Evaluación de los efectos tóxicos asociados a las células T del receptor de antígeno quimérico mediante un modelo de ratón de xenoinjerto derivado de pacientes con leucemia linfoblástica aguda

Aquí, describimos un protocolo en el que se utiliza un modelo de xenoinjerto derivado de pacientes con leucemia linfoblástica aguda como estrategia para evaluar y monitorear las toxicidades asociadas a las células T del receptor de antígeno quimérico dirigido a CD19.

La terapia con células del receptor de antígeno quimérico T (CART) se ha convertido en una herramienta poderosa para el tratamiento de múltiples tipos de neoplasias malignas CD19⁺ , lo que ha llevado a la reciente aprobación por parte de la FDA de varias terapias celulares CART dirigidas a CD19 (CART19). Sin embargo, la terapia con células CART se asocia con un conjunto único de toxicidades que conllevan su propia morbilidad y mortalidad. Esto incluye el síndrome de liberación de citocinas (CRS, por sus siglas en inglés) y la neuroinflamación (NI, por sus siglas en inglés). El uso de modelos preclínicos de ratón ha sido crucial en la investigación y el desarrollo de la tecnología CART para evaluar tanto la eficacia como la toxicidad de CART. Los modelos preclínicos disponibles para probar esta inmunoterapia celular adoptiva incluyen modelos singénicos, xenoinjertos, transgénicos y de ratón humanizado. No existe un modelo único que refleje a la perfección el sistema inmunológico humano, y cada modelo tiene fortalezas y debilidades. El objetivo de este artículo es describir un modelo de xenoinjerto derivado de pacientes que utiliza blastocitos leucémicos de pacientes con leucemia linfoblástica aguda como estrategia para evaluar las toxicidades asociadas a CART19, CRS y NI. Se ha demostrado que este modelo recapitula las toxicidades asociadas a CART19, así como la eficacia terapéutica observada en la clínica.

La terapia celular con receptor de antígeno quimérico T (CART) ha revolucionado el campo de la inmunoterapia contra el cáncer. Ha demostrado ser exitoso en el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda (LLA) recidivante/refractaria, el linfoma de células B grandes, el linfoma de células del manto, el linfoma folicular y el mieloma múltiple 1,2,3,4,5,6,7^, lo que ha llevado a las recientes aprobaciones de la FDA. A pesar del éxito inicial en los ensayos clínicos, el tratamiento con terapia celular CART produce toxicidades que a menudo son graves y, en ocasiones, letales. Las toxicidades más comunes después de la terapia con células CART incluyen el desarrollo de CRS y NI, también conocido como síndrome de neurotoxicidad asociado a células efectoras inmunitarias (ICANS)^8,9. El CRS se debe a la sobreactivación y expansión masiva de las células CART in vivo, lo que conduce a la posterior secreción de múltiples citocinas inflamatorias, incluyendo interferón-γ, factor de necrosis tumoral-α, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) e interleucina-6 (IL-6). Esto resulta en hipotensión, fiebres altas, síndrome de fuga capilar, insuficiencia respiratoria, falla multiorgánica y, en algunos casos, la muerte^10,11. El SRC se desarrolla en el 50-100% de los casos después de la terapia celular CART19^11,12,13. El ICANS es otro evento adverso único asociado a la terapia con células CART y se caracteriza por edema cerebral generalizado, confusión, obnubilación, afasia, debilidad motora y, ocasionalmente, convulsiones ^9,14. Cualquier grado de ICANS ocurre en hasta el 70% de los pacientes, y los grados 3-4 se reportan en el 20-30% de los pacientes 5,10,15,16. En general, el SRI y el ICANS son comunes y pueden ser fatales.

El manejo de ICANS después de la terapia con células CART es un desafío. La mayoría de los pacientes con ICANS también experimentan CRS¹⁷, que a menudo se puede tratar con el antagonista del receptor de IL-6 tocilizumab o esteroides¹⁸. Un informe previo reveló que la intervención temprana con tocilizumab disminuyó la tasa de SRC grave, pero no afectó la incidencia ni la gravedad de la ICANS¹⁹. En la actualidad, no existe un tratamiento eficaz ni un agente profiláctico para el ICANS, por lo que es crucial investigar estrategias preventivas²⁰.

Se cree que las células mieloides y las citoquinas/quimiocinas asociadas son los principales impulsores del desarrollo del SRC y de la ICANS²¹. Mientras que el SRC está directamente relacionado con la elevación extrema de las citocinas y la expansión de las células T, la fisiopatología de las ICANS es en gran parte desconocida^22,23. Por lo tanto, es imperativo establecer un modelo de ratón que recapitule estas toxicidades después de la terapia con células CART para estudiar los mecanismos y desarrollar estrategias preventivas.

En la actualidad existen múltiples modelos animales preclínicos que se utilizan para estudiar, optimizar y validar la eficacia de las células CART, así como para monitorizar sus toxicidades asociadas. Estos incluyen ratones singénicos, xenoinjertos, transgénicos inmunocompetentes, transgénicos humanizados y xenoinjertos derivados de pacientes, además de modelos de primates. Sin embargo, cada uno de estos modelos tiene inconvenientes, y algunos no reflejan la verdadera eficacia o seguridad de las células CART^24,25. Por lo tanto, es imperativo elegir cuidadosamente el mejor modelo para los objetivos previstos del estudio.

El objetivo de este artículo es describir la metodología que se utiliza para evaluar las toxicidades asociadas a las células CART, CRS y NI, utilizando un modelo in vivo de xenoinjerto derivado de pacientes (PDX) de LLA (Figura 1). En concreto, en los métodos aquí descritos, se utilizan células CART19 generadas en el laboratorio de los autores siguiendo los protocolos descritos anteriormente. En resumen, las células T humanas se aíslan de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes sanos mediante una técnica de gradiente de densidad, se estimulan con perlas CD3/CD28 en el día 0 y se transducen lentiviralmente en el día 1 con CAR compuestas por un fragmento variable de cadena única dirigido a CD19 fusionado con los dominios de señalización 4-1BB y CD3ζ. A continuación, estas células CART se expanden, se desgranan el día 6 y se criopreservan el día 8 26,27,28,29,30. Como se ha descrito anteriormente, los ratones se someten a un tratamiento de agotamiento linfológico, seguido de la administración de blastocitos leucémicos (LLA) derivados del ^paciente28. En primer lugar, el injerto tumoral se verifica mediante la extracción de sangre submandibular. Tras el establecimiento de una carga tumoral adecuada, se administran células CART19 a los ratones. Luego, los ratones se pesan diariamente para evaluar su bienestar. Se realiza una resonancia magnética nuclear (RMN) de animales pequeños para evaluar la NI, junto con el sangrado de la cola para evaluar la expansión de las células T y la producción de citocinas/quimiocinas. Se recomienda encarecidamente el uso de las técnicas que se describen a continuación como modelo para estudiar las toxicidades asociadas a las células CART en un modelo PDX.

Este protocolo sigue las pautas de la Junta de Revisión Institucional (IRB, por sus siglas en inglés), el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC A00001767, por sus siglas en inglés) y el Comité Institucional de Bioseguridad (IBC, Bios00000006.04) de Mayo Clinic.

NOTA: Todos los materiales utilizados para trabajar con ratones deben ser estériles.

1. Inyección de busulfano a ratones NSG

1. Obtener ratones machos, de 8 a 12 semanas de edad, inmunocomprometidos, NOD-SCID IL2rγnull (NSG) y pesarlos antes de la inyección.
   NOTA: Para obtener significación estadística, se recomienda utilizar al menos cinco ratones por grupo y repetir este experimento al menos una vez más con ratones hembra.
2. Prepare el busulfano para la inyección intraperitoneal (I.P.). Usando una jeringa de insulina de 1 ml, llene lenta y cuidadosamente la jeringa con exactamente 30 mg/kg de busulfán, seguido de una inyección i.p a los ratones, y colóquelos nuevamente en la jaula.

2. Inyección de TODOS los blastocitos derivados del paciente (CD19⁺) a los ratones NSG

NOTA: Este protocolo sigue las pautas del Comité Institucional de Bioseguridad de Mayo Clinic (IBC, Bios00000006.04).

1. Recolectar blastocitos leucémicos primarios de la sangre periférica de pacientes con LLA recidivante y resistente al tratamiento.
2. Preparar las células diana para la inyección intravenosa (i.v.).
   1. Cuente las células diana CD19⁺ con un hemocitómetro y registre el volumen y la concentración finales de células.
      NOTA: Para determinar la viabilidad celular, se recomienda encarecidamente utilizar azul de tripano mientras se cuentan las células.
   2. Granular las células por centrifugación a 300 × g durante 5 min a 4 °C.
   3. Vuelva a suspender el gránulo celular en solución salina tamponada con fosfato (PBS) hasta una concentración final de 50 × 10⁶ células/ml en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y colóquelo en hielo.
   4. Vórtice de dedo el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene las células diana hasta que las células estén completamente homogeneizadas.
   5. Con una jeringa de insulina de 1 ml, llene lenta y cuidadosamente la jeringa con exactamente 100 μl de las células diana preparadas y agite la jeringa para eliminar las burbujas.
      NOTA: El volumen de 100 μL administrará 5 × 10⁶ células a cada ratón.
   6. Coloque a los ratones bajo una luz cálida durante 5-10 minutos. Una vez que la vena de la cola se hinche y sea más visible a simple vista, coloque a los ratones en una cámara de confinamiento/restricción adecuada.
   7. Limpie la cola del ratón con un hisopo con alcohol. Inyecte las células diana directamente en la vena de la cola (i.v.) y vuelva a colocar al ratón en la jaula. Después de la inoculación de las células diana, controle a los ratones diariamente o según lo recomendado por el comité local de ética animal.

3. Evaluación del injerto tumoral

1. A partir de las 6 semanas después de la inyección de células diana, se evalúa el injerto tumoral mediante citometría de flujo para medir la expresión de células CD19⁺ en la sangre periférica.
2. Ensayo de sangre periférica para evaluar la expansión de CD19⁺
   1. Extraiga sangre de los ratones 6-8 semanas después de la inyección de células CART19.
      NOTA: Se pueden utilizar varios métodos para extraer sangre. Para este protocolo, la extracción de sangre submandibular es el método preferido de elección.
   2. Anestesiar al ratón con isoflurano en una cámara de inducción con isoflurano al 5%. Una vez que se logra la anestesia, mantener al 1-3% el isoflurano inhalado a través de un cono nasal.
      NOTA: Se recomienda encarecidamente aplicar ungüento oftálmico para prevenir la sequedad ocular.
   3. Retire el ratón de la cámara y sujételo con la mano no dominante agarrando la piel suelta sobre el cuello. Perfore la vena con una lanceta ligeramente detrás de la mandíbula.
      NOTA: Solo se requiere la punta de la aguja (1-2 mm) para ingresar a la vena.
   4. A medida que la sangre gotea, recoja al menos 50 μL en un tubo recubierto de heparina y mezcle bien invirtiendo el tubo hacia arriba y hacia abajo varias veces. Transfiera 30 μL de sangre a un tubo de poliestireno de fondo redondo de 5 mL.
      NOTA: Para la sangre restante, centrifugar por el tubo a 17.000 × g durante 10 min a 4 °C. Transfiera el suero (capa sobrenadante) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml limpio y etiquetado, y guárdelo a -80 °C (para su uso en el ensayo de citocinas).
   5. Agregue 2 ml de tampón de lisis (10 veces tampón de lisado a base de cloruro de amonio diluido a 1 veces con agua sin nucleasas) en el tubo inferior redondo de 5 ml que contiene la sangre. Mezclar muy bien mediante el vórtice del tubo. Incubar el tubo a temperatura ambiente durante 20 minutos para asegurar una lisis adecuada de los glóbulos rojos.
   6. Añadir 2 mL de tampón de flujo (PBS, 0,2 g/L de cloruro de potasio, 0,2 g/L de fosfato de potasio monobásico, 8 g/L de cloruro de sodio y 1,15 g/L de fosfato de sodio dibásico que contiene 2% de suero fetal bovino y 1% de azida sódica).
   7. Centrifugar el tubo a 300 × g durante 5 min a 4 °C. Decantar el sobrenadante y añadir 2 mL de tampón de flujo. Repita este paso de lavado 2 veces.
   8. Decantar cuidadosamente el contenido del tubo. Observe la pequeña cantidad de líquido con un gránulo que queda en el tubo. Añadir 100 μL de tampón de flujo, y resuspender muy bien.
   9. Transfiera todo el líquido restante en el tubo de flujo de 5 ml a una placa de 96 pocillos. Asegúrese de que cada muestra esté correctamente etiquetada. Añadir 100 μL de tampón de flujo a los pocillos correspondientes y centrifugar la placa de 96 pocillos a 650 × g durante 3 min a 4 °C.
3. Evaluar la expansión de las células diana CD19⁺ mediante citometría de flujo (Figura 2).
   1. Prepare una mezcla maestra que contenga 0,3 μl de tinción viva/muerta, 0,13 μg (2,5 μl) de anticuerpo anti-CD19 humano, 0,06 μg (2,5 μl) de anticuerpo anti-CD45 humano, 5 μg (2,5 μl) de anti-CD45 de ratón y 42,2 μl de tampón de flujo para un total de 50 μl por muestra. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 min.
   2. Lavar con 150 μL de tampón de flujo seguido de centrifugación a 650 × g durante 3 min a 4 °C. Decantar el sobrenadante y volver a suspender el gránulo en 195 μL de tampón de flujo y 5 μL de perlas de conteo.
   3. Adquirirlo en un citómetro de flujo para determinar el nivel de expresión de células CD19⁺ . Para fines de compuerta y análisis, primero se compuerta la población de interés (CD19⁺) en función de las características de dispersión frontal frente a lateral, seguida de una sola población de compuerta y, a continuación, células vivas. Una vez que las células vivas están controladas, se evalúa la población humana de CD45 frente a la de ratón CD45 y, a partir de la población humana, se puede controlar la población diana de CD19⁺ .
4. Cuantificar para determinar la cantidad presente en 70 μL, y luego expresar en células/μL usando la ecuación (1):
   Recuento absoluto de células CD19+ = ([células CD19⁺/perlas de recuento] × número de perlas de recuento dentro de 5 μL)/70
   NOTA: Repita el ensayo de sangre periférica cada 5 días para evaluar la expansión de las células CD19⁺ . No recolectar más de 200 μl de sangre acumulativamente cada 2 semanas de acuerdo con las pautas del comité local de ética animal. Una vez que los ratones hayan alcanzado una carga de enfermedad de ≥10 células/μl, aleatorizarlos a grupos de células CART19 o de control (sección 4).

4. Administración de células CART19 in vivo

1. Preparación de las células CART19 (~Día 80):
   NOTA: La generación de células CART19 ha sido publicada previamente 27,30,31. Este procedimiento debe realizarse dentro de un Gabinete de Bioseguridad Nivel 2+ utilizando técnica aséptica y equipo de protección individual.
   1. Descongele las celdas CART19 en un recipiente al baño maría (37 °C). Luego, lave las células en medio tibio de células T (MTC) para eliminar el dimetilsulfóxido.
      NOTA: La MTC está compuesta por un 10% de suero AB humano (v/v), un 1% de penicilina-estreptomicina-glutamina (v/v) y medio de células hematopoyéticas libre de suero^27,30.
   2. Centrifugar las células CART19 a 300 × g durante 8 min a 4 °C y volver a suspender en MTC tibia hasta una concentración final de 2 × 10⁶ células/mL. Deje reposar las células CART en una incubadora (37 °C, 5% de_CO2) durante la noche, pero no más de 16 h.
2. Administración de células CART19 mediante inyección intravenosa (Día ~80)
   1. Cuente las celdas CART19 y centrifugue a 300 × g durante 8 minutos a 4 °C.
   2. Vuelva a suspender las células CART19 con 10 ml de PBS y centrifugar a 300 × g durante 8 min a 4 °C.
   3. Vuelva a suspender las células CART19 a una concentración final de 40 × 10⁶ células/ml con PBS, transfiera las células a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml y colóquelas en hielo.
   4. Realice inyecciones en la vena de cola de la célula CART19 (como se detalló anteriormente) inyectando 100 μL de células resuspendidas por vía intravenosa.
      NOTA: Un volumen de 100 μL administrará 4 × 10⁶ células a cada ratón. Incluya un grupo de ratones no tratados como control negativo.

5. Evaluación de las toxicidades asociadas a las células CART19

1. Después de la administración de células CART19, monitoree a los ratones 2 veces al día para evaluar cualquier cambio en su bienestar, como debilidad motora, cuerpo encorvado y pérdida de peso corporal.
   NOTA: Todos estos cambios físicos se correlacionan con los síntomas del SRC en este modelo²⁸.
2. Una vez que los ratones comiencen a desarrollar debilidad motora y reducción de peso (reducción del 10-20% desde el valor basal), recolectar sangre periférica para analizar la carga tumoral y realizar el aislamiento sérico de citocinas según la metodología descrita en la sección 3 (Figura 3).
3. Almacene los tubos de microcentrífuga sérica a -80 °C y utilice los sueros para analizar las quimiocinas y citocinas mediante un ensayo Multiplex (Figura 4).
   NOTA: Si los ratones muestran signos de parálisis de las extremidades traseras, parecen moribundos o letárgicos, y la pérdida de peso es > del 20% de su peso corporal hasta el punto de limitar su capacidad para alcanzar la comida y/o el agua, entonces serán sometidos a la eutanasia.

6. Imágenes de resonancia magnética

NOTA: Se utilizó un escáner de resonancia magnética preclínica (para animales pequeños) con un imán de orificio vertical para la resonancia magnética in vivo y la adquisición de imágenes^32,33.

