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离子交换色谱法

Overview

资料来源: 实验室的博士 B.吉尔 Venton-弗吉尼亚大学

离子交换色谱法是色谱的分离基于电荷分析物类型。列用那充满了带电的固定相,坚实的支持,被称为一种离子交换树脂。强阳离子交换色谱法优先分离出来阳离子通过使用-带负电荷的树脂,而强阴离子交换色谱法优先选择阴离子通过使用一种带正电的树脂。这种类型是色谱的受欢迎的样品制备,例如在蛋白质或核酸样品的清理工作。

离子交换色谱法是一个两步过程。第一步,样品装上加载缓冲区中的列。绑定到列树脂带电样品的基于树脂吸引样品相反电荷的离子相互作用。因此,带电的样品的相反极性树脂到强烈绑定。其他分子,不收取或相反的电荷是不受约束和通过列洗。第二步是洗脱绑定到树脂的分析物。这被通过盐的梯度,在缓冲区中盐的用量现在慢慢地上升。馏分收集在列的结尾作为洗脱发生和纯化的样品感兴趣的可以恢复这些组分之一。另一种技术,如谱,可能需要确定哪一部分包含示例。离子交换色谱法是在蛋白质研究,隔离有特定电荷或大小,感兴趣的蛋白质,如大小可以确定在与树脂之间的交互中尤其有用。

离子交换色谱法是更一般的分离技术比亲和层析,也常用于蛋白质样品制备抗体相连列绑定一个具体分析物。必须为每种分析物,购买新的亲和柱,而同一类型的离子交换柱,经常与不同的洗脱条件,可以用来清理许多蛋白质相同罪名。离子交换色谱法也可以与其他类型的色谱分离基于其他属性一起使用。例如,尺寸排阻色谱法分离基于大小和可以在离子交换色谱法之前用来选择只给定大小的化合物。

Principles

离子交换色谱法被受离子的化学相互作用,导致分析物的可逆吸附在固定相上的原则。样品和固体支持之间的粘结强度受的数量和类型的样品和树脂官能团。加载缓冲区一般有低电导率为了促进样品与树脂之间的相互作用。强阳离子交换树脂通常功能磺酸官能团虽然弱阳离子交换树脂具有羧酸。强阴离子交换树脂含有第四纪胺而弱阴离子交换树脂功能二级或三级胺。强和弱的用语指列材料并不如何好将绑定分析物的酸碱属性。弱的树脂在较小的 ph 值范围比强树脂,收取但仍然非常有效,绑定物,可能是一个不错的选择,如果他们被指控在所需的 ph 值范围。使用前,离子交换色谱柱被平衡 ph 值,使用平衡缓冲区。

用盐梯度洗脱样品感兴趣。不紧紧地绑定到树脂的样品将洗脱第一,因为盐会最容易打扰他们离子键的列。更紧密绑定会的样品后,洗脱时高盐的用量。通常情况下,使用线性渐变的盐,盐的浓度随时间线性方式的地方增加。然而,一步梯度能也使用的盐浓度随着时间的推移加紧。

离子交换实验的一个重要的考虑因素是 ph 值的缓冲区。Ph 值有需要继续维持这样的利益被分析物中扣除,并将绑定到树脂。蛋白质,收费基于蛋白质的等电点,蛋白质在哪里中立带电,与实测值作为 pI。Ph 值与蛋白 pI 给预期的蛋白质电荷有关的信息。在阳离子交换色谱法,提高 ph 值将导致分析物要少正电和不太可能与交互的负电荷的树脂。同样,在阴离子交换层析,降低 ph 值将导致分析物要少负电和不太可能与带正电的树脂进行交互。因此 ph 值的调整也可以用于选择性洗脱物从列。Ph 值调整而不是盐的使用可能是便于分离两种不同类型的蛋白质具有不同的 pI 值。

Procedure

1.准备样品和列

  1. 在这个演示中,一种 2 蛋白混合物将阳离子交换柱上分离: 血红蛋白和细胞色素 C.添加 0.2 毫升平衡缓冲 (pH 8.1) 蛋白样品和涡拌匀。2 分钟要删除任何泡沫的离心机。
  2. 阳离子交换柱置于试管 5 分钟,使树脂来解决。夹紧测试管柱上环站,以确保它是直立。
  3. 打开顶盖的列,然后底部的上限。滴出来进试管的重力作用下的列中允许的缓冲区。
  4. 洗两次列列-卷 (在这种情况下,列卷是 0.3 毫升) 的平衡缓冲区。添加第二个列卷之前的平衡缓冲滴出入废瓶让第一列卷 (0.3 毫升)。这一步让平衡与平衡缓冲区的列。在这一步,不打扰树脂慢慢添加平衡缓冲区。

2.运行蛋白样品通过阳离子交换柱

  1. 将列放在标记为"未绑定 1"2 毫升离心管中。仔细地加载 0.1 毫升到该列顶部的蛋白样品。
  2. 一旦样品已加载到列的顶部,用冲洗 0.3 毫升的平衡缓冲区在列的顶部添加缓冲区并允许它滴,一路过关斩将。重复此步骤 4 x (共 5 洗) 并收集每个洗在单独、 2 毫升离心管中。标记为"未绑定 1 5"管。
  3. 为最后 2 洗、 离心 10 s 1,000 x g,以确保所有未绑定的物种脱落的列。任何将绑定到列的样品不应在这些洗,但并不受约束的示例将洗不。离心提供更多的力量来洗未绑定列的材料。
  4. 提出一种新型的标记的 2 毫升离心机集合管"绑定 1"的列。把 0.3 毫升的洗脱缓冲液 (高盐,pH 5.5) 放在上面的列。离心机产生的淋洗液为 10 1,000 x g s。
  5. 通过将列放置在新的离心管,加入 0.3 毫升,重复洗脱步骤 2 次数越多,离心 10 s.标签这些"绑定 2 和 3"。
  6. 任何颜色的变化或对分数的观察记录。血红蛋白是彩色的蛋白,看起来红棕色,而细胞色素 C 是略带红色的颜色。

3.结果: 阳离子交换的血红蛋白和细胞色素 C

  1. 细胞色素 C 有 10.5 和血红蛋白 6.8 pI pI。因此,当使用时 ph 值 8.1 平衡缓冲液,血红蛋白不绑定到列因为它带负电荷的离子。细胞色素 C 在此 ph 值带正电,并绑定到列,因为 ph 值 < pI。
  2. 血红蛋白是未绑定的馏分中观察到,因为它不绑定到列。
  3. 细胞色素 C 被观察在绑定的分数,因为它被绑定到阳离子交换柱。

Figure 1
图 1。非结合型的分数 (血红蛋白) 和绑定的分数 (细胞色素 C) 的图片。

Application and Summary

离子交换色谱法广泛应用于生物化学分离和纯化蛋白样品。蛋白质有许多氨基酸与被指控的官能团。蛋白质分离基于净电荷,是依赖于 ph 值。一些蛋白质是更带正电荷而其他人都更带负电荷。此外,肽标记可以基因添加到一种蛋白质来给它不在范围内正常蛋白质,使它能够完全分开的等电点。离子交换色谱法可用于分离多亚基蛋白复合物,作为不同的配置会有不同数量的电荷和不同的相互作用。

离子交换色谱法的另一个主要的应用是水分析。阴离子交换色谱法可以用于测量负离子,包括硫酸盐、 硝酸盐、 亚硝酸盐、 氟和氯的浓度。阳离子交换色谱法用于测量如钠、 钾、 钙、 镁离子的浓度。类型的离子交换色谱法也用于水的净化,因为大多数水软化剂筛选出在硬水通过将它们绑定到一种树脂,可以释放绑定的钠镁和钙离子。重金属,比如铜,铅,也能去除水离子交换色谱法。

离子交换色谱法也是有用的金属净化的。它可以用于净化 actanides,如钚,并从反应堆核乏的燃料棒中移除。它也可用于清除铀和从水或其他环境样品中删除它。

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Overview

1:07

Principles of Ion-Exchange Chromatography

3:48

Preparing the Sample and Column

4:42

Running a Protein Sample on the Ion-Exchange Column

5:55

Representative Results

6:37

Applications

8:29

Summary

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