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Aqui, descrevemos um protocolo para microscopia de localização por ultrassom (ULM), que atinge resolução espacial de 12,5 μm para obter imagens da microvasculatura cerebral em ratos. Ele permite a visualização detalhada da direção e velocidade do fluxo sanguíneo, oferecendo uma ferramenta poderosa para o avanço dos estudos da circulação cerebral e distúrbios vasculares.
A microvasculatura cerebral forma uma rede complexa de vasos essenciais para manter a função cerebral. Doenças como acidente vascular cerebral, doença de Alzheimer, gliomas e demência vascular podem perturbar profundamente o sistema microvascular. Infelizmente, as modalidades atuais de imagens médicas oferecem apenas observações indiretas nessa escala. Inspirada na microscopia óptica, a microscopia de localização por ultrassom (ULM) supera o trade-off clássico entre profundidade de penetração e resolução espacial. Ao localizar e rastrear microbolhas injetadas individuais (MBs) com precisão de subcomprimento de onda, mapas vasculares e de velocidade podem ser gerados na escala micrométrica. Aqui, apresentamos um protocolo robusto para imagens de super-resolução da microvasculatura cerebral in vivo em ratos usando uma plataforma de ultrassom comercial. Este método atinge resolução espacial de 12,5 μm, reconstruindo a arquitetura microvascular e fornecendo informações detalhadas sobre a direção e velocidade do fluxo sanguíneo, melhorando muito nossa compreensão da microcirculação cerebral. O protocolo pode ser estendido a modelos de doenças de ratos, oferecendo uma ferramenta poderosa para o diagnóstico precoce e tratamento de doenças neurovasculares.
A microvasculatura cerebral, composta por capilares, arteríolas e vênulas, é essencial para manter a função cerebral, facilitando o fornecimento de nutrientes, a troca de oxigênio e a remoção de resíduos 1,2. Interrupções nessa rede estão implicadas em distúrbios neurológicos, como acidente vascular cerebral3, doença de Alzheimer4, gliomas5 e demência vascular6, levando a deficiências na fisiologia cerebral. As alterações microvasculares frequentemente precedem o início dos sintomas clínicos, tornando-as um alvo crítico para intervenções diagnósticas e terapêuticas 7,8. Uma compreensão abrangente das alterações vasculares nos níveis estrutural e funcional é fundamental para o avanço das estratégias de pesquisa e tratamento.
No entanto, a imagem da microvasculatura cerebral é particularmente desafiadora devido ao tamanho pequeno e à localização parcialmente profunda dentro do cérebro. As modalidades convencionais de imagem, como ressonância magnética (RM)9 e tomografia computadorizada (TC)10, embora adequadas para capturar alterações vasculares em grande escala, oferecem uma resolução espacial (~100 μm) que é muito grosseira para visualizar pequenos vasos. Métodos ópticos como a microscopia de dois fótons11 fornecem excelente resolução espacial (até 1 μm) para obter imagens de capilares individuais, mas são prejudicados pelo campo de visão limitado e profundidade de penetração (menos de 1 mm), restringindo sua capacidade de obter imagens de regiões cerebrais profundas. Como uma técnica baseada em ultrassom, o Doppler12, embora ofereça avaliação do fluxo sanguíneo em tempo real, permanece limitado por uma resolução de 50-200 μm, insuficiente para detalhes microvasculares. No geral, nenhum método único atende atualmente ao duplo requisito de alta resolução espacial e penetração cerebral suficiente necessária para imagens de microvasculatura cerebral.
Inspirada na microscopia óptica 13,14, a microscopia de localização ultrassônica (ULM) permite a visualização de estruturas finas na escala de mícrons, localizando microbolhas (MBs) injetadas individualmente e rastreando seu deslocamento com resolução de comprimento de onda15. Ele ignora o compromisso clássico entre penetração e resolução na imagem de ultrassom16. Este estudo detalha um protocolo robusto para implementar o ULM em um modelo de rato vivo e, assim, permitir imagens de super-resolução da microvasculatura cerebral por meio da plataforma de ultrassom disponível comercialmente. O protocolo não apenas fornece uma reconstrução abrangente da estrutura microvascular, mas também fornece informações detalhadas sobre a direção e a velocidade do fluxo sanguíneo, o que não é possível com as técnicas convencionais de imagem. Embora o protocolo tenha sido validado em ratos normais, ele é extensível a modelos de doenças em ratos, oferecendo possibilidades para estudos personalizados em diferentes condições patológicas.
Todos os experimentos em animais realizados neste trabalho são aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Fudan (Número de Aprovação: 2022JS-004). O protocolo segue rigorosamente as diretrizes de cuidados com os animais da Universidade de Fudan para garantir o tratamento humano dos animais. Antes do início experimental, os ratos devem ter um período de 1 semana para aclimatação ambiental, durante o qual recebem ração e água suficientes. O fotoperíodo é cuidadosamente regulado de acordo com seus ritmos biológicos para garantir a manutenção de estados fisiológicos normais. No final do experimento, a eutanásia é realizada com uma overdose de isoflurano inalado.
NOTA: A configuração experimental é mostrada na Figura 1A-H.
1. Preparação animal para imagens ULM
2. Configuração antes da coleta de dados
3. Coleta de dados (tempo ~ 20 min)
NOTA: Verasonics (sistema de ultrassom) fornece os scripts MATLAB originais para uso com o sistema Vantage e não foi modificado.
4. Processamento e análise de dados (Tempo ~ 8 h)
A Figura 1 ilustra a configuração detalhada para imagens ULM microvasculares cerebrais in vivo em ratos, com cada elemento cuidadosamente projetado para minimizar a variabilidade experimental e garantir a aquisição de dados precisos para resultados confiáveis de imagem de super-resolução.
A Figura 2A mostra a estrutura reconstruída pelo ULM da microvasculatura no cérebro do rato, posicionada a -1 mm do ponto de Bregma, com uma profundidade de imagem próxima a 12 mm. A espessura efetiva do corte ao longo do plano de imagem varia de 0,1 mm a 0,3 mm. Tanto os microvasos mais rasos quanto os mais profundos são claramente visíveis e a qualidade da imagem não se deteriora com o aumento da profundidade (Figura 2B). Calculando a largura total na metade máxima (FWHM) da distribuição de intensidade ao longo da linha tracejada nas regiões de interesse (ROI), vasos de vários diâmetros podem ser detectados, sendo o menor de 13 μm (Figura 2C). Aplicando a correlação do anel de Fourier (FRC) para avaliação da resolução, a resolução espacial da imagem da microvasculatura do cérebro de rato é quantificada em 12,5 μm (Figura 2D).
As informações do fluxo sanguíneo são cruciais para refletir as respostas fisiológicas e diagnosticar doenças. A Figura 3A ilustra as direções do fluxo sanguíneo em uma fatia transversal do cérebro do rato, onde azul indica fluxo em direção à sonda e vermelho indica fluxo para longe da sonda. Com base nisso, regiões cerebrais específicas, como pequenas artérias no córtex fluindo para baixo e pequenas veias fluindo para cima, podem ser diferenciadas20 (Figura 3B). A Figura 3C mostra um mapa de velocidade do fluxo sanguíneo cerebral codificado em cores diferentes, com vasos maiores exibindo taxas de fluxo visivelmente mais altas. A distribuição das velocidades varia de 1 a 80 mm/s, concentrada predominantemente na faixa de 10-25 mm/s (Figura 3D), o que representa 81,57% de toda a faixa de velocidade. Essa proporção é calculada determinando o número de pontos de dados de velocidade dentro da faixa de 5 a 25 mm/s em relação ao número total de pontos de dados na matriz de velocidade.
A Figura 4 apresenta os resultados de imagem de um modelo de glioblastoma em rato utilizando o protocolo proposto. As células de glioblastoma C6 foram implantadas no cérebro de ratos. A Figura 4A mostra a estrutura microvascular no cérebro de um modelo de rato glioblastoma, com dilatação vascular anormal e irregularidades estruturais observadas ao redor do tumor. Os vasos da região tumoral apresentam maior tortuosidade em comparação com a área normal do lado esquerdo. A Figura 4B fornece informações sobre a direção do fluxo sanguíneo, permitindo uma compreensão dos padrões de fluxo dentro da região do tumor. A Figura 4C exibe um mapa de velocidade do fluxo sanguíneo, revelando heterogeneidade no fluxo vascular dentro e ao redor do tumor.
Figura 1: Detalhes da configuração experimental para imagens ULM in vivo da microvasculatura cerebral de ratos. (A) Posição das barras auriculares usadas para estabilizar a cabeça do rato. (B) A área raspada na cabeça do rato preparada para acesso cirúrgico. (C) Rato posicionado sobre o instrumento estereotáxico com máscara respiratória; Os hemostáticos são usados para retrair a pele em ambos os lados. (D) Brocas esféricas (2,5 mm e 1 mm) montadas na broca craniana para craniotomia. (E) Área de craniotomia marcada em relação a Bregma e Lambda. (F) Cérebro de rato exposto após craniotomia. (G) Uma agulha de demora inserida na veia da cauda do rato e conectada a uma bomba de seringa para microinjeção. (H) Exemplo de vasculatura cerebral de rato com sangramento excessivo; A caixa branca destaca uma região carente de reconstrução vascular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Resultados experimentais da reconstrução ULM da estrutura microvascular do cérebro de ratos in vivo. (A) Estrutura microvascular do cérebro do rato a -1 mm do ponto de Bregma. (B) Imagens ampliadas de duas regiões de interesse (ROI) em locais mais rasos e profundos em A, para destacar a morfologia de pequenos vasos. (C) Distribuição de intensidade ao longo da linha tracejada em B, com valores numéricos indicando diâmetros de vasos medidos usando largura total na metade do máximo (FWHM). (D) Avaliação do desempenho da reconstrução do ULM usando a técnica do anel de Fourier, o 1/2 bit foi escolhido para padronizar a resolução sem sacrificar a qualidade da imagem, que define a maior frequência espacial onde a correlação ainda indica informações estatisticamente significativas. O "○" marca o ponto de interseção da curva de correlação e o limite de 1/2 bit, indicando o limite de resolução. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Resultados experimentais da reconstrução ULM da direção e velocidade do fluxo sanguíneo microvascular no cérebro de ratos in vivo. (A) Direção do fluxo sanguíneo no cérebro do rato. Azul indica fluxo ascendente em direção à sonda e vermelho indica fluxo descendente para longe da sonda. (B) Pequenas artérias e veias nas regiões corticais do cérebro de ratos delineadas com base na direção do fluxo sanguíneo. (C) Velocidade do fluxo sanguíneo no cérebro do rato. (D) Histograma de velocidade do fluxo sanguíneo no cérebro de ratos, mostrando a distribuição de 1 mm / s a 80 mm / s. As barras azuis claras representam a faixa de velocidade de 5 a 25 mm/s. A linha vermelha representa a curva ajustada aos dados, ilustrando o perfil típico de distribuição de velocidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Resultados experimentais da reconstrução ULM da estrutura microvascular no modelo de glioblastoma cerebral de rato in vivo. (A) Estrutura microvascular do cérebro de rato. (B) Direção do fluxo sanguíneo no cérebro do rato. (C) Velocidade do fluxo sanguíneo no cérebro do rato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Este protocolo utilizou com sucesso o ULM para realizar imagens de super-resolução da microvasculatura cerebral de ratos in vivo. Em comparação com outras modalidades de imagem, o ULM acomoda simultaneamente a resolução espacial e a profundidade de penetração. O cérebro do rato exposto foi fotografado e não através do crânio, evitando atenuação e distorção causadas pela presença de osso. Sob um transdutor com frequência central de 15,625 MHz, foram captadas estruturas vasculares a uma profundidade de aproximadamente 12 mm, com resolução espacial de até 12,5 μm. A direção do fluxo sanguíneo facilitou a diferenciação de regiões específicas de pequenas artérias e veias. Além disso, a técnica suporta uma ampla gama de medições de velocidade de fluxo (1-80 mm/s).
A craniotomia realizada em ratos é fundamental neste protocolo. Durante a cirurgia, é essencial minimizar o sangramento excessivo. Por um lado, o sangramento excessivo pode afetar a circulação sanguínea, sendo uma manifestação típica a ausência de reconstrução vascular nas áreas corticais. Por outro lado, também pode causar alterações fisiológicas ou até mesmo a morte nos animais experimentais. O dispositivo estereotáxico usado no procedimento apresenta um programa de craniotomia automatizado que pode reduzir o trauma e aumentar a taxa de sucesso, mas depende muito da experiência do médico. Isso ocorre porque a determinação precisa da localização e profundidade do local da broca é necessária para evitar causar danos ou lesões secundárias ao cérebro do rato. Embora a craniotomia nem sempre seja necessária, a imagem transcraniana do ULM mostra-se promissora, mas requer algoritmos robustos de compensação ou correção de distorção. Além disso, uma bomba de microinjeção é empregada para administrar MBs de forma constante, garantindo que permaneçam esparsos e estáveis dentro do sistema vascular do rato. Essa abordagem é amigável para técnicas convencionais de localização, pois facilita reconstruções ULM de alta qualidade. No entanto, ele estende a aquisição de dados e a duração da imagem, tornando a imagem ULM um processo prolongado. Uma estratégia alternativa envolve o uso de injeções de MB de alta densidade, o que requer a implementação de algoritmos avançados, como aprendizado profundo21,22, para manter a resolução da imagem sem degradação.
A anestesia com isoflurano foi utilizada seguindo a dosagem recomendada pelo fabricante do equipamento para manter a estabilidade fisiológica no rato. No entanto, conforme documentado em estudos anteriores, a anestesia com isoflurano tem efeitos conhecidos no sistema circulatório, potencialmente influenciando parâmetros cardiovasculares, como pressão arterial e frequência cardíaca23,24. Essas alterações podem introduzir variabilidade na dinâmica do fluxo sanguíneo, afetando potencialmente a precisão das medições do fluxo sanguíneo.
Em conclusão, este protocolo demonstra o amplo potencial de aplicação do ULM, fornecendo uma referência para pesquisas prospectivas de doenças cerebrais baseadas em modelos de pequenos animais. Possui valor significativo para a compreensão das alterações fisiopatológicas no nível microvascular e para avaliar a resposta da progressão da doença aos tratamentos.
Os autores não têm nada a divulgar.
Este trabalho foi apoiado em parte pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China sob a Concessão 2023YFC2410903, a Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Bolsas 12274092, 12034005), o Programa Explorer de Xangai (Concessão 21TS1400200), o Programa Internacional de Cooperação em Ciência e Tecnologia de Xangai (Concessão 24490710400) e a Fundação AI for Science da Universidade de Fudan (Concessão FudanX24AI016).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Alcohol | DICHANG | https://www.dehsm.com/goods-17187.html | 75% |
Beamforming program | Institute of Biomedical Engineering at the University of Montreal | Matlab Ultrasound Toolbox 3.4 version | |
Body temperature maintenance device | RWD Life Science Co., Ltd. | 69026 | |
Brain stereotaxic instrument | RWD Life Science Co., Ltd. | 71000-R | Adaptable to breathing mask |
Cranial Microinjection Surgical Instrument Kit | RWD Life Science Co., Ltd. | SP0005-R | |
Digital microscope | RWD Life Science Co., Ltd. | DOM-1001 | |
Drug delivery catheter | RWD Life Science Co., Ltd. | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/administration/draw-blood | |
Erythromycin ointment | Renhe Pharma | H36020018 | 1% x 15 g |
Gas anesthesia machine | RWD Life Science Co., Ltd. | R500IE | Includes breathing mask |
Handheld electric clipper | GUAZHOUMU | MJD-DTJ02 | |
Handheld mini cranial drill | RWD Life Science Co., Ltd. | 78001 | |
Indwelling needle | Kindly EnterpriseDevelopment Group Co., LTD | Positive Pressure Model | 26 G |
Iodine solution | HYNAUT | https://www.hainuocn.com/index/detail/524.html | 4.5–5.5 g/L |
IQ demodulation program | Institute of Biomedical Engineering at the University of Montreal | Matlab Ultrasound Toolbox 3.4 version | |
Isoflurane | RWD Life Science Co., Ltd. | R510-22-10 | |
MATLAB software | MathWorks | Version R2021a | |
Microinjection pump | RWD Life Science Co., Ltd. | R462 | |
Sodium chloride injection | SHENG'AO animals pharmaceutical Co., Ltd. | 270071460 | 0.90% |
SonoVue | Bracco | https://www.bracco.com/en-se/product/sonovue | |
Spherical drill bit | RWD Life Science Co., Ltd. | HM1027/HM1010 | |
Supporting Positioning Software | RWD Life Science Co., Ltd. | V2.0.0.30400 | |
Syringe | Kindly EnterpriseDevelopment Group Co., Ltd. | RWLB | 1 mL |
Tracking program | Jean-Yves Tinevez | 2016 version | |
Ultrasound gel | Junkang Medical Equipment Co., Ltd. | Model DS-1 | |
Ultrasound probe | VERASONICS, INC. | L22-14vX LF | |
Verasonics Ultrasound System | VERASONICS, INC. | Vantage-256 | ultrasound platform |
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