1. Mezcle 120 μL de gadolinio + 880 μL de solución salina y cárguelo en una jeringa de insulina de 1 mL. Inyectar 100 μL en cada ratón (i.p.).
   NOTA: El gadolinio debe inyectarse 15-20 minutos antes del inicio del experimento.
2. Anestesiar al ratón con isoflurano (2-3%) en una cámara de inducción durante 10-15 min.
   NOTA: Es muy recomendable aplicar pomada oftálmica para prevenir la sequedad ocular.
3. Coloque la espina dorsal del ratón en la sonda de cuna compatible con roedores. Luego, proceda a colocar el mouse enganchando sus dientes en la barra de mordida.
4. Tire de la cabeza del ratón hacia la bobina de volumen de 25 mm y ajuste el cono de la nariz atado al sistema de anestesia de isoflurano. Apriete la perilla de la barra de mordida para mantener la posición durante la exploración.
   NOTA: Si realiza una resonancia magnética con contraste, asegúrese de inyectar el gadolinio (en este caso) o el agente de contraste al menos 10 minutos antes de colocar el aparato en el imán del orificio. A lo largo del tiempo de la toma de imágenes, los ratones serán anestesiados mediante la inhalación de isoflurano al 2-3% en el aire a través del cono de la nariz, y su frecuencia respiratoria será monitoreada simultáneamente.
5. Para la evaluación de la respiración, use un dispositivo de monitoreo respiratorio/respiratorio.
   NOTA: Es importante evaluar también la temperatura corporal para prevenir una posible hipotermia debido a la exposición prolongada a la anestesia. Se recomienda utilizar almohadillas térmicas para controlar la temperatura corporal.
   1. Coloque la sonda del monitor de respiración cerca del diafragma y asegúrela con cinta quirúrgica. Mantenga la frecuencia respiratoria entre 20 y 60 respiraciones por minuto para que la condición del ratón sea estable.
      NOTA: Esta velocidad proporciona imágenes de resonancia magnética más estables y evita artefactos de movimiento en la imagen adquirida. Si la frecuencia respiratoria es superior al rango de 20-60 respiraciones por minuto, aumente la concentración de isoflurano. Si la frecuencia respiratoria es inferior a 20 respiraciones por minuto, la anestesia es demasiado profunda; por lo tanto, es necesario disminuir la concentración.
6. Inserte la sonda para animales en el orificio pequeño dentro del sistema de resonancia magnética para animales pequeños de orificio vertical. Ajusta la cabeza del animal en el centro de la bobina. Asegure el aparato con el candado para que pueda mantenerse en posición vertical y conecte el instrumento a la computadora.
7. Abra y utilice el software (por ejemplo, Paravision) para configurar las posiciones de escaneo y los tipos de escaneos. Determinar las posiciones axiales y sagitales óptimas manteniéndolas consistentes para todos los grupos experimentales.
   NOTA: Se recomienda utilizar la adquisición de una exploración de prueba como referencia antes de las resonancias magnéticas completas.
8. Proceda con la recolección de datos de resonancia magnética (como se describió anteriormente^32,34,35,36). Obtenga imágenes de resonancia magnética ponderadas en T1 y T2 utilizando la configuración sugerida que se menciona a continuación.
   1. Para las imágenes de RM ponderadas en T1, utilice una secuencia multieco multicorte (MSME) ponderada en T1 con un tiempo de repetición (TR) de 300 ms, un tiempo de eco (TE) de 9,5 ms, un campo de visión (FOV) de 4 cm x 2 cm x 2 cm y una matriz de 192 x 96 x 96.
   2. Para las imágenes de RM ponderadas en T2, se utilizó una secuencia multieco multicorte (MSME) con un TR de 300 ms, un TE de 9,5 ms, un campo de visión de 4 cm x 2 cm x 2 cm y una matriz de 192 x 96 x 96.
9. Una vez que se completen los escaneos, retire la sonda del orificio. Extrae suavemente el ratón quitando los dientes de la barra de mordida. Vigile al animal en una jaula separada hasta que esté completamente consciente y haya recuperado la función motora adecuada.
10. Después de la extracción de los datos del software, utilice un software de análisis para la cuantificación y el renderizado del volumen 3D (Figura 4) de las regiones de hiperintensidad.
    NOTA: Si es posible, se recomienda encarecidamente tener dos observadores ciegos separados para el análisis de los datos.

El objetivo de este protocolo es evaluar las toxicidades asociadas a las células CART utilizando un modelo de ratón PDX a partir de células tumorales de pacientes con LLA (Figura 1). En primer lugar, los ratones NSG recibieron inyecciones i.p. de busulfano (30 mg/kg) con el objetivo de inmunosuprimirlos y facilitar el injerto de células CART²⁸. Al día siguiente, recibieron ~5 × 10⁶ PBMC (i.v.) derivadas de pacientes con LLA. Los ratones fueron monitoreados para el injerto durante ~ 13 semanas a través del ensayo de sangrado de la cola. Se recolectaron y lisaron glóbulos rojos, seguido de preparación por citometría de flujo para evaluar la expresión de células tumorales CD19⁺ (Figura 2).

Una vez que los ratones alcanzaron ≥10 células tumorales/μL, fueron aleatorizados y preparados para recibir 4 × 10⁶ células CART19 (i.v.). Para evaluar las toxicidades asociadas a CART19, los ratones se pesaron una vez al día (Figura 3A). La pérdida de peso fue elegida como un síntoma de la aparición de CRS, ya que previamente se ha revelado que está relacionada con toxicidades asociadas a las células CART^28,37. Se realizaron análisis de sangre periférica (a través de la extracción de sangre submandibular) para evaluar la carga tumoral y la expansión de las células CART mediante análisis de citometría de flujo de células tumorales CD19+ humanas y células T CD3⁺ humanas. Además, se recolectó suero y se realizó una evaluación de citoquinas inflamatorias. Los ensayos se realizaron un día antes de la infusión de células CART19, así como a los 5 y 10 días después de la infusión de células CART19, ya que estos puntos temporales son particularmente relevantes para la aparición del SRC y el desarrollo de los síntomas.

