmissor pode ser evocado através de uma variedade de protocolos de estimulação, incluindo a estimulação elétrica, activado pela luz despolarização canais rodopsina mediada 4 e hiperosmótico salino, os quais serão brevemente descritos.

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Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Aplicação de eletrofisiologia às sinapses acessível fornece uma medida quantificável de atividade sináptica, útil na análise de mutantes sináptica. Este artigo descreve um método de dissecação usada para expor as junções neuromusculares (MNJ) de<em&gt; Caenorhabditis elegans (C. elegans)</em&gt; E discute brevemente alguns dos usos que esta preparação pode ser aplicada.

Dissecação e gravação a partir da junção neuromuscular C. Elegans

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

dissecting-and-recording-from-the-c-elegans-neuromuscular-junction

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

15.5K visualizações.  University of Illinois, Chicago. Aplicação de eletrofisiologia às sinapses acessível fornece uma medida quantificável de atividade sináptica, útil na análise de mutantes sináptica. Este artigo descreve um método de dissecação usada para expor as junções neuromusculares (MNJ) de Caenorhabditis elegans (C. elegans) E discute brevemente alguns dos usos que esta preparação pode ser aplicada.

Vídeo: Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Geração de transgênicos Estável C. elegans Usando microinjeção

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Biologia

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle synapses, we developed a larval tissue preparation that had features of live intact larvae, but also had good optical properties.  This new preparation also allowed for access of perfusates to the synapse.  We used fly larvae, immersed them in artificial hemolymph, and relaxed their normal rhythmic body contractions by chilling them. Next we dissected off the posterior segments of each animal and with a blunt insect pin pushed the mouth parts backward through the body cavity.  This everted the larval body wall, like turning a sock inside-out.  We completed the dissection with ultra-fine dissection scissors and thus exposed the visceral side of the body wall muscles. The glial structures at the NMJ expressed membrane targeted GFP under the control of glial specific promoters. The post-synaptic membrane, the SSR (Subsynaptic Reticula) in muscle expressed synaptically targeted dsRed. We needed to acutely label the motor neuron terminals, the third part of the synapse. To do this we applied primary antibodies to HRP, conjugated to a far-red emitting flurophore.  To test for dye diffusion properties into the perisynaptic space between the motor neuron terminals and the SSR, we applied a solution of large Dextran molecules conjugated to far-red emitting flurophore and collected images.

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

We described structural features of the Glia-neuromuscular synapses in a novel Inside-out tissue preparation of live fly larvae using fluorescent dyes with confocal microscopy. We labeled live neuron terminals with fluorescent primary antibodies to HRP, and also visualized the perisynaptic space with fluorescent Dextrans.

Visualizando o Live Drosophila Junção neuromuscular-Glial com corantes fluorescentes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

Produção de C. elegans Transgenes via Recombineering com o GalK Marcador selecionável

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

Alto rendimento Triagem e Biossensoriais com Fluorescente C. elegans Cepas

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos: Sincronização e observação

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, normal development or changes in environmental conditions2-5. Understanding the cellular signaling pathways that are involved in the response to hypoxia could provide new insight into treatment strategies for diverse human pathologies, from stroke to cancer. This goal has been impeded, at least in part, by technical difficulties associated with controlled hypoxic exposure in genetically amenable model organisms.
The nematode Caenorhabditis elegans is ideally suited as a model organism for the study of hypoxic response, as it is easy to culture and genetically manipulate. Moreover, it is possible to study cellular responses to specific hypoxic O2 concentrations without confounding effects since C. elegans obtain O2 (and other gasses) by diffusion, as opposed to a facilitated respiratory system6. Factors known to be involved in the response to hypoxia are conserved in C. elegans. The actual response to hypoxia depends on the specific concentration of O2 that is available. In C. elegans, exposure to moderate hypoxia elicits a transcriptional response mediated largely by hif-1, the highly-conserved hypoxia-inducible transcription factor6-9. C .elegans embryos require hif-1 to survive in 5,000-20,000 ppm O27,10. Hypoxia is a general term for "less than normal O2". Normoxia (normal O2) can also be difficult to define. We generally consider room air, which is 210,000 ppm O2 to be normoxia. However, it has been shown that C. elegans has a behavioral preference for O2 concentrations from 5-12% (50,000-120,000 ppm O2)11. In larvae and adults, hif-1 acts to prevent hypoxia-induced diapause in 5,000 ppm O212. However, hif-1 does not play a role in the response to lower concentrations of O2 (anoxia, operational definition &lt;10 ppm O2)13. In anoxia, C. elegans enters into a reversible state of suspended animation in which all microscopically observable activity ceases10. The fact that different physiological responses occur in different conditions highlights the importance of having experimental control over the hypoxic concentration of O2.
Here, we present a method for the construction and implementation of environmental chambers that produce reliable and reproducible hypoxic conditions with defined concentrations of O2. The continual flow method ensures rapid equilibration of the chamber and increases the stability of the system. Additionally, the transparency and accessibility of the chambers allow for direct visualization of animals being exposed to hypoxia. We further demonstrate an effective method of harvesting C. elegans samples rapidly after exposure to hypoxia, which is necessary to observe many of the rapidly-reversed changes that occur in hypoxia10,14. This method provides a basic foundation that can be easily modified for individual laboratory needs, including different model systems and a variety of gasses.

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

This paper details how to use continuous-flow hypoxia chambers to generate atmospheres with defined concentrations of O2 to understand biological responses to decreased O2. This system is easy to setup and maintain, and flexible enough to suit a wide range of O2 concentrations and model systems

Criando ambientes definidos gasosos para estudar os efeitos da hipóxia na<em&gt; C. elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Um Método para o cultivo embrionário<em&gt; C. elegans</em&gt; Células

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Um modelo de anóxia-inanição por isquemia / reperfusão em<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

Investigando as proteínas príon-like espalhando e de toxicidade de usar o Metazoan Organismo Modelo<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...