Valutazione delle tossicità associate alle cellule T del recettore dell'antigene chimerico utilizzando un modello murino di xenotrapianto derivato dal paziente per la leucemia linfoblastica acuta

Qui, descriviamo un protocollo in cui un modello di xenotrapianto derivato dal paziente di leucemia linfoblastica acuta viene utilizzato come strategia per valutare e monitorare le tossicità associate alle cellule T del recettore dell'antigene chimerico mirato al CD19.

La terapia cellulare del recettore T dell'antigene chimerico (CART) è emersa come un potente strumento per il trattamento di più tipi di tumori maligni CD19 ⁺ , che ha portato alla recente approvazione da parte della FDA di diverse terapie cellulari CART (CART19) mirate al CD19. Tuttavia, la terapia cellulare CART è associata a un insieme unico di tossicità che portano la loro morbilità e mortalità. Ciò include la sindrome da rilascio di citochine (CRS) e la neuroinfiammazione (NI). L'uso di modelli murini preclinici è stato cruciale nella ricerca e nello sviluppo della tecnologia CART per valutare sia l'efficacia che la tossicità CART. I modelli preclinici disponibili per testare questa immunoterapia cellulare adottiva includono modelli murini singeneici, xenotrapianti, transgenici e umanizzati. Non esiste un singolo modello che rispecchi perfettamente il sistema immunitario umano e ogni modello ha punti di forza e di debolezza. Questo documento sui metodi mira a descrivere un modello di xenotrapianto derivato dal paziente utilizzando blasti leucemici da pazienti con leucemia linfoblastica acuta come strategia per valutare le tossicità associate a CART19, CRS e NI. Questo modello ha dimostrato di ricapitolare le tossicità associate a CART19 e l'efficacia terapeutica come visto nella clinica.

La terapia cellulare del recettore dell'antigene chimerico T (CART) ha rivoluzionato il campo dell'immunoterapia del cancro. Ha dimostrato di avere successo nel trattamento della leucemia linfoblastica acuta recidivante / refrattaria (LLA), del linfoma a grandi cellule B, del linfoma mantellare, del linfoma follicolare e del mieloma multiplo 1,2,3,4,5,6,7^, portando a recenti approvazioni della FDA. Nonostante il successo iniziale negli studi clinici, il trattamento con terapia cellulare CART provoca tossicità spesso gravi e occasionalmente letali. Le tossicità più comuni dopo la terapia cellulare CART includono lo sviluppo di CRS e NI, noti anche come sindrome da neurotossicità associata alle cellule effettrici immunitarie (ICANS)^8,9. La CRS è causata dalla sovraattivazione e dalla massiccia espansione delle cellule CART in vivo, che porta alla successiva secrezione di più citochine infiammatorie, tra cui interferone-γ, fattore di necrosi tumorale α, fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) e interleuchina-6 (IL-6). Ciò si traduce in ipotensione, febbre alta, sindrome da perdita capillare, insufficienza respiratoria, insufficienza multiorgano e, in alcuni casi, morte^10,11. La CRS si sviluppa nel 50-100% dei casi dopo terapia cellulare CART19^11,12,13. ICANS è un altro evento avverso unico associato alla terapia cellulare CART ed è caratterizzato da edema cerebrale generalizzato, confusione, ottunndazione, afasia, debolezza motoria e, occasionalmente, convulsioni ^9,14. Qualsiasi grado di ICANS si verifica fino al 70% dei pazienti e i gradi 3-4 sono riportati nel 20-30% dei pazienti 5,10,15,16. Nel complesso, CRS e ICANS sono comuni e possono essere fatali.

La gestione di ICANS dopo terapia cellulare CART è impegnativa. La maggior parte dei pazienti con ICANS sperimenta anche CRS¹⁷, che spesso può essere trattata con l'antagonista del recettore IL-6 tocilizumab o steroidi¹⁸. Un precedente rapporto ha rivelato che l'intervento precoce con tocilizumab ha ridotto il tasso di CRS grave, ma non ha influenzato l'incidenza o la gravità di ICANS¹⁹. Attualmente, non esiste un trattamento efficace o un agente profilattico per ICANS ed è fondamentale studiare strategie preventive²⁰.

Si ritiene che le cellule mieloidi e le citochine/chemochine associate siano i principali motori dello sviluppo di CRS e ICANS²¹. Mentre la CRS è direttamente correlata all'estrema elevazione delle citochine e all'espansione delle cellule T, la fisiopatologia di ICANS è in gran parte sconosciuta^22,23. Pertanto, è imperativo stabilire un modello murino che riassuma queste tossicità dopo la terapia cellulare CART per studiare i meccanismi e sviluppare strategie preventive.

Esistono diversi modelli animali preclinici attualmente utilizzati per studiare, ottimizzare e convalidare l'efficacia delle cellule CART, nonché per monitorare le loro tossicità associate. Questi includono topi singeneici, xenograft, transgenici immunocompetenti, transgenici umanizzati e xenograft derivati dal paziente, oltre a modelli di primati. Tuttavia, ciascuno di questi modelli presenta degli svantaggi e alcuni non riflettono i veri problemi di efficacia o sicurezza delle celle CART^24,25. Pertanto, è imperativo scegliere attentamente il modello migliore per gli obiettivi previsti dello studio.

Questo articolo cerca di descrivere la metodologia utilizzata per valutare le tossicità associate alle cellule CART, CRS e NI, utilizzando un modello in vivo di xenotrapianto derivato da pazienti (PDX) ALL (Figura 1). In particolare, nei metodi qui descritti, le cellule CART19 generate nel laboratorio degli autori vengono utilizzate seguendo i protocolli precedentemente descritti. In breve, le cellule T umane vengono isolate da cellule mononucleate di sangue periferico (PBMC) di donatori sani tramite una tecnica di gradiente di densità, stimolate con perline CD3 / CD28 il giorno 0 e trasdotte lentiviralmente il giorno 1 con CAR composte da un frammento variabile a catena singola mirato a CD19 fuso a domini di segnalazione 4-1BB e CD3ζ. Queste cellule CART vengono quindi espanse, de-beaded il giorno 6 e crioconservate il giorno 8 26,27,28,29,30. Come descritto in precedenza, i topi sono sottoposti a trattamento linfodepletivo, seguito dalla somministrazione di blasti leucemici derivati dal paziente (LLA)²⁸. In primo luogo, l'attecchimento del tumore viene verificato tramite raccolta di sangue sottomandibolare. A seguito della creazione di un carico tumorale appropriato, le cellule CART19 vengono somministrate ai topi. Quindi, i topi vengono pesati quotidianamente per valutare il benessere. La risonanza magnetica per piccoli animali (MRI) viene eseguita per valutare NI, insieme al sanguinamento della coda per valutare l'espansione delle cellule T e la produzione di citochine / chemochine. Le tecniche descritte di seguito sono altamente raccomandate per essere utilizzate come modello per studiare le tossicità associate alle cellule CART in un modello PDX.

Questo protocollo segue le linee guida dell'Institutional Review Board (IRB) della Mayo Clinic, dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC A00001767) e dell'Institutional Biosafety Committee (IBC, Bios00000006.04).

NOTA: Tutti i materiali utilizzati per lavorare con i topi devono essere sterili.

1. Iniezione di busulfan ai topi NSG

1. Ottenere topi maschi, di 8-12 settimane, immunocompromessi, NOD-SCID IL2rγnull (NSG) e pesarli prima dell'iniezione.
   NOTA: Per la significatività statistica, si raccomanda di utilizzare almeno cinque topi per gruppo e di ripetere questo esperimento almeno una volta con topi femmina.
2. Preparare busulfan per iniezione intraperitoneale (i.p.). Utilizzando una siringa da insulina da 1 ml, riempire lentamente e con attenzione la siringa con esattamente 30 mg/kg di busulfan, seguita da iniezione endovenosa nei topi, e rimetterli nella gabbia.

2. Iniezione di TUTTI i blasti derivati dal paziente (CD19⁺) ai topi NSG

NOTA: Questo protocollo segue le linee guida del Comitato istituzionale per la biosicurezza della Mayo Clinic (IBC, Bios00000006.04).

1. Raccogliere blasti leucemici primari dal sangue periferico di pazienti con LLA recidivante e refrattaria.
2. Preparare le cellule bersaglio per l'iniezione endovenosa (e.v.).
   1. Contare le cellule bersaglio CD19⁺ utilizzando un emocitometro e registrare il volume finale e la concentrazione delle cellule.
      NOTA: Per determinare la vitalità cellulare, si consiglia vivamente di utilizzare il blu di tripano durante il conteggio delle cellule.
   2. Pellettare le celle mediante centrifugazione a 300 × g per 5 minuti a 4 °C.
   3. Risospendere il pellet cellulare in soluzione salina tamponata fosfato (PBS) ad una concentrazione finale di 50 × 10⁶ cellule/ml in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e posizionare su ghiaccio.
   4. Vortice di dita il tubo di microcentrifuga da 1,5 mL contenente le cellule bersaglio fino a quando le cellule sono completamente omogeneizzate.
   5. Utilizzando una siringa da insulina da 1 ml, riempire lentamente e con attenzione la siringa con esattamente 100 μL delle cellule bersaglio preparate e far scorrere la siringa per rimuovere le bolle.
      NOTA: Il volume di 100 μL somministrerà 5 × 10⁶ cellule a ciascun topo.
   6. Posizionare i topi sotto una luce calda per 5-10 minuti. Una volta che la vena caudale diventa ingorgata e più visibile ad occhio nudo, posizionare i topi in una camera di confinamento / contenimento appropriata.
   7. Pulire la coda del topo con un tampone imbevuto di alcool. Iniettare le cellule bersaglio direttamente nella vena della coda (e.v.) e riposizionare il topo nella gabbia. Dopo l'inoculazione delle cellule bersaglio, monitorare i topi quotidianamente o come raccomandato dal comitato etico animale locale.

3. Valutazione dell'attecchimento tumorale

1. A partire da 6 settimane dopo l'iniezione della cellula bersaglio, valutare l'attecchimento del tumore utilizzando la citometria a flusso per misurare l'espressione delle cellule CD19⁺ nel sangue periferico.
2. Saggio del sangue periferico per valutare l'espansione di CD19⁺
   1. Prelevare il sangue dai topi 6-8 settimane dopo l'iniezione di cellule CART19.
      NOTA: Diversi metodi possono essere utilizzati per prelevare il sangue. Per questo protocollo, la raccolta del sangue sottomandibolare è il metodo preferito di scelta.
   2. Anestetizzare il topo con isoflurano in una camera di induzione con isoflurano al 5%. Una volta ottenuta l'anestesia, mantenere all'1-3% l'isoflurano inalato attraverso un cono nasale.
      NOTA: Si consiglia vivamente di applicare unguento oftalmico per prevenire la secchezza oculare.
   3. Rimuovere il mouse dalla camera e tenere il topo con la mano non dominante afferrando la pelle flaccida sul collo. Forare la vena con una lancetta leggermente dietro la mandibola.
      NOTA: Solo la punta dell'ago (1-2 mm) è necessaria per entrare nella vena.
   4. Mentre il sangue gocciola, raccogliere almeno 50 μL in un tubo rivestito di eparina e mescolare bene invertendo il tubo su e giù più volte. Trasferire 30 μL di sangue in un tubo di polistirene a fondo rotondo da 5 ml.
      NOTA: Per il sangue rimanente, ruotare lungo il tubo a 17.000 × g per 10 minuti a 4 °C. Trasferire il siero (strato di surnatante in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL pulita ed etichettata e conservarla a -80 °C (per l'uso nel test delle citochine).
   5. Aggiungere 2 mL di tampone di lisi (10x tampone lisante a base di cloruro di ammonio diluito a 1x utilizzando acqua priva di nucleasi) nel tubo inferiore rotondo da 5 mL contenente il sangue. Mescolare molto bene vorticando il tubo. Incubare il tubo a temperatura ambiente per 20 minuti per garantire una corretta lisi dei globuli rossi.
   6. Aggiungere 2 ml di tampone di flusso (PBS, 0,2 g/L di cloruro di potassio, 0,2 g/L di fosfato di potassio monobasico, 8 g/L di cloruro di sodio e 1,15 g/L di fosfato di sodio bibasico contenente il 2% di siero fetale bovino e l'1% di azoturo di sodio).
   7. Centrifugare il tubo a 300 × g per 5 minuti a 4 °C. Decantare il surnatante e aggiungere 2 ml di buffer di flusso. Ripetere questa fase di lavaggio 2x.
   8. Decantare accuratamente il contenuto del tubo. Osservare la piccola quantità di liquido con un pellet rimasto nel tubo. Aggiungere 100 μL di buffer di flusso e risospendere molto bene.
   9. Trasferire tutto il liquido rimanente nel tubo di flusso da 5 mL in una piastra da 96 pozzetti. Assicurati che ogni campione sia etichettato correttamente. Aggiungere 100 μL di buffer di flusso ai pozzetti corrispondenti e centrifugare la piastra a 96 pozzetti a 650 × g per 3 minuti a 4 °C.
3. Valutare l'espansione delle cellule bersaglio CD19⁺ mediante citometria a flusso (Figura 2).
   1. Preparare una miscela master contenente 0,3 μL di colorante vivo/morto, 0,13 μg (2,5 μL) di anticorpo CD19 antiuomo, 0,06 μg (2,5 μL) di anticorpo CD45 antiuomo, 5 μg (2,5 μL) di CD45 antitopo e 42,2 μL di tampone di flusso per un totale di 50 μL per campione. Incubare al buio a temperatura ambiente per 15 min.
   2. Lavare con 150 μL di tampone di flusso seguito da centrifugazione a 650 × g per 3 minuti a 4 °C. Decantare il surnatante e risospendere il pellet in 195 μL di tampone di flusso e 5 μL di perline di conteggio.
   3. Acquisire su un citometro a flusso per determinare il livello di espressione delle cellule CD19⁺ . Ai fini del gating e dell'analisi, prima gate la popolazione di interesse (CD19⁺) in base alle caratteristiche di dispersione in avanti rispetto a quelle laterali, seguita da una singola popolazione di gating, e poi cellule vive. Una volta che le cellule vive sono gated, valutare la popolazione CD45 umana rispetto alla popolazione CD45 del topo e, dalla popolazione umana, eliminare la popolazione target CD19 ⁺ .
4. Quantificare per determinare la quantità presente in 70 μL, e quindi esprimere in celle/μL usando l'equazione (1):
   Conta assoluta delle cellule CD19+ = ([cellule CD19⁺/sfere di conteggio] × numero di sfere di conteggio entro 5 μL)/70
   NOTA: Ripetere il test del sangue periferico ogni 5 giorni per valutare l'espansione delle cellule CD19⁺ . Raccogliere non più di 200 μL di sangue cumulativamente ogni 2 settimane in conformità con le linee guida del comitato etico animale locale. Una volta che i topi hanno raggiunto un carico di malattia di ≥10 cellule/μL, randomizzare a cellule CART19 o gruppi di controllo (sezione 4).

4. Somministrazione di cellule CART19 in vivo

1. Preparazione delle cellule CART19 (~Giorno 80):
   NOTA: La generazione di celle CART19 è stata precedentemente pubblicata 27,30,31. Questa procedura deve essere eseguita all'interno di un armadio di biosicurezza di livello 2+ utilizzando tecnica asettica e dispositivi di protezione individuale.
   1. Scongelare le celle CART19 in un contenitore a bagnomaria (37 °C). Quindi, lavare le cellule in mezzo di cellule T calde (TCM) per rimuovere il dimetilsolfossido.
      NOTA: La MTC è composta da siero AB umano (v / v) al 1%, 1% da penicillina-streptomicina-glutammina (v / v) e da cellule ematopoietiche prive di siero ^27,30.
   2. Centrifugare le cellule CART19 a 300 × g per 8 minuti a 4 °C e risospendere in MTC caldo fino a una concentrazione finale di 2 × 10⁶ cellule/ml. Lasciare riposare le cellule CART in un incubatore (37 °C, 5% CO₂) durante la notte, ma per non più di 16 ore.
2. Somministrazione di cellule CART19 tramite iniezione endovenosa (Giorno ~80)
   1. Contare le cellule CART19 e centrifugare a 300 × g per 8 minuti a 4 °C.
   2. Risospendere le cellule CART19 con 10 ml di PBS e centrifugare a 300 × g per 8 minuti a 4 °C.
   3. Risospendere le cellule CART19 a una concentrazione finale di 40 × 10⁶ cellule/ml con PBS, trasferire le cellule in una provetta sterile da microcentrifuga da 1,5 mL e metterle su ghiaccio.
   4. Eseguire iniezioni di vene della coda delle cellule CART19 (come descritto sopra) iniettando 100 μL di cellule risospese e.v.
      NOTA: Un volume di 100 μL somministrerà 4 × 10⁶ cellule a ciascun topo. Includere un gruppo di topi non trattati come controllo negativo.

5. Valutazione della tossicità associata alle cellule CART19

1. Dopo la somministrazione di cellule CART19, monitorare i topi 2 volte al giorno per valutare eventuali cambiamenti nel loro benessere, come debolezza motoria, corpo curvo e perdita di peso corporeo.
   NOTA: Tutti questi cambiamenti fisici sono correlati con i sintomi della CRS in questo modello²⁸.
2. Una volta che i topi iniziano a sviluppare debolezza motoria e riduzione del peso (riduzione del 10-20% rispetto al basale), raccogliere sangue periferico per analizzare il carico tumorale e condurre l'isolamento sierico per le citochine secondo la metodologia descritta nella sezione 3 (Figura 3).
3. Conservare le provette di microcentrifuga sierica a -80 °C e utilizzare i sieri per analizzare le chemochine e le citochine utilizzando un test multiplex (Figura 4).
   NOTA: Se i topi mostrano segni di paralisi degli arti posteriori, appaiono moribondi o letargici, e la perdita di peso è > il 20% del loro peso corporeo fino al punto che limita la loro capacità di raggiungere cibo e / o acqua, allora saranno sottoposti a eutanasia.

6. Imaging MRI

NOTA: Uno scanner MRI preclinico (per piccoli animali) con un magnete a foro verticale è stato utilizzato per la risonanza magnetica in vivo e l'acquisizione di immagini^32,33.

1. Mescolare 120 μL di gadolinio + 880 μL di soluzione salina e caricare in una siringa da insulina da 1 ml. Iniettare 100 μL in ciascun topo (i.p.).
   NOTA: Il gadolinio deve essere iniettato 15-20 minuti prima dell'inizio dell'esperimento.
2. Anestetizzare il topo usando isoflurano (2-3%) in una camera di induzione per 10-15 minuti.
   NOTA: Si consiglia vivamente di applicare unguento oftalmico per prevenire la secchezza degli occhi.
3. Posizionare la spina del mouse sulla sonda della culla compatibile con il roditore. Quindi, procedere a posizionare il mouse agganciando i denti alla barra del morso.
4. Tirare la testa del mouse nella bobina del volume di 25 mm e regolare il cono del naso legato al sistema di anestesia isoflurano. Stringere la manopola della barra del morso per mantenere la posizione per tutta la durata della scansione.
   NOTA: Se si esegue una risonanza magnetica con mezzo di contrasto, assicurarsi che il gadolinio (in questo caso) o l'agente di contrasto vengano iniettati almeno 10 minuti prima di inserire l'apparecchio nel magnete. Durante tutto il tempo dell'imaging, i topi saranno anestetizzati dall'inalazione del 2-3% di isoflurano nell'aria attraverso il cono del naso e la loro frequenza respiratoria sarà monitorata simultaneamente.
5. Per la valutazione della respirazione, utilizzare un dispositivo di monitoraggio respiratorio / respiratorio.
   NOTA: È importante valutare anche la temperatura corporea al fine di prevenire possibili ipotermie dovute all'esposizione prolungata all'anestesia. Si consiglia di utilizzare cuscinetti termici per controllare la temperatura corporea.
   1. Collegare la sonda del monitor di respirazione vicino al diaframma e fissarla con nastro chirurgico. Mantenere la frequenza respiratoria tra 20-60 respiri al minuto in modo che le condizioni del topo siano stabili.
      NOTA: questa frequenza fornisce immagini MRI più stabili e previene gli artefatti di movimento nell'immagine acquisita. Se la frequenza respiratoria è superiore all'intervallo 20-60 respiri al minuto, aumentare la concentrazione di isoflurano. Se la frequenza respiratoria è inferiore a 20 respiri al minuto, l'anestesia è troppo profonda; Pertanto, la concentrazione deve essere ridotta.
6. Inserire la sonda animale nel foro di piccole dimensioni all'interno del sistema di risonanza magnetica per piccoli animali a foro verticale. Regolare la testa dell'animale al centro della bobina. Fissare l'apparecchio con la serratura in modo che possa stare in posizione verticale e collegare lo strumento al computer.
7. Aprire e utilizzare il software (ad esempio, Paravision) per impostare le posizioni di scansione e i tipi di scansioni. Determinare le posizioni assiali e sagittali ottimali mantenendoli coerenti per tutti i gruppi sperimentali.
   NOTA: Si consiglia di utilizzare l'acquisizione di una scansione di prova come riferimento prima delle scansioni MRI a lunghezza intera.
8. Procedere con la raccolta dei dati MRI (come precedentemente descritto^32,34,35,36). Ottenere immagini MRI pesate sia T1 che T2 utilizzando la configurazione suggerita menzionata di seguito.
   1. Per le immagini MRI pesate in T1, utilizzare la sequenza multislice multiecho (MSME) pesata T1 con un tempo di ripetizione (TR) di 300 ms, un tempo di eco (TE) di 9,5 ms, un campo visivo (FOV) di 4 cm x 2 cm x 2 cm e una matrice di 192 x 96 x 96.
   2. Per le immagini MRI pesate in T2, utilizzare una sequenza Multislice Multiecho (MSME) con un TR di 300 ms, un TE di 9,5 ms, un FOV di 4 cm x 2 cm x 2 cm e una matrice di 192 x 96 x 96 è stata utilizzata.
9. Una volta completate le scansioni, rimuovere la sonda dal foro. Estrarre delicatamente il mouse rimuovendo i denti dalla barra del morso. Monitorare l'animale in una gabbia separata fino a quando non è completamente cosciente e ha riacquistato un'adeguata funzione motoria.
10. Dopo l'estrazione dei dati dal software, utilizzare il software di analisi per la quantificazione e il rendering del volume 3D (Figura 4) delle regioni di iperintensità.
    NOTA: Se possibile, si consiglia vivamente di avere due osservatori in cieco separati per l'analisi dei dati.

Lo scopo di questo protocollo è valutare le tossicità associate alle cellule CART utilizzando un modello di topi PDX da cellule tumorali di pazienti con LLA (Figura 1). In primo luogo, i topi NSG hanno ricevuto iniezioni i.p. di busulfan (30 mg / kg) con l'obiettivo di immunosopprimerli e facilitare l'attecchimento delle cellule CART²⁸. Il giorno seguente, hanno ricevuto ~ 5 × 10⁶ PBMC (i.v.) derivati da TUTTI i pazienti. I topi sono stati monitorati per l'attecchimento per ~ 13 settimane tramite il saggio di sanguinamento della coda. I globuli rossi sono stati raccolti e lisati, seguiti dalla preparazione della citometria a flusso per valutare l'espressione delle cellule tumorali CD19⁺ (Figura 2).

Una volta che i topi hanno raggiunto ≥10 cellule tumorali / μL, sono stati randomizzati e preparati a ricevere 4 × 10⁶ cellule CART19 (e.v.). Per valutare la tossicità associata a CART19, i topi sono stati pesati una volta al giorno (Figura 3A). La perdita di peso è stata scelta come sintomo della comparsa di CRS, poiché è stato precedentemente rivelato essere correlato alle tossicità associate alle cellule CART^28,37. Sono stati eseguiti saggi del sangue periferico (tramite raccolta di sangue sottomandibolare) per valutare il carico tumorale e l'espansione delle cellule CART mediante analisi citometrica a flusso di cellule tumorali umane CD19 + e cellule T CD3 ⁺ umane. Inoltre, è stato raccolto il siero ed è stata eseguita una valutazione delle citochine infiammatorie. I test sono stati effettuati un giorno prima dell'infusione di cellule CART19 e 5 e 10 giorni dopo l'infusione di cellule CART19, poiché questi punti temporali sono particolarmente rilevanti per l'insorgenza della CRS e lo sviluppo dei sintomi.

Qui, in particolare, è stato eseguito un test multiplex prima e dopo la somministrazione di cellule CART19, dove le citochine e le chemochine più rappresentative erano GM-CSF, IL-18, MIP-1α e IP-10 (Figura 3B). Tuttavia, altri test possono essere fatti per valutare le concentrazioni di queste proteine nel siero. In alternativa, i topi sono stati sottoposti a scansione MRI per valutare la permeabilità vascolare nel sistema nervoso centrale (SNC). Ai topi è stato iniettato il reagente di contrasto gadolinio (i.p.) per misurare l'infiammazione cerebrale e la rottura della barriera emato-encefalica³⁸. Quindi, sono stati anestetizzati con isoflurano e sono state prese immagini pesate in T1 e T2 (Figura 4). Con le immagini T2 (Figura 4, a sinistra), la sezione più luminosa (bianca) indica la presenza di edema o fluido, che si osserva principalmente nei tumori cerebrali e nell'infiammazione. Con le immagini T1 (Figura 4, al centro), le sezioni più luminose indicano aree in cui vi è perdita di sangue o rottura della barriera emato-encefalica. Infine, con l'aiuto del software, le immagini di ricostruzione 3D (Figura 4, a destra) sono state assemblate utilizzando immagini T1 potenziate con gadolinio basate su segnali di iperintensità corrispondenti alla permeabilità vascolare, che rende il volume di perdita di gadolinio nel cervello³⁴.

Figura 1: Schema sperimentale di un modello di xenotrapianto derivato dal paziente utilizzato per valutare le tossicità associate alle cellule CART, la sindrome da rilascio di citochine e la neuroinfiammazione. I topi NSG sono stati condizionati con 30 mg/kg di busulfan (i.p.) e hanno ricevuto 3 × 10 6-5 × 10⁶ blasti (e.v.) derivati dal sangue periferico di pazienti con LLA. Successivamente, i topi sono stati monitorati per l'attecchimento del tumore tramite raccolta di sangue sottomandibolare, seguita da citometria a flusso per valutare i blasti CD19 ⁺. Quando le cellule CD19+ del sangue periferico erano ≥10 cellule/μL, i topi hanno ricevuto 2 × 10^6-5 × 10^{6 cellule} CART19. I topi sono stati pesati quotidianamente come misura del loro benessere. A 10 giorni dall'infusione di cellule CART19, sono state eseguite risonanze magnetiche cerebrali di topo per rilevare la neuroinfiammazione. Il sanguinamento della coda per valutare la produzione di citochine / chemochine e l'espansione delle cellule T è stato eseguito settimanalmente dopo l'iniezione di cellule CART19. Abbreviazioni: CART = chimeric antigen receptor T cell; CART19 = CART mirato a CD19; LLA = leucemia linfoblastica acuta; i.v. = endovenosa; I.P. = intraperitoneale; PB = sangue periferico; NSG = NOD-SCID IL2rγnull. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Analisi delle cellule tumorali CD19⁺ come indicatore del carico tumorale in un modello ALL PDX per valutare le tossicità associate alle cellule CART. (A) Analisi citometrica a flusso rappresentativa che mostra la strategia di gating per analizzare la popolazione di cellule CD19⁺ prelevata da un campione di sangue periferico di un topo iniettato con LLA derivata dal paziente. (B) La quantificazione e il confronto delle popolazioni di cellule CD19⁺ tra topi trattati con CART19 e topi non trattati sulla base di dati grezzi ottenuti dall'analisi della citometria a flusso. (ANOVA unidirezionale; n = 3 topi per gruppo; barre di errore, SEM). Abbreviazioni: ns = non significativo; LLA = leucemia linfoblastica acuta; PDX = xenotrapianto; CART = cellula T del recettore dell'antigene chimerico; CART19 = CART mirato a CD19; SSC-H = altezza del picco di dispersione laterale; FSC-H = altezza del picco di dispersione in avanti; SSC-A = area laterale del picco di dispersione; FSC-A = area di picco di dispersione in avanti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Valutazione delle tossicità associate a CART19 utilizzando un modello ALL PDX. (A) Grafico rappresentativo della percentuale di riduzione del peso nei topi trattati con cellule CART19 o cellule T di controllo non trasdotte per i primi 6 giorni dopo CART (ANOVA bidirezionale, ***p < 0,001, ****p < 0,00001; barre di errore, SEM). (B) Espressione di citochine e chemochine nel siero dei topi NSG prima e dopo la somministrazione di cellule CART19. I topi NSG sono stati sottoposti a sanguinamento sottomandibolare prima e dopo la somministrazione di cellule CART19 (e.v.) per raccogliere il loro siero e valutare l'espressione delle seguenti citochine e chemochine: GM-CSF, IL-18, MIP-1α, IP-10, IL-1β e IL-6 (ANOVA a due vie, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001; n = 3 topi; nove repliche tecniche; barre di errore, SEM). Abbreviazioni: ns = non significativo; LLA = leucemia linfoblastica acuta; PDX = xenotrapianto; CART = cellula T del recettore dell'antigene chimerico; CART19 = CART mirato a CD19; NSG = NOD-SCID IL2rγnull; GM-CSF = fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi; IL-18 = interleuchina-18; MIP-1α = proteina infiammatoria dei macrofagi-1 alfa; IP-10 = proteina 10 indotta da interferone gamma; IL-1β = interleuchina-1β; IL-6 = interleuchina-6. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Risonanza magnetica utilizzata per valutare la neuroinfiammazione durante il trattamento con cellule CART19 in un modello PDX. I topi NSG innestati con cellule tumorali derivate da pazienti LLA sono stati infusi con cellule CART19 e il cervello è stato ripreso con risonanza magnetica potenziata con gadolinio dopo che i topi hanno mostrato sintomi neurologici entro 10 giorni dall'infusione di CART. (Sinistra) Immagine pesata in T2 che rivela evidenza di edema e possibile infiltrato infiammatorio durante NI in topi trattati con CART19 (freccia rossa). (Al centro) Sezione assiale rappresentativa della risonanza magnetica pesata in T1 che mostra un aumento del contrasto all'interno del parenchima cerebrale, indicando un aumento della permeabilità vascolare nei topi trattati con CART19 (freccia rossa). (Destra) Le ricostruzioni tridimensionali del cervello dei roditori con regioni di iperintensità T1 (rosso) sono state generate utilizzando il software Analyze 12.0. Abbreviazioni: MRI = risonanza magnetica; LLA = leucemia linfoblastica acuta; PDX = xenotrapianto; CART = cellula T del recettore dell'antigene chimerico; CART19 = CART mirato al CD19. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Ricapitolazione delle tossicità associate alle cellule CART clinicamente osservate dal modello ALL PDX. Abbreviazioni: GM-CSF = fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi; IL = interleuchina; CRS = sindrome da rilascio di citochine; NI = neuroinfiammazione; BBB = barriera emato-encefalica; SNC = sistema nervoso centrale; MCP-1 = proteina chemioattrattante monocitaria 1.

In questo rapporto è stata descritta una metodologia per valutare le tossicità associate alle cellule CART utilizzando un modello ALL PDX. Più specificamente, questo modello cerca di imitare due tossicità potenzialmente letali, CRS e NI, che i pazienti spesso sperimentano dopo l'infusione di cellule CART. Riassume molti segni distintivi delle tossicità CART osservate nella clinica: perdita di peso, disfunzione motoria, neuroinfiammazione, produzione di citochine infiammatorie e chemochine e infiltrazione di diverse cellule effettrici nel sistema nervoso centrale 8,20,28. In precedenza, questo modello PDX è stato utilizzato per imitare lo sviluppo iniziale di CRS e NI (Tabella 1) e valutare diverse strategie per la prevenzione e il trattamento della tossicità. Uno studio in questo modello PDX ha utilizzato cellule CART19 impoverite di GM-CSF. Più specificamente, questi risultati hanno dimostrato che la deplezione di GM-CSF ha comportato la riduzione della secrezione di citochine e chemochine legate al CRS, che è stata chiaramente dimostrata utilizzando questo modello murino ALL PDX²⁹. Questo modello PDX è stato utilizzato con successo anche per valutare l'espansione in vivo della cellula CART correlata allo sviluppo di CRS dopo infusione di cellule CART19 utilizzando un trasportatore di ioduro di sodio (NIS) come piattaforma di imaging²⁶. Pertanto, questo modello proposto rappresenta uno strumento utile che può essere utilizzato per valutare le potenziali tossicità derivanti dalle cellule CART.

È importante ricordare che molti altri modelli sono stati utilizzati per studiare le cellule CART in vivo. Questi includono modelli murini singeneici, transgenici e umanizzati, oltre a modelli xenogenici²⁴. Il modello murino singeneico, chiamato anche modello murino allogenico immunocompetente, utilizza cellule CART, tumore e antigeni bersaglio di origine murina. Ciò è vantaggioso in quanto consente lo studio delle cellule CART in un sistema immunitario completamente funzionale e può anche rivelare tossicità on-target, off-tumore. Lo svantaggio di questo modello è che la biologia e l'immunità dei topi sono diverse da quelle degli esseri umani e, pertanto, non è un modello rilevante per gli studi traslazionali in cui l'obiettivo è procedere agli studi clinici^24,39.

I modelli murini transgenici immunocompetenti esprimono un transgene dell'antigene associato al tumore umano (TAA) sia sul tessuto sano che sui tumori in modelli che imitano quelli trovati nei tessuti umani. Questi topi sono stati utilizzati anche negli studi CART per valutare meglio la sicurezza delle cellule CART rivelando effetti off-tumorali on-target^40,41. Topi umanizzati impiantati con cellule staminali ematopoietiche umane CD34⁺ possono essere un modello vantaggioso per studiare l'efficacia e la tossicità del CART sul sistema ematopoietico umano, poiché il sistema immunitario ricostituito può imitare l'inibizione della CART e indurre una tempesta di citochine che ricapitola la CRS vista in clinica^42,43,44. Sebbene questi modelli consentano lo studio di specifiche cellule immunitarie in relazione all'efficacia della CART, il sistema umanizzato è ancora primitivo e necessita di ulteriore ottimizzazione. Inoltre, il loro uso nello studio degli effetti fuori bersaglio è limitato poiché la maggior parte degli antigeni dell'ospite sui tessuti sani sono di origine murina. Inoltre, il modello murino umanizzato CD34⁺ è tecnicamente difficile da sviluppare⁴⁵. Tuttavia, i modelli di xenotrapianto umano in topi immunocompromessi sono comunemente usati per valutare l'efficacia delle cellule CART umane prima di tradurli in studi clinici e, come dimostrato in questo articolo, possono essere utilizzati per valutare le tossicità associate all'attività delle cellule CART. Tuttavia, la mancanza di cellule immunitarie e immunitarie come le cellule T e le cellule NK limita la loro applicazione per valutare la tossicità off-tumor on-target, le interazioni delle cellule CART con le cellule immunitarie innate e l'inibizione delle cellule CART da parte del microambiente tumorale.

Il vantaggio del protocollo qui descritto è che richiede semplici procedure che utilizzano topi NSG per osservare e valutare le tossicità associate alle cellule CART. In primo luogo, è facile da riprodurre ed è stato ottimizzato per valutare le strategie per prevenire la tossicità CART attraverso la neutralizzazione GM-CSF e per visualizzare l'espansione delle cellule CART in correlazione con l'insorgenza di CRS. Quando si utilizza questo nuovo modello PDX, è importante eseguire correttamente i passaggi critici, come la conferma del corretto attecchimento delle esplosioni ALL e il monitoraggio precoce dell'insorgenza di CRS subito dopo la somministrazione di CART. La valutazione delle citochine e il monitoraggio del peso sono cruciali per determinare le tossicità associate a CART e la risonanza magnetica definisce l'insorgenza di NI. Gli svantaggi di questo modello sono i seguenti: 1) poiché le cellule PDX ALL impiegano più tempo per attecchirsi e raggiungere un elevato carico tumorale, sono necessari circa 2-3 mesi dall'inoculazione delle cellule tumorali al trattamento cellulare CART19; 2) come modello primario di PDX, vi è una significativa variabilità da paziente a paziente per quanto riguarda il tempo di attecchimento e la risposta alla terapia cellulare CART; 3) il carico tumorale non può essere valutato con la bioluminescenza e richiede frequenti valutazioni del sangue periferico; e 4) la mancanza di cellule immunitarie innate limita la capacità di questo modello di studiare le interazioni della CART con le cellule immunitarie o il microambiente tumorale.

L'interesse nel testare cellule adottive all'interno di modelli murini più complessi è cresciuto negli ultimi dieci anni poiché è diventato evidente che semplici modelli murini immunodeficienti non sono modelli preclinici ideali. Il modello murino PDX qui descritto per valutare le tossicità associate alle cellule CART rappresenta un promettente modello preclinico nel campo della terapia cellulare CART in quanto imita la tempistica, i sintomi e i marcatori di CRS e NI dopo infusione di cellule CART come visto in clinica. Nel complesso, la metodologia qui descritta fornisce una solida piattaforma per valutare le tossicità e l'efficacia associate alle cellule CART19.

S.S.K. è inventore di brevetti nel campo dell'immunoterapia CAR concessi in licenza a Novartis (attraverso un accordo tra Mayo Clinic, University of Pennsylvania e Novartis) e a Mettaforge (attraverso Mayo Clinic). R.L.S. e S.S.K. sono inventori di brevetti nel campo dell'immunoterapia CAR concessi in licenza a Humanigen. S.S.K. riceve finanziamenti per la ricerca da Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs e Lentigen.

Questo lavoro è stato in parte supportato attraverso il National Institutes of Health (R37CA266344, 1K99CA273304), il Dipartimento della Difesa (CA201127), la pipeline K2R DELLA Mayo Clinic (S.S.K.), il Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (S.S.K.) e la Predolin Foundation (R.L.S.). Inoltre, vorremmo ringraziare lo staff della Mayo Clinic NMR Core Facility. La Figura 1 è stata creata nel BioRender.com

An erratum was issued for: Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model. The Authors section was updated from:

Claudia Manriquez Roman^1,2,3,4,5
R. Leo Sakemura^1,2
Fang Jin⁶
Roman H. Khadka⁶
Mohamad M. Adada^1,2
Elizabeth L. Siegler^1,2
Aaron J. Johnson⁶
Saad S. Kenderian^1,2,6
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester,
²Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester,
³Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester,
⁴Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester,
⁵Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester,
⁶Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester

to:

Claudia Manriquez Roman^1,2,3,4,5
R. Leo Sakemura^1,2
Brooke L. Kimball^1,2
Fang Jin⁶
Roman H. Khadka⁶
Mohamad M. Adada^1,2
Elizabeth L. Siegler^1,2
Aaron J. Johnson⁶
Saad S. Kenderian^1,2,6
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester,
²Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester,
³Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester,
⁴Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester,
⁵Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester,
⁶Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester