יצירת נוגדנים: ייצור נוגדנים חד שבטיים באמצעות היברידיות

Overview

מקור: פרנסס נגד סג'אאסטד^1,2,ויטני סוונסון^2,3ותומאס ס. גריפית'^1,2,3,4
¹ מיקרוביולוגיה, אימונולוגיה, ותוכנית לתואר שני בביולוגיה של הסרטן, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
² המרכז לאימונולוגיה, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
³ המחלקה לאורולוגיה, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
⁴ מרכז הסרטן הבונים החופשיים, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455

נוגדנים פוליקלונליים מוגדרים כאוסף של נוגדנים המכוונים נגד דטרמיננטים אנטיגניים שונים של אנטיגן או מספר אנטיגנים (1). בעוד נוגדנים פוליקלונליים הם כלים רבי עוצמה לזיהוי מולקולות ביולוגיות, יש מגבלה חשובה אחת - הם אינם מסוגלים להבחין בין אנטיגנים החולקים דטרמיננטים אנטיגניים. לדוגמה, כאשר אלבומין סרום בקר משמש לחיסון בעל חיים, תאי B עם משטח שונה Ig יגגיב דטרמיננטים אנטיגניים שונים על אלבומין סרום בקר. התוצאה היא תערובת של נוגדנים באנטיריום. מכיוון שארבומין בסרום בקר חולק כמה אפיטופים עם אלבומין בסרום אנושי באזורים השמורים אבולוציונית של החלבון, זה סרום אנטי-בקר אלבומין אנטי-וירוס יגיב גם עם אלבומין סרום אנושי. לכן, תרופה זו לא תהיה שימושית להבחנה בין אלבומינים של בקר וסרום אנושי.

מספר גישות ננקטו כדי להתגבר על בעיית הספציפיות של אנטי-זירה פוליקלונלית. האחת היא על ידי ספיגת הנוגדנים הלא רצויים על ידי העברת האנטי-אנרגיה דרך עמוד כרומטוגרפיה של אנטיגנים משותקים (2). שיטה זו היא מייגע ולעתים קרובות לא מסוגל להסיר לחלוטין את הנוגדנים לא רצויים. גישה נוספת היא לבודד תאי B בודדים המייצרים נוגדנים ולהרחיב אותם בתרבית. עם זאת, כמו רוב התאים הרגילים ללא תימוץ, תאי B אינם שורדים בתרבית ארוכת טווח.

כדי להתגבר על חוסר היכולת של תאי B לשרוד בתרבות, גישה אחת היא להכין היברידית של תאי מיאלומה-B. בשנת 1847, הנרי בנס-ג'ונס גילה כי חולים עם מיאלומה נפוצה, גידול לימפואידי, ייצרו כמות גדולה של נוגדנים (3). תאי B בחולים אלה הפכו ממאירים וגדלים ללא שליטה. מכיוון שתאי B הממאירים נגזרים משיבוט יחיד, הם זהים ומייצרים רק סוג אחד של נוגדן (כלומר,נוגדן חד שבטי, או mAb). עם זאת, רוב תאי מיאלומה אלה מייצרים נוגדנים של פרטים לא ידועים. בשנת 1975, על ידי היתוך תא מיאלומה לתא B, הצליחו סזאר מילשטיין וז'ורז ' קולר לייצר הכלאה שניתן לתרבות ללא הגבלת זמן במבחנה ומייצרת מספר בלתי מוגבל של נוגדנים חד שבטיים של ייחודיות אנטיגנית ידועה (4). הרציונל מאחורי הגישה שלהם הוא לשלב את המאפיינים האלמותיים של תא המיאלומה ואת הנוגדן המייצר תכונות של תא B. הטכניקה שלהם חוללה מהפכה בייצור הנוגדנים ומספקת אמצעי רב עוצמה לזיהוי וטיהור של מולקולות ביולוגיות באמצעות נוגדנים חד שבטיים.

בדרך כלל, הכנת נוגדן חד שבטי דורשת מספר חודשים. ההליך הכללי כולל את השלבים הבאים:

חיסון וסינון של טיטר נוגדנים
היתוך של תאי B המייצרים נוגדנים ותאי מיאלומה
צמיחה סלקטיבית של ההיברידית
הקרנת ההיברידיות לייצור הנוגדן החד שבטי הרצוי
שיבוט על ידי הגבלת דילול - תהליך לפיו תאים מדוללים לריכוז כדי לאפשר סטטיסטית פחות מתא אחד להתווסף לבארות של צלחת 96-well. כמה בארות בסופו של דבר עם 0 תאים וחלקם יהיו 1 תא. בארות עם זרעים עם תא אחד בסופו של דבר יגדלו לתוך אוכלוסייה חד שבטית של תאים.
צמיחת ההיברידיות והכנת נוגדן חד שבטי

פרוטוקול זה מתמקד בשלב האחרון - צמיחת ההיברידיות והכנת הנוגדן המונוקלונלי. הנוגדן מטוהר מן התרבות supernatant על ידי משקעים אמוניום גופרתי (המכונה לעתים קרובות מלח החוצה) - שיטה נפוצה של הסרת חלבונים מפתרון. חלבונים בתמיסה יוצרים קשרי מימן, יחד עם אינטראקציות הידרופיליות אחרות, עם מים דרך הקבוצות הקוטביות והאיוניות החשופות שלהם. כאשר מוסיפים ריכוזים של יונים קטנים וטעונים מאוד (כגון אמוניום או סולפט), קבוצות אלה מתחרות עם החלבונים לקשירה למים. זה מסיר את מולקולות המים מן החלבון ומקטין את המסיסות שלה, וכתוצאה מכך משקעים של החלבון.

Procedure

הערה: טכניקת תרבית תאים סטרילית צריכה להישמר בעת טיפול בתאי ההיברידימה ובמדיה באופן סטרילי (למשל, בארון בטיחות ביולוגית) עד לצעדי טיהור הנוגדנים.

1. הפשרת תאי היברידיה קפואים

לדגור על הוויאל המכיל את תאי ההיברידיומה הקפואים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עד להפשרה (כ-2 דקות).
הוסף את התאים המופשרים לצינור חרוט 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של RPMI מלא (RPMI בתוספת סרום בקר עוברי 10%, 100 פניצילין U /mL, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 1mM נתרן pyruvate, 1x חומצות אמינו לא חיוניות, 50 μM 2-Mercaptoethanol, 10 mM HEPES).
צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-1200 סל"ד כדי לשטוף את כל אמצעי ההקפאה המזהמים.
לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant נוזלי, ו resuspend גלולה התא 5 מ"ל טרי להשלים RPMI. לאחר מכן, הוסף את התאים לבקבוק תרבית רקמות T75 המכיל RPMI מלא של 15 מ"ל (נפח סופי של RPMI הוא 20 מ"ל).
לגדל את התאים באינקובטור סטנדרטי ב 37 °C עם 5% CO₂. תאים אינם דבקים בזמן שהם נמצאים בתרבית.

2. הרחבת הכלאה

אפשר לתאים להתרחב במשך כ -3 ימים עד הבקבוקון הוא ~ 80% confluent.
הערה: כמות זו של זמן יכולה להשתנות בהתאם למספר ההתחלתי של תאים, כמו גם הבדלים מובנים בשיעורי הצמיחה של תאים שונים. חשוב שתאים יהיו בשלב הצמיחה המעריכי.
ברגע הבקבוקון הראשוני מגיע ~ 80% השפעה, להסיר את התאים מבקבוק T75 הראשוני הזה, למקם לתוך צינור צנטריפוגה חרוט ספין (1200 סל"ד במשך 5 דקות) כדי כדורי התאים.
resuspend התאים ב 6 מ"ל של RPMI מלא, ולאחר מכן להפיץ את ההשעיה התא לשלושה צלוחיות T75 חדשות (2 מ"ל / בקבוקון המכיל RPMI 18 מ"ל). לדגור אלה שלושה צלוחיות T75 ב 37 °C עם 5% CO₂ עד שהם ~ 80% confluent (זה צריך לקחת כ 3 ימים).

3. ייצור נוגדנים במדיום ללא סרום

הערה: בשלב זה, התאים מוכנים להמשיך את צמיחתם במדיום נטול סרום המיועד לצמיחה של קווי תאים היברידיים. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים במדיום הנוזלי HB Basal המוכנים לשימוש וזמינים מסחרית המכילים את מוצר תוספת HB101.

התאים מכל אחד משלושת צלוחיות T75 (ב-80% זיהום) נאספים וצנטריפוגות (1200 סל"ד למשך 5 דקות).
כדור התא מכל בקבוקון T75 הוא resuspended 10 מ"ל בתוספת HB101 סרום בינוני ולאחר מכן הוסיף שני T225 צלוחיות בתוספת HB101 בינוני ללא סרום (כלומר 5 מ"ל השעיית תא לתוך כל אחד 6 צלוחיות המכיל ~ 220-240 מ"ל HB101 בכל בקבוק).
המשך לגדל את התאים בבקבוקי T225 ו- HB101 ב- 37°C עם 5% CO₂ במשך שלושה שבועות, או עד שתאים מתחילים למות. התאים מייצרים mAb במהלך 3 השבועות האלה ומפרשים אותו למדיום התרבותי. ברגע שהתאים מתחילים למות, הם כבר לא מייצרים mAb.

4. טיהור נוגדנים - יום 1

הערה: בשלב זה, אין צורך לשמור על סטריליות ולכן אין צורך בטיפול בתקשורת באופן סטרילי (למשל, בארון בטיחות ביולוגית). יתר על כן, הכלאות אינן נחשבות לסוכן "רמת BSL2".

יוצקים מדיה מהבקבוקונים לצינורות לרוטור בזווית קבועה. לסובב את הצינורות בצנטריפוגה עם רוטור זווית קבועה ב 10,000 סל"ד במשך 8 דקות. שלב זה נועד להסיר את הפסולת התאית מן לתרבות-על.
הערה: גדלי הצינור יכולים להשתנות בהתאם לרוטור המשמש. הדבר החשוב לזכור הוא לקבל את אותו נפח בצינורות כדי להבטיח את הרוטור מאוזן כראוי לפני צנטריפוגה. סביר להניח שכל נפח המדיה לא יתאים לצנטריפוגה בבת אחת. שאר אמצעי התקשורת יצופו מאוחר יותר (שלב 4.5) באמצעות אותם צינורות.
הכן פלסטיק 2L עם בר ערבוב בדלי מוקף קרח. מניחים על צלחת ערבוב.
צרף חלק עליון מסנן 500 מ"ל על בקבוק 1L. חברו את יחידת המסנן העליונה של הבקבוק לוואקום הביתי באמצעות צינורות מתאימים.
יוצקים את supernatant מ שלב 4.1 (אשר עדיין מכיל את mAb המיוצר על ידי תאי hybridoma) לתוך החלק העליון של המסנן.
המשך להשתמש באותה קבוצה של צינורות כדי גלולה פסולת תא מהמדיה (הכדור ימשיך לבנות). המתן להפעלת הוואקום עד שראש המסנן יהיה מלא וקבוצה נוספת של סופר-נט-נט מוכנה לשפוך פנימה. אל תתנו למסנן להתייבש או שהסינון יהפוך לאיטי מאוד.
כאשר בקבוק 1L קרוב למלא, להסיר את החלק העליון מסנן ולשפוך supernatant לתוך 2L כף מוכנה בשלב 4.2. א'א',ח'י את החלק העליון של המסנן. עקוב אחר אמצעי האחסון.
חזור על שלבי המרכז והסינון עד שכל המדיה מעובדת.
למדוד 295 גרם של אמוניום גופרתי לכל 1L של סופרנאט מסונן שנאסף. תוך כדי ערבוב, לאט להוסיף את אמוניום גופרתי על-טבעי במהלך השעות הקרובות (~ 25 גרם כל 15 דקות) כדי למנוע ריכוז גבוה מקומי של מלח אמוניום גופרתי שעלול לגרום חלבונים לא רצויים לזרז.
לאחר הוספת כל האמוניום גופרתי, מכסים את הכיס בנייר כסף ומעבירים עם צלחת הערבוב ל-4 מעלות צלזיוס (למשל, מקרר או חדר קר). מערבבים לילה. ערבוב מתמיד של הפתרון נדרש כדי solubilize המלח, אבל ערבוב ממושך יכול להוביל denaturation של חלבונים בתמיסה על פני השטח / ממשק האוויר.
לשטוף את הצינורות באמצעות רוטור זווית קבועה.

5. טיהור נוגדנים - יום 2

יוצקים את האמוניום-סולפט המכיל סופר-טבעי מהכוס 2L לתוך צינורות עבור רוטור זווית קבועה. ספין בצנטריפוגה עם רוטור זווית קבועה ב 6500 סל"ד במשך 20 דקות ללא בלם.
ואקום לשאוף supernatant, דואג לא למצוץ את הכדור כפי שהוא יהיה רך. המשך להשתמש באותה קבוצה של צינורות כדי לאסוף גלולה מהאמוניום-גופרתי המכיל סופרנטנט.
לאחר השאיפה האחרונה, resuspend כל גלולה (המכיל נוגדנים) ב ~ 1 מיליליטר PBS.
הסר את אמוניום גופרתי מן פתרון mAb מזורז על ידי דיאליזה נגד כמויות גדולות של PBS. כדי לעשות זאת, לחתוך תחילה כ 1 אינץ 'של צינורות דיאליזה (למשל, Membra-Cel MD25-14 MWCO 12,000-14,000 דלתון מנותק צינורות דיאליזה תאית) עבור כל mL של פתרון mAb. הרטיבו את הצינורות עם dH₂O. לקשור קשר בקצה אחד של הצינורות ולמלא עם dH₂O כדי לבדוק את הקשר הזה לא דולף. ריק dH₂O מהצינורות.
פיפטה PBS / פתרון נוגדן לתוך הצינורות. לשטוף את הצינורות עם PBS נוסף 0.25 מ"ל, ולהעביר צינורות.
אבטחו את החלק העליון של הצינורות קרוב ככל האפשר לפתרון עם קליפ דיאליזה כתום.
הדבק את החלק העליון של הצינורות לחלק החיצוני של 4L. אפשר לחלק המלא של הצינורות להיתלות לתוך הכיס. ממלאים את הכיס ב-PBS ומוסיפים מוט ערבוב.
מערבבים למשך הלילה כ-8 שעות ב-4°C.
החליפו את ה-PBS בכורסה ב-PBS טרי וערבובו כ-8 שעות פעמיים נוספות.
מעבירים את הנוגדן מהצינורות לצינורות חרוטים של 15 או 50 מ"ל. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 1200 סל"ד כדי להסיר כל משקעים שאולי נוצרו. מעבירים את הסופר-נט לצינור טרי.
לדלל aliquot של נוגדן 1:20 עם PBS (5 מיקרול נוגדן + 95 μl PBS). כמות ריכוז הנוגדנים עם ספקטרופוטומטר (ריק עם PBS) ב 280 ננומטר. השתמש במקדם הכחדה (ε) של 1.43. הריכוז מחושב כ
Aliquot את הנוגדן לתוך בקבוקוני בורג cap ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.

Results

באמצעות פרוטוקול זה, השגנו את התוצאות הבאות עם מספר הכלאות שונות:

הכלאה: RB6-BC5 (עכבר נגד עכבר Ly6C/ Ly6G (Gr1) IgG2b, κ mAb)
מנת יתר₂₈₀ - 1.103
(1.103/1.43) (20) = 15.42 מ"ג/מ"ל

הכלאה: GK1.5 (עכבר נגד עכבר CD4 IgG2b, κ mAb)
מנת יתר₂₈₀ - 0.485
(0.485/1.43) (20) = 6.78 מ"ג/מ"ל

הכלאה: 2.43 (עכברוש נגד עכבר CD8 IgG2b, κ mAb)
מנת יתר₂₈₀ - 0.209
(0.209/1.43) (20) = 2.92 מ"ג/מ"ל

כל אלה הן תוצאות לדוגמה, וחשוב לציין כי כל ייצור לרוץ עם אותה hybridoma יכול להיות שונה במקצת בכמות mAb זמין בסוף.

Application and Summary

ההליך המתואר לעיל הוא דרך פשוטה וישירה קדימה לטהר נוגדנים חד שבטיים מתרבות היברידית. חשוב לזכור, עם זאת, כי אמוניום גופרתי יהיה לזרז חלבונים אחרים שעשויים להיות בתרבות supernatant. כתוצאה מכך, ריכוזי הנוגדנים שנקבעו ממדידות הספיגה הם הערכות. המשתמש עשוי לרצות להעריך את הטוהר של המדגם המחויג על ידי הפעלת כמות קטנה על ג'ל SDS-polyacrylamide. mAb המיוצר על ידי hybridoma, פעם מטוהר באמצעות מתודולוגיה זו, ניתן להשתמש במגוון דרכים. RB6-BC5, GK1.5 ו- 2.43 mAb המתוארים לעיל משמשים בדרך כלל לדלדול ויואו של נויטרופילים, תא CD4 T ותאי CD8 T, בהתאמה, בעכברים. mAb אחרים המיוצרים ומטוהרים באמצעות פרוטוקול זה יכולים לשמש עבור cytometry זרימה (כאשר מצומד פלואורופור או בשילוב עם Ab משני), ELISA, או סופג מערבי.

References

Lipman NS, Jackson LR, Trudel LJ, Weis-Garcia F. Monoclonal versus polyclonal antibodies: distinguishing characteristics, applications, and information resources. ILAR Journal, 46 (3), 258-268 (2005).
Arora S, Ayyar BV, O'Kennedy R. Affinity chromatography for antibody purification Methods Mol Biol. 1129, 497-516 (2014).
Henry BJ. On a new substance occurring in the urine of a patient with mollities ossium. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 138, 55-62 (1848).
Köhler G and Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity". Nature. 256, 495-497 (1975).

Tags

הערה: טכניקת תרבית תאים סטרילית צריכה להישמר בעת טיפול בתאי ההיברידימה ובמדיה באופן סטרילי (למשל, בארון בטיחות ביולוגית) עד לצעדי טיהור הנוגדנים.

1. הפשרת תאי היברידיה קפואים

לדגור על הוויאל המכיל את תאי ההיברידיומה הקפואים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עד להפשרה (כ-2 דקות).
הוסף את התאים המופשרים לצינור חרוט 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של RPMI מלא (RPMI בתוספת סרום בקר עוברי 10%, 100 פניצילין U /mL, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 1mM נתרן pyruvate, 1x חומצות אמינו לא חיוניות, 50 μM 2-Mercaptoethanol, 10 mM HEPES).
צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-1200 סל"ד כדי לשטוף את כל אמצעי ההקפאה המזהמים.
לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant נוזלי, ו resuspend גלולה התא 5 מ"ל טרי להשלים RPMI. לאחר מכן, הוסף את התאים לבקבוק תרבית רקמות T75 המכיל RPMI מלא של 15 מ"ל (נפח סופי של RPMI הוא 20 מ"ל).
לגדל את התאים באינקובטור סטנדרטי ב 37 °C עם 5% CO₂. תאים אינם דבקים בזמן שהם נמצאים בתרבית.

2. הרחבת הכלאה

אפשר לתאים להתרחב במשך כ -3 ימים עד הבקבוקון הוא ~ 80% confluent.
הערה: כמות זו של זמן יכולה להשתנות בהתאם למספר ההתחלתי של תאים, כמו גם הבדלים מובנים בשיעורי הצמיחה של תאים שונים. חשוב שתאים יהיו בשלב הצמיחה המעריכי.
ברגע הבקבוקון הראשוני מגיע ~ 80% השפעה, להסיר את התאים מבקבוק T75 הראשוני הזה, למקם לתוך צינור צנטריפוגה חרוט ספין (1200 סל"ד במשך 5 דקות) כדי כדורי התאים.
resuspend התאים ב 6 מ"ל של RPMI מלא, ולאחר מכן להפיץ את ההשעיה התא לשלושה צלוחיות T75 חדשות (2 מ"ל / בקבוקון המכיל RPMI 18 מ"ל). לדגור אלה שלושה צלוחיות T75 ב 37 °C עם 5% CO₂ עד שהם ~ 80% confluent (זה צריך לקחת כ 3 ימים).

3. ייצור נוגדנים במדיום ללא סרום

הערה: בשלב זה, התאים מוכנים להמשיך את צמיחתם במדיום נטול סרום המיועד לצמיחה של קווי תאים היברידיים. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים במדיום הנוזלי HB Basal המוכנים לשימוש וזמינים מסחרית המכילים את מוצר תוספת HB101.

התאים מכל אחד משלושת צלוחיות T75 (ב-80% זיהום) נאספים וצנטריפוגות (1200 סל"ד למשך 5 דקות).
כדור התא מכל בקבוקון T75 הוא resuspended 10 מ"ל בתוספת HB101 סרום בינוני ולאחר מכן הוסיף שני T225 צלוחיות בתוספת HB101 בינוני ללא סרום (כלומר 5 מ"ל השעיית תא לתוך כל אחד 6 צלוחיות המכיל ~ 220-240 מ"ל HB101 בכל בקבוק).
המשך לגדל את התאים בבקבוקי T225 ו- HB101 ב- 37°C עם 5% CO₂ במשך שלושה שבועות, או עד שתאים מתחילים למות. התאים מייצרים mAb במהלך 3 השבועות האלה ומפרשים אותו למדיום התרבותי. ברגע שהתאים מתחילים למות, הם כבר לא מייצרים mAb.

4. טיהור נוגדנים - יום 1

הערה: בשלב זה, אין צורך לשמור על סטריליות ולכן אין צורך בטיפול בתקשורת באופן סטרילי (למשל, בארון בטיחות ביולוגית). יתר על כן, הכלאות אינן נחשבות לסוכן "רמת BSL2".

יוצקים מדיה מהבקבוקונים לצינורות לרוטור בזווית קבועה. לסובב את הצינורות בצנטריפוגה עם רוטור זווית קבועה ב 10,000 סל"ד במשך 8 דקות. שלב זה נועד להסיר את הפסולת התאית מן לתרבות-על.
הערה: גדלי הצינור יכולים להשתנות בהתאם לרוטור המשמש. הדבר החשוב לזכור הוא לקבל את אותו נפח בצינורות כדי להבטיח את הרוטור מאוזן כראוי לפני צנטריפוגה. סביר להניח שכל נפח המדיה לא יתאים לצנטריפוגה בבת אחת. שאר אמצעי התקשורת יצופו מאוחר יותר (שלב 4.5) באמצעות אותם צינורות.
הכן פלסטיק 2L עם בר ערבוב בדלי מוקף קרח. מניחים על צלחת ערבוב.
צרף חלק עליון מסנן 500 מ"ל על בקבוק 1L. חברו את יחידת המסנן העליונה של הבקבוק לוואקום הביתי באמצעות צינורות מתאימים.
יוצקים את supernatant מ שלב 4.1 (אשר עדיין מכיל את mAb המיוצר על ידי תאי hybridoma) לתוך החלק העליון של המסנן.
המשך להשתמש באותה קבוצה של צינורות כדי גלולה פסולת תא מהמדיה (הכדור ימשיך לבנות). המתן להפעלת הוואקום עד שראש המסנן יהיה מלא וקבוצה נוספת של סופר-נט-נט מוכנה לשפוך פנימה. אל תתנו למסנן להתייבש או שהסינון יהפוך לאיטי מאוד.
כאשר בקבוק 1L קרוב למלא, להסיר את החלק העליון מסנן ולשפוך supernatant לתוך 2L כף מוכנה בשלב 4.2. א'א',ח'י את החלק העליון של המסנן. עקוב אחר אמצעי האחסון.
חזור על שלבי המרכז והסינון עד שכל המדיה מעובדת.
למדוד 295 גרם של אמוניום גופרתי לכל 1L של סופרנאט מסונן שנאסף. תוך כדי ערבוב, לאט להוסיף את אמוניום גופרתי על-טבעי במהלך השעות הקרובות (~ 25 גרם כל 15 דקות) כדי למנוע ריכוז גבוה מקומי של מלח אמוניום גופרתי שעלול לגרום חלבונים לא רצויים לזרז.
לאחר הוספת כל האמוניום גופרתי, מכסים את הכיס בנייר כסף ומעבירים עם צלחת הערבוב ל-4 מעלות צלזיוס (למשל, מקרר או חדר קר). מערבבים לילה. ערבוב מתמיד של הפתרון נדרש כדי solubilize המלח, אבל ערבוב ממושך יכול להוביל denaturation של חלבונים בתמיסה על פני השטח / ממשק האוויר.
לשטוף את הצינורות באמצעות רוטור זווית קבועה.

5. טיהור נוגדנים - יום 2

יוצקים את האמוניום-סולפט המכיל סופר-טבעי מהכוס 2L לתוך צינורות עבור רוטור זווית קבועה. ספין בצנטריפוגה עם רוטור זווית קבועה ב 6500 סל"ד במשך 20 דקות ללא בלם.
ואקום לשאוף supernatant, דואג לא למצוץ את הכדור כפי שהוא יהיה רך. המשך להשתמש באותה קבוצה של צינורות כדי לאסוף גלולה מהאמוניום-גופרתי המכיל סופרנטנט.
לאחר השאיפה האחרונה, resuspend כל גלולה (המכיל נוגדנים) ב ~ 1 מיליליטר PBS.
הסר את אמוניום גופרתי מן פתרון mAb מזורז על ידי דיאליזה נגד כמויות גדולות של PBS. כדי לעשות זאת, לחתוך תחילה כ 1 אינץ 'של צינורות דיאליזה (למשל, Membra-Cel MD25-14 MWCO 12,000-14,000 דלתון מנותק צינורות דיאליזה תאית) עבור כל mL של פתרון mAb. הרטיבו את הצינורות עם dH₂O. לקשור קשר בקצה אחד של הצינורות ולמלא עם dH₂O כדי לבדוק את הקשר הזה לא דולף. ריק dH₂O מהצינורות.
פיפטה PBS / פתרון נוגדן לתוך הצינורות. לשטוף את הצינורות עם PBS נוסף 0.25 מ"ל, ולהעביר צינורות.
אבטחו את החלק העליון של הצינורות קרוב ככל האפשר לפתרון עם קליפ דיאליזה כתום.
הדבק את החלק העליון של הצינורות לחלק החיצוני של 4L. אפשר לחלק המלא של הצינורות להיתלות לתוך הכיס. ממלאים את הכיס ב-PBS ומוסיפים מוט ערבוב.
מערבבים למשך הלילה כ-8 שעות ב-4°C.
החליפו את ה-PBS בכורסה ב-PBS טרי וערבובו כ-8 שעות פעמיים נוספות.
מעבירים את הנוגדן מהצינורות לצינורות חרוטים של 15 או 50 מ"ל. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 1200 סל"ד כדי להסיר כל משקעים שאולי נוצרו. מעבירים את הסופר-נט לצינור טרי.
לדלל aliquot של נוגדן 1:20 עם PBS (5 מיקרול נוגדן + 95 μl PBS). כמות ריכוז הנוגדנים עם ספקטרופוטומטר (ריק עם PBS) ב 280 ננומטר. השתמש במקדם הכחדה (ε) של 1.43. הריכוז מחושב כ
Aliquot את הנוגדן לתוך בקבוקוני בורג cap ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.

Skip to...

0:01

Concepts

2:51

Hybridoma Expansion

6:04

Antibody Production in Serum-Free Medium

7:28

Antibody Purification - Day 1

9:25

Antibody Purification - Days 2-4

12:00

Analysis and Results

Videos from this collection:

article

Now Playing

יצירת נוגדנים: ייצור נוגדנים חד שבטיים באמצעות היברידיות

Immunology

43.3K Views

article

ציטומטריית זרימה ומיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנטיות (FACS): בידוד של לימפוציטים מסוג Splenic B

Immunology

92.5K Views

article

מיון תאים המופעל מגנטי (MACS): בידוד של לימפוציטים T תימיים

Immunology

22.7K Views

article

אליסה אסייס: עקיפה, כריך ותחרותי

Immunology

236.8K Views

article

אליספוט אסאי: זיהוי של IFN-γ הפרשת טחול

Immunology

28.3K Views

article

אימונוהיסטוכימיה ואימונוציטוכימיה: הדמיית רקמות באמצעות מיקרוסקופיה קלה

Immunology

78.5K Views

article

מיקרוסקופיה חיסונית: כתמי אימונופלואורסצנטיות של מקטעי רקמות משובצים בפרפין

Immunology

53.5K Views

article

מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות קונפוקלית: טכניקה לקביעת לוקליזציה של חלבונים בפיברובלסטים של עכברים

Immunology

43.0K Views

article

טכניקות מבוססות אימונופרציפיטציה: טיהור חלבונים אנדוגניים באמצעות חרוזי אגרוז

Immunology

87.3K Views

article

ניתוח מחזור התא: הערכת התפשטות תאי CD4 ו- CD8 T לאחר גירוי באמצעות כתמי CFSE וציטומטריית זרימה

Immunology

24.1K Views

article

העברת תאים מאמצת: הצגת טחול עכבר תורם לעכבר מארח והערכה של הצלחה באמצעות FACS

Immunology

22.1K Views

article

ת לבדיקת מוות בתא: כרום שחרר את ההסתה של היכולת הציטוטוקסית

Immunology

151.3K Views

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved