抗体生成:ハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体の産生

ソース: フランシス V. シャアスタッド^1,2, ホイットニー・スワンソン^2,3,トーマス・S・グリフィス^1,2,3,4
1ミネソタ大学、ミネアポリス、MN 55455
²ミネソタ大学免疫学センター,ミネアポリス,MN 55455
³ミネソタ大学泌尿器科,ミネアポリス,MN 55455
⁴ミネソタ大学、ミネアポリス、MN 55455

ポリクローナル抗体は、抗原または複数の抗原の異なる抗原決定基に対して向けられた抗体のコレクションとして定義される(1)。ポリクローナル抗体は生体分子を同定するための強力なツールですが、1つの重要な制限があります - 抗原決定基を共有する抗原を区別することができません。例えば、ウシ血清アルブミンを使用して動物を免疫する場合、異なる表面Igを持つB細胞は、ウシ血清アルブミン上の異なる抗原決定要因に応答する。その結果、抗血清中の抗体の混合物が得られます。ウシ血清アルブミンは、タンパク質の進化的に保存された領域でヒト血清アルブミンといくつかのエピトープを共有するので、この抗ウシ血清アルブミン抗血清もヒト血清アルブミンと反応します。したがって、この抗血清は、ウシとヒト血清アルブミンを区別するのに有用ではないであろう。

ポリクローナル抗セラの特異性の問題を克服するためにいくつかのアプローチが取られています。1つは、固定化抗原のクロマトグラフィーカラムを通して抗血清を通過させることによって不要な抗体を吸収することである(2)。この方法は退屈であり、しばしば不要な抗体を完全に除去することができません。別のアプローチは、個々の抗体産生B細胞を単離し、培養中にそれらを拡大することです。しかし、ほとんどの正常な未形質細胞と同様に、B細胞は長期培養では生存しない。

培養中に生き残るB細胞の不能を克服するために、1つのアプローチは骨髄腫-B細胞ハイブリドーマを調製することである。1847年、ヘンリー・ベンス・ジョーンズは、リンパ球腫瘍である多発性骨髄腫患者が大量の抗体を産生することを発見しました(3)。これらの患者のB細胞は悪性になり、制御不能に成長している。悪性B細胞は単一のクローンに由来するので、それらは同一であり、単一のタイプの抗体(すなわち、モノクローナル抗体、またはmAb)のみを産生する。しかし、これらの骨髄腫細胞のほとんどは、未知の特異性の抗体を産生する。1975年、骨髄腫細胞をB細胞に融合することにより、セザール・ミルシュタインとジョージ・コーラーは、インビトロで無期限に培養し、既知の抗原特異性のモノクローナル抗体を無制限に産生できるハイブリドーマの産生に成功しました(4)。彼らのアプローチの背後にある根拠は、骨髄腫細胞の不滅の特性とB細胞の産生特性を組み合わせることである。彼らの技術は抗体産生に革命を起こさせ、モノクローナル抗体を用いた生体分子の同定と精製のための強力な手段を提供する。

一般に、モノクローナル抗体を調製するには数ヶ月を要する。一般的な手順には、次の手順が含まれます。

1. 抗体電化剤の免疫とスクリーニング
2. 抗体産生B細胞と骨髄腫細胞の融合
3. ハイブリドーマの選択的増殖
4. 所望のモノクローナル抗体を産生するためのハイブリドーマのスクリーニング
5. 希釈を制限することによりクローニング - 細胞が統計的に1未満の細胞を96ウェルプレートのウェルに追加することを可能にするために濃度に希釈されるプロセス。いくつかの井戸は0セルで終わり、いくつかは1セルを持つことになります。1細胞で播種された井戸は、最終的に細胞のモノクローナル集団に成長します。
6. ハイブリドーマの増殖とモノクローナル抗体の調製

このプロトコルは、ハイブリドーマの成長およびモノクローナル抗体の調製の最後のステップに焦点を当てています。抗体は、硫酸アンモニウム沈殿(しばしば塩漬けと呼ばれる)によって培養上清から精製される- 溶液からタンパク質を除去する一般的に使用される方法である。溶液中のタンパク質は、水素結合を形成し、他の親水性相互作用と共に、露出した極性およびイオン基を通る水と共に形成する。小さく、高荷電性の高いイオン(アンモニウムや硫酸塩など)を添加すると、これらの基は、水に結合するためのタンパク質と競合します。これは、タンパク質から水分子を除去し、その溶解性を減少させ、タンパク質の沈殿をもたらす。

注:無菌細胞培養技術は、抗体精製工程まで(例えば、バイオセーフティキャビネット内)無菌方法でハイブリドーマ細胞および培方を取り扱う場合に維持されるべきである。

1. 凍結ハイブリドーマ細胞の解凍

1. 凍結したハイブリドーマ細胞を含むバイアルを37°Cの水浴で解凍するまでインキュベートします(約2分)。
2. 完全なRPMIの10 mLを含む15 mL円錐管に解凍細胞を加える(RPMIは10%の胎児牛血清、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン、1M mMピルビン酸ナトリウム、1x非必須アミノ酸、50μM 2-Mercapeを補充した)。
3. 1200 RPMで5分間遠心分離機を使用して、汚染された凍結媒体を洗い流します。
4. 遠心分離後、液体上清を廃棄し、5mLフレッシュコンプリートRPMIで細胞ペレットを再懸濁する。次いで、15mL完全RPMIを含むT75組織培養フラスコに細胞を添加する(RPMIの最終体積は20mLである)。
5. 5%CO₂で37°Cで標準的なインキュベーターで細胞を成長させます。培養中の細胞は非付着性である。

2. ハイブリドーマ拡張

1. フラスコが~80%コンフルエントになるまで、約3日間細胞を膨張させます。
   注:この時間は、細胞の開始数と、異なる細胞の増殖速度の固有の違いに基づいて異なる場合があります。細胞が指数関数的な成長段階にあることは重要です。
2. 最初のフラスコが約80%の合流に達したら、この最初のT75フラスコから細胞を取り出し、円錐遠心管に入れ、細胞をペレットにスピン(5分間1200 RPM)する。
3. 完全なRPMIの6 mLで細胞を再懸濁し、次いで3つの新しいT75フラスコ(18 mL RPMIを含む2 mL/フラスコ)に細胞懸濁液を分配する。これら3つのT75フラスコを37°Cで37°Cでインキュベートし、5%CO₂で約80%のコンフルエントになるまでインキュベートします(これは約3日かかります)。

3. 無血液中の抗体産生

注:この時点で、細胞は、ハイブリドーマ細胞株の増殖のために設計された無血清培地で成長を継続する準備ができています。このプロトコルでは、HB101サプリメント製品を含む市販のHB Basal液体媒体を使用しています。

1. 3つのT75フラスコ(約80%合流)のそれぞれからの細胞を収集し、遠心分離(5分間1200 RPM)を行います。
2. 各T75フラスコからの細胞ペレットを10mL補充HB101無血清培地に再懸濁し、次いでHB101無血清を補充した2つのT225フラスコに添加した(すなわち、各フラスコに~220-240 mL HB101を含む6つのフラスコのそれぞれに5mL細胞懸濁液)。
3. T225フラスコおよびHB101培養中の細胞を37°Cで37°Cで5%CO2で3週間、または細胞が死に始めるまで増殖し続ける。細胞は、これらの3週間の間にmAbを産生し、培養培地に分泌している。細胞が死に始めると、彼らはもはやmAbを産生していません。

4. 抗体精製 - 1日目

注:この時点で、無菌性を維持する必要はないので、無菌的な方法でメディアを取り扱う(例えば、バイオセーフティキャビネット内)必要はない。さらに、ハイブリドーマは「BSL2レベル」の薬剤とは見なされない。

1. フラスコから固定角度ローター用のチューブにメディアを注ぎます。10,000 RPMで固定角度ローターで遠心分離機でチューブを8分間回転させます。このステップは、培養上清から細胞破片を除去するように設計されている。
   注:チューブのサイズは、使用するローターによって異なります。覚えておくべき重要なことは、遠心分離の前にローターが適切にバランスをとっていることを確認するために、チューブ内で同じボリュームを持つことです。メディアのボリューム全体が一度に遠心分離機に収まらない可能性があります。残りのメディアは、後で同じチューブを使用して遠心分離されます(ステップ4.5)。
2. 氷に囲まれたバケツに攪拌バー付きの2Lプラスチックビーカーを準備します。かき混ぜるプレートの上に置きます。
3. 1Lボトルに500mLフィルタートップを取り付けます。適切なチューブを介して真空にボトルトップフィルターユニットを取り付けます。
4. ステップ4.1(まだハイブリドーマ細胞によって産生されるmAbを含む)から上清をフィルタートップに注ぎます。
5. メディアからセルデブリをペレットするために同じチューブセットを使用し続けます(ペレットは構築し続けます)。フィルタートップがいっぱいになり、上清の別のバッチが注ぐ準備ができるまで、真空を実行するのを待ちます。フィルターを乾かしたり、フィルタリングが非常に遅くなることをしないでください。
6. 1Lボトルが満杯に近づいたら、フィルタートップを取り外し、ステップ4.2で調製した2Lビーカーに上清を注ぎます。フィルタトップを再接続します。ボリュームを追跡します。
7. すべてのメディアが処理されるまで、遠心分離とろ過の手順を繰り返します。
8. 濾過された上清を1L当たり硫酸アンモニウム295gを測定する。攪拌しながら、次の数時間(15分ごとに〜25g)にわたって上清に硫酸アンモニウムをゆっくりと加え、望ましくないタンパク質を沈殿させる可能性のある高濃度の硫酸アンモニウム塩を防ぎます。
9. 硫酸アンモニウムをすべて加えたら、ビーカーをホイルで覆い、攪拌プレートで4°C(例えば、ウォークイン冷蔵庫または冷蔵庫)に移動します。一晩かき混ぜる。溶液の一定の撹拌は、塩を可溶化するために必要であるが、長時間の撹拌は、表面/空気界面で溶液中のタンパク質の変性につながることができます。
10. 固定角度ローターを使用してチューブを洗浄します。

5. 抗体精製 - 2日目

1. 2Lビーカーから上清を含む硫酸アンモニウムをチューブに注ぎ、固定角度ローターを使用します。ブレーキなしで20分間6500 RPMの固定角度ローターで遠心分離機で回転します。
2. 真空は上清を吸引し、ペレットが柔らかくなるように吸い上げないように注意してください。同じチューブセットを使用して、上清を含む硫酸アンモニウムからペレットを収集し続けます。
3. 最後の吸引の後、各ペレット(抗体を含む)を~1 mlのPBSで再中断する。
4. 大量のPBSに対する透析により、沈殿したmAb溶液から硫酸アンモニウムを除去する。これを行うには、まずmAb溶液の各mLについて約1インチの透析チューブ(例えば、Membra-Cel MD25-14 MWCO 12,000-14,000ダルトンカットオフセルロース透析チューブ)を切断します。dH₂O. チューブの一方の端に結び目を結び、dH₂O で塗りつぶして、ノットが漏れていないことを確認します。チューブから空_のdH2O。
5. チューブにピペットPBS/抗体溶液。チューブを追加の0.25 ml PBSですすいで、チューブに移します。
6. オレンジ色の透析クリップで、チューブの上部を可能な限り溶液の近くに固定します。
7. チューブの上部を4Lビーカーの外側の上部にテープで留めします。チューブの充填部分をビーカーに掛けます。ビーカーにPBSを充填し、攪拌バーを追加します。
8. 4°Cで約8時間かき混ぜる。
9. ビーカー内のPBSを新鮮なPBSに交換し、さらに2回約8時間かき混ぜます。
10. 抗体をチューブから15mlまたは50mlの円錐管に移します。1200 RPMで5分間遠心分離機を形成した可能性のある沈殿物を除去する。上清を新鮮なチューブに移します。
11. 抗体1:20のアリコートをPBS(5 μl抗体+95 μl PBS)で希釈する。280 nmで分光光度計(PBSでブランク)で抗体濃度を定量します。消滅係数 (ε) 1.43 を使用します。濃度は次のように計算されます。
    
    
12. 抗体をスクリューキャップバイアルにアリコートし、-80°Cで保存します。

このプロトコルを使用して、いくつかの異なるハイブリドーマを持つ以下の結果を得ました。

ハイブリドーマ: RB6-BC5 (ラット抗マウス Ly6C/Ly6G (Gr1) IgG2b, κ mAb)
OD_280- 1.103
(1.103/1.43)(20) = 15.42 mg/mL

ハイブリドーマ: GK1.5 (ラット抗マウス CD4 IgG2b, κ mAb)
OD₂₈₀ - 0.485
(0.485/1.43)(20) = 6.78 mg/mL

ハイブリドーマ:2.43(ラットアンチマウスCD8 IgG2b、κ mAb)
OD₂₈₀ - 0.209
(0.209/1.43)(20) = 2.92 mg/mL

これらはすべて結果の例であり、同じハイブリドーマを持つ各生産実行は、最後に利用可能なmAbの量がわずかに異なる可能性があることを注意することが重要です。

上記の手順は、ハイブリドーマ培養上清からモノクローナル抗体を精製するための簡単で簡単な方法です。しかし、硫酸アンモニウムは、培養上清にある可能性のある他のタンパク質を沈殿させることを覚えておくことが重要です。その結果、吸光度測定から決定される抗体濃度が推定される。ユーザーは、SDS-ポリアクリルアミドゲル上で少量を実行することによって透析サンプルの純度を評価することを望むことができる。ハイブリドーマによって産生されるmAbは、この方法論を用いて一度精製され、様々な方法で使用することができる。上記のRB6-BC5、GK1.5、および2.43 mAbは、マウスにおいて、それぞれ好中球、CD4T細胞、およびCD8 T細胞の生体内枯渇に使用される。このプロトコルを使用して製造および精製された他のmAbは、フローサイトメトリー(蛍石に結合した場合、または二次Abと組み合わせて使用する場合)、ELISA、またはウェスタンブロッティングに使用することができる。

1. Lipman NS, Jackson LR, Trudel LJ, Weis-Garcia F. Monoclonal versus polyclonal antibodies: distinguishing characteristics, applications, and information resources. ILAR Journal, 46 (3), 258-268 (2005).
2. Arora S, Ayyar BV, O'Kennedy R. Affinity chromatography for antibody purification Methods Mol Biol. 1129, 497-516 (2014).
3. Henry BJ. On a new substance occurring in the urine of a patient with mollities ossium. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 138, 55-62 (1848).
4. Köhler G and Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity". Nature. 256, 495-497 (1975).