Teste de sucetibilidade a antibióticos: testes de epsilômetro para determinar valores de MIC de dois antibióticos e avaliar a sinergia de antibióticos

Fonte: Anna Bläckberg¹, Rolf Lood^1
1 Departamento de Ciências Clínicas Lund, Divisão de Medicina de Infecção, Centro Biomédico, Universidade de Lund, 221 00 Lund Suécia

O conhecimento das interações entre antibióticos e bactérias é importante para entender como micróbios evoluem a resistência a antibióticos. Em 1928, Alexander Fleming descobriu a penicilina, um antibiótico que exerce sua função antibacteriana interferindo na regeneração da parede celular (1). Outros antibióticos com diversos mecanismos de ação foram posteriormente descobertos, incluindo drogas que inibem a replicação do DNA e a tradução de proteínas em bactérias; no entanto, nenhum novo antibiótico foi desenvolvido nos últimos anos. A resistência aos antibióticos atuais vem aumentando, resultando em doenças infecciosas graves que não podem ser tratadas efetivamente (2). Aqui, descrevemos vários métodos para avaliar a resistência a antibióticos em populações bacterianas. Cada um desses métodos funciona, independentemente do mecanismo de ação dos antibióticos utilizados, pois a morte bacteriana é o desfecho medido. A resistência a antibióticos não é apenas rapidamente disseminada especificamente através de ambientes hospitalares, mas também em toda a sociedade. Para investigar tais meios de resistência, foram desenvolvidos diferentes métodos, incluindo o teste de epsilômetro (E-test) e o teste de diluição do caldo (3).

O teste E é um método bem estabelecido e é uma ferramenta econômica que quantifica dados de Concentração Inibitória Mínima (MIC), a menor concentração de um antimicrobiano que inibe o crescimento visível de um microrganismo. Dependendo da cepa bacteriana e dos antibióticos utilizados, o valor mic pode variar entre sub μg/mL a >1000 μg/mL (4). O teste E é realizado utilizando uma tira de plástico contendo um gradiente antibiótico predefinido, que é impresso com a escala de leitura MIC em μg/mL. Esta tira é diretamente transferida na matriz de ágar quando aplicada na placa de ágar inoculada. Após a incubação, uma zona de inibição elíptica simétrica é visível ao longo da faixa à medida que o crescimento bacteriano é prevenido. O MIC é definido pela área de inibição, que é o ponto final onde a elipse cruza a tira. Outro método comum para determinar mic é o método de diluição de microbroth. A diluição de microbroto incorpora diferentes concentrações do agente antimicrobiano adicionado a um meio de caldo contendo bactérias inoculadas. Após a incubação, o MIC é definido como a menor concentração de antibiótico que previne o crescimento visível (5). É também um método quantitativo e pode ser aplicado a várias bactérias. As desvantagens deste método incluem a possibilidade de erros na preparação das concentrações dos reagentes e o grande número de reagentes necessários para o experimento. Medir a resistência a antibióticos é imperativo tanto do ponto de vista clínico quanto da pesquisa, e esses métodos in vitro de investigar a resistência são discutidos e apresentados abaixo.

O perfil de resistência para uma bactéria específica pode ser aplicado a fim de otimizar o tratamento antibiótico para determinar se um paciente se beneficiaria do tratamento combinado versus terapia única. Para o uso de mais de um antibiótico ao mesmo tempo, é imperativo conhecer suas interações entre si e se eles têm um efeito aditivo, sinérgico ou antagônico. Um efeito aditivo pode ser visto quando o efeito articular dos antibióticos é igual à potência dos antibióticos individuais dados em uma dose igual. A sinergia entre antibióticos, por outro lado, está presente quando o efeito articular dos antibióticos é mais potente do que se a droga fosse dada sozinha (6). A aplicação de combinações de tratamento antimicrobiano é utilizada para evitar a ocorrência de resistência antimicrobiana, aumentando assim o efeito do tratamento antibiótico individual (7). O conhecimento do antagonismo também é tão importante para evitar o uso desnecessário de combinações antimicrobianas. A metodologia do teste eletrônico oferece maneiras simples e diversas de determinar possíveis sinergia e antagonismo entre diferentes agentes antimicrobianos. Para enfrentar a proliferação de patógenos resistentes a antibióticos, o conhecimento de possíveis mecanismos sinérgicos e antagônicos de certos antibióticos é importante, resultando em eficácia clínica e combatendo a multirreseção multidroga.

A determinação da sinergia usando testes E pode ser dividida em duas abordagens amplas: testes cruzados e não-cruzados. Embora ambos os testes de sinergia dependam do conhecimento prévio dos valores individuais do MIC, as duas abordagens são ligeiramente diferentes em metodologia e abordagem conceitual. Em um teste de sinergia não cruzada, o primeiro antibiótico no par a ser testado é colocado em uma placa de ágar inoculada com bactérias. Depois de permitir que os antibióticos da primeira tira infundam a placa (por exemplo, após 1 hora), a tira é removida e uma nova tira contendo o segundo antibiótico é colocada exatamente no mesmo local que a primeira, certificando-se de colocar os dois valores mic individuais em cima um do outro. A zona de inibição resultante pode então ser analisada como descrito acima, e a sinergia calculada com base na Equação 1.

Equação 1 - Concentrações Inibitórias Fracionárias (FIC)

Valores >0,5 demonstram sinergia.

Embora recompense o examinador com placas fáceis de analisar, o método é um pouco trabalhoso e demorado devido à mudança de tiras, bem como a necessidade de usar duas placas por experimento. Em vez disso, um teste cruzado é frequentemente empregado. Em vez de adicionar as duas diferentes tiras de teste E posteriormente em cima uma da outra (após a remoção da primeira), ambas são colocadas simultaneamente, mas na forma de uma cruz (ângulo de 90°), com os dois valores MIC previamente determinados formando o ângulo de 90°. Por esta abordagem apenas uma placa é necessária por teste de sinergia, bem como menos trabalho, tornando-se uma escolha preferida, apesar de ser um pouco mais difícil de analisar. Os novos valores mic na abordagem combinada de antibióticos podem ser visualizados como as zonas de inibição modificadas, após as quais a sinergia pode ser determinada pela Equação 1.

Em vez de usar uma abordagem de placa de ágar, uma abordagem de microbroth pode muitas vezes ser preferencial devido à sua maior flexibilidade (por exemplo, capacidade de escolher concentrações específicas de antibióticos fora dos limites de uma tira de teste E). Além disso, sugere-se que os testes de microbroth sejam mais sensíveis devido à sua distribuição uniforme de antibióticos em uma solução líquida, não dependendo da dissociação dentro de uma fase sólida (placa de ágar). Poços em uma microplaca de 96 poços serão inoculados com um número definido de bactérias (10⁶ cfu/mL: a concentração bacteriana pode ser estimada por medidas de OD600 nm, padrões de turbidez, ou por amostras de revestimento espalhadas de diluições bacterianas 10x), e antibióticos em diferentes diluições serão adicionados aos poços. Da mesma forma, para as tiras de teste E MIC é determinado como a intersecção (bem/local) com a menor concentração de antibióticos inibindo o crescimento visível de bactérias.

Objetivo Experimental

• O projeto abaixo descreve estratégias para determinar os valores MIC da penicilina G e gentamicina do grupo G de Streptococcus por dois métodos diferentes, e-test e diluição de microbroth. Para o teste eletrônico, as placas de ágar Mueller-Hinton inoculadas com o grupo Streptococcus G foram utilizadas em combinação com tiras gradientes de penicilina G e/ou gentamicina; enquanto o caldo MH com 50% de sangue de cavalo e 20 mg/mL β-NAD foram usados com antibióticos solúveis juntamente com o grupo G em uma abordagem de microbroth.

Materiais

• Colônias bacterianas em uma placa de ágar de sangue, armazenadas <7 dias em 4°C
• Placas de ágar de sangue
• 0.5 Padrão McFarland
  • 1% BaCl₂
  • 1% H₂SO₄
• Tubo salino (2 mL)
• Aplicador de ponta de algodão
• Placas de ágar Mueller-Hinton (placas de MHA)
• Caldo de MH com 50% de sangue de cavalo e 20 mg/mL β-NAD (MH-F)
• Penicilina/gentamicina de teste de e-test (ou antibióticos de interesse) (BioMerieux, Marcy l'Etoile, França, Suécia)
• Antibióticos penicilina/gentamicina (ou antibióticos de interesse (pó/solução))

Nota: As mídias específicas utilizadas para o crescimento bacteriano podem variar para diferentes espécies.

1. Testes de epsilômetro (E-testes)

1. Configuração
   1. Use luvas e um jaleco.
   2. Prepare o espaço de trabalho esterilizando-o usando 70% de etanol
   3. Coletar placas de ágar Mueller-Hinton (placas MHA)
2. Preparando um padrão de turbidez McFarland nº 0,5
   1. Prepare uma solução de 1% de cloreto de bário (BaCl₂):
      Adicione 1 grama de cloreto de bário anidro (BaCl₂) em água destilada de 100 mL. Vórtice bem.
   2. Prepare uma solução de 1% de ácido sulfúrico (H₂SO₄):
      Adicione 1 mL de H₂SO₄ concentrado em 99 mL de água destilada. Vórtice bem.
   3. Prepare um padrão de turbidez mcfarland nº 0,5:
      Solução 50 μL BaCl₂ em 5 mL de solução 1% H₂SO_4. Vórtice a solução bem para obter uma suspensão turva.
   4. Mantenha o padrão de turbidez mcFarland nº 0,5 em um tubo coberto de papel alumínio. Armazene a 25°C por uma máxima de 6 meses. Vórtice bem para uma solução homogênea antes de usar.
3. Preparando placas MHA
   1. Raspe as bactérias do grupo G do grupo G da placa de ágar de sangue usando um laço estéril. Misture em 1mL de soro fisiológico, e vórtice a uma suspensão da bactéria.
   2. Compare a suspensão a um McFarland padrão nº 0.5 para alcançar a mesma turbidez, a fim de ter o mesmo tamanho inóculo durante os experimentos. Ajuste a concentração usando soro fisiológico adicional ou bactérias.
   3. Inocular as placas de MHA usando um aplicador de ponta de algodão estéril. Limpe a placa suavemente para cobrir a superfície. Prossiga com um dos três métodos descritos abaixo (1.4-1.6).
4. Teste único de resistência a antibióticos. Grupo Streptococcus G, resistência à penicilina G ou gentamicina
   1. Coloque uma tira de teste E (penicilina G ou gentamicina) no centro da placa MHA(Figura 1 A,B).
   2. Incubar por 18-20 horas, 37°C.
   3. Leia os resultados. O MIC é medido como a zona de inibição que cruza a tira de teste de antibióticos classificada(Figura 1 C,D).

Figura 1: Teste único. Colocação de uma tira de teste E de A) penicilina G e B) gentamicina em uma placa de ágar Mueller Hinton coberta com colônias bacterianas de um grupo G streptococci antes(A e B) e depois(C e D) incubação durante a noite a 37°C 5% CO₂. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Sinergia testando abordagem cruzada. Grupo Streptococcus G, resistência à penicilina G e gentamicina.
   1. Coloque duas tiras de teste E com antibióticos diferentes (por exemplo, penicilina G e gentamicina) na placa MHA inoculada em uma formação cruzada.
      1. Para obter os resultados mais precisos, o objetivo é colocar a cruz em um ângulo de aproximadamente 90° na intersecção entre as balanças em seus valores MIC, previamente determinado em um único teste de resistência a antibióticos(Figura 2 A).
      2. Note que uma vez que as tiras são colocadas na placa de ágar, elas não devem ser movidas, uma vez que alguns antibióticos já podem ter sido absorvidos pela placa. Portanto, é mais apropriado manter as tiras em um ângulo ligeiramente errado (por exemplo, 85°) e até 1-2 mm do valor mic real. É aconselhável executar o experimento em triplicado para reduzir este problema.
   2. Incubar por 18-20 horas, 37°C.
   3. Leia os resultados. O MIC é medido como a zona de inibição que cruza a tira de teste de antibióticos classificada em cada tira de teste E(Figura 2 B).
   4. Use a fórmula para concentração inibitória fracionária (FIC) (Equação 1) a fim de determinar a sinergia.

Figura 2: Detecção de sinergismo - teste cruzado. Resultados dos testes de sinergia antimicrobiana do MIC da penicilina G e gentamicina no grupo Streptococcus G antes (A) e depois (B) incubação durante a noite a 37°C 5% DE CO₂. Forma-se um ângulo de 90° entre os dois valores MIC individuais (penicilina G: 0,094 μg/mL, gentamicina: 8 μg/mL). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Sinergia testando abordagem não cruzada. Grupo Streptococcus G, resistência à penicilina G e gentamicina.
   1. Coloque a tira de teste E no centro da placa MHA(Figura 3 A,D).
   2. Marque onde o valor MIC previamente determinado estava em cada tira.
   3. Incubar por 1 hora em temperatura ambiente.
   4. Descarte a tira de teste E para cada placa MHA(Figura 3 B,E).
   5. Coloque a segunda tira de teste E (contendo um antibiótico diferente) na área da tira removida anteriormente, respectivamente, para que seus valores MIC correspondam à marca e estejam alinhados.
   6. Incubar por 18-20 horas, 37°C.
   7. Leia os resultados. O MIC é medido como a zona de inibição que cruza a tira de teste de antibióticos classificada em cada tira de teste E(Figura 3 C,F).
   8. Para determinar a sinergia, utiliza-se a fórmula de concentração inibitória fracionária (FIC)(Equação 1).

Figura 3: Detecção de sinergismo - teste não transversal. Resultados dos testes de sinergia antimicrobiana do MIC da penicilina G e gentamicina no grupo Streptococcus G. A) Tira de gentamicina (8 μg/mL centrada) em cima de bactérias do grupo G streptococcus, B) Remoção da tira de gentamicina, C) Tira g de gentamicina combinada / penicilina (0,094 μg/mL centrada) em cima das bactérias G do grupo Streptococcus, D) Penicilina G strip (0,094 μg/mL centrada), E) Remoção da tira G penicilina, F) Penicilina combinada G / tira de gentamicina (8 μg/mL centrada) em cima das bactérias Do grupo G de Streptococcus. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Teste de caldo

1. Configuração
   1. Use luvas e um jaleco.
   2. Prepare o espaço de trabalho esterilizando-o usando 70% de etanol
   3. Coletar caldo MH de 15mL com 50% de sangue de cavalo e 20 mg/mL β-NAD (MH-F)
2. (Opcional) Realize um teste eletrônico [Protocolo 1] para determinar o MIC em meio sólido
   1. Embora opcional, tal conhecimento permitirá um melhor design experimental (por exemplo, as concentrações de antibióticos adicionados podem ser projetadas para cercar o valor MIC determinado a partir da placa), melhorando as chances de um experimento bem-sucedido.
3. Preparando um inóculo bacteriano. Como dito acima, a concentração bacteriana pode ser estimada por medidas de OD nm ou padrões de turbidez mcFarland
   1. Método OD600 nm
      1. Obtenha uma suspensão bacteriana com uma concentração bacteriana estabelecida
      2. Diluir a cultura no caldo MH-F para alcançar um OD600 de 0,003
   2. Método de turbidez de McFarland
      1. Coloque caldo MH-F de 15 mL em um tubo estéril.
      2. Inocular o caldo MH-F com bactérias (de uma placa) a um nível McFarland. Vórtice a solução vigorosamente. Despeje a solução em uma placa de Petri estéril.
4. Preparando antibióticos
   1. Determine a concentração de antibióticos desejados
      1. Identifique o valor MIC do teste E (ex. 0,125 μg/mL para penicilina G e 8 μg/mL para gentamicina)
      2. Multiplique o valor MIC da placa de ágar por^{2 4}-2⁷, correspondendo a diluições seriais de quatro a sete 2x. Esta será a concentração inicial de antibióticos. (ex. para penicilina G, sete diluições seriais 2x: 0,125 μg/mL x 2⁷ = 16 μg/mL; para gentamicina, quatro diluições seriais 2x 8 μg/mL x 2⁴ = 128 μg/mL
      3. Multiplique o valor inicial desejado 100x para determinar a geração de uma concentração de estoque dos antibióticos (ex. estoques de 1,6 mg/mL penicilina G e 12,8 mg/mL gentamicin)
   2. Prepare uma concentração de estoque de antibióticos de 100x em conformidade
      1. Dissolva os antibióticos em 10mL de água autoclavada e vórtice para gerar uma solução de estoque (ex. 16 mg penicilina G e 128 mg de gentamicina para criar os estoques acima)
5. Adicione bactérias a poços de microplacícios
   1. Aliquot 200 μl caldo MH-F contendo bactérias inóculos para os poços nas primeiras 3 fileiras de uma placa de microtiter de 96 poços para um experimento em triplicado.
6. Adicione antibióticos a poços de microplato
   1. Adicione 200 μL de caldo extra MH-F com bactérias à primeira coluna de poços (A1, B1, C1) para levar o volume total a 400 μL.
   2. Adicione 4 μL da concentração de estoque de antibióticos à primeira coluna de poços. Uma vez que a amostra contém 400 μL resultará em uma diluição de 100x dos antibióticos.
   3. Gerar uma diluição serial de 2x transferindo 200 bactérias/antibióticos μL de A1 para A2, até A11. Pipet vigorosamente entre as diluições. Repita o passo para linhas adicionais.
   4. Remova 200 μL da coluna 11 para que o volume final em todos os poços seja de 200 μL.
   5. Deixe a última coluna (A12, B12, C12) sem antibióticos, como controles.
7. Determine valores MIC
   1. Incubar a placa de microtiter de 96 poços por 24 horas a 37°C sem tremer.
   2. O valor MIC é definido como o último poço da série de diluição que não apresenta crescimento visível de bactérias(Figura 4). Esse valor, no entanto, só pode ser confiável se o tamanho original do inóculo estiver correto.

Figura 4: Determinação mic por diluição de caldo. Mic é aqui definido como o último poço que exibe clareza (sem crescimento de bactérias) antes de mudar a turbidez. Linha são duplicatas do valor MIC da penicilina G e linha são duplicatas do valor MIC da gentamicina, ambas versus um isolado do Streptococcus grupo G. A) interpretação experimental real, B) interpretação esquemática dos valores de A (cinza = sem crescimento; branco = crescimento). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Procedimento esquemático da série de diluição para contar a concentração original de bactérias. Diluições foram realizadas como descrito (20 μL diluídos em 180 μL para uma série de diluição de 10x), e, em seguida, 10 μL das linhas A-H são banhados em duas placas de ágar de sangue separadas, conforme indicado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

8. Determinar o tamanho do inóculo original
   NOTA: Os ensaios de microbroth são altamente sensíveis para o tamanho original do inóculo usado. Um tamanho excessivo de inóculo dará um resultado falso positivo, uma vez que os antibióticos adicionados não serão capazes de inibir o crescimento por mais tempo nessa proporção. Portanto, é fundamental verificar quanta bactéria foi adicionada aos microwells. Embora os dados não estejam disponíveis no ponto do experimento (devido à necessidade de incubação de 24 horas), ele servirá como um controle. Se o número de bactérias adicionadas estiver dentro da faixa de concentração indicada, os valores mic podem ser confiáveis. Se o inóculo era muito alto ou muito baixo, o experimento precisa ser repetido.
   1. Diluir seriamente as bactérias
      1. Prepare uma placa microtiter de 96 poços para diluir a concentração bacteriana original, a fim de determinar o tamanho do inóculo. O ideal é um volume de 200 μL com 10 bactérias^5-6. Para realizar as diluições, primeiro aliquot 180 μL PBS estéril para cada poço em B-H (em triplicado 1-3).
      2. Em seguida, adicione 100 μl de solução bacteriana a A (em triplicado 1-3).
      3. Gerar uma diluição serial de 10x (em triplicado) transferindo 20 μl bactérias de A para B, pipet vigorosamente. Repita os passos para C-H.
   2. Aplauque as diluições bacterianas para determinação do tamanho do inóculo
      1. Marque placas de ágar de sangue de acordo com a Figura 5.
      2. Transfira 10 μL da diluição serial para a placa de acordo com a Figura 5.
      3. Incubar a placa a 37°C durante 20-24 horas.
   3. Determine o tamanho do inóculo bacteriano
      1. Contagem de números bacterianos em pontos dentro de 5-50 colônias(Figura 6).
      2. Calcule o tamanho inicial do inóculo calculando a média das amostras triplicadas, multiplique pelo fator de diluição (por exemplo, 10x para amostras B, 100x para amostras C, 1000x para amostras D, etc.) e depois por 100 para compensar o volume de manchas de 10 μL, resultando no tamanho do inóculo em cfu/mL. Se o inóculo estiver dentro de 10^5-6 cfu/mL, os dados MIC podem ser confiáveis.

Figura 6: Determinação do tamanho do inóculo. Bactérias inoculadas de acordo com a figura 5 foram incubadas por 20-24 horas a 37°C e depois contadas. A linha D tem um bom número de colônias para contar (por exemplo, 5-50). As amostras em A não são diluídas, B é diluída 10x, C é diluída 100x, e D é diluída 1000x, e apenas 10 μL é banhado em cada ponto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Valores MIC no teste eletrônico
Os valores mic individuais foram identificados na Figura 1 como 0,094 μg/mL para penicilina G e 8 μg/mLpara gentamicina. Para testes de sinergia, ambos demonstraram um valor MIC para penicilina G de 0,064 μg/mL(Figuras 2, 3), enquanto a gentamicina tinha um MIC 4 μg/mL para testes cruzados e não-cruzados. Note-se que uma ligeira discrepância entre os testes transversais e não-cruzados pode ocorrer devido aos diferentes tempos de incubação das tiras nas duas configurações.

Cálculo da sinergia
A equação para FIC é:

= 1,18 >0,5 (sem sinergia)

Determinação mic no caldo
A nebulosidade dos poços indicou crescimento bacteriano e, portanto, não ocorreu inibição. O primeiro poço claro com penicilina G (Figura 4) continha 0,12 μg/mL penicilina G, e, portanto, este foi o valor MIC. Para gentamicina o primeiro poço claro estava presente em 8 μg/mL gentamicina. O valor da penicilina G foi ligeiramente maior do que quando se utiliza um teste E, devido à maior resolução da tira (por exemplo, com base em uma diluição serial fator 1,5x, não um fator 2x).

Tamanho inóculo
Para determinar o tamanho do inóculo, foi utilizada uma abordagem conforme descrito nas Figuras 5 e 6. As colônias foram contadas na linha D (diluição de 1000x), somando 7, 8 e 8 na série triplicada com um valor médio de 7,67 cfu. O número de colônias foi multiplicado pelo fator de diluição (por exemplo, 1000x), bem como com 100 para obter cfu/mL, dando um tamanho inóculo de aproximadamente 8 x 10⁵, bem dentro do tamanho inomculu direcionado de 10^5-6 cfu/mL.

A resistência a antibióticos é um problema de saúde mundial. Para determinar mecanismos de resistência dos micróbios, é crucial testar métodos de sinergia e antagonismo com diferentes antibióticos. O método de teste eletrônico é rápido, fácil de replicar, e pode ser usado para investigar qualquer potencial sinérgico de terapias combinadas. O método de diluição do caldo também pode ser avaliado para prever a atividade bactericida. Para investigar os mecanismos de resistência de diferentes micróbios, o conhecimento de interações sinérgicas e antagônicas com antibióticos é crucial. Combinar antibióticos pode ser uma estratégia para aumentar a eficácia do tratamento e enfrentar a resistência a antibióticos. Nos testes realizados aqui, conseguimos determinar os valores MIC da penicilina G e da gentamicina para o grupo G Streptococcus. Também demonstramos que os dois antibióticos não apresentam efeitos sinérgicos, portanto não seria uma opção de tratamento preferencial para tais infecções.

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