Dieser Artikel wurde von NIH gewährt JER finanziert. Ich möchte Dr. Alex Gottschalk für die Bereitstellung der transgenen Würmer Ausdruck Kanal Rhodopsin in cholinergen Motoneuronen in einer der Aufnahme Demonstrationen begleitet haben.

A. Herstellung von Werkzeugen für die Präparation verwendet. <ol><li> Die Dissektion / Aufnahme Kammer: Wir in der Regel konstruieren unsere Aufnahme Kammer aus einem 1 / 16 th Zoll Magnetfolie, mit einem kreisrunden Loch in der Mitte, die groß genug für einen 22 mm Durchmesser runden Deckglas Platz gebohrt. Die äußeren Abmessungen der Kammer wird auf dem Mikroskoptisch verwendet werden, um die Aufnahmen abhängen. Auf der Rückseite der Magnetfolie, legen wir eine 48 x 60 mm Deckglas, das wir in die Kammer halten, indem man ein Pellet aus niedrigen Schmelz Paraplax Gewebe eingebettet Wachs in jeder Ecke des Deckglases eingeklemmt zwischen dem Glas und der Kammer . Das Wachs wird dann auf einer heißen Platte geschmolzen, Glasplatte nach oben, bis es eine durchgehende Schicht kleben das Deckglas auf die Kammer bildet. Lassen Sie diesen Schritt unbeaufsichtigt wie das Wachs schmilzt schnell. Die Kammer sollte entfernt und gekühlt werden, sobald das Wachs geschmolzen ist. Überschüssiges Wachs, das entlang der Innenkante des 22mm kreisförmigen Hohlraum eingedrungen ist, kann entfernt mit einer Rasierklinge Kante. </li><li> Sylgard-beschichtete Deckgläser: Die Präparation wird auf einem 22 mm, Sylgard-beschichteten Deckglas, dass innerhalb der kreisförmigen Hohlraum der Aufnahme Kammer platziert durchgeführt wird. Die Sylgard Mantel hilft dem Cyanoacrylsäure Kleber, um die Abdeckung halten Schlupf beim Verkleben der Würmer nach unten und dient auch als Kissen, auf dem Bruch wieder auf den Leim Pipettenspitze, wenn es angeschlossen wird. Sylgard wird frisch zubereitet nach den Anweisungen des Herstellers (10 Teile Silikon-Basis zu 1 Teil Härter nach Gewicht). Ein kleiner Tropfen Sylgard wird dann auf jeder Deckglas gelegt und schmierte über mit einer Rasierklinge Rand, um eine gleichmäßige Oberfläche zu machen. Die beschichteten Deckgläser sind in großen, flachen, abgedeckten Behältern gestellt und in einem 65 °-Grad-Ofen über Nacht aushärten. </li><li> Pipetten: In der Regel verwenden wir die gleiche 1 mm Außendurchmesser Filament Borosilikatglas, um die Pipetten zum Kleben Würmer unten zu erzeugen, so dass Nagelhaut Einschnitte und die Aufnahme von Muskeln, mit Hilfe einer Elektrode Abzieher. Es ist ratsam, ein Glas Pipetten, bevor er eine Präparation wie dieser Phase mehrere schnellen Austausch von Pipetten erfordern ziehen kann. </li><li> Leimgerät: Glue ist geladen und angewendet von der Spitze eines Klebers Pipette, durch Mund-Druck. Die Verklebung Pipette wird in das eine Ende eines 2 Fußstück aus Polyethylen-Schlauch mit einem Innendurchmesser, der Außendurchmesser der Pipette Glas (in der Regel 1 mm) passt eingefügt. Das andere Ende des Schlauches hat einen eppendorf Pipettenspitzen, die als Mundstück dient. </li><li> Extraction Pipette: Der Wurm Eingeweide sind von dem Wurm Hohlraum entfernt werden, wenn die Nagelhaut Schnitt gemacht worden ist. Dies ist mit einem Stück Schlauch an einer Eppendorf Pipette ähnlich dem Leimgerät aber in diesem Fall das Glas Extraktion Pipettenspitze ist wieder ausreichend gebrochen, damit Eier und Innereien einfach abgesaugt werden von dem Wurm Hohlraum erreicht. </li></ol> B. Die Dissektion <ol><li> In der Aufzeichnung Kammer eine kreisförmige Wachsschreiber Linie liegt in der Nähe des Umfangs der Kammer zu dem ein Sylgard-beschichteten Deckglas fest sitzt gedrückt (Sylgard-Mantel nach oben) gezogen. Dieses Wachs Linie immobilisiert das Deckglas und verhindert das Eindringen von Recording-Lösung unter und verdrängen das Deckglas beim Präparieren und Aufnahme. Die Kammer wird dann mit extrazellulären Recording-Lösung gefüllt und mehrere Würmer sind in der Mitte mit einem Wurm holen platziert. Worms wird in der Lösung schwimmen, aber mit der Praxis können diese Würmer sich ohne weitere Verfahren wie Kühlung, um Bewegung zu verhindern geklebt werden. Während der Ausbildung der Bühne, kann es helfen, Kleben mutierten Würmer, in denen Schwimmen beeinträchtigt wird (z. B. unc-31-Mutanten) Praxis. </li><li> Ein Leimbehälter aus einer PCR-Cap in Wachs oder Plastilin statt fashioned, wird verwendet, um eine Arbeitsgruppe eine Bestandsaufnahme der Cyanoacrylsäure Leim halten. Kleber Pipetten mit ähnlichen Tipp Dimensionen, um die Aufnahme Pipetten (normalerweise ~ 4 MOhm Widerstand) werden verwendet, um Klebstoff anwenden. Mit dem Leimgerät, wird eine kleine Menge der Leim in die Leim-Pipette angesaugt, über die Sezierung Rahmen der Pipettenspitze zu visualisieren, wie der Kleber aufgesaugt. </li><li> Die Cyanoacrylsäure Kleber (HistoacrylBlue, Aesulap) polymerisiert bei Kontakt mit extrazellulären Recording-Lösung, daher ist es wichtig, positive Druck auf den Leim Pipette zu halten, wie es die Kammer Lösung tritt der Klebstoff von Härten zu vermeiden und Einstecken der Pipette. Sobald der Leim Pipette in die Kammer-Lösung ist, muss eine kleine, aber konstanten Strom von Klebstoff auf die Oberfläche unter Sylgard Mund-Druckregelung zu verhindern Verstopfung angewendet werden. Wenn die Pipette verstopft es manchmal durch leichtes Antippen der Spitze auf dem Sylgard-beschichtetes Glas entsperrt werden. Es wird empfohlen, dass Sie Verkleben der Praxis, bevor Sie Leim Würmer. Wenn Sie regelmäßig schreiben können Ihren Namen in Leim auf die Sylgard, mit Briefen von Linien dünner als die Würmer Breite hergestellt sind Sie bereit, proceed dem Verkleben der Wurm Nagelhaut. </li><li> Zum Kleben ein Wurm, verwenden Sie positive Druck, eine kleine Menge des Klebers, um entweder den Kopf oder Schwanz des Wurmes legen und schnell zu zeichnen der Wurm nach unten auf die Sylgard Oberfläche. Versuchen Sie, den Wurm in der Nähe der Mitte der Kammer anbringen, wie Würmer geklebt zu nahe an den Rand wird schwierig sein, mit der Aufnahme Pipetten zu erreichen. Dann bewerben Sie sich ein konstanter Strom von Kleber entlang der dorsalen Kante des Wurms Nagelhaut vom Ausgangspunkt Anlage, wodurch der Wurm in eine C-Position mit der Vulva nach innen (zum ventralen Muskel-Aufnahmen). Allfällige Lücken in diesem Leimfuge sollte so gefüllt werden, dass der Wurm stark befestigt ist, um den Wurm nicht abgehängt werden während der Nagelhaut Schnitt Schritt zu verhindern. </li><li> Um die Nagelhaut Schnitt, eine Hand-Dissektion Pipette wechseln. Diese Pipette muss schärfer als der Kleber / Aufnahme Pipetten und haben einen kurzen, stabilen Schaft. Mit der höchsten Vergrößerung auf dem Binokular, richten Sie die Pipette parallel zur Längsachse des Wurms und legen Sie die Spitze über Mittelpunkt entlang der Wurm (in der Nähe der Vulva) der an den Schnitt an der Nagelhaut / Leim-Schnittstelle. Dieser Schnitt gibt die Würmer hydrostatischen Druck zwingt Eier und Darm durch den Schnitt Punkt. Weiter Schneiden der Nagelhaut in Richtung Kopf des Wurms mit einem Schneidebewegung ähnlich wie bei einem Brief öffnen, bis Sie den Rachen gelangen. Schalten Sie um auf die Extraktion Pipette absaugen die inneren Organe des Wurms. Nach dem Löschen des Schnittes wird die Schuppenschicht geöffnet halten es zylindrische Form. Verwenden Sie einen Frischkleben Pipette Schweißpunkt die Schnittkante der Kutikula nach unten auf die Sylgard Oberfläche. Es ist wichtig, minimal Leimpunkte in dieser Phase nutzen, um eine Beschädigung oder Verschleierung der NMJs. Das Bauchmark und Körper Wand Muskeln sind nun frei. </li><li> Um die Basalmembran, die NMJs Abdeckungen entfernen, absaugen der extrazellulären Recording-Lösung aus der Kammer und gelten Kollagenase (0.4mg/ml in extrazellulären Recording-Lösung) für ca. 10-20 Sekunden, abnehmen und waschen mehrmals mit frischem extrazellulären Recording-Lösung. Fahren Sie mit der Aufzeichnung der Bühne. </li></ol> C. Patch-Clamp Aufnahme <ol><li> Position der Aufnahme Kammer auf einem oben rechts Mikroskoptisch mit einer 10X-Objektiv zur Mitte des Wurms. Wechseln Sie zu einem 40x Wasser-emersion Ziel mit DIC und überprüfen Sie, dass der Körper Wand Muskeln und Nervenstränge intakt sind. Positionieren Sie den Wurm so, dass die Längsachse des Wurms parallel mit der vorderen Kante des Anwendungsbereichs ist, so dass Elektroden sowohl aus dem linken und rechten Seite eingeführt werden. </li><li> Patch der Muskel mit Standard-Patch-Clamp-Techniken. Recording-Elektroden von ca. 4 MOhm Widerstand gut zu funktionieren. Nachdem die Elektrode berührt die Muskel-Membran, erhöhen Unterdruck-bis ein gigohm Siegel erhalten. Für die whole-cell Voltage-Clamp-Aufnahmemodus, wenden Sie mehr Saug-und zap die Membran, bis die gigohm Siegel gebrochen ist. In eine gute Aufnahme, Körper Wand Muskeln Wildtyp erwachsenen Würmer haben typischerweise eine Zellmembran Kapazität von ca. 70 pF und stabil für mindestens 10 Minuten in einem Betrieb von -60 mV bei minimaler Halteströme (~ 50 erfasst pA). </li><li> Die extrazelluläre Recording-Lösung besteht aus (in mM): NaCl 150, KCl 5, CaCl 2 5, MgCl 2 4, Glucose 10, Saccharose 5, HEPES 15 (pH 7,3, ~ 330mOsm). Die Patch-Pipette enthält (in mM): KCl 120, KOH 20, MgCl 2 4, (N-Tris [hydroxymethyl] mthyl-2-amino-sulfonsäure) TES 5, Dihydrat CaCl 2 0,25, Na 2 ATP 4, Saccharose 36 , EGTA 5 (pH 7,2, ~ 312 mOsm). Hinweis: Diese Lösungen künstlich Last Muskelzellen mit Chlorid, so dass die GABA-Rezeptor-vermittelten Ströme nach innen durch Chlorid-Efflux in einem Betrieb von -60 mV. Variationen über diese Lösungen verwendet wurden (siehe Publikationen für Details). </li><li> Evozierte Freisetzung. Normalerweise legen wir eine zweite Elektrode, die extrazelluläre Lösung auf dem Bauchmark ventral des gepatchten Muskel. Diese lose Patch-Konfiguration erfordert große depolarisierende Stimuli (in der Größenordnung von 10s Volt) nur von kurzer Dauer (1-2ms) bis zur maximalen evozierte Potentiale (typischerweise 2,0-2,5 nA) in Wildtyp-Würmern zu erreichen. Die Grenzen dieses Ansatzes sind: 1) Nur ein paar evozierte geliefert werden können, bevor der Nervenstrang irreversibel geschädigt ist und 2 sein) Aus unbekannten Gründen kann nur cholinerge evozierte Potentiale hervorgerufen werden durch diese Stimulation Konfiguration. </li><li> Licht aktivierten Kanal-Rhodopsin Stimulation. Vor kurzem hat die Gottschalk-Labor transgenen Würmer Ausdruck Algen-derived Kanal Rhodopsine, dass die Membran über Licht-Stimulation depolarisieren in Teilmengen von Neuronen, abhängig von der verwendeten Promotor zur Expression 4-Laufwerk. Erzeugten Im Fall des C. elegans NMJ sind integrierte Linien auszudrücken Kanal Rhodopsin entweder in der cholinergen Motoneuronen oder GABAergen Motoneuronen jetzt verfügbe. Da Kanal Rhodopsin reagiert nur auf Licht, wenn all-trans-Retinal mit dem Opsin Einheit verknüpft ist, müssen Würmer für diese Anwendung eingesetzt auf Bakterien mit retinalen geschnürt angebaut werden. Ein grünes Licht Impuls kann dann verwendet werden, um wieder zu aktivieren den Kanal Rhodopsin verursacht evozierte Freisetzung von ACh entweder oder GABA, je nachdem, welche transgenen Würmern verwendet werden. Diese transgenen Würmer können in Mutanten gekreuzt werden. Der Vorteil dieser Technik gegenüber dem Vorjahr elektrische Stimulation sind: 1) Light-Aktivierung nicht zu neuronalen Schäden, so dass viele wiederholen Stimulationen durchgeführt werden und 2) evozierte Freisetzung von beiden GABAerge oder cholinergen Motoneuronen können unabhängig voneinander studiert werden. </li><li> Hyperosmotischen-induzierten Freisetzung. Um die Größe der leicht lösbare Vesikel Pool (was die summiert Pool von grundierten Vesikel aus allen NMJ ist auf die aufgenommene Muskel), ein Druck-Pipette mit hyperosmotischen extrazellulären Lösung (eingestellt auf ~ 850 mOsm, indem zusätzliche Saccharose) wird verwendet, zu messen. Druck-Puls-Anwendungen von 1-3 Sekunden erzeugen eine Flut von asynchronen postsynaptischen Ereignisse unter Verwendung des Standard-Lösungen beschrieben. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/old/1165_2009_1_22_3/figure1.png" alt="" width="600" height="449" /> Abbildung 1: Schematische Übersicht über die C. elegans Dissektion und neuromuskuläre Aufnahme-Konfiguration Ein Sylgard beschichteten Deckglas durch Verschmieren ein Tropfen Sylgard über das Glas und Aushärtung gemacht über Nacht in den kreisförmigen Hohlraum der vorgefertigten Aufnahme Kammer gelegt und mit Recording-Lösung. Ein Wurm in der Mitte platziert ist, die Sylgard geklebt ab dem Kopf oder Schwanz, Aufbringen von Klebstoff auf der Rückenseite des Wurms mit einem Kleber Pipette. Sobald Kleben abgeschlossen ist, einen Einschnitt neben der Vulva, an der Schnittstelle zwischen der Oberhaut und Leim wird mit einem Glas Nadel gemacht und erweitert auf den Kopf (siehe rote perforierten Linie). Nach Extraktion der Eingeweide und Eier aus der Körperhöhle, ist die Schnittkante des Einschnitts punktgeschweißt mit Leim auf die Sylgard Freilegung der ventralen Nerven (grün) und Körper Wand Muskeln (rot). Die ventral-medial Muskel anterior der Vulva ist Patch-geklemmt und der stimulierenden Elektrode vorgeschaltet ist am Nervenstrang platziert. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/1165/Reprensentative.png" alt="Represenative Abbildung" width="600" height="404" /> Whole-cell-, Spannungs-geklemmt Körperwand Muskel-Aufnahmen sind für jede der drei Stimulationsprotokolle oben beschrieben (elektrisch evozierte, Licht-evozierte und hyperosmotischen Antworten) gezeigt. In allen Fällen ist die ventral-medial Körperwand Muskel ist bei -60 mV geklemmt. A. Wild-Typ Muskelzellen weisen typischerweise hohe endogene innen Miniatur-synaptischen Ströme in unseren Standard-Recording-Lösungen. B. A 2 ms Depolarisation des vorderen Bauchmark Ursachen synchrone Freisetzung aus mehreren Synapsen was zu einer großen evozierte Potentiale von rund 2-2,5 nA in Wildtyp-Würmer. Vertreter Spuren auf der rechten Seite des Wildtyp-Spuren in A und B zeigen synaptische Freisetzung in einem stark unkoordinierten Mutante (unc-18). Panel C zeigt eine Licht-evozierte Potentiale aus der neuromuskulären Synapse von einem Wildtyp-Wurm Ausdruck Kanal Rhodopsin in cholinergen Neuronen. A 2 ms Lichtpuls erzeugt typischerweise eine Antwort von 1,5-1,8 nA. D. Druck-Ausstoß von 850 mOsm hyperosmotischen Kochsalzlösung auf den Muskel für 1s produziert eine asynchrone Flut von Miniatur-synaptischen Ströme, die die leicht lösbare Pool von Vesikeln.

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	<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genetics. 77 (1), 71-71 (1974).</li><li>Richmond, J. E., Davis, W. S., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Neurosci. 2 (11), 959-959 (1999).</li><li>Richmond, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook. 1, (2006).</li><li>Liewald, J. F., Brauner, M., Stephens, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature methods. 5 (10), 895-895 (2008).</li><li>Lockery, S. R., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in enzymology. 293, 201-201 (1998).</li><li>Brockie, P. J., Mellem, J. E., Hills, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuron. 31 (4), 617-617 (2001).</li><li>Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Neurosci. 2 (9), 791-791 (1999).</li></ol>

Die genetischen Modellorganismus C, elegans ist ideal für die Untersuchung der synaptischen Übertragung geeignet, durch die funktionelle Analyse von Mutationen in Genen, synaptischer Proteine. Hier haben wir eine Dissektionstechnik, dass die C macht beschriebenen elegans NMJs zugänglich für elektrophysiologische Analysen. Das dazugehörige Video zeigt die wichtigsten Schritte in der C. elegans Dissektion und die typische Aufnahme-Konfiguration verwendet werden, um synaptische Aktivität zu messen. Die drei Schritte, die zu den größten Herausforderungen in Erlernen dieser Technik darstellen; 1) der Wurm Beleimungsschritt, 2) die Durchführung einer erfolgreichen Einschnitt, und 3) Patchen auf die Wand des Körpers Muskeln. Sobald diese gemeistert haben, wird dies Vorbereitung offen für die Aufnahme der postsynaptischen Muskel entweder in der Voltage-Clamp-oder Current-Clamp-Modi. Responses to evozierten Stimuli kann leicht gemessen werden mit dieser seziert die Zubereitung in einer Vielzahl von Mutanten-Hintergründen. Angesichts der bereits geringen Größe des Wildtyp-erwachsenen Wurm (1 mm in der Länge), kann synaptischen Mutanten, die nicht bis ins Erwachsenenalter oder bleiben dürr nicht zugänglich sein, diese Zerlegung Ansatz. Die motorischen Neuronen des Bauchmarks sind auch sehr klein (Zelle soma ist 2-5 um) und stellen zusätzliche Herausforderungen für Elektrophysiologen, obwohl mehrere Labors erfolgreich von C. aufgenommen haben elegans Neuronen in Variationen der sezierten Vorbereitung hier beschriebenen 5 6.

dissecting and recording from the c. elegans neuromuscular junction

Neurotransmission ist der Prozess, durch den Nervenzellen übertragen Informationen über chemische Signale an ihre postsynaptischen Ziele, auf einer schnellen Zeitskala. Dieser komplexe Prozess erfordert die koordinierte Aktivität von vielen Vor-und post-synaptischen Proteinen, geeignete synaptischer Verbindungen, Durchführung von elektrischen Signalen, Targeting und Grundieren von sekretorischen Vesikeln, Calcium-sensitiven, Vesikelfusion, Lokalisation und Funktion von postsynaptischen Rezeptoren zu gewährleisten und schließlich das Recycling Mechanismen. Wie Neurowissenschaftler ist es unser Ziel, aufzuklären, welche Proteine ​​Funktion in jedem dieser Schritte und verstehen ihre Wirkmechanismen. Elektrophysiologischen Ableitungen von Synapsen eine quantifizierbare aus dem zugrunde liegenden elektrischen Ereignisse, die während der synaptischen Übertragung auftreten zu lesen. Durch die Kombination dieser Technik mit dem leistungsstarken Reihe von molekularen und genetischen Werkzeuge zur Verfügung, synaptischer Proteine ​​in C. manipulieren elegans, können wir analysieren die daraus resultierenden funktionellen Veränderungen der synaptischen Übertragung. Die C. elegans NMJs gebildet zwischen Motoneuronen und Körper Wand Muskeln kontrollieren Fortbewegung, also Mutanten mit unkoordinierten Bewegungsapparates Phänotypen (bekannt als unc s) oft stören synaptischen Übertragung an diesen Synapsen 1. Da unc Mutanten auf ein reichhaltiges Angebot an einer bakteriellen Nahrungsquelle erhalten bleiben, bleiben sie umsetzbar, solange sie einige Rachenraum Pumpen Fähigkeit, Nahrung aufnehmen zu behalten. Dies, zusammen mit der Tatsache, dass C. elegans existieren als Zwitter, können sich auf mutierten Nachkommen ohne die Notwendigkeit für aufwendige Paarungsverhalten passieren. Diese Attribute, mit unserem jüngsten Fähigkeit, von den Würmern Rekord NMJs 2,3,7 machen dieses ein hervorragendes Modell Organismus, in dem genau wie unc Mutanten Auswirkungen Neurotransmission Adresse gekoppelt. Die Dissektion Methode besteht darin Immobilisierung erwachsenen Würmer mit einem Cyanoacrylsäure Leim, um einen Einschnitt in der Wurm Nagelhaut Freilegung der NMJs machen. Da C. elegans Erwachsene zahlen nur 1 mm in der Länge der Dissektion mit dem Einsatz von einem Binokular durchgeführt und erfordert gute Hand-Auge-Koordination. NMJ Aufnahmen werden durch whole-cell Spannungsbegrenzung einzelnen Körper Wand Muskelzellen und die Freisetzung von Neurotransmittern können evozierte mit einer Vielzahl von Stimulationsprotokolle einschließlich elektrischer Stimulation, Licht-aktivierte Kanal-Rhodopsin-vermittelte Depolarisation 4 und hyperosmotischen Kochsalzlösung, die alle sein wird gemacht werden kurz beschrieben.

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Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Die Anwendung der Elektrophysiologie, barrierefreie Synapsen eine quantifizierbare Messung der synaptischen Aktivität, nützlich bei der Analyse synaptischer Mutanten. Dieser Artikel beschreibt ein Dissektion Methode verwendet, um die motorischen Endplatten (NMJ) von expose<em&gt; Caenorhabditis elegans (C. elegans)</em&gt; Und beschreibt kurz einige der Anwendungen, auf die dieses Präparat angewendet werden können.

Dissecting und Aufnahme von C. elegans neuromuskulären Synapse

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

dissecting-and-recording-from-the-c-elegans-neuromuscular-junction

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

15.5K Aufrufe.  University of Illinois, Chicago. Die Anwendung der Elektrophysiologie, barrierefreie Synapsen eine quantifizierbare Messung der synaptischen Aktivität, nützlich bei der Analyse synaptischer Mutanten. Dieser Artikel beschreibt ein Dissektion Methode verwendet, um die motorischen Endplatten (NMJ) von expose Caenorhabditis elegans (C. elegans) Und beschreibt kurz einige der Anwendungen, auf die dieses Präparat angewendet werden können.

Serie: Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generierung von stabilen transgenen C. elegans mit Mikroinjektion

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Forschung

Biologie

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle synapses, we developed a larval tissue preparation that had features of live intact larvae, but also had good optical properties.  This new preparation also allowed for access of perfusates to the synapse.  We used fly larvae, immersed them in artificial hemolymph, and relaxed their normal rhythmic body contractions by chilling them. Next we dissected off the posterior segments of each animal and with a blunt insect pin pushed the mouth parts backward through the body cavity.  This everted the larval body wall, like turning a sock inside-out.  We completed the dissection with ultra-fine dissection scissors and thus exposed the visceral side of the body wall muscles. The glial structures at the NMJ expressed membrane targeted GFP under the control of glial specific promoters. The post-synaptic membrane, the SSR (Subsynaptic Reticula) in muscle expressed synaptically targeted dsRed. We needed to acutely label the motor neuron terminals, the third part of the synapse. To do this we applied primary antibodies to HRP, conjugated to a far-red emitting flurophore.  To test for dye diffusion properties into the perisynaptic space between the motor neuron terminals and the SSR, we applied a solution of large Dextran molecules conjugated to far-red emitting flurophore and collected images.

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

We described structural features of the Glia-neuromuscular synapses in a novel Inside-out tissue preparation of live fly larvae using fluorescent dyes with confocal microscopy. We labeled live neuron terminals with fluorescent primary antibodies to HRP, and also visualized the perisynaptic space with fluorescent Dextrans.

Visualisierung der Live- Drosophila Glial-neuromuskulären Synapse mit Fluoreszenzfarbstoffen

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

Die Produktion von C. elegans Transgene via Recombineering mit dem GalK Selektionsmarker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

High-Throughput-Screening und Biosensorik mit Fluorescent C. elegans Die Stämme

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Grundlegende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisation und Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, normal development or changes in environmental conditions2-5. Understanding the cellular signaling pathways that are involved in the response to hypoxia could provide new insight into treatment strategies for diverse human pathologies, from stroke to cancer. This goal has been impeded, at least in part, by technical difficulties associated with controlled hypoxic exposure in genetically amenable model organisms.
The nematode Caenorhabditis elegans is ideally suited as a model organism for the study of hypoxic response, as it is easy to culture and genetically manipulate. Moreover, it is possible to study cellular responses to specific hypoxic O2 concentrations without confounding effects since C. elegans obtain O2 (and other gasses) by diffusion, as opposed to a facilitated respiratory system6. Factors known to be involved in the response to hypoxia are conserved in C. elegans. The actual response to hypoxia depends on the specific concentration of O2 that is available. In C. elegans, exposure to moderate hypoxia elicits a transcriptional response mediated largely by hif-1, the highly-conserved hypoxia-inducible transcription factor6-9. C .elegans embryos require hif-1 to survive in 5,000-20,000 ppm O27,10. Hypoxia is a general term for "less than normal O2". Normoxia (normal O2) can also be difficult to define. We generally consider room air, which is 210,000 ppm O2 to be normoxia. However, it has been shown that C. elegans has a behavioral preference for O2 concentrations from 5-12% (50,000-120,000 ppm O2)11. In larvae and adults, hif-1 acts to prevent hypoxia-induced diapause in 5,000 ppm O212. However, hif-1 does not play a role in the response to lower concentrations of O2 (anoxia, operational definition &lt;10 ppm O2)13. In anoxia, C. elegans enters into a reversible state of suspended animation in which all microscopically observable activity ceases10. The fact that different physiological responses occur in different conditions highlights the importance of having experimental control over the hypoxic concentration of O2.
Here, we present a method for the construction and implementation of environmental chambers that produce reliable and reproducible hypoxic conditions with defined concentrations of O2. The continual flow method ensures rapid equilibration of the chamber and increases the stability of the system. Additionally, the transparency and accessibility of the chambers allow for direct visualization of animals being exposed to hypoxia. We further demonstrate an effective method of harvesting C. elegans samples rapidly after exposure to hypoxia, which is necessary to observe many of the rapidly-reversed changes that occur in hypoxia10,14. This method provides a basic foundation that can be easily modified for individual laboratory needs, including different model systems and a variety of gasses.

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

This paper details how to use continuous-flow hypoxia chambers to generate atmospheres with defined concentrations of O2 to understand biological responses to decreased O2. This system is easy to setup and maintain, and flexible enough to suit a wide range of O2 concentrations and model systems

Erstellen Definierte gasförmigen Umgebungen, um die Auswirkungen von Hypoxie auf Studieren<em&gt; C elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Chemotaxis-Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Ein Verfahren zur Kultivierung von embryonalen<em&gt; C. elegans</em&gt; Zellen

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Ein Anoxia-Hunger-Modell für Ischämie / Reperfusion in<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

Untersuchung der Verbreitung und Toxizität von Prion-ähnlichen Proteine ​​Mit dem Metazoan Modellorganismus<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...