Modelagem da hidrocefalia pós-hemorrágica da prematuridade em ratos

A hidrocefalia pós-hemorrágica da prematuridade (PHHP) pode ser modelada em ratos neonatais combinando corioamnionite e hemorragia intraventricular. A combinação desses eventos pré-natais e pós-natais recapitula com precisão as características clínicas da PHHP, incluindo macrocefalia, ventriculomegalia e pressão intracraniana elevada, ao longo da vida.

A hidrocefalia da prematuridade pós-hemorrágica (PHHP) é uma sequela grave de hemorragia intraventricular grave (HIV) em recém-nascidos muito prematuros com menos de 32 semanas de idade gestacional (IG). A PHHP é definida pelo acúmulo de líquido cefalorraquidiano (LCR) associado a sintomas clínicos de pressão intracraniana (PIC) elevada. Bebês com PHHP sofrem dependência de shunt ao longo da vida, com metade exigindo cirurgia repetida no primeiro ano de vida e muitos exigindo várias cirurgias adicionais ao longo da vida. A corioamnionite pré-natal predispõe os prematuros à HIV grave e a necessidade de tratamento cirúrgico do PHHP tende à sepse neonatal. Essas características clínicas sugerem que a inflamação sistêmica é um componente integral da fisiopatologia do PHHP.

Aqui, definimos um modelo animal que recapitula todos os aspectos clínicos e características essenciais do PHHP em ratos. O objetivo deste protocolo é ilustrar como a corioamnionite in utero e a HIV pós-natal usando glóbulos vermelhos lisados podem ser combinados para produzir PHHP. Essa abordagem pré-clínica produz macrocefalia progressiva e crânios abobadados, pressão intracraniana elevada e ventriculomegalia que podem ser detectadas por ressonância magnética (RNM) ou microscopia. Além da interrupção sustentada na dinâmica do LCR, os ratos também apresentam atraso cognitivo e incapacidade funcional na idade adulta. Assim, esta plataforma pré-clínica facilita estudos translacionais únicos e incomparáveis de PHHP que podem incorporar medidas moleculares, celulares, bioquímicas, histológicas, de imagem e de resultados funcionais. Também pode ser usado para análise rigorosa do plexo coroide, cílios móveis ependimários e sistema glinfático em paralelo. Por último, também pode ser uma ferramenta pré-clínica inestimável para a investigação de novas estratégias de intervenção cirúrgica e abordagens terapêuticas não cirúrgicas para o tratamento da hidrocefalia.

A hidrocefalia pós-hemorrágica da prematuridade (PHHP) continua sendo um problema substancial de saúde pública. Definida pelo acúmulo sintomático de líquido cefalorraquidiano (LCR) concomitante com pressão intracraniana (PIC) elevada secundária à hemorragia intraventricular (HIV), a PHHP é uma manifestação grave de encefalopatia da prematuridade e contribui significativamente para a carga global de prematuridade e hidrocefalia adquirida ^1,2. Globalmente, aproximadamente 400.000 bebês a cada ano nascem ou adquirem a carga vitalícia da hidrocefalia³ e muitos morrem devido à falta de tratamento³. A PHHP é comum em países desenvolvidos em bebês muito prematuros (<32 semanas de gestação) com HIV grave, e muitas vezes afeta os bebês mais doentes que já sofrem de outras comorbidades com risco de vida ^4,5.

O único tratamento disponível para a hidrocefalia é a cirurgia⁶. Os procedimentos cirúrgicos proporcionam melhor longevidade quando os bebês têm mais de 6 meses no momento da primeira intervenção permanente, seja para um shunt ventriculoperitoneal (VP) para desviar o líquido cefalorraquidiano (LCR), terceira ventriculostomia endoscópica (ETV) ou ETV com coagulação do plexo coróide (ETV-CPC)⁷. A opção mais comum, os shunts VP, geralmente falham em um ano e predispõem as crianças a uma vida inteira de complicações, cirurgias repetidas e hospitalizações a um custo tremendo para a criança, a família e a sociedade. ⁸ Em particular, a ansiedade de um shunt potencialmente falhando a qualquer momento é onerosa para as famílias⁹. O cuidado de crianças com hidrocefalia sintomática, incluindo cirurgias frequentes, é uma das principais causas de gastos com saúde pediátrica 10,11,12,13,14. O custo anual estimado para gastos relacionados a shunts em crianças foi de US$ 2 bilhões em 2003¹⁵. Enquanto as crianças com shunts representam apenas 0,6% das internações hospitalares, elas geram 3,1% dos encargos hospitalares pediátricos¹⁵. Assim, a descoberta de terapias seguras e não cirúrgicas para o tratamento da PHHP é fundamental.

Em bebês, o PHHP se desenvolve após a HIV durante um período clínico que dura de semanas a meses após a identificação inicial do sangramento cerebral. Um estudo realizado pela Hydrocephalus Clinical Research Network (HCRN) confirmou que os shunts VP continuam sendo a melhor opção cirúrgica para neonatos com PHHP¹⁶. Mesmo para crianças com PHHP em países de alta renda com acesso a cuidados neurocirúrgicos pediátricos qualificados, os resultados estão longe de ser ideais, com >50% dos shunts colocados em bebês com PHHP exigindo revisão cirúrgica nos primeiros 2 anos⁸. Apesar da clara necessidade de identificar tratamentos mais seguros e eficazes para o PHHP, a pesquisa tem enfrentado obstáculos. O progresso tem sido dificultado em parte porque a literatura pré-clínica sobre PHHP muitas vezes não consegue distinguir adequadamente a ventriculomegalia causada por hidrocefalia ex vacuo ^17,18 da hidrocefalia sintomática com macrocefalia^19,20. De fato, os modelos de desenvolvimento da hidrocefalia devem incluir macrocefalia progressiva e/ou medições de PIC¹ elevada.

A fusão de insights clínicos e pré-clínicos melhorou o desenho do estudo e impulsionou nossa compreensão do PHHP². Estudos realizados em diversos centros em todo o mundo mostraram que a HIV é mais comum em neonatos muito prematuros secundários à corioamnionite 21,22,23,24,25,26,27,28. Além da infecção e inflamação placentária, a sepse neonatal é um importante fator de risco adicional e pode desempenhar um papel central na progressão de HIV para ventriculomegalia, PHHP sintomática e subsequente intervenção cirúrgica²⁹. Dados pré-clínicos e clínicos sustentam que a inflamação transmitida pelo sangue pode causar hidrocefalia²⁰, e a inflamação sistêmica aumenta a secreção de LCR pelo plexo coróide³⁰. Além disso, adultos com hemorragia subaracnóidea e HIV que também sofrem de sepse são muito mais propensos a necessitar de um shunt³¹. A literatura mais recente confirmou que a inflamação reduz a propulsão do LCR dos cílios móveis ependimários 19,20,32 e a reabsorção do LCR pelo sistema glinfático 33,34,35,36. No geral, a inflamação sistêmica é um fator fisiopatológico e clínico chave no PHHP¹.

Considerando esses achados, criamos um modelo pré-clínico de PHHP adequado à idade. Esse modelo combina a HIV no período pós-natal imediato e precoce com a corioamnionite, principal causa de parto prematuro¹⁹. Essa abordagem experimental inicia-se no útero, com a insuficiência placentária, inflamação placentária e inflamação intraamniótica que definem a corioamnionite 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ^,20,21,22,
23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40^,41,42,
43,44,45. Especificamente, recapitulamos uma síndrome da resposta inflamatória fetal, neutrofilia placentária e microambiente pró-inflamatório do SNC no período pré-termo por laparotomia abdominal em mães de ratos prenhes no dia embrionário 18 (E18) ^{37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44 , 45}. A lesão intrauterina é induzida pela oclusão bilateral temporária da artéria uterina levando à hipóxia-isquemia sistêmica transitória (TSHI) seguida de injeção intraamniótica de lipopolissacarídeo (LPS)37,38,39,40,41,42,43,44,45. Posteriormente, para perturbar a dinâmica do LCR e catalisar o desenvolvimento de hidrocefalia nos filhotes nascidos vivos, a HIV é induzida no dia 1 pós-natal. Isso é realizado com injeção intracerebroventricular bilateral (ICV) de hemácias lisadas (hemácias) nos ventrículos laterais 19,37,44. Os filhotes são então estudados à medida que a hidrocefalia se desenvolve e ao longo de sua vida.

O Comitê de Cuidados e Uso de Animais (ACUC) da Universidade Johns Hopkins aprovou todos os procedimentos experimentais aqui descritos. Este protocolo utiliza mães de ratos Sprague-Dawley grávidas e filhotes de ambos os sexos.

1. Indução de corioamnionite em E18

NOTA: A parte do insulto in utero deste protocolo foi publicada anteriormente em detalhes, está resumida acima e é o assunto de um protocolo JOVE separado e vídeo 19,37,38,39,40,41,42,43,44,46. Resumidamente, ratas Sprague-Dawley fêmeas grávidas são submetidas a laparotomia abdominal no dia embrionário 18 (E18) para induzir corioamnionite, que inclui TSHI e administração intraamniótica de LPS.

1. Anestesia
   1. Induzir anestesia na mãe de ratos prenhes E18 com 2-4% de isoflurano.
   2. Retirar a mãe grávida da câmara de indução e colocar o rato em decúbito dorsal sobre uma manta cirúrgica de água circulante ajustada a 37 °C.
   3. Aplique pomada oftálmica para evitar o ressecamento da córnea. Aperte suavemente uma pata para confirmar a ausência de reflexo de pinça do dedo do pé. Monitore a profundidade do anestésico a cada 15-20 min e aumente o isoflurano em caso de resposta positiva ao pinçamento do dedo do pé.
   4. Administre buprenorfina de liberação prolongada (0,1 mg / kg SC) na nuca.
2. Preparação cirúrgica e esfrega
   1. Usando a técnica estéril padrão, raspe o abdômen.
   2. Esfregue o abdômen 3x com betadina alternada e etanol a 70%.
   3. Cubra o animal usando campos cirúrgicos estéreis.
3. Laparotomia abdominal
   1. Faça uma incisão na linha média de 3 cm na pele abdominal preparada com um bisturi.
   2. Use fórceps e tesouras cirúrgicas para segurar a camada fascial abdominal e faça uma incisão da linha alba avascular da camada muscular para acessar a cavidade peritoneal.
   3. Exteriorize o útero.
   4. Isole e clampeie as artérias uterinas com clipes de aneurisma por 60 min. Mantenha a temperatura e mantenha o conteúdo intra-abdominal úmido com solução salina estéril.
   5. Remova os clipes e injete 100 μL de LPS (4 μg/saco de solução de LPS) em cada saco amniótico de cada feto. Não perturbe o feto ou a placenta.
   6. Irrigue os cornos uterinos e o campo generosamente 3x com solução salina estéril.
4. Fechando a laparotomia
   1. Substitua os cornos uterinos na cavidade peritoneal.
   2. Reaproxime as bordas da camada musculofascial e feche usando uma sutura 3-0 em execução.
   3. Aproxime novamente a camada de pele e feche a pele usando uma sutura 3-0 em execução.
   4. Use uma agulha 26 G para injetar subcutaneamente bupivacaína a 0,125% ao redor das bordas da ferida.
   5. Para controles simulados, realize a laparotomia pelo mesmo período de tempo para controlar durante a anestesia. Não aperte as artérias e não administre injeções intraamnióticas. Ao final do procedimento, feche a laparotomia em duas camadas (fáscia muscular abdominal e pele) com sutura 3-0. Em todos os casos, os filhotes nascem a termo (E21/22) e são cuidados pela mãe.

2. Preparação de glóbulos vermelhos lisados em P1

1. Coleta de sangue
   1. Pegue um filhote de rato Sprague-Dawley macho e uma fêmea no dia 1 pós-natal (P1) de uma ninhada que sofreu corioamnionite em E18. Decapite rapidamente cada filhote doador com uma tesoura cirúrgica dedicada.
      NOTA: Usamos 1 filhote macho e 1 fêmea para coleta de sangue para eliminar um possível viés sexual, representando cada um nas coortes de doadores. Além disso, usamos um par compatível com o sexo para garantir volume e rendimento suficientes de hemácias lisadas para injetar seus irmãos de ninhada. Normalmente, cada filhote doador produz hemácias lisadas suficientes para realizar a injeção de ICV em um máximo de 4-5 irmãos de ninhada.
   2. Colete o sangue imediatamente em um tubo de microcentrífuga de 2 mL contendo 0,2 mL de solução salina estéril, tomando cuidado para coletar apenas sangue de fluxo livre após a decapitação e não raspar ou apertar para produzir mais sangue, pois isso leva à hemólise prematura. Vórtice bem.
      NOTA: A quantidade exata de sangue varia de acordo com o animal doador e o peso individual, mas deve ser máxima, mantendo as precauções acima.
   3. Pique / pique coágulos sanguíneos com uma pequena tesoura cirúrgica.
   4. Centrifugue a suspensão de sangue a 500 × g por 10 min a 4 ^oC, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 0,2 mL de solução salina estéril. Vórtice bem.
   5. Pique / pique coágulos sanguíneos residuais pós-vórtice com uma pequena tesoura cirúrgica.
   6. Repita as etapas 2.1.4-2.1.5 mais duas vezes para um total de 3x, limpando a tesoura cirúrgica com spray de etanol a 70% entre cada rodada de lisagem.
2. Lise de glóbulos vermelhos
   1. Após a centrifugação final, adicione 0,25 mL de solução salina estéril ao pellet; vórtice bem.
   2. Coloque a suspensão em gelo seco por 5 min.
   3. Remova a suspensão do gelo seco, coloque-a em uma incubadora ajustada a 37,5 ^oC por 5 min até que esteja completamente descongelada e vortex bem.
   4. Repita os ciclos de congelamento e descongelamento para um total de 3x (três congelamentos e três descongelamentos).
   5. Na conclusão do último degelo, vortex e execute um giro rápido. As hemácias agora estão lisadas e prontas para uso.
      NOTA: A mistura deve ter uma cor opaca semelhante ao suco de tomate e ser facilmente transformada em seringas.

3. Injeções intracerebroventriculares de glóbulos vermelhos lisados em P1

1. Anestesia com hipotermia
   1. Coloque uma pequena plataforma no gelo úmido para esfriar.
   2. Coloque um lenço seco de laboratório por cima para proteger a pele do filhote.
      NOTA: Esta superfície plana e fria é usada para anestesiar e injetar os filhotes.
   3. Transfira o filhote (P1 envelhecido) da almofada de aquecimento para a limpeza de tarefas sobre a plataforma fria para induzir a anestesia por hipotermia.
   4. Confirme a profundidade da anestesia apertando uma pata e confirmando a ausência do reflexo de pinça do dedo do pé.
   5. Defina uma lâmpada cirúrgica externa para suas configurações mais brilhantes.
   6. Com um assistente usando o indicador e o dedo médio para manter suavemente a linha média da cabeça do animal, transilumine o crânio para visualizar os ventrículos laterais através do crânio. Identifique o bregma visualizando o seio sagital superior (linha média) através da pele e palpando a sutura coronal com pinças finas como pontos de referência de interseção.
2. Injeção de ICV
   1. Limpe a cabeça do filhote anestesiado com um cotonete embebido em etanol a 70%.
   2. Identifique e marque o local da injeção como 1 mm lateral da sutura sagital, a meio caminho entre lambda e bregma.
   3. Após a visualização, use uma seringa de insulina de 0,3 mL, 8 mm de comprimento e 31 G com uma agulha percutânea ultrafina para injetar 20 μL de hemácias lisadas no ventrículo lateral direito. Insira a agulha diretamente para baixo usando a técnica à mão livre até uma profundidade de aproximadamente metade do comprimento da agulha e injete e remova a agulha lentamente (processo de injeção e remoção em aproximadamente 10-15 s).
   4. Deixe a agulha no lugar por vários segundos após a injeção para evitar a saída das hemácias lisadas injetadas.
   5. Repita com o ventrículo lateral esquerdo e injete 20 μL de hemácias lisadas.
   6. Coloque o filhote em uma almofada de aquecimento ajustada a 37,5 ^oC para se recuperar da anestesia.
   7. Registre o sexo do filhote e atribua um identificador único de animal.
   8. Retorne o filhote para a gaiola de casa somente após a recuperação total na almofada de aquecimento e a recuperação da consciência, de modo que o animal possa manter a decúbito esternal com segurança.
   9. Monitore todos os filhotes de ratos diariamente quanto à saúde e bem-estar.

4. Confirmação de hemorragia intraventricular bilateral bem-sucedida em P2

1. Ultrassonografia de cabeça
   1. Para se preparar para o ultrassom da cabeça, remova os filhotes P2 de sua gaiola doméstica.
   2. Coloque o gel de ultrassom na sonda de ultrassom e posicione a sonda sobre a parte superior do crânio.
   3. Com pressão extremamente leve, mova a sonda para visualizar os ventrículos. Confirme a hiperecogenicidade bilateral nos ventrículos laterais representando a HIV.

5. Confirmação de hidrocefalia pós-hemorrágica bem-sucedida

1. Medição da distância intraaural (IAD), um substituto para o perímetro cefálico, para confirmar a macrocefalia
   1. Para se preparar para a medição, adquira uma pequena fita métrica apropriada para medir a circunferência da cabeça, de preferência com designações milimétricas claramente visualizadas.
   2. Peça a um observador mascarado que remova o filhote de sua gaiola doméstica.
   3. Enquanto segura suavemente o filhote, meça a distância de orelha a orelha (distância intraaural, IAD) e registre o valor em milímetros.
   4. Repita o IAD diariamente de P1 a P15 e represente graficamente os valores. Rastreie o IAD em série e meça novamente em P21 ao realocar os filhotes para novas gaiolas fisicamente separadas da mãe (que é o ponto de tempo padrão para o desmame do filhote). Repita o IAD posteriormente a cada 5 dias, começando em P25 até P60.
2. Medição da pressão de abertura para confirmar a pressão intracraniana elevada
   1. Peça a um observador mascarado que remova o filhote de sua gaiola doméstica.
   2. Anestesiar com 75-100 mg/kg de cetamina intraperitoneal (IP) e 5-10 mg/kg de xilazina IP em preparação para a eutanásia.
   3. Verifique a profundidade da anestesia apertando uma pata e confirmando a ausência do reflexo de pinça / pedal do dedo do pé.
   4. Insira uma pequena agulha (31 G) conectada a um manômetro no espaço do LCR da junção cervicomedular.
   5. Registre a pressão de abertura no manômetro.
   6. Retire a agulha e decapite o rato com uma tesoura afiada e prossiga com a coleta de tecidos.
3. Ressonância magnética (RM) ex-vivo para avaliação da ventriculomegalia
   1. Anestesiar com 75-100 mg/kg de cetamina intraperitoneal (IP) e 5-10 mg/kg de xilazina IP em preparação para a eutanásia.
   2. Verifique a profundidade da anestesia apertando uma pata e confirmando a ausência do reflexo de pinça / pedal do dedo do pé.
   3. Perfundir os ratos com solução salina tamponada com fosfato (PBS), seguido de paraformaldeído a 4% (PFA) até ficar bem fixado.
   4. Remova o cérebro e fixe o cérebro em 4% de PFA
   5. Incorpore o cérebro em agarose a 2% em um tubo cônico de 50 mL. Deixe repousar em temperatura ambiente.
   6. Transfira o cérebro para o scanner de ressonância magnética para ressonância magnética ex vivo .
   7. Execute 11.7T MRI da seguinte forma: T2 Turbo RARE; TE/TR = 30,0/3000 ms; média = 2; Espaçamento entre eco = 10.000 ms; Fator RARO = 8; número de fatias = 30; espessura do corte = 1 mm; tamanho da imagem = 128 x 128; FOV = 28 mm x 28 mm; resolução de corte = 0,219 x 0,219 mm²; FA = 90,0°.
      NOTA: Embora a ressonância magnética forneça evidências de modelagem bem-sucedida do PHHP, não é necessário escanear todos os cérebros em uma determinada coorte para verificar o PHHP. A medição do IAM e do ICP é suficiente para verificar conforme descrito acima. Em última análise, a capacidade de um investigador de realizar ressonância magnética in vivo ou ex vivo dependerá de uma variedade de fatores, como acesso ao scanner de ressonância magnética, fundos e capacidade técnica. Esta etapa é particularmente útil para validação ao incorporar recentemente o modelo PHHP. É fundamental observar que, na ausência de sinais documentados de aumento da pressão intracraniana, como pressão de abertura elevada, achados isolados de ventriculomegalia na ressonância nuclear magnética (RNM) não representam hidrocefalia.

Usando este modelo, a hidrocefalia se desenvolve nos dias e semanas após a injeção de glóbulos vermelhos lisados. Uma representação de um desenho experimental típico e progressão da hidrocefalia é fornecida na Figura 1. Foram avaliados 5-6 animais sham e 6-8 animais PHHP por grupo. Quando juvenis, os ratos com PHHP exibiram macrocefalia (Figura 2), pressão intracraniana elevada (Figura 3) e ventriculomegalia (Figura 4). A constelação e a combinação desses achados representam hidrocefalia. Esses ratos também apresentam atraso no desenvolvimento¹⁹ e, quando adultos, sobrevivem com dificuldades cognitivas persistentes e PIC elevada. Os homens têm pior desempenho do que as mulheres neste modelo¹⁹, o que replica o cenário clínico em que os homens são mais propensos a desenvolver hidrocefalia ^3,19. Os investigadores que usam esta plataforma experimental para estudar a hidrocefalia poderão confirmar a conclusão bem-sucedida do procedimento visualizando macrocefalia progressiva e um crânio abobadado que se desenvolve ao longo de 5 dias após a indução de IVH e mantido ao longo da vida (Figura 2). A macrocefalia sustentada é um sinal essencial, clinicamente importante e facilmente identificável de um procedimento bem-sucedido. No dia 21 pós-natal (P21), aumentos estatisticamente significativos nas DAIs (substituto do perímetro cefálico usado clinicamente) e na pressão de abertura são quantificáveis (Figura 3). Da mesma forma, a ventriculomegalia e o aumento do volume ventricular são observáveis na ressonância magnética e na histologia em comparação com os controles simulados (Figura 4)^1,2,19. A quantificação do volume ventricular por ressonância magnética estrutural ou por meio de procedimentos histológicos padrão, como violeta de cresil ou coloração de hematoxilina e eosina, é um excelente complemento para difusão mais sofisticada e imagens funcionais. Esses dados são consistentes com as características clínicas do PHHP, incluindo macrocefalia, dinâmica do LCR interrompida levando à expansão ventricular e PIC elevada.

Figura 1: Desenho experimental. O protocolo de indução de PHHP inicia-se com a indução de corioamnionite em ratos no 18º dia embrionário (E18) e hemorragia intraventricular no 1º dia pós-natal (P1). A hidrocefalia se desenvolve e evolui ao longo da vida e pode ser avaliada por várias métricas, incluindo ensaios funcionais, até a idade adulta. Abreviaturas: PHHP = hidrocefalia pós-hemorrágica da prematuridade; HIV = hemorragia intraventricular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Macrocefalia tipificando PHHP. Ratos com PHHP têm crânios aumentados e abobadados e macrocefalia em comparação com controles simulados. Abreviatura: PHHP = hidrocefalia pós-hemorrágica da prematuridade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Quantificação da macrocefalia e pressão intracraniana elevada. Ratos com PHHP (n = 8) aumentaram a distância intra-aural (um substituto para o perímetro cefálico) e aumentaram a pressão de abertura (pressão intracraniana, n = 6) no dia 21 pós-natal (P21) em comparação com os controles simulados (n = 5-6). (teste t **p < 0,01, as barras de erro representam o erro padrão da média). Abreviatura: PHHP = hidrocefalia pós-hemorrágica da prematuridade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Ratos com PHHP têm ventriculomegalia moderada a grave. Ratos com PHHP têm ventrículos aumentados e volume ventricular aumentado em comparação com controles simulados claramente identificáveis na ressonância magnética. (A) A imagem estrutural T2 mostra dilatação ventricular no plano coronal de anterior para posterior em P21. (B) Os aumentos do volume ventricular em ratos PHHP em comparação com animais simulados também são visíveis nos planos axial, coronal e sagital em ratos adultos em P60. Os volumes ventriculares podem ser quantificados usando (C) ressonância magnética (n = 5-7 / grupo) e emparelhados com (D) reconstrução 3D do sistema ventricular em qualquer idade. (teste t **p < 0,01, as barras de erro representam o erro padrão da média). Abreviatura: PHHP = hidrocefalia pós-hemorrágica da prematuridade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Este protocolo para a indução de PHHP permite medidas de resultados rigorosas, quantificáveis e clinicamente traduzíveis da estrutura e função cerebral concomitantes com características fenotípicas da hidrocefalia, incluindo elevação crônica da PIC, ventriculomegalia e macrocefalia, desde o nascimento até a idade adulta⁴. Ensaios bioquímicos, histológicos e funcionais podem ser usados para avaliar a saúde do plexo coróide, ependima e sistema glinfático, bem como da substância cinzenta e branca¹⁹. Além disso, este modelo pode apoiar a integração de imagens funcionais do LCR e cílios de células vivas com neuroimagem multimodal e resultados biocomportamentais. Também pode ser usado para combinar estudos mecanísticos usando citometria de fluxo multiparâmetro e ensaios dinâmicos de células neurais com histologia e imunoquímica para avaliar rigorosamente o microambiente ventricular. Juntamente com avaliações digitais da marcha e testes de cognição e função executiva com tela sensível ao toque ^2,19, essa abordagem pode permitir a avaliação de biomarcadores celulares, fluidos e neurocomportamentais não utilizados anteriormente em estudos translacionais de PHHP.

Para famílias de crianças com PHHP, a maior prioridade após a função de shunt durável é a melhora do resultado cognitivo e a promessa de estratégias de tratamento não cirúrgico 47,48,49. O desenvolvimento de farmacoterapias para atender a essas necessidades é o primeiro passo para transformar o cuidado de crianças com PHHP 2,47,48,49. Este modelo pré-clínico é passível de testar regimes de medicamentos e produtos farmacêuticos emergentes. É apropriado para a avaliação de intervenções não cirúrgicas e tratamentos farmacológicos projetados para modular a dinâmica do LCR. Esses medicamentos podem ser administrados por várias vias de administração nos ratos (ou seja, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, minibomba osmótica) e sua hidrocefalia e ventriculomegalia podem ser rastreadas, monitoradas e quantificadas ao longo da vida usando sinais clínicos e de imagem. Vários aspectos da saúde do cérebro também podem ser testados, incluindo volume ventricular, perda de substância branca e conectividade funcional. Histologia, imuno-histoquímica, qPCR e experimentos associados podem ser realizados na coleta de tecidos de regiões específicas e desfechos distintos do desenvolvimento. Esta plataforma para estudo em ratos também pode facilitar o estudo de condições comórbidas associadas à hidrocefalia, incluindo paralisia cerebral, epilepsia e dor crônica⁴.

A mortalidade nesse modelo é de 3-7% e ocorre mais frequentemente nas primeiras 48 h pós-HIV^19,44. Ocasionalmente, os filhotes de ratos não conseguem ganhar peso e se alimentar de forma eficaz. Essa falha no crescimento pôde ser resultado direto da macrocefalia progressiva associada a um procedimento bem-sucedido ou hemorragia cortical/subcortical causada por uma técnica inadequada de injeção de ICV. Na ausência da precisão necessária, pode-se observar infarto hemorrágico cortical ou trauma da base do crânio. Os cuidados pós-natais podem ser interrompidos pelas intervenções pré-natais ou pós-natais descritas, pois os filhotes são marcadamente diferentes dos controles simulados em relação ao formato da cabeça, tamanho do corpo e comportamento. A técnica cirúrgica e de injeção adequada, combinada com proficiência neuroanatômica avançada, é crucial para garantir que os resultados representativos acima sejam totalmente realizados.

Esta plataforma pré-clínica requer a realização de uma laparotomia abdominal aberta em ratas prenhes. Isso requer habilidade cirúrgica avançada. No período pós-natal, a falha em injetar com precisão as hemácias lisadas nos ventrículos laterais não resultará em HIV nem PHHP e esses ratos não crescerão para demonstrar macrocefalia progressiva, pressão de abertura elevada ou ventriculomegalia. O conforto com injeções à mão livre e a anatomia ventricular de roedores neonatais é essencial. Notavelmente, fontanelas abertas e crânios relativamente finos possibilitam a transiluminação e facilitam a identificação de marcos neuroanatômicos, como bregma e os aspectos dorsais dos ventrículos laterais necessários para a colocação bem-sucedida da agulha. A HIV unilateral é possível se ambos os ventrículos laterais não forem acessados, e isso pode resultar em macrocefalia transitória, mas não persistente. A saída do LCR após o acesso ventricular é um indicador adequado de injeções bem-sucedidas. Da mesma forma, a aspiração de LCR para o cubo da agulha antes da injeção de hemácias lisadas garante que o injetor esteja no espaço ventricular adequado para prosseguir com a injeção. Embora a ventriculomegalia na ressonância magnética possa estar presente na ausência de hidrocefalia (encefalomalácia), a combinação desse achado, juntamente com pressão de abertura elevada e déficits neurocognitivos, representa a execução bem-sucedida da técnica PHHP.

A análise do sucesso do procedimento pode ser verificada comparando as métricas representativas acima entre filhotes que foram submetidos à injeção ICV de hemácias lisadas e filhotes simulados ou em filhotes que foram submetidos à injeção de ICV versus filhotes de controle que apresentaram corioamnionite, mas não injeção ICV de hemácias lisadas. É importante ressaltar que as barragens simuladas sofrem exposição ao isoflurano, bem como laparotomia e externalização uterina. Ao contrário do modelo PHHP, no entanto, os sacos amnióticos e o útero são então devolvidos à cavidade abdominal e a laparotomia é concluída sem oclusão da artéria uterina ou injeção de LPS. Os filhotes nascidos dessas barragens simuladas normalmente não recebem injeções de hemácias lisadas, pois é a combinação específica de TSHI + LPS no útero (que os fetos simulados não experimentam) seguida de IVH que leva ao PHHP. Além disso, por ter controles pareados por idade e sexo que não são expostos a TSHI + LPS ou IVH, somos capazes de validar o sucesso técnico do modelo e comparar mais diretamente os resultados das coortes PHHP que receberam intervenção com os resultados de suas contrapartes simuladas. Essa comparação permite testes robustos de eficácia do modelo e de quaisquer intervenções terapêuticas nele.

Apesar da proficiência técnica exigida, este modelo é vantajoso em comparação com outros modelos de HIV precoce e hidrocefalia porque é adequado à idade, incorpora inflamação sistêmica, tem sequelas de PHHP em evolução até a idade adulta e oferece a oportunidade de avaliar medidas de resultados translacionais, como testes funcionais sofisticados e neuroimagem 30,50,51,52. Também produz ventriculomegalia sustentada e PIC elevada. O uso de hemácias lisadas aumenta a relevância translacional desse modelo. Bebês prematuros que sofrem de HIV têm sangue total liberado em seus ventrículos. Esse sangue permanece no sistema ventricular do LCR e se degrada ao longo de semanas (lise de hemácias), levando a uma resposta inflamatória persistente nos ventrículos, comumente vista na ultrassonografia de crânio de rotina como hiperecogenicidade ependimária^53,54. O uso de hemácias lisadas corrobora e fundamenta trabalhos anteriores que avaliam a eficácia de hemoderivados/componentes individuais na criação de hidrocefalia e ventriculomegalia sustentada⁵⁵. Ao contrário dos concentrados de hemácias, a injeção intraventricular de hemácias lisadas resulta em ventrículos significativamente aumentados na ressonância magnética 24 h após a injeção e além de^19,55. Descobriu-se que a injeção de hemácias lisadas regula positivamente os níveis de hemoxigenase-1 e ferritina no espaço periventricular quando comparada à injeção concentrada de hemácias ou solução salina⁵⁵. Isso é importante, pois a fisiopatologia da HIV humana se deve em grande parte à quebra do sangue inicial e à liberação gradual de produtos de degradação do ferro e outros componentes do sangue concomitantes com danos teciduais resultantes.

A heme-oxigenase 1 é uma enzima importante na degradação do heme, e a ferritina é uma proteína de armazenamento de ferro; assim, seu aumento da concentração periventricular após a injeção de hemácias lisadas se alinha intimamente com a etiologia da HIV humana. Por fim, a injeção de ferro apenas nos espaços ventriculares negligencia outros componentes das hemácias, como a anidrase carbônica 29. Além disso, a injeção de ferro não maximiza a gravidade potencial da HIV induzida, que se correlaciona diretamente com a probabilidade de hidrocefalia subsequente. Como a escolha de usar hemácias lisadas, a lógica por trás da injeção de ambos os ventrículos é aumentar a translação. A literatura clínica mostra um claro aumento da associação entre a HIV mais grave e a PHHP subsequente. A introdução de hemorragias bilateralmente por si só aumenta a gravidade da HIV, bem como a probabilidade de extensão da matriz germinativa para os espaços ventriculares e dilatação ventricular resultante - outra característica da HIV mais grave. Além disso, conforme descrito acima, a injeção bilateral também permite um modo de avaliar a comunicação do LCR. Vinte microlitros é o menor volume para atingir de forma confiável a hidrocefalia sustentada e sem envolvimento parenquimatoso significativo, de modo que a mortalidade de filhotes de ratos se torna uma variável complicada.

Em conclusão, o uso de um modelo animal que recapitula os aspectos clínicos do PHHP, incluindo macrocefalia progressiva, pressão intracraniana elevada, ventriculomegalia e atraso cognitivo na idade adulta, adiciona rigor ao campo e facilita estudos únicos e incomparáveis necessários para novas abordagens terapêuticas e melhor compreensão mecanicista da complexa fisiopatologia dessa forma comum de lesão cerebral perinatal.

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Os autores agradecem o financiamento fornecido pelos Institutos Nacionais de Saúde (R01HL139492), pelo Programa de Pesquisa Médica Dirigido pelo Congresso (W81XWH1810166, W81XWH1810167, W81XWH2210461 e W81XWH2210462), pela Associação de Hidrocefalia e pelo Instituto de Pesquisa Rudi Schulte.