Aquí, en particular, se realizó un ensayo Multiplex antes y después de la administración de células CART19, donde las citocinas y quimiocinas más representativas fueron GM-CSF, IL-18, MIP-1α e IP-10 (Figura 3B). Sin embargo, se pueden realizar otros ensayos para evaluar las concentraciones de estas proteínas en el suero. Alternativamente, los ratones se sometieron a una resonancia magnética para evaluar la permeabilidad vascular en el sistema nervioso central (SNC). A los ratones se les inyectó el reactivo de contraste gadolinio (i.p.) para medir la inflamación cerebral y la alteración de la barrera hematoencefálica³⁸. A continuación, se les anestesió con isoflurano y se les tomaron imágenes potenciadas en T1 y T2 con contraste (Figura 4). En las imágenes T2 (Figura 4, izquierda), la sección más brillante (blanca) indica la presencia de edema o líquido, que se observa principalmente en tumores cerebrales e inflamación. Con las imágenes T1 (Figura 4, centro), las secciones más brillantes indican áreas donde hay fugas de sangre o alteración de la barrera hematoencefálica. Por último, con la ayuda de un software, las imágenes de reconstrucción en 3D (Figura 4, derecha) se ensamblaron utilizando imágenes T1 mejoradas con gadolinio basadas en señales de hiperintensidad correspondientes a la permeabilidad vascular, lo que hace que el volumen de fuga de gadolinio en el cerebro^{sea 34}.

Figura 1: Esquema experimental de un modelo de xenoinjerto derivado del paciente utilizado para evaluar las toxicidades asociadas a las células CART, el síndrome de liberación de citocinas y la neuroinflamación. Los ratones NSG se acondicionaron con 30 mg/kg de busulfano (i.p.) y recibieron 3 × 10^6-5 × 10⁶ blastocitos (i.v.) derivados de la sangre periférica de pacientes con LLA. A continuación, se monitorizó el injerto tumoral de los ratones mediante la extracción de sangre submandibular, seguida de una citometría de flujo para evaluar los blastos CD19⁺. Cuando las células CD19⁺ de sangre periférica fueron ≥10 células/μL, los ratones recibieron 2 × 10 6-5 × 10⁶ células CART19. Los ratones fueron pesados diariamente como una medida de su bienestar. A los 10 días después de la infusión de células CART19, se realizaron resonancias magnéticas cerebrales de ratón para detectar neuroinflamación. El sangrado de la cola para evaluar la producción de citocinas/quimiocinas y la expansión de las células T se realizó semanalmente después de la inyección de células CART19. Abreviaturas: CART = célula T receptora de antígeno quimérico; CART19 = CART dirigido a CD19; LLA = leucemia linfoblástica aguda; i.v. = intravenoso; i.p. = intraperitoneal; PB = sangre periférica; NSG = NOD-SCID IL2rγnull. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Análisis de las células tumorales CD19⁺ como indicador de la carga tumoral en un modelo ALL PDX para evaluar los efectos tóxicos asociados a las células CART. (A) Análisis citométrico de flujo representativo que muestra la estrategia de activación para analizar la población de células CD19⁺ tomada de una muestra de sangre periférica de un ratón inyectado con blastocitos de LLA derivados del paciente. (B) La cuantificación y comparación de las poblaciones de células CD19⁺ entre ratones tratados con CART19 frente a ratones no tratados basados en datos brutos obtenidos del análisis de citometría de flujo. (ANOVA de un factor; n = 3 ratones por grupo; barras de error, SEM). Abreviaturas: ns = no significativo; LLA = leucemia linfoblástica aguda; PDX = xenoinjerto derivado del paciente; CART = célula T receptora de antígeno quimérico; CART19 = CART dirigido a CD19; SSC-H = altura del pico de dispersión lateral; FSC-H = altura del pico de dispersión hacia adelante; SSC-A = área de pico de dispersión lateral; FSC-A = área de pico de dispersión hacia adelante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Evaluación de las toxicidades asociadas a CART19 utilizando un modelo ALL PDX. (A) Gráfico representativo del porcentaje de reducción de peso en ratones tratados con células CART19 o células T de control no transducidas durante los primeros 6 días después de CART (ANOVA de dos vías, ***p < 0,001, ****p < 0,00001; barras de error, SEM). (B) Expresión de citoquinas y quimiocinas en suero de ratones NSG antes y después de la administración de células CART19. Los ratones NSG se sometieron a hemorragia submandibular antes y después de la administración de células CART19 (i.v.) para recolectar su suero y evaluar la expresión de las siguientes citocinas y quimiocinas: GM-CSF, IL-18, MIP-1α, IP-10, IL-1β e IL-6 (ANOVA de dos vías, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001; n = 3 ratones; nueve réplicas técnicas; barras de error, SEM). Abreviaturas: ns = no significativo; LLA = leucemia linfoblástica aguda; PDX = xenoinjerto derivado del paciente; CART = célula T receptora de antígeno quimérico; CART19 = CART dirigido a CD19; NSG = NOD-SCID IL2rγnull; GM-CSF = factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos; IL-18 = interleucina-18; MIP-1α = proteína inflamatoria alfa 1 de macrófagos; IP-10 = proteína 10 inducida por interferón gamma; IL-1β = interleucina-1β; IL-6 = interleucina-6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Resonancia magnética utilizada para evaluar la neuroinflamación durante el tratamiento con células CART19 en un modelo PDX. A los ratones NSG injertados con células tumorales derivadas de pacientes con LLA se les infundieron células CART19 y se obtuvieron imágenes de los cerebros con resonancia magnética mejorada con gadolinio después de que los ratones exhibieran síntomas neurológicos dentro de los 10 días posteriores a la infusión de CART. (Izquierda) Imagen ponderada en T2 que revela evidencia de edema y posible infiltrado inflamatorio durante la NI en ratones tratados con CART19 (flecha roja). (Medio) Sección axial representativa de la resonancia magnética ponderada en T1 que muestra un realce del contraste dentro del parénquima cerebral, lo que indica un aumento de la permeabilidad vascular en ratones tratados con CART19 (flecha roja). (Derecha) Se generaron reconstrucciones tridimensionales del cerebro de roedores con regiones de hiperintensidad T1 (rojo) utilizando el software Analyze 12.0. Abreviaturas: RM = resonancia magnética; LLA = leucemia linfoblástica aguda; PDX = xenoinjerto derivado del paciente; CART = célula T receptora de antígeno quimérico; CART19 = CART dirigido a CD19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Recapitulación de los efectos tóxicos clínicamente observados en las células CART mediante el modelo ALL PDX. Abreviaturas: GM-CSF = factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos; IL = interleucina; CRS = síndrome de liberación de citocinas; NI = neuroinflamación; BHE = barrera hematoencefálica; SNC = sistema nervioso central; MCP-1 = proteína quimioatrayente de monocitos 1.

En este informe, se ha descrito una metodología para evaluar las toxicidades asociadas a las células CART utilizando un modelo ALL PDX. Más específicamente, este modelo busca imitar dos toxicidades potencialmente mortales, CRS y NI, que los pacientes a menudo experimentan después de la infusión de células CART. Recapitula muchas características de las toxicidades de CART observadas en la clínica: pérdida de peso, disfunción motora, neuroinflamación, producción inflamatoria de citoquinas y quimiocinas, y la infiltración de diferentes células efectoras en el sistema nervioso central 8,20,28. Anteriormente, este modelo PDX se ha utilizado para imitar el desarrollo inicial de CRS y NI (Tabla 1) y evaluar diferentes estrategias para la prevención y el tratamiento de la toxicidad. Un estudio en este modelo PDX utilizó células CART19 deplecionadas de GM-CSF. Más específicamente, estos resultados demostraron que la depleción de GM-CSF resultó en la reducción de la secreción de citocinas y quimiocinas ligadas a CRS, lo que se demostró claramente utilizando este modelo de ratón ALL PDX²⁹. Este modelo PDX también se ha utilizado con éxito para evaluar la expansión in vivo de las células CART que se correlaciona con el desarrollo de CRS después de la infusión de células CART19 utilizando un simportador de yoduro de sodio (NIS) como plataforma de imagen²⁶. Por lo tanto, este modelo propuesto representa una herramienta útil que puede utilizarse para evaluar las toxicidades potenciales derivadas de las células CART.

Es importante mencionar que se han utilizado muchos otros modelos para estudiar las células CART in vivo. Estos incluyen modelos singénicos, transgénicos y humanizados de ratón, además de modelos xenogénicos²⁴. El modelo de ratón singénico, también llamado modelo de ratón de aloinjerto inmunocompetente, utiliza células CART, tumores y antígenos diana de origen murino. Esto es ventajoso, ya que permite el estudio de las células CART en un sistema inmunitario completamente funcional y también puede revelar toxicidades dentro y fuera del tumor. La desventaja de este modelo es que la biología y la inmunidad del ratón son diferentes a las de los humanos y, por lo tanto, no es un modelo relevante para estudios traslacionales donde el objetivo es proceder a ensayos clínicos^24,39.

Los modelos de ratones transgénicos inmunocompetentes expresan un transgén del antígeno asociado al tumor humano (TAA) tanto en el tejido sano como en los tumores en patrones que imitan los que se encuentran en los tejidos humanos. Estos ratones también se han utilizado en estudios CART para evaluar mejor la seguridad de las células CART al revelar efectos fuera del tumor en el objetivo^40,41. Los ratones humanizados a los que se les implantaron células madre hematopoyéticas humanas CD34⁺ pueden ser un modelo ventajoso para estudiar la eficacia y toxicidad de CART en el sistema hematopoyético humano, ya que el sistema inmune reconstituido puede imitar la inhibición de CART e inducir una tormenta de citoquinas que recapitula el CRS visto en la clínica^42,43,44. Aunque estos modelos permiten el estudio de células inmunitarias específicas en relación con la eficacia de CART, el sistema humanizado es todavía primitivo y necesita una mayor optimización. Además, su uso en el estudio de los efectos fuera del objetivo es limitado, ya que la mayoría de los antígenos del huésped en el tejido sano son de origen murino. Además, el modelo de ratón humanizado CD34⁺ es técnicamente difícil de desarrollar⁴⁵. Sin embargo, los modelos de xenoinjertos humanos en ratones inmunodeprimidos se utilizan comúnmente para evaluar la eficacia de las células CART humanas antes de traducirlas a ensayos clínicos y, como se demuestra en este artículo, se pueden utilizar para evaluar las toxicidades asociadas con la actividad de las células CART. Sin embargo, la falta de células inmunitarias y del sistema inmunitario, como las células T y las células NK, limita su aplicación para evaluar la toxicidad fuera del tumor en la diana, las interacciones de las células CART con las células inmunitarias innatas y la inhibición de las células CART por el microambiente tumoral.

La ventaja del protocolo descrito aquí es que requiere procedimientos sencillos con ratones NSG para observar y evaluar las toxicidades asociadas a las células CART. En primer lugar, es fácil de reproducir y se ha optimizado para evaluar estrategias de prevención de toxicidades por CART a través de la neutralización de GM-CSF y para visualizar la expansión celular de CART en correlación con la aparición de CRS. Cuando se utiliza este novedoso modelo de PDX, es importante realizar correctamente los pasos críticos, como la confirmación del injerto adecuado de los blastos de LLA y la monitorización temprana de la aparición del SRC inmediatamente después de la administración de CART. La evaluación de las citocinas y la monitorización del peso son cruciales para determinar las toxicidades asociadas a la CART, y la RM define la aparición de NI. Las desventajas de este modelo son las siguientes: 1) como las células PDX ALL tardan más en injertarse y alcanzan una carga tumoral alta, se requieren aproximadamente 2-3 meses desde la inoculación de las células tumorales hasta el tratamiento con células CART19; 2) como modelo primario de PDX, existe una variabilidad significativa de paciente a paciente con respecto al tiempo hasta el injerto y la respuesta a la terapia celular CART; 3) la carga tumoral no se puede evaluar con imágenes de bioluminiscencia y requiere una evaluación frecuente de sangre periférica; y 4) la falta de células inmunitarias innatas limita la capacidad de este modelo para estudiar las interacciones de CART con las células inmunitarias o el microambiente tumoral.

El interés en probar células adoptivas dentro de modelos de ratón más complejos ha crecido en la última década, ya que se ha hecho evidente que los modelos de ratón inmunodeficientes simples no son modelos preclínicos ideales. El modelo de ratón PDX descrito aquí para evaluar los efectos tóxicos asociados a las células CART representa un modelo preclínico prometedor en el campo de la terapia con células CART, ya que imita la línea de tiempo, los síntomas y los marcadores de CRS y NI después de la infusión de células CART como se observa en la clínica. En general, la metodología descrita aquí proporciona una plataforma sólida para evaluar las toxicidades asociadas a las células CART19, así como su eficacia.

S.S.K. es inventor de patentes en el campo de la inmunoterapia con CAR que están licenciadas a Novartis (a través de un acuerdo entre Mayo Clinic, la Universidad de Pensilvania y Novartis) y a Mettaforge (a través de Mayo Clinic). R.L.S. y S.S.K. son inventores de patentes en el campo de la inmunoterapia con CAR que están licenciadas a Humanigen. S.S.K. recibe fondos de investigación de Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs y Lentigen.

Este trabajo fue financiado en parte por los Institutos Nacionales de la Salud (R37CA266344, 1K99CA273304), el Departamento de Defensa (CA201127), la cartera K2R de Mayo Clinic (S.S.K.), el Centro de Medicina Personalizada de Mayo Clinic (S.S.K.) y la Fundación Predolin (R.L.S.). Además, nos gustaría agradecer al personal del Centro Central de RMN de Mayo Clinic. La Figura 1 fue creada en BioRender.com

An erratum was issued for: Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model. The Authors section was updated from:

Claudia Manriquez Roman^1,2,3,4,5
R. Leo Sakemura^1,2
Fang Jin⁶
Roman H. Khadka⁶
Mohamad M. Adada^1,2
Elizabeth L. Siegler^1,2
Aaron J. Johnson⁶
Saad S. Kenderian^1,2,6
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester,
²Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester,
³Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester,
⁴Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester,
⁵Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester,
⁶Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester

to:

Claudia Manriquez Roman^1,2,3,4,5
R. Leo Sakemura^1,2
Brooke L. Kimball^1,2
Fang Jin⁶
Roman H. Khadka⁶
Mohamad M. Adada^1,2
Elizabeth L. Siegler^1,2
Aaron J. Johnson⁶
Saad S. Kenderian^1,2,6
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester,
²Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester,
³Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester,
⁴Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester,
⁵Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester,
⁶Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester