Avaliação das Toxicidades Associadas às Células T do Receptor de Antígeno Quimérico Usando um Modelo de Xenoenxerto de Camundongo Derivado de Pacientes com Leucemia Linfoblástica Aguda

Aqui, descrevemos um protocolo no qual um modelo de xenoenxerto derivado de pacientes com leucemia linfoblástica aguda é usado como estratégia para avaliar e monitorar as toxicidades associadas ao receptor de antígeno quimérico CD19-alvo.

A terapia celular com receptor de antígeno quimérico T (CART) emergiu como uma ferramenta poderosa para o tratamento de vários tipos de malignidades CD19⁺ , o que levou à recente aprovação pelo FDA de várias terapias celulares CART direcionadas para CD19 (CART19). No entanto, a terapia celular CART está associada a um conjunto único de toxicidades que carregam sua própria morbidade e mortalidade. Isso inclui a síndrome de liberação de citocinas (SRC) e a neuroinflamação (NI). O uso de modelos pré-clínicos em camundongos tem sido crucial na pesquisa e desenvolvimento da tecnologia CART para avaliar tanto a eficácia quanto a toxicidade da CART. Os modelos pré-clínicos disponíveis para testar essa imunoterapia celular adotiva incluem modelos de camundongos singênicos, xenoenxertos, transgênicos e humanizados. Não há um modelo único que espelhe perfeitamente o sistema imunológico humano, e cada modelo tem pontos fortes e fracos. Este artigo tem como objetivo descrever um modelo de xenoenxerto derivado de pacientes usando blastos leucêmicos de pacientes com leucemia linfoblástica aguda como estratégia para avaliar toxicidades associadas à CART19, RSC e NI. Demonstrou-se que esse modelo recapitula as toxicidades associadas à CART19, bem como a eficácia terapêutica observada na clínica.

A terapia celular com receptor de antígeno quimérico T (CART) revolucionou o campo da imunoterapia contra o câncer. Provou ser bem-sucedida no tratamento da leucemia linfoblástica aguda (LLA) recidivante/refratária, linfoma de grandes células B, linfoma de células do manto, linfoma folicular e mieloma múltiplo1,2,3,4,5,6,7^, levando a recentes aprovações do FDA. Apesar do sucesso inicial nos ensaios clínicos, o tratamento com terapia celular CART resulta em toxicidades muitas vezes graves e ocasionalmente letais. As toxicidades mais comuns após a terapia celular com CART incluem o desenvolvimento de RN e RN, também conhecida como síndrome de neurotoxicidade associada a células efetoras imunes (ICANS)^8,9. A RSC é causada devido à superativação e expansão maciça das células CART in vivo, levando à secreção subsequente de múltiplas citocinas inflamatórias, incluindo interferon-γ, fator de necrose tumoral-α, fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) e interleucina-6 (IL-6). Isso resulta em hipotensão, febre alta, síndrome de extravasamento capilar, insuficiência respiratória, falência de múltiplos órgãos e, em alguns casos, morte^10,11. A RSC desenvolve-se em 50-100% dos casos após terapia celular com CART19^11,12,13. A ICANS é outro evento adverso único associado à terapia celular com CART e é caracterizada por edema cerebral generalizado, confusão, obnubilação, afasia, fraqueza motora e, ocasionalmente, convulsões ^9,14. Qualquer grau de ICANS ocorre em até 70% dos pacientes, e os graus 3-4 são relatados em 20-30% dos pacientes 5,10,15,16. Em geral, a SRC e a ICANS são comuns e podem ser fatais.

O manejo da ICANS após a terapia celular com CART é desafiador. A maioria dos pacientes com ICANS também apresenta RSC¹⁷, que muitas vezes pode ser tratada com o antagonista do receptor de IL-6 tocilizumabe ou esteroides¹⁸. Um relato anterior revelou que a intervenção precoce com tocilizumabe diminuiu a taxa de RSC grave, mas não afetou a incidência ou a gravidade da ICANS¹⁹. Atualmente, não há tratamento efetivo ou agente profilático para o ICANS, sendo crucial investigar estratégias^{preventivas 20}.

Acredita-se que as células mieloides e as citocinas/quimiocinas associadas sejam os principais impulsionadores do desenvolvimento da RSC e ICANS²¹. Enquanto a RSC está diretamente relacionada à elevação extrema de citocinas e expansão de células T, a fisiopatologia da ICANS é amplamente desconhecida^22,23. Portanto, é imperativo estabelecer um modelo de camundongo que recapitule essas toxicidades após a terapia celular com CART para estudar os mecanismos e desenvolver estratégias preventivas.

Existem vários modelos animais pré-clínicos atualmente usados para estudar, otimizar e validar a eficácia de células CART, bem como para monitorar suas toxicidades associadas. Estes incluem camundongos singênicos, xenoenxertos, transgênicos imunocompetentes, transgênicos humanizados e xenoenxertos derivados de pacientes, além de modelos de primatas. No entanto, cada um desses modelos apresenta desvantagens, e alguns não refletem as verdadeiras preocupações de eficácia ou segurança das células CART^24,25. Portanto, é imperativo a escolha criteriosa do melhor modelo para os objetivos pretendidos do estudo.

Este artigo procura descrever a metodologia utilizada para avaliar a toxicidade associada às células CART, RNC e NI, utilizando um modelo in vivo de xenoenxerto derivado de ALL (PDX) (Figura 1). Especificamente, nos métodos aqui descritos, as células CART19 geradas em nosso laboratório são utilizadas seguindo protocolos previamente descritos. Resumidamente, as células T humanas são isoladas de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de doadores saudáveis por meio de uma técnica de gradiente de densidade, estimuladas com esferas CD3/CD28 no dia 0 e transduzidas lentiviricamente no dia 1 com CARs compostas por um fragmento variável de cadeia única direcionado para CD19 fundido aos domínios de sinalização 4-1BB e CD3ζ. Essas células CART são então expandidas, desfrisadas no 6º dia e criopreservadas no 8º dia 26,27,28,29,30. Como descrito anteriormente, camundongos são submetidos a tratamento linfodepletante, seguido pela administração de blastos leucêmicos derivados do paciente (LLA)²⁸. Primeiro, verifica-se a enxertia tumoral por meio da coleta de sangue submandibular. Após o estabelecimento de uma carga tumoral apropriada, as células CART19 são administradas aos camundongos. Em seguida, os ratos são pesados diariamente para avaliar o bem-estar. A ressonância magnética (RM) de pequenos animais é realizada para avaliar a infecção hospitalar, juntamente com o sangramento da cauda para avaliar a expansão de células T e a produção de citocinas/quimiocinas. As técnicas descritas abaixo são altamente recomendadas para serem usadas como modelo para estudar toxicidades associadas a células CART em um modelo PDX.

Este protocolo segue as diretrizes do Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Mayo Clinic, Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC A00001767) e Comitê Institucional de Biossegurança (IBC, Bios00000006.04).

NOTA: Todos os materiais utilizados para trabalhar com ratos devem ser estéreis.

1. Injeção de bussulfano em camundongos NSG

1. Obter camundongos machos, 8-12 semanas de idade, imunocomprometidos, NOD-SCID IL2rγnull (NSG), e pesá-los antes da injeção.
   NOTA: Para significância estatística, recomenda-se usar pelo menos cinco camundongos por grupo e repetir este experimento pelo menos mais uma vez com camundongos fêmeas.
2. Preparar bussulfano para injeção intraperitoneal (i.p.). Usando uma seringa de insulina de 1 mL, encha lenta e cuidadosamente a seringa com exatamente 30 mg/kg de bussulfano, seguido de injeção i.p nos camundongos, e coloque-os de volta na gaiola.

2. Injeção de TODOS os blastos derivados do paciente (CD19⁺) nos camundongos NSG

NOTA: Este protocolo segue as diretrizes do Comitê Institucional de Biossegurança da Mayo Clinic (IBC, Bios00000006.04).

1. Coletar blastos leucêmicos primários do sangue periférico de pacientes com LLA recidivante e refratária.
2. Preparar células-alvo para injeção intravenosa (IV).
   1. Conte as células-alvo CD19⁺ usando um hemocitômetro e registre o volume final e a concentração das células.
      NOTA: Para determinar a viabilidade celular, é altamente recomendável utilizar o azul de tripano durante a contagem das células.
   2. Pellet as células por centrifugação a 300 × g durante 5 min a 4 °C.
   3. Ressuspender o pellet celular em solução salina tamponada com fosfato (PBS) até uma concentração final de 50 × 10⁶ células/mL em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e colocar no gelo.
   4. Vórtice do dedo o tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo as células-alvo até que as células estejam completamente homogeneizadas.
   5. Usando uma seringa de insulina de 1 mL, encha lenta e cuidadosamente a seringa com exatamente 100 μL das células-alvo preparadas e mexa na seringa para remover bolhas.
      NOTA: O volume de 100 μL administrará 5 × 10⁶ células a cada rato.
   6. Coloque os ratos sob luz morna por 5-10 min. Uma vez que a veia da cauda se torne ingurgitada e mais visível a olho nu, coloque os ratos em uma câmara de confinamento/contenção apropriada.
   7. Limpe a cauda do rato com um cotonete com álcool. Injete as células-alvo diretamente na veia da cauda (i.v.) e coloque o camundongo de volta na gaiola. Após a inoculação das células-alvo, monitorar os camundongos diariamente ou conforme recomendado pelo comitê de ética animal local.

3. Avaliação do enxerto tumoral

1. A partir de 6 semanas após a injeção da célula-alvo, avaliar o enxerto tumoral usando citometria de fluxo para medir a expressão de células CD19⁺ no sangue periférico.
2. Dosagem de sangue periférico para avaliação da expansão CD19⁺
   1. Retirar o sangue dos ratinhos 6-8 semanas após a injeção de células CART19.
      NOTA: Vários métodos podem ser usados para retirar sangue. Para esse protocolo, a coleta de sangue submandibular é o método de escolha.
   2. Anestesiar o camundongo com isoflurano em câmara de indução com isoflurano a 5%. Uma vez obtida a anestesia, manter a 1-3% o isoflurano inalado através de um cone nasal.
      NOTA: É altamente recomendável aplicar pomada oftálmica para evitar o ressecamento dos olhos.
   3. Retire o mouse da câmara e segure o mouse com a mão não dominante, segurando a pele solta sobre o pescoço. Puncione a veia com uma lanceta ligeiramente atrás da mandíbula.
      NOTA: Apenas a ponta da agulha (1-2 mm) é necessária para entrar na veia.
   4. À medida que o sangue estiver pingando, colete pelo menos 50 μL em um tubo revestido com heparina e misture bem invertendo o tubo para cima e para baixo várias vezes. Transfira 30 μL de sangue para um tubo de poliestireno de fundo redondo de 5 mL.
      NOTA: Para o sangue restante, gire o tubo a 17.000 × g durante 10 minutos a 4 °C. Transfira o soro (camada sobrenadante) para um tubo de microcentrífuga limpo e marcado de 1,5 mL e armazene-o a −80 °C (para uso no ensaio de citocinas).
   5. Adicionar 2 ml de tampão de lise (tampão de lise à base de cloreto de amónio 10x diluído a 1x utilizando água isenta de nucleases) no tubo de fundo redondo de 5 ml que contém o sangue. Misture muito bem agitando o tubo. Incubar o tubo à temperatura ambiente durante 20 minutos para garantir a lise adequada dos glóbulos vermelhos.
   6. Adicionar 2 mL de tampão de fluxo (PBS, 0,2 g/L de cloreto de potássio, 0,2 g/L de fosfato de potássio monobásico, 8 g/L de cloreto de sódio e 1,15 g/L de fosfato dibásico de sódio contendo 2% de soro fetal bovino e 1% de azida sódica).
   7. Centrifugar o tubo a 300 × g durante 5 min a 4 °C. Decantar o sobrenadante e adicionar 2 mL de tampão de fluxo. Repita este passo de lavagem 2x.
   8. Decantar cuidadosamente o conteúdo do tubo. Observe a pequena quantidade de líquido com um pellet remanescente no tubo. Adicione 100 μL de tampão de fluxo e ressuspenda muito bem.
   9. Transfira todo o líquido restante no tubo de fluxo de 5 mL para uma placa de 96 poços. Certifique-se de que cada amostra está devidamente rotulada. Adicionar 100 μL de tampão de fluxo aos poços correspondentes e centrifugar a placa de 96 poços a 650 × g durante 3 min a 4 °C.
3. Avaliar a expansão das células-alvo CD19⁺ por citometria de fluxo (Figura 2).
   1. Preparar uma mistura principal contendo 0,3 μL de coloração viva/morta, 0,13 μg (2,5 μL) de anticorpo anti-humano CD19, 0,06 μg (2,5 μL) de anticorpo anti-humano CD45, 5 μg (2,5 μL) de anti-camundongo CD45 e 42,2 μL de tampão de fluxo para um total de 50 μL por amostra. Incubar no escuro à temperatura ambiente durante 15 minutos.
   2. Lavar com 150 μL de tampão de fluxo seguido de centrifugação a 650 × g durante 3 min a 4 °C. Decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 195 μL de tampão de fluxo e 5 μL de esferas de contagem.
   3. Adquira em um citômetro de fluxo para determinar o nível de expressão de células CD19⁺ . Para fins de gating e análise, primeiro gate a população de interesse (CD19⁺) com base nas características de dispersão frontal versus lateral, seguido por uma única população de gating e, em seguida, células vivas. Uma vez que as células vivas são gated, avaliar a população CD45 humana versus CD45 de camundongo, e da população humana, porta a população-alvo CD19⁺ .
4. Quantificar para determinar a quantidade presente em 70 μL, e então expressar em células/μL usando a equação (1):
   Contagem absoluta de células CD19+ = ([células CD19⁺/contas de contagem] × número de contas de contagem dentro de 5 μL)/70
   NOTA: Repetir o ensaio de sangue periférico a cada 5 dias para avaliar a expansão celular CD19⁺ . Coletar no máximo 200 μL de sangue cumulativamente a cada 2 semanas, de acordo com as diretrizes do comitê local de ética animal. Uma vez que os camundongos tenham atingido uma carga de doença de ≥10 células/μL, randomize para células CART19 ou grupos de controle (seção 4).

4. Administração de células CART19 in vivo

1. Preparação das células CART19 (~Dia 80):
   NOTA: A geração de células CART19 já foi previamente publicada 27,30,31. Este procedimento deve ser realizado dentro de um Gabinete de Biossegurança Nível 2+ utilizando técnica asséptica e equipamentos de proteção individual.
   1. Descongelar as células CART19 num recipiente de banho-maria (37 °C). Em seguida, lave as células em meio de células T morno (MTC) para remover o dimetil sulfóxido.
      NOTA: A MTC é composta por 10% de soro AB humano (v/v), penicilina-estreptomicina-glutamina a 1% (v/v) e meio celular hematopoiético livre de soro^27,30.
   2. Centrifugar as células CART19 a 300 × g por 8 min a 4 °C e ressuspender em MTC quente até uma concentração final de 2 × 10⁶ células/mL. Deixe as células CART descansarem em uma incubadora (37 °C, 5% CO₂) durante a noite, mas por não mais de 16 h.
2. Administração de células CART19 por injeção i.v. (Dia ~80)
   1. Conte as células CART19 e gire para baixo a 300 × g durante 8 minutos a 4 °C.
   2. Ressuspender as células CART19 com 10 mL de PBS e girar para baixo a 300 × g por 8 min a 4 °C.
   3. Ressuspender as células CART19 para uma concentração final de 40 × 10⁶ células/mL com PBS, transferir as células para um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL e colocá-las no gelo.
   4. Realizar injeções na veia da cauda celular CART19 (conforme detalhado acima) injetando 100 μL de células ressuspensas i.v.
      NOTA: Um volume de 100 μL administrará 4 × 10⁶ células a cada rato. Incluir um grupo de camundongos não tratados como controle negativo.

5. Avaliação das toxicidades associadas às células CART19

1. Após a administração de células CART19, monitore os camundongos 2x por dia para avaliar quaisquer alterações em seu bem-estar, como fraqueza motora, corpo curvado e perda de peso corporal.
   NOTA: Todas essas alterações físicas correlacionam-se com os sintomas da RSC neste modelo²⁸.
2. Uma vez que os camundongos começam a desenvolver fraqueza motora e redução de peso (redução de 10-20% em relação à linha de base), colete sangue periférico para analisar a carga tumoral e realizar isolamento sérico para citocinas, de acordo com a metodologia descrita na seção 3 (Figura 3).
3. Armazenar os tubos de microcentrífuga de soro a −80 °C e usar os soros para analisar as quimiocinas e citocinas usando um ensaio Multiplex (Figura 4).
   NOTA: Se os ratos apresentarem sinais de paralisia dos membros posteriores, parecerem moribundos ou letárgicos, e a perda de peso for > de 20% do seu peso corporal até ao ponto de limitar a sua capacidade de alcançar comida e/ou água, então serão sujeitos à eutanásia.

6. Ressonância magnética

OBS: Um aparelho de RM pré-clínico (para pequenos animais) com ímã de furo vertical foi utilizado para ressonância magnética in vivo e aquisição de imagens^32,33.

1. Misture 120 μL de Gadolínio + 880 μL de solução salina e carregue em uma seringa de insulina de 1 mL. Injectar 100 μL em cada rato (i.p.).
   NOTA: O gadolínio deve ser injetado 15-20 minutos antes do início do experimento.
2. Anestesiar camundongos com isoflurano (2-3%) em câmara de indução por 10-15 min.
   NOTA: É altamente recomendável aplicar pomada oftálmica para evitar o ressecamento dos olhos.
3. Coloque a coluna do mouse na sonda de berço compatível com roedores. Em seguida, prossiga para posicionar o mouse prendendo os dentes na barra de mordida.
4. Puxe a cabeça do mouse na bobina de volume de 25 mm e ajuste o cone nasal preso ao sistema de anestesia com isoflurano. Aperte o botão da barra de mordida para manter a posição durante a varredura.
   NOTA: Se estiver a realizar uma ressonância magnética com contraste, certifique-se de que o gadolínio (neste caso) ou o agente de contraste é injetado pelo menos 10 minutos antes de colocar o aparelho no íman de furo. Durante todo o tempo de exame, os camundongos serão anestesiados pela inalação de isoflurano a 2-3% em ar através do cone nasal, e sua frequência respiratória será monitorada simultaneamente.
5. Para avaliação da respiração, use um dispositivo de monitoramento respiratório/respiratório.
   OBS: É importante avaliar também a temperatura corporal para prevenir possíveis hipotermias devido à exposição prolongada à anestesia. Recomenda-se o uso de almofadas térmicas para controlar a temperatura corporal.
   1. Conecte a sonda do monitor respiratório perto do diafragma e fixe-a com fita cirúrgica. Mantenha a taxa de respiração entre 20-60 respirações por minuto para que a condição do rato seja estável.
      NOTA: Esta taxa fornece imagens de ressonância magnética mais estáveis e evita artefatos de movimento na imagem adquirida. Se a frequência respiratória for maior do que a faixa de 20-60 respirações por minuto, aumente a concentração de isoflurano. Se a frequência respiratória for inferior a 20 respirações por minuto, a anestesia é muito profunda; portanto, a concentração precisa ser diminuída.
6. Insira a sonda animal no pequeno furo dentro do sistema de ressonância magnética de pequenos animais de furo vertical. Ajuste a cabeça do animal no centro da bobina. Fixe o aparelho com a trava para que ele fique em pé e conecte o instrumento ao computador.
7. Abra e use o software (por exemplo, Paravision) para configurar as posições de varredura e os tipos de varreduras. Determinar as posições axiais e sagitais ideais, mantendo-as consistentes para todos os grupos experimentais.
   NOTA: Recomenda-se usar a aquisição de um exame de varredura como referência antes dos exames de ressonância magnética de corpo inteiro.
8. Proceder com a coleta dos dados da RM (conforme descrito anteriormente^32,34,35,36). Obtenha imagens de RM ponderadas em T1 e T2 usando a configuração sugerida mencionada abaixo.
   1. Para as imagens ponderadas em T1 na RM, utilizar a sequência multislice multieco ponderada em T1 (MSME) com tempo de repetição (TR) de 300 ms, tempo de eco (TE) de 9,5 ms, campo de visão (FOV) de 4 cm x 2 cm x 2 cm e matriz de 192 x 96 x 96 cm.
   2. Para as imagens ponderadas em T2 foram utilizadas uma sequência Multislice Multiecho (MSME) com TR de 300 ms, TE de 9,5 ms, FOV de 4 cm x 2 cm x 2 cm e matriz de 192 x 96 x 96.
9. Quando as varreduras estiverem concluídas, remova a sonda do furo. Extraia suavemente o rato, removendo os dentes da barra de mordida. Monitorar o animal em uma gaiola separada até que ele esteja totalmente consciente e tenha recuperado a função motora adequada.
10. Após a extração dos dados do software, utilizar software de análise para quantificação e renderização do volume 3D (Figura 4) das regiões de hiperintensidade.
    NOTA: Se possível, é altamente recomendável ter dois observadores cegos separados para a análise dos dados.

O objetivo deste protocolo é avaliar a toxicidade associada às células CART usando um modelo PDX de células tumorais de pacientes com LLA (Figura 1). Primeiro, camundongos NSG receberam injeções i.p. de bussulfano (30 mg/kg) com o objetivo de imunossuprimi-los e facilitar o enxerto de células CART²⁸. No dia seguinte, receberam ~5 × 10⁶ PBMCs (i.v.) derivados de TODOS os pacientes. Os camundongos foram monitorados para enxerto por ~13 semanas através do ensaio de sangramento na cauda. As hemácias foram coletadas e lisadas, seguidas de preparação por citometria de fluxo para avaliar a expressão de células tumorais CD19⁺ (Figura 2).

Uma vez que os camundongos atingiram ≥10 células tumorais/μL, eles foram randomizados e preparados para receber 4 × 10⁶ células CART19 (i.v.). Para avaliar as toxicidades associadas à CART19, os camundongos foram pesados uma vez por dia (Figura 3A). A perda de peso foi escolhida como sintoma do aparecimento da RSC, pois foi previamente revelado estar relacionado à toxicidade das células CART^28,37. Ensaios de sangue periférico (via coleta de sangue submandibular) foram realizados para avaliar a carga tumoral e a expansão celular CART por citometria de fluxo de células tumorais CD19+ humanas e células T CD3⁺ humanas. Além disso, o soro foi coletado e uma avaliação de citocinas inflamatórias foi realizada. Os ensaios foram feitos um dia antes da infusão de células CART19, bem como 5 e 10 dias após a infusão de células CART19, pois esses momentos são particularmente relevantes para o início da RSC e o desenvolvimento de sintomas.

Aqui, em particular, um ensaio Multiplex foi realizado antes e após a administração de células CART19, onde as citocinas e quimiocinas mais representativas foram GM-CSF, IL-18, MIP-1α e IP-10 (Figura 3B). No entanto, outros ensaios podem ser feitos para avaliar as concentrações dessas proteínas no soro. Alternativamente, camundongos foram submetidos a exames de RM para avaliar a permeabilidade vascular no sistema nervoso central (SNC). Camundongos foram injetados com o reagente de contraste gadolínio (i.p.) para medir a inflamação cerebral e a ruptura da barreira hematoencefálica³⁸. Em seguida, foram anestesiados com isoflurano e obtidas imagens ponderadas em T1 e T2 com contraste (Figura 4). Nas imagens em T2 (Figura 4, esquerda), o corte mais claro (branco) indica a presença de edema ou líquido, que é mais visto em tumores cerebrais e inflamação. Com imagens em T1 (Figura 4, meio), os cortes mais brilhantes indicam áreas onde há vazamento de sangue ou ruptura da barreira hematoencefálica. Por fim, com o auxílio de software, as imagens de reconstrução 3D (Figura 4, à direita) foram montadas em T1 com gadolínio, baseadas em sinais de hiperintensidade correspondentes à permeabilidade vascular, o que torna o volume de extravasamento de gadolínio no encéfalo³⁴.

Figura 1: Esquema experimental de um modelo de xenoenxerto derivado do paciente usado para avaliar a toxicidade associada às células CART, a síndrome de liberação de citocinas e a neuroinflamação. Camundongos NSG foram condicionados com 30 mg/kg de bussulfano (i.p.) e receberam 3 × 10^6-5 × 10⁶ blastos (i.v.) derivados do sangue periférico de pacientes com LLA. Em seguida, os camundongos foram monitorados quanto à enxertia tumoral via coleta de sangue submandibular, seguida de citometria de fluxo para avaliação de blastos CD19⁺. Quando as células CD19⁺ do sangue periférico estavam ≥10 células/μL, os camundongos receberam 2 × 10 6-5 × 10⁶ células CART19. Os ratos foram pesados diariamente como medida de seu bem-estar. Aos 10 dias após a infusão de células CART19, foram realizadas ressonâncias magnéticas do cérebro de camundongos para detectar neuroinflamação. O sangramento da cauda para avaliar a produção de citocinas/quimiocinas e a expansão das células T foi realizado semanalmente após a injeção das células CART19. Abreviações: CART = célula T do receptor de antígeno quimérico; CART19 = CARRINHO direcionado para CD19; LLA = leucemia linfoblástica aguda; i.v. = intravenosa; i.p. = intraperitoneal; PB = sangue periférico; NSG = NOD-SCID IL2rγnull. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Análise de células tumorais CD19⁺ como indicador de carga tumoral em um modelo ALL PDX para avaliar toxicidades associadas a células CART. (A) Análise representativa de citometria de fluxo mostrando a estratégia de gating para analisar a população de células CD19⁺ retiradas de uma amostra de sangue periférico de um camundongo injetado com blastos de LLA derivados do paciente. (B) A quantificação e comparação das populações de células CD19⁺ entre camundongos tratados com CART19 versus camundongos não tratados com base em dados brutos obtidos da análise por citometria de fluxo. (ANOVA one-way; n = 3 camundongos por grupo; barras de erro, EPM). Abreviações: ns = não significante; LLA = leucemia linfoblástica aguda; PDX = xenoenxerto derivado do paciente; CART = célula T do receptor de antígeno quimérico; CART19 = CARRINHO direcionado para CD19; SSC-H = altura do pico de dispersão lateral; FSC-H = altura do pico de dispersão anterior; SSC-A = área do pico de dispersão lateral; FSC-A = área do pico de dispersão para frente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Avaliação das toxicidades associadas à CART19 usando um modelo ALL PDX. (A) Gráfico representativo da percentagem de redução de peso em ratinhos tratados com células CART19 ou células T de controlo não transduzidas durante os primeiros 6 dias após a CART (ANOVA de duas vias, ***p < 0,001, ****p < 0,00001; barras de erro, MEV). (B) Expressão de citocinas e quimiocinas no soro de camundongos NSG antes e após a administração de células CART19. Camundongos NSG foram submetidos a sangramento submandibular antes e após a administração de células CART19 (i.v.) para coletar seu soro e avaliar a expressão das seguintes citocinas e quimiocinas: GM-CSF, IL-18, MIP-1α, IP-10, IL-1β e IL-6 (ANOVA two-way, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001; n =3 camundongos; nove réplicas técnicas; barras de erro, SEM). Abreviações: ns = não significante; LLA = leucemia linfoblástica aguda; PDX = xenoenxerto derivado do paciente; CART = célula T do receptor de antígeno quimérico; CART19 = CARRINHO direcionado para CD19; GNS = NOD-SCID IL2rγnull; GM-CSF = fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos; IL-18 = interleucina-18; MIP-1α = proteína inflamatória de macrófagos-1 alfa; IP-10 = proteína 10 induzida por interferon gama; IL-1β = interleucina-1β; IL-6 = interleucina-6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Ressonância magnética utilizada para avaliar neuroinflamação durante o tratamento com células CART19 em modelo PDX. Camundongos NSG enxertados com células tumorais derivadas de ALL pacientes foram infundidos com células CART19, e os cérebros foram imageados com RM com gadolínio depois que os camundongos exibiram sintomas neurológicos dentro de 10 dias após a infusão de CART. (Esquerda) Imagem ponderada em T2 revelando evidência de edema e possível infiltrado inflamatório durante IH em camundongos tratados com CART19 (seta vermelha). (Meio) Corte axial representativo da RM ponderada em T1 mostrando realce pelo meio de contraste no parênquima cerebral, indicando aumento da permeabilidade vascular em camundongos tratados com CART19 (seta vermelha). (Direita) Reconstruções tridimensionais do cérebro de roedores com regiões de hiperintensidade T1 (vermelho) foram geradas utilizando o software Analyze 12.0. Abreviações: RM = ressonância magnética; LLA = leucemia linfoblástica aguda; PDX = xenoenxerto derivado do paciente; CART = célula T do receptor de antígeno quimérico; CART19 = CARRINHO direcionado para CD19. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Recapitulação das toxicidades associadas às células CART observadas clinicamente pelo modelo ALL PDX. Abreviações: GM-CSF = fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos; IL = interleucina; RSC = síndrome de liberação de citocinas; NI = neuroinflamação; BBB = barreira hematoencefálica; SNC = sistema nervoso central; MCP-1 = proteína quimiotática de monócitos 1.

Neste relatório, uma metodologia para avaliar a toxicidade associada a células CART usando um modelo ALL PDX foi descrita. Mais especificamente, este modelo procura mimetizar duas toxicidades potencialmente fatais, RSC e NI, que os pacientes frequentemente experimentam após a infusão de células CART. Ela recapitula muitas características das toxicidades da CART observadas na clínica: perda de peso, disfunção motora, neuroinflamação, produção de citocinas inflamatórias e quimiocinas e infiltração de diferentes células efetoras no sistema nervoso central 8,20,28. Anteriormente, esse modelo PDX foi usado para mimetizar o desenvolvimento inicial de RNS e RN (Tabela 1) e avaliar diferentes estratégias de prevenção e tratamento da toxicidade. Um estudo neste modelo PDX utilizou células CART19 depletadas de GM-CSF. Mais especificamente, esses resultados demonstraram que a depleção de GM-CSF resultou na redução da secreção de citocinas e quimiocinas ligadas à SRC, o que foi claramente demonstrado usando este modelo de camundongo ALL PDX²⁹. Este modelo PDX também foi usado com sucesso para avaliar a expansão in vivo de células CART correlacionando-se com o desenvolvimento de RSC após infusão de células CART19 usando um symporter de iodeto de sódio (NIS) como plataforma de imagem²⁶. Portanto, este modelo proposto representa uma ferramenta útil que pode ser usada para avaliar as potenciais toxicidades decorrentes de células CART.

É importante mencionar que muitos outros modelos têm sido utilizados para estudar células CART in vivo. Estes incluem modelos de camundongos singênicos, transgênicos e humanizados, além de modelos xenogênicos²⁴. O modelo singênico de camundongo, também chamado de modelo de camundongo aloenxerto imunocompetente, utiliza células CART, tumor e antígenos-alvo de origem murina. Isso é vantajoso, pois permite o estudo de células CART em um sistema imunológico totalmente funcional e também pode revelar toxicidades no alvo e fora do tumor. A desvantagem desse modelo é que a biologia e a imunidade de camundongos são diferentes das humanas e, portanto, não é um modelo relevante para estudos translacionais em que o objetivo é prosseguir para ensaios clínicos ^24,39.

Modelos de camundongos transgênicos imunocompetentes expressam um transgene de antígeno associado a tumor humano (TAA) em tecidos saudáveis e tumores, em padrões que imitam aqueles encontrados em tecidos humanos. Esses camundongos também têm sido utilizados em estudos de CART para melhor avaliar a segurança das células CART, revelando efeitos fora do alvo fora do tumor^40,41. Camundongos humanizados implantados com células-tronco hematopoéticas humanas CD34⁺ podem ser um modelo vantajoso para estudar a eficácia e toxicidade da CART no sistema hematopoético humano, uma vez que o sistema imune reconstituído pode mimetizar a inibição da CART e induzir uma tempestade de citocinas que recapitula a RSC observada na clínica^42,43,44. Embora esses modelos permitam o estudo de células imunes específicas em relação à eficácia da CART, o sistema humanizado ainda é primitivo e necessita de maior otimização. Além disso, seu uso no estudo de efeitos fora do alvo é limitado, uma vez que a maioria dos antígenos do hospedeiro no tecido saudável é de origem murina. Além disso, o modelo de camundongo humanizado CD34⁺ é tecnicamente desafiador para ser^{desenvolvido45}. No entanto, modelos de xenoenxerto humano em camundongos imunocomprometidos são comumente usados para avaliar a eficácia de células CART humanas antes da tradução para ensaios clínicos e, como demonstrado neste artigo, podem ser usados para avaliar as toxicidades associadas à atividade de células CART. No entanto, a falta de sistema imunológico e células imunes, como células T e células NK, limita sua aplicação para avaliar a toxicidade fora do tumor no alvo, interações de células CART com células imunes inatas e inibição de células CART pelo microambiente tumoral.

A vantagem do protocolo aqui descrito é que ele requer procedimentos simples usando camundongos NSG para observar e avaliar as toxicidades associadas às células CART. Primeiro, é fácil de reproduzir, e foi otimizado para avaliar estratégias para prevenir toxicidades de CART através da neutralização GM-CSF e para visualizar a expansão celular de CART em correlação com o início da SRC. Ao usar esse novo modelo PDX, é importante executar corretamente as etapas críticas, como a confirmação da enxertia adequada dos blastos de LLA e o monitoramento precoce do início da RSC logo após a administração da CART. A avaliação das citocinas e o monitoramento do peso são cruciais para determinar as toxicidades associadas à CART, e a RM define o início da NI. As desvantagens desse modelo são as seguintes: 1) como as células PDX ALL levam mais tempo para enxertar e atingir uma alta carga tumoral, são necessários aproximadamente 2-3 meses desde a inoculação das células tumorais até o tratamento com células CART19; 2) como modelo PDX primário, há uma variabilidade significativa de paciente para paciente em relação ao tempo para enxertia e resposta à terapia celular com CART; 3) a carga tumoral não pode ser avaliada com imagens de bioluminescência e requer avaliação frequente do sangue periférico; e 4) a falta de células imunes inatas limita a capacidade desse modelo de estudar interações CART com células imunes ou o microambiente tumoral.

O interesse em testar células adotivas em modelos de camundongos mais complexos tem crescido na última década, à medida que se tornou evidente que modelos simples de camundongos imunodeficientes não são modelos pré-clínicos ideais. O modelo de camundongo PDX descrito aqui para avaliar as toxicidades associadas às células CART representa um modelo pré-clínico promissor no campo da terapia celular com CART, pois imita a linha do tempo, os sintomas e os marcadores de SRC e NI após a infusão de células CART, como visto na clínica. Em geral, a metodologia descrita aqui fornece uma plataforma robusta para avaliar as toxicidades associadas às células CART19, bem como a eficácia.

S.S.K. é um inventor de patentes no campo da imunoterapia CAR que são licenciadas para a Novartis (através de um acordo entre a Mayo Clinic, Universidade da Pensilvânia e Novartis) e para a Mettaforge (através da Mayo Clinic). R.L.S. e S.S.K. são inventores de patentes no campo da imunoterapia CAR que são licenciadas para a Humanigen. S.S.K. recebe financiamento de pesquisa da Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs e Lentigen.

Este trabalho foi parcialmente apoiado através do National Institutes of Health (R37CA266344, 1K99CA273304), Department of Defense (CA201127), Mayo Clinic K2R pipeline (S.S.K.), Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (S.S.K.) e Predolin Foundation (R.L.S.). Além disso, gostaríamos de agradecer à equipe do Mayo Clinic NMR Core Facility. A Figura 1 foi criada em BioRender.com

An erratum was issued for: Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model. The Authors section was updated from:

Claudia Manriquez Roman^1,2,3,4,5
R. Leo Sakemura^1,2
Fang Jin⁶
Roman H. Khadka⁶
Mohamad M. Adada^1,2
Elizabeth L. Siegler^1,2
Aaron J. Johnson⁶
Saad S. Kenderian^1,2,6
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester,
²Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester,
³Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester,
⁴Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester,
⁵Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester,
⁶Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester

to:

Claudia Manriquez Roman^1,2,3,4,5
R. Leo Sakemura^1,2
Brooke L. Kimball^1,2
Fang Jin⁶
Roman H. Khadka⁶
Mohamad M. Adada^1,2
Elizabeth L. Siegler^1,2
Aaron J. Johnson⁶
Saad S. Kenderian^1,2,6
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester,
²Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester,
³Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester,
⁴Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester,
⁵Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester,
⁶Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester