Testes para alimentos geneticamente modificados

Fonte: Laboratórios de Margaret Workman e Kimberly Frye - Universidade Depaul

A modificação genética dos alimentos tem sido um tema controverso devido às preocupações debatidas sobre saúde e segurança ambiental. Este experimento demonstra a compreensão técnica de como o DNA alimentar é geneticamente identificado, permitindo a tomada de decisão educada sobre a segurança e os perigos potenciais do uso de organismos geneticamente modificados (OGM) em suprimentos alimentares.

A Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) é usada para amplificar o DNA alimentar para testar a presença de DNA geneticamente modificado em produtos alimentícios. A presença de bandas específicas de DNA é detectada usando eletroforese de gel para extrair DNA de alimentos extraídos através de um gel de 3% de agarose, uma concentração densa o suficiente para separar as faixas de DNA contendo o DNA geneticamente modificado. Vários controles são usados no procedimento de eletroforese para garantir que o DNA seja extraído com sucesso de alimentos de teste (primer de plantas), e para fornecer exemplos conhecidos de DNA geneticamente modificado (DNA geneticamente modificado) e DNA não geneticamente modificado (controle alimentar não-OGM certificado adquirido).

A Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) identifica sequências de DNA que foram inseridas na planta GM. Em contraste com as proteínas, o DNA é uma molécula relativamente estável, portanto fragmentos de DNA podem ser isolados de bens altamente processados e estão suficientemente intactos para serem amplificados pelo PCR. Os engenheiros genéticos usam apenas um pequeno número de sequências regulatórias (sequências de promotores e terminadores) para controlar a expressão dos genes inseridos, e por isso essas sequências são comuns à maioria das culturas GM. As duas sequências identificadas neste procedimento são duas das sequências regulatórias mais comuns, o gene promotor 35S do vírus do mosaico de couve-flor (CaMV) e o gene terminator nopaline synthase (NOS) da Agrobacterium tumefaciens.

O PCR envolve ciclos repetitivos, cada um consistindo de desnaturação de modelos, ressarem-se e extensão do primer ressarcido pela polimerase de DNA Taq. Uma vez que o DNA é extraído dos alimentos, um cicloviário térmico é usado para manipular rapidamente a temperatura, causando os estágios dos ciclos pcr.

O estágio de desnaturação ocorre quando as amostras são rapidamente aquecidas a 94 °C, fazendo com que os fios de DNA se separem. O resfriamento rápido a 59 °C permite que os primers se aqueçam aos fios de DNA separados, depois reaqueçam até 72 °C para que a polimerase de DNA Taq amplie os primers, fazendo cópias completas de cada fio de DNA e completando um ciclo térmico.

O DNA amplificado pode então ser executado através de um gel de agarose com eletroforese para separar o DNA em bandas visíveis para identificação do gene promotor 35S e do exterminador do NOS. O DNA amplificado é carregado em poços em uma extremidade do gel, usando um corante de carregamento comprado que ajuda a pesar a amostra para evitar a dissolução no buffer circundante. O corante de carregamento também fornece um visual, de modo que o movimento do DNA pode ser visto durante a eletroforese na "frente" do corante. O processo de eletroforese funciona usando uma corrente elétrica separada em extremidades de cátodo e ânodo. O DNA é carregado no gel na extremidade mais próxima do lado do cátodo da câmara, e a carga negativa de DNA é atraída para a extremidade ânodo da câmara e é puxada através da ágarose. Sequências maiores de DNA (aumento do número de pares de base) não podem se mover tão facilmente através da ágarose e se separarão cedo, enquanto as sequências menores são capazes de viajar mais para baixo do gel em direção ao fim do ânodo.

Um processo de coloração ajuda na vinculação ao DNA, a fim de adicionar contraste entre o gel de fundo e as margens do DNA para melhor visualização dos resultados. Usando locais conhecidos fornecidos para os diferentes tamanhos de sequências de DNA cada gel de teste pode ser analisado para a presença ou ausência dos genes promotores 35S e NOS terminator.

Os controles são usados para garantir que o DNA seja extraído corretamente e para fornecer uma comparação com as amostras de alimentos de teste. O primer da planta comprado é adicionado a cada amostra para fornecer ácidos nucleicos comuns a todas as plantas. Isso permite uma verificação de controle de qualidade no processo de extração de DNA, pois qualquer DNA vegetal extraído deve ser estendido com este primer durante o PCR e também deve ser visto no gel após a eletroforese estar completa. Primer comprado para os genes 35S e NOS são usados como um controle positivo para fornecer bandas de DNA no gel para modificação genética. Se o controle do modelo OGM positivo não se amplificar, há um problema com a reação do PCR e um resultado GMO negativo do alimento de teste não é confiável. Um produto alimentar não transgênico certificado também é comprado e usado como controle negativo para mostrar como é a separação do DNA quando nenhum material geneticamente modificado está presente.

1. Extração de DNA de amostras de alimentos

1. Adicione 500 μL de matriz de mistura PCR comprada a cada um dos 2 tubos de tampa de parafuso usando uma tubulação de transferência ou 200-1.000 μL de micropipette de volume ajustável. Pipeta para cima e para baixo com a tubulação entre cada alíquota para misturar uniformemente a matriz PCR.
2. Rotule um tubo de tampa de parafuso "não-OGM" e o outro "teste".
3. Pese 0,5 g de alimentos não transgênicos certificados e coloque-o na argamassa.
4. Adicione 2,5 mL de água destilada e moa com pilão por 2 minutos para formar um chorume.
5. Adicione mais 2,5 mL de água destilada e continue moendo com pilão até que o chorume fique liso o suficiente para pipetar.
6. Pipet 50 μL de chorume moído para o tubo de tampa de parafuso contendo 500 μL de pré-mistura PCR rotulado como "não-OGM" usando a marca de 50-μL em uma tubulação graduada. Tubo de recapitulação.
7. Repita as etapas 1.3-1.6 para preparar a amostra de alimentos de teste.
8. Pipet 50 μL de chorume de alimento de ensaio moído para o tubo de tampa de parafuso rotulado "teste". Tubo de recapitulação.
9. Vórtice os alimentos não transgênicos e tubos pcr de teste por 1 min e coloque tubos em banho de água de 95 °C por 5 min. Se não houver vórtice disponível, aperte o tubo várias vezes para misturar antes de colocar no banho de água.
10. Coloque tubos em uma centrífuga por 5 minutos. Uma pelota sólida deve se formar na parte inferior do tubo. Se a pelota não for formada após 5 min, centrífuga novamente por intervalos de 2 minutos até que a pelota se forme.
11. Os tubos podem ser usados imediatamente para PCR ou armazenados em uma geladeira por até 1 semana.

2. Configuração de reações do PCR

1. Tubos PCR número 1-6 e inicial. Os números devem corresponder aos seguintes conteúdos do tubo listados na Tabela 1.
2. Coloque cada tubo PCR rotulado em um suporte de microtubo com tampas abertas.
3. Usando uma dica fresca para cada adição, adicione 20 μL do primer indicado na Tabela 1 a cada tubo PCR. Tubos de tampa.
4. Utilizando uma ponta fresca para cada tubo, adicione 20 μL da amostra de DNA indicada na Tabela 1 a cada tubo PCR, certificando-se de pipeta apenas do supernatante e evitando a pelota sólida na parte inferior dos tubos.
5. Depois que cada amostra de DNA for pipetada no tubo PCR correspondente, use pipeta para misturar DNA e primer, pipetando suavemente para cima e para baixo; tubos de recapitulação.
6. Coloque tubos PCR no cicloviário térmico e programe o ciclo dor para:
   Denaturação inicial: 1 ciclo a 94 °C por 2 min.
   Amplificação: 40 ciclos a 94 °C para 1 min (desnaturação), 59 °C para 1 min (ressarição) e 72 °C para 2 min (extensão).
   Extensão Final: 1 ciclo a 72 °C por 10 min.
   Por dentro de: 4 °C por tempo indeterminado.

3. 3% Preparação de Gel Agarose

1. Usando fita de laboratório ou mascaramento, fitar com segurança as extremidades abertas da bandeja de gel. Certifique-se de que a fita está selada nas bordas da bandeja para evitar que agarose derretida vaze.
2. Pesar 3 g de agarose em um frasco erlenmeyer de 250 mL ou maior.
3. Adicione 100 mL de tampão TAE 1x (comprado ou preparado a partir do concentrado).
4. Usando uma placa magnética quente com uma barra de mexida, aqueça o béquer até que a agarose esteja completamente dissolvida no tampão e a solução esteja fervendo e fique clara. Alternativamente, um forno micro-ondas pode ser usado colocando béquer no forno e aquecendo por intervalos de 30 s, usando uma haste de mesclagem para misturar a cada 10 s, repetindo até que a mistura esteja fervendo e se deixe claro.
5. Inverta um frasco de Erlenmeyer de 50 mL na abertura do frasco de 250 mL para atuar como um refluxo, impedindo que a solução agarose evapore.
6. Deixe a solução agarose esfriar a 60 °C e despeje 30-50 mL em cada bandeja de gel colada.
7. Coloque um pente de gel no primeiro par de entalhes para criar poços de gel.
8. Deixe o gel esfriar completamente antes de remover a fita e pentear. O gel se solidificará e passará de claro para nublado quando pronto, aproximadamente 10-20 min.

4. Eletroforese de Produtos PCR

1. Coloque um gel de 3% de agarose pré-feito em uma bandeja de gel ou use uma bandeja de gel que tenha sido usada para lançar um gel de 3% de agarose derramado.
2. Deslize a bandeja de gel para a câmara de eletroforese com os poços mais próximos da extremidade do cátodo (preto).
3. Despeje 1x tampão TAE na câmara, o suficiente para ter 2 mm de tampão acima da parte superior da bandeja de gel.
4. Obtenha tubos PCR do cicloviário térmico e coloque no suporte de microtubo.
5. Usando uma dica de pipeta fresca cada vez, adicione 10 μL de corante de carregamento Laranja G (LD) comprado em cada amostra e misture bem.
6. Carregar 20 μl da régua de peso molecular e 20 μL de cada amostra no gel na ordem indicada(Tabela 2).
7. Executar eletroforese de gel por 30 min a 100 V.
8. Remova a bandeja de gel da câmara e o gel de slides para remover da bandeja. Coloque gel em uma bandeja de coloração.
9. Mergulhe gel na mancha de gel de DNA comprada por 5 min, cuidadosamente tremendo bandeja para ajudar a distribuir a mancha por todo o gel.
10. Transfira o gel para um recipiente de lavagem e enxágue com água da torneira (40-55 °C) por aproximadamente 10 s.
11. Destain lavando 3x em água morna da torneira por 6 min cada com agitação suave para melhores resultados. Se necessário, continue se deseminhando em água morna até que o contraste desejado seja alcançado.

Mesa 1. Lista dos números de tubos apropriados, primers e amostras de DNA.

Mesa 2. A ordem apropriada para carregar 20 μL da régua de peso molecular e 20 μL de cada amostra no gel.

Após a desininagem, os géis podem ser analisados olhando para as rotas de alimentação de teste (Tabela 3) para determinar se as bandas de DNA para os genes 35S promoter e NOS terminator estão presentes nos locais conhecidos no gel. Colocar o gel em uma caixa de luz UV pode ajudar a fornecer contraste aumentado(Figura 1). Alternativamente, os géis podem ser colocados em papel branco ou amarelo para fornecer um fundo contrastante para destacar as faixas de DNA(Figura 2).

Figura 1. Um gel detido mostrando faixas separadas de DNA. Gel agarose após eletroforese de gel agarose na caixa de luz UV.

Figura 2. Diagrama de locais conhecidos para o promotor 35S e DNA exterminador nos. A presença ou ausência de uma banda de 200 bps na faixa 5 indica se o alimento de teste contém ou não OGMs.

Mesa 3. Tamanhos de banda de amostra pcr (pares de base (bp)).

A Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) é usada para amplificar o DNA, permitindo uma ampla gama de testes de laboratório de DNA. Uma área de testes agora possível com PCR é identificar OGMs por meio de testes para presença ou ausência das sequências de DNA utilizadas na modificação genética das culturas alimentares. Tipicamente, uma cultura é geneticamente modificada para conferir uma vantagem contra os impedimentos naturais aos rendimentos ideais, por exemplo, pragas(Figura 3),doenças, condições de seca(Figura 4), etc. Como a vantagem é obtida pela inserção de material genético de uma espécie diferente no próprio DNA da planta, potenciais riscos à saúde humana e ambientais foram identificados com o uso de OGM. Uma preocupação ambiental é a capacidade do DNA geneticamente modificado de ser trocado involuntariamente através de processos de polinização, o que poderia levar à entrada de DNA geneticamente modificado nos genomas das culturas destinadas a serem vendidas como não-OGM.

Figura 3. Larvas de besouro colorado, folhas devoradoras de uma batata.

Figura 4. Milho destruído pela seca.