この記事は、JERにNIHの補助金によって賄われていた。私は録音のデモの1つで使用コリン作動性運動ニューロンにチャネルロドプシンを発現するトランスジェニックワームを提供するための博士アレックスゴットシャルクに感謝したいと思います。

解剖のために使用するツールのA.の準備。 <ol><li>解剖/録音室：私たちは通常、22 mmの直径の円形カバーガラスを十分に収容できる大きさであることを中心にドリルで丸穴で、1 / 16インチの磁性シートから私たちの記録室を構築する。チャンバーの外側の寸法は、レコーディングを行うために使用される顕微鏡のステージに依存します。磁性シートの裏面に、私たちはカバーの各隅に低い溶融Paraplax組織埋め込むワックスのペレットを配置することにより、チャンバーに付着する48 × 60 mmのカバースリップを、添付ガラスとチャンバーの間に挟まスリップ。それは連続的な層の接着チャンバーにカバースリップを形成するまでワックスは、その後、ガラス板を上に向けて、ホットプレート上で溶融する。ワックスはすぐに溶けて、このステップは放置しないでください。チャンバーは削除と同時にワックスが溶けているように冷却する必要があります。 22ミリメートルの円形空洞の内側の縁に沿ってseepedている過剰なワックスは、かみそりの刃のエッジを使用して削除できます。 </li><li> Sylgardコーティングされたカバースリップ：解剖が22ミリメートル、録音室の円形の空洞内に配置されているSylgardコーティングしたカバースリップ上で実行されている。 Sylgardのコートは、シアノアクリル接着剤がダウンしてもワームがそれが差し込まになったときに接着剤ピペットチップをバックブレークするクッションとして機能するときに接着スリップカバーに付着することができます。 Sylgardは（10重量部硬化剤1部に対して、シリコーンベース）の指示を製造するにしたがって、新鮮で構成されています。 Sylgardの小滴は、各カバースリップ上に配置され、さらに表面を作るためにかみそりの刃のエッジを使用して全体に染みています。コー​​ティングされたカバースリップは、大型フラットふた付きの容器に入れて治すために一晩65℃程度のオーブンに残されます。 </li><li>ピペットは：一般的に、我々は、電極プラーを使用して、筋肉からキューティクルの切開と記録を作成、接着ワーム用ピペットを生成するために同じ1ミリメートル、外径のフィラメントホウケイ酸ガラスを使用してください。この段階では、ピペットのいくつかの迅速な交換を必要とすることができるように解剖を試みる前に、ピペットのjarファイルをプルすることをお勧めします。 </li><li>グルーアプリケーター：接着剤は口圧によって、接着剤のピペットの先端からロードして適用されます。接着のピペットは、ピペットのガラス（通常1 mm）の外径と一致する内径を有するポリエチレンチューブの2フィートピースの一端に挿入されます。チューブのもう一方の端は、マウスピースとして機能するエッペンドルフピペットの先端を保持しています。 </li><li>抽出ピペット：キューティクルの切開が行われた後、ワームの内臓は、ワームの空洞から削除する必要があります。これは、接着剤の塗布に似ていますが、この場合にはガラスの抽出ピペットチップが戻って十分に卵と内臓は簡単にワームの空洞の外バキュームを可能にするために切断されるエッペンドルフピペットの先端に取り付けられたチューブの部分で達成されます。 </li></ol> B.解剖<ol><li>録音室で円形のワックスペンラインは、Sylgardコーティングされたカバースリップを所定の位置に確実に押されているチャンバー（Sylgard -コートが上を向いて）の境界に近い描画されます。このワックスのラインは、カバースリップを固定化し、下に浸透し、解剖し、記録中にカバースリップを外れからレコーディングソリューションを防ぎます。チャンバーは、細胞外記録液で満たされているといくつかのワームは、ワームのピックを使って中央に配置されます。ワームは、溶液中で泳ぐだろう、しかし練習と、これらのワームは、このような動きを防ぐために冷却するように、それ以上の手続きなしでダウン接着することができます。トレーニングの段階では、それは水泳が損なわれている接着変異体ワームを（そのようなUNC - 31変異体のような）練習することができます。 </li><li>ワックスや粘土で開催されたPCRのキャップから作ら接着剤の容器は、シアノアクリル接着剤の作業用ストックを保持するために使用されます。記録ピペット（通常は〜4メグオームの抵抗）と同様の先端寸法と接着剤のピペットは、接着剤を適用するために使用されます。グルーアプリケーターを用いて、接着剤の少量の接着剤が吸い取られるようにピペットチップを可視化するために解剖スコープを使用して、接着剤のピペットに吸い上げています。 </li><li>シアノアクリル接着剤（HistoacrylBlue、Aesulap）は細胞外記録液と接触すると重合する、従ってそれが硬化から接着剤を防止し、ピペットを差し込むためにチャンバー液に入ると接着剤のピペットで正圧を維持することが重要です。とすぐに接着剤をピペットでチャンバーの溶液中にあるように、接着剤の小さいながらも一定の流れが閉塞を防ぐために口圧力制御下にSylgardの表面に適用する必要があります。ピペットがなった場合、それが時には優しくsylgardコーティングされたガラスに関するヒントをタップしてブロックを解除することができるプラグイン。それは、接着剤のワームを試みる前に、接着を実践することをお勧めします。あなたが日常的にワームの幅よりも細い線で作られた文字で、Sylgard上で接着剤で自分の名前を書くことができるなら、procの準備が整いました接着ワームの表皮にEED。 </li><li>接着剤ワームをするために、頭部やワームのテールのどちらかに接着剤の少量を添付するために正圧を使用し、急速にSylgardの表面にワームを描く。エッジに近すぎる接着ワームは、記録ピペットで到達が難しくなるのでチャンバーの中心近くにワームを添付してみてください。その後、（腹側筋肉の録音のための）内側に面した外陰部とC -位置にワームを強制的に、開始、添付ファイルからワームのキューティクルの背側縁に沿って接着剤の一定のストリームを適用する。この接着剤の行の任意のギャップは、ワームが強くキューティクル切開のステップ中に切り離すことは、ワームを防ぐために、接続されているので、入力されているはずです。 </li><li>キューティクル切開を行うには、ハンドヘルド解剖のピペットに切り替えます。このピペットは、接着剤/録音ピペットよりもシャープになると短く、頑丈なシャフトを持っている必要があります。解剖範囲で最高倍率を使用して、ワームの縦軸にピペットを平行に整列し、キューティクル/接着剤界面での切開を行うワーム（近くに外陰部に）に沿って中間点に関するヒントを挿入する。この切開は、切開のポイントを介して卵と腸を強制的にワームの静水圧を解放します。あなたが咽頭に到達するまで、手紙を開くために同様のスライス動きでワームの頭に向かってキューティクルを切断続ける。ワームの内臓を真空抽出ピペットに切り替える。切開をクリアした後、開いたキューティクルは、その円筒状の形状を保持します。 Sylgardの表面にクチクラの切り口を下に溶接見つけるために新鮮な接着のピペットを使用してください。 NMJsを損傷または不明瞭にしないため、この段階で最小限の接着剤スポットを使用することが重要です。 腹側神経索と体壁の筋肉は、現在公開されています。 </li><li> 、NMJsを覆う基底膜を除去チャンバーから細胞外記録のソリューションを吸うと、約10-20秒間コラゲナーゼを（細胞外記録液の0.4mg/ml）に適用するには、削除して、新鮮な細胞外記録液で数回洗浄する。録音の段階に進みます。 </li></ol> C.パッチクランプ記録<ol><li>中央ワームのに10倍対物レンズを用いてまで右顕微鏡のステージ上の記録室を置きます。 DICと40Xの水出現の目標に切り替え、体壁の筋肉と神経索が完全な状態であることを確認してください。ワームの縦軸は電極が左右両側から導入できるように、範囲の前縁と平行になるようにワームを配置します。 </li><li>標準的なパッチクランプ技術を使用して筋肉にパッチを適用します。約4メグオームの抵抗の記録電極が適しています。電極は、筋肉の膜に触れた後gigohmシールが得られるまで、負圧を増加させる。ホールセル電圧クランプ記録モードの場合は、より多くの吸引を適用し、gigohmシールが破裂するまで膜を攻撃する。良い録音では、野生型の成虫の体壁の筋肉は、通常、約70 pFの細胞膜の静電容量を持っているし、安定的に最小限の保持電流（〜50 -60 mVの保持電位で少なくとも10分間記録することができますPA）。 </li><li>塩化ナトリウム150、KClの5、CaCl 2の 5、MgCl 2の 4、グルコース10、ショ糖5、HEPES 15（pHは7.3、〜330mOsm）：細胞外記録のソリューションは、（mm）で構成されています。パッチピペットは（mMで）含まれています：KClを120、KOH 20、MgCl 2の 4、（N -トリス[ヒドロキシメチル] mthyl -2 -アミノエタン-スルホン酸）TES 5、二水和物CaCl 2で 0.25、硫酸ナトリウム ATP 4、ショ糖36 、EGTA 5（pHは7.2、〜312 mOsm）。注：これらのソリューションは、人工的にGABA受容体を介した電流は-60 mVの保持電位で塩素流出による内側になるように、塩化物と筋肉細胞を読み込むこれらのソリューションのバリエーション（詳細については出版物を参照）が使用されている。 </li><li>リリースを誘発。一般的に我々は、パッチを適用した筋肉の前腹側神経索の細胞外溶液を含む第二の電極を配置する。この緩やかなパッチの構成は、野生型ワームで最大の誘発反応（通常は2.0から2.5 NA）を達成するために短期間の大規模な脱分極刺激（ボルトの10秒のオーダー）（1 - 2msの）が必要です。このアプローチの限界は、1）神経索が不可逆的に損傷し、2する前に、ほんの数誘発反応が理由は不明）に配信することができる、唯一のコリン作動性誘発反応は、この刺激の構成を使用して誘発することができます。 </li><li>光は、チャネルロドプシンの刺激を活性化。最近、ゴットシャルクのラボでは、式4を駆動するために使用されるプロモーターに応じて、神経細胞のサブセットで、光刺激により細胞膜を脱分極藻類由来のチャネルロドプシンを発現するトランスジェニックワームが生成されています。 Cの場合で虫 NMJ、どちらかのコリン作動性運動ニューロンやGABA作動性運動ニューロンにチャネルロドプシンを発現している統合された行が現在availablですE.チャネルロドプシンのみが全トランスレチナールはオプシン部分に関連付けられているとき点灯に応答するので、このアプリケーションで使用するワームは、網膜が混入細菌上に成長されている必要があります。緑色の光パルスは、繰り返しtransgenicワームが使用されているかによって、アセチルコリンやGABAのどちらかの誘発放出をcausing channelロドプシンをアクティブにすることができます。これらのトランスジェニックワームは、変異株に交差することができます。前の電気刺激に対するこの手法の利点は次のとおり、1）光活性化はGABA作動性またはコリン作動性運動ニューロンは独立して調査することができるのいずれかからリリースを誘発）、多くの繰り返しの刺激を行うと2できるように、神経損傷を引き起こすことはありません。 </li><li>高浸透圧誘発性放出。容易に放出可能小胞プール（記録された筋肉の上にすべてのNMJのからプライミング小胞の合計プールを反映する）の大きさを測定するために、高浸透圧、細胞外溶液の入った圧力ピペットは（追加のショ糖を添加することにより〜850 mOsmに調整）に使用されます。 1-3秒の圧力パルスのアプリケーションでは、上記の標準液を使用して非同期のポストシナプスのイベントの弾幕を生成する。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/old/1165_2009_1_22_3/figure1.png" alt="" width="600" height="449" /> 図1：Cの回路図の概要elegansの解剖および神経筋録音の設定 ガラスと硬化全体Sylgardのスミアドロップによるsylgardコーティングされたカバースリップは、一晩プレハブ記録室の円形の空洞内に配置し、記録液で覆われている。中央に配置されたワームは、接着剤ピペットを用いて、ワームの背側に接着剤を適用し、先頭または末尾から開始Sylgard表面に糊付けされています。一度接着が完了すると、キューティクルと接着剤間の界面における外陰部に隣接切開は、ガラスの針で行われ、（赤のミシン目を参照）頭に向かって拡張されます。内臓や体腔から卵の抽出に続いて、切開の面取り部は腹側神経（緑）と体壁の筋肉（赤）を公開するSylgardに接着剤でスポット溶接されている。外陰部の前腹側、内側の筋肉は、パッチクランプされ、刺激電極は、神経索に上流に配置されます。 代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/1165/Reprensentative.png" alt="Represenative図" width="600" height="404" />全細胞、電圧クランプ体壁筋の録音は、（電気的に誘発、光誘発し、高浸透圧応答）上記の3つの刺激の各プロトコルに示されている。すべてのケースでは腹側内側体壁筋を-60 mVにクランプされます。 A.野生型筋細胞は、通常、私たちの標準的なレコーディングソリューションで内因性の内向きの小型のシナプス電流の高い率を示す。 B.前腹側神経索の2msの脱分極は、野生型ワームで2〜2.5前後nAの大きな誘発反応で生じるいくつかのシナプスからの同期放出を引き起こします。 AとBの野生型のトレースの右側にある代表的なトレースがひどくまとまりのない変異体（UNC - 18）におけるシナプス放出を示す。パネルCは、コリン作動性ニューロンにおけるチャネルロドプシンを発現する野生型ワームの神経筋接合部からの光誘発反応を示しています。 2msの光パルスは、通常、1.5〜1.8 nAの応答を生成します。 D. 1秒のための筋肉の上に850 mOsm高浸透圧の生理食塩水圧力放出は、小胞の容易に放出可能プールを表すミニチュアシナプス電流の非同期弾幕を生成します。

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	<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genetics. 77 (1), 71-71 (1974).</li><li>Richmond, J. E., Davis, W. S., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Neurosci. 2 (11), 959-959 (1999).</li><li>Richmond, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook. 1, (2006).</li><li>Liewald, J. F., Brauner, M., Stephens, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature methods. 5 (10), 895-895 (2008).</li><li>Lockery, S. R., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in enzymology. 293, 201-201 (1998).</li><li>Brockie, P. J., Mellem, J. E., Hills, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuron. 31 (4), 617-617 (2001).</li><li>Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Neurosci. 2 (9), 791-791 (1999).</li></ol>

遺伝的モデル生物C、elegansのは理想的にシナプスのタンパク質をコードする遺伝子の変異の機能解析を通じて、シナプス伝達の研究に適しています。ここではCをレンダリングする解剖手法を記載している虫は、電気生理学的解析のためにアクセスNMJs。付属のビデオは 、C言語の重要な手順を示していますelegansの解剖とシナプス活性を測定するために用いられる代表的な録音の設定。このテクニックを学ぶことに最大の課題を提起三つのステップとしては、1）ワームの接着のステップ、2）成功した​​切開を行う、と体壁の筋肉への3）パッチ。これらをマスターしたら、この準備は、電圧クランプや電流クランプモードでのポストシナプス筋の録音に適している。誘発刺激に対する応答は、容易に変異さまざまな経歴でこの解剖の準備を用いて測定することができます。野生型成体のワーム（長さは1 mm）をすでに分サイズを考えると、成人に達するか、または骨張った残っていないシナプスの変異体は、この解剖のアプローチに従順になる場合があります。いくつかのラボが正常にCから記録されているものの、腹神経索の運動ニューロンは、また非常に小さいです（セルソーマの2から5ミクロン）とelectrophysiologistsのための追加の課題を提起解剖準備のバリエーションで虫のニューロンは、ここ5を説明した。

dissecting and recording from the c. elegans neuromuscular junction

神経伝達は、神経細胞が急速な時間スケールで、彼らのポストシナプスのターゲットに化学信号を介して情報を転送するプロセスです。この複雑なプロセスがリサイクル、分泌小胞、カルシウムセンシング、小胞融合、シナプス後受容体の局在と機能し、最後の適切なシナプス接続、電気信号​​の伝導、標的とプライミングを確保するために多くの事前事後シナプスタンパク質の協調活動が必要ですメカニズム。神経科学者としては、これらの各ステップで機能するタンパク質の解明とその​​作用メカニズムを理解することが、当社の目標です。シナプスからの電気生理学的記録は、シナプス伝達中に発生する基本的な電気的事象から読み出さ定量化を提供しています。分子および遺伝学的ツールの強力な配列とCのシナプスタンパク質を操作するために利用可能なこの手法を組み合わせることにより、 elegansは 、我々はシナプス伝達の結果として得られる機能的な変化を分析することができます。 C.虫は、運動ニューロンと体壁の筋肉のコントロールの移動、これらのシナプス1のため、まとまりのない運動器官の表現型（UNCのとして知られている）を持つ変異体がしばしば乱すシナプス伝達の間に形成さNMJs。 UNCの変異体は、細菌の食物源の豊富な供給を維持しているので、彼らは食物を摂取するために、いくつかの咽頭のポンプ機能を維持する限り、実行可能なままです。この、一緒に事実とそのC.虫は雌雄同体として存在し、それらは精巧な交尾行動を必要とせずに変異子孫に渡すことができます。ワームから記録するために我々の最近の能力と相まって、これらの属性は、2,3,7はこの方法UNC変異体の影響の神経伝達を正確に対処するための優れたモデル生物行うNMJs。 解剖の方法は、NMJsを公開するワームの表皮に切開を行うために、シアノアクリル接着剤を使用して、成虫を固定化する伴います。 C.以来、 虫の大人は、解剖は解剖顕微鏡を使用して実行し、優れた手と目のコーディネーションを必要とされる長さはわずか1 mmである。 NMJの録音は全細胞の個々の体壁筋細胞と神経伝達物質の放出をクランプ電圧は、電気刺激、光活性化チャネルロドプシンを介する脱分極4となるすべてが高浸透圧生理食塩水、を含む刺激のさまざまなプロトコルを使用して誘発することができることによって作られています簡単に説明します。

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Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

アクセス可能なシナプスの電気生理学のアプリケーションでは、シナプス変異体の分析に有用なシナプス活性の定量的な尺度を提供しています。この記事では、神経筋接合部（NMJ）のを公開するために使用される解剖の方法を説明します<em&gt;線虫Caenorhabditis elegans（線虫）</em&gt;と簡潔にこの製剤を適用することができる用途のいくつかについて説明します。

解離性とC. elegansの神経筋接合部から録音する

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

dissecting-and-recording-from-the-c-elegans-neuromuscular-junction

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

15.5K ビュー.  University of Illinois, Chicago. アクセス可能なシナプスの電気生理学のアプリケーションでは、シナプス変異体の分析に有用なシナプス活性の定量的な尺度を提供しています。この記事では、神経筋接合部（NMJ）のを公開するために使用される解剖の方法を説明します線虫Caenorhabditis elegans（線虫）と簡潔にこの製剤を適用することができる用途のいくつかについて説明しま?...

ビデオ: Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

マイクロインジェクションを使用して安定したトランスジェニック線虫の世代

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

生物学

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle synapses, we developed a larval tissue preparation that had features of live intact larvae, but also had good optical properties.  This new preparation also allowed for access of perfusates to the synapse.  We used fly larvae, immersed them in artificial hemolymph, and relaxed their normal rhythmic body contractions by chilling them. Next we dissected off the posterior segments of each animal and with a blunt insect pin pushed the mouth parts backward through the body cavity.  This everted the larval body wall, like turning a sock inside-out.  We completed the dissection with ultra-fine dissection scissors and thus exposed the visceral side of the body wall muscles. The glial structures at the NMJ expressed membrane targeted GFP under the control of glial specific promoters. The post-synaptic membrane, the SSR (Subsynaptic Reticula) in muscle expressed synaptically targeted dsRed. We needed to acutely label the motor neuron terminals, the third part of the synapse. To do this we applied primary antibodies to HRP, conjugated to a far-red emitting flurophore.  To test for dye diffusion properties into the perisynaptic space between the motor neuron terminals and the SSR, we applied a solution of large Dextran molecules conjugated to far-red emitting flurophore and collected images.

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

We described structural features of the Glia-neuromuscular synapses in a novel Inside-out tissue preparation of live fly larvae using fluorescent dyes with confocal microscopy. We labeled live neuron terminals with fluorescent primary antibodies to HRP, and also visualized the perisynaptic space with fluorescent Dextrans.

ライブの視覚化ショウジョウバエ</em蛍光色素で>グリア - 神経筋接合部

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

の生産 C.エレガンス</emとRecombineering経由>トランスジーン galK選択可能なマーカー

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

蛍光とハイスループットスクリーニングとバイオセンシング C.エレガンス菌株

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

基本的な<em&gt;線虫Caenorhabditis elegans</em&gt;方法：同期との観測

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, normal development or changes in environmental conditions2-5. Understanding the cellular signaling pathways that are involved in the response to hypoxia could provide new insight into treatment strategies for diverse human pathologies, from stroke to cancer. This goal has been impeded, at least in part, by technical difficulties associated with controlled hypoxic exposure in genetically amenable model organisms.
The nematode Caenorhabditis elegans is ideally suited as a model organism for the study of hypoxic response, as it is easy to culture and genetically manipulate. Moreover, it is possible to study cellular responses to specific hypoxic O2 concentrations without confounding effects since C. elegans obtain O2 (and other gasses) by diffusion, as opposed to a facilitated respiratory system6. Factors known to be involved in the response to hypoxia are conserved in C. elegans. The actual response to hypoxia depends on the specific concentration of O2 that is available. In C. elegans, exposure to moderate hypoxia elicits a transcriptional response mediated largely by hif-1, the highly-conserved hypoxia-inducible transcription factor6-9. C .elegans embryos require hif-1 to survive in 5,000-20,000 ppm O27,10. Hypoxia is a general term for "less than normal O2". Normoxia (normal O2) can also be difficult to define. We generally consider room air, which is 210,000 ppm O2 to be normoxia. However, it has been shown that C. elegans has a behavioral preference for O2 concentrations from 5-12% (50,000-120,000 ppm O2)11. In larvae and adults, hif-1 acts to prevent hypoxia-induced diapause in 5,000 ppm O212. However, hif-1 does not play a role in the response to lower concentrations of O2 (anoxia, operational definition &lt;10 ppm O2)13. In anoxia, C. elegans enters into a reversible state of suspended animation in which all microscopically observable activity ceases10. The fact that different physiological responses occur in different conditions highlights the importance of having experimental control over the hypoxic concentration of O2.
Here, we present a method for the construction and implementation of environmental chambers that produce reliable and reproducible hypoxic conditions with defined concentrations of O2. The continual flow method ensures rapid equilibration of the chamber and increases the stability of the system. Additionally, the transparency and accessibility of the chambers allow for direct visualization of animals being exposed to hypoxia. We further demonstrate an effective method of harvesting C. elegans samples rapidly after exposure to hypoxia, which is necessary to observe many of the rapidly-reversed changes that occur in hypoxia10,14. This method provides a basic foundation that can be easily modified for individual laboratory needs, including different model systems and a variety of gasses.

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

This paper details how to use continuous-flow hypoxia chambers to generate atmospheres with defined concentrations of O2 to understand biological responses to decreased O2. This system is easy to setup and maintain, and flexible enough to suit a wide range of O2 concentrations and model systems

に低酸素の影響を検討するために定義され気体環境を作成する<em&gt; C.エレガンス</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegansの走化性アッセイ

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

培養胚のための方法<em&gt; C.虫</em&gt;細胞

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

における虚血/再灌流のための無酸素飢餓モデル<em&gt; C.虫</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

拡散とプリオン様タンパク質の毒性は後生動物モデル生物を用いて調査<em&gt; C。エレガンス</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...