Explorando mutações da caspase e modificação pós-translacional por abordagens de modelagem molecular

O presente protocolo utiliza um pacote de simulação biomolecular e descreve a abordagem de dinâmica molecular (MD) para modelar a caspase do tipo selvagem e suas formas mutantes. O método MD permite avaliar a evolução dinâmica da estrutura da caspase e o efeito potencial de mutações ou modificações pós-traducionais.

A apoptose é um tipo de morte celular programada que elimina células danificadas e controla o desenvolvimento e a homeostase tecidual de organismos multicelulares. Caspases, uma família de proteases de cisteína, desempenham um papel fundamental na iniciação e execução da apoptose. A maturação das caspases e sua atividade é ajustada por modificações pós-traducionais de forma altamente dinâmica. Para avaliar o efeito das alterações pós-translacionais, os locais potenciais são rotineiramente mutados com resíduos persistentes a quaisquer modificações. Por exemplo, o resíduo de serina é substituído por alanina ou ácido aspártico. No entanto, tais substituições poderiam alterar a conformação do sítio ativo da caspase, levando a distúrbios na atividade catalítica e nas funções celulares. Além disso, mutações de outros resíduos de aminoácidos localizados em posições críticas também podem quebrar a estrutura e as funções das caspases e levar à perturbação da apoptose. Para evitar as dificuldades de empregar resíduos mutantes, abordagens de modelagem molecular podem ser prontamente aplicadas para estimar o efeito potencial das substituições de aminoácidos na estrutura da caspase. O presente protocolo permite a modelagem tanto da caspase do tipo selvagem quanto de suas formas mutantes com o pacote de simulação biomolecular (Amber) e instalações de supercomputador para testar o efeito de mutações na estrutura e função da proteína.

A apoptose é um dos processos celulares mais amplamente estudados que regulam a morfogênese e a homeostase tecidual de organismos multicelulares. A apoptose pode ser iniciada por uma ampla gama de estímulos externos ou internos, como a ativação de receptores de morte, distúrbios nos sinais do ciclo celular, danos ao DNA, estresse do retículo endoplasmático (RE) e várias infecções bacterianas e virais¹. As caspases - principais atores apoptóticos - são convencionalmente classificadas em dois grupos: iniciadores (caspase-2, caspase-8, caspase-9 e caspase-10) e efetores (caspase-3, caspase-6 e caspase-7), dependendo de sua estrutura de domínio e do lugar na cascata da caspase ^2,3. Após os sinais de morte celular, as caspases iniciadoras interagem com moléculas adaptadoras que facilitam a dimerização induzida pela proximidade e o autoprocessamento para formar uma enzima ativa. As caspases efetoras são ativadas através de clivagem por caspases iniciadoras e realizam etapas de execução a jusante por clivagem múltiplos substratos celulares⁴.

A maturação e a função das caspases iniciadora e efetora são reguladas por um grande número de diferentes mecanismos intracelulares, dentre os quais a modificação pós-translacional desempenha um papel indispensável na modulação da morte celular⁵. A adição de grupos modificadores (fosforilação, nitrosilação, metilação ou acetilação) ou proteínas (ubiquitinação ou SUMOilação) altera a atividade enzimática das caspases ou a conformação e estabilidade proteica que regulam a apoptose. A mutagênese dirigida ao site é amplamente aplicada para investigar os possíveis locais de modificação pós-translacional e discernir seu papel. Um suposto local de modificação é geralmente substituído por outro aminoácido, que não pode ser modificado ainda mais. Assim, serina e treonina potencialmente fosforiladas são mutadas para alanina, e os locais de ubiquitinação de lisina são substituídos por arginina. Outra estratégia inclui a substituição de um aminoácido que imita particularmente a modificação pós-translacional (por exemplo, glutamato e aspartato têm sido usados para imitar serina fosforilada ou treonina)⁶. No entanto, algumas dessas substituições localizadas na alta vizinhança de um sítio ativo ou em posições críticas podem alterar a estrutura da caspase, perturbar a atividade catalítica e suprimir a morte celular apoptótica⁷. Efeitos semelhantes podem ser observados em casos de mutações missense associadas a tumores em genes caspase. Por exemplo, a mutação tumoral associada à caspase-6 - R259H - resultou em alterações conformacionais de alças na bolsa de ligação ao substrato, reduzindo o eficiente turnover catalítico dos substratos⁸. A substituição do aminoácido G325A na caspase-8 identificada no carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço poderia dificultar a atividade da caspase-8, o que levou à modulação da sinalização do fator nuclear kB (NF-kB) e promoveu a tumorigênese⁹.

Para avaliar o efeito potencial das substituições de aminoácidos na estrutura e função da caspase, a modelagem molecular pode ser aplicada. A abordagem da dinâmica molecular (MD) é descrita neste trabalho para modelar a caspase do tipo selvagem e suas formas mutantes usando o pacote de simulação biomolecular (Amber). O método MD fornece uma visão da evolução dinâmica da estrutura da proteína após a introdução de mutações. Originalmente desenvolvido pelo grupo de Peter Kollman, o pacote Amber tornou-se uma das ferramentas de software mais populares para simulações biomoleculares^10,11,12,13. Este software é dividido em duas partes: (1) AmberTools, uma coleção de programas rotineiramente utilizados para a preparação do sistema (atribuição de tipo de átomo, adição de hidrogênios e moléculas de água explícita, etc.) e análise de trajetória; e (2) Âmbar, que é centrado em torno do programa de simulação pmemd. O AmberTools é um pacote gratuito (e um pré-requisito para instalar o próprio Amber), enquanto o Amber é distribuído com uma estrutura separada de licenças e taxas. Simulações paralelas em um supercomputador e/ou utilizando unidades de processamento gráfico (GPUs) podem melhorar substancialmente o desempenho para a pesquisa científica da dinâmica da estrutura de proteínas¹⁴. As versões de software mais recentes disponíveis são AmberTools21 e Amber20, mas os protocolos descritos também podem ser usados com as versões anteriores.

1. Preparação do sistema

NOTA: Os modelos moleculares das formas proteicas nativas e mutantes são construídos com base em uma estrutura cristalina apropriada obtida do Protein Data Bank^15,16.

1. Para recuperar a estrutura PDB selecionada, use a lista suspensa Baixar arquivos e clique em Formato PDB. Remova comentários e dados de conectividade e insira um cartão TER entre cadeias de proteínas separadas no arquivo PDB. Opcionalmente, defina o estado de protonação dos resíduos de histidina substituindo o nome do resíduo HIS por HIE, HID ou HIP (Arquivo Suplementar 1).
   NOTA: É razoável não remover moléculas de água cristalograficamente resolvidas (se presentes no arquivo PDB).
2. Para preparar o modelo inicial, inicie o programa tleap (pacote AmberTools) e insira comandos que manipulam objetos tleap .
   1. Inicie o programa: tleap. Carregue o campo de força ff14SB para descrever a proteína com mecânica molecular: > fonte leaprc.protein.ff14SB.
   2. Campos de força de carga para moléculas de água e íons atômicos (Na⁺, Cl^-): fonte de > leaprc.water.tip3p.
   3. Carregue o arquivo PDB e construa coordenadas para hidrogênios, criando um objeto chamado mol: > mol = loadpdb protein.pdb.
   4. Verifique se há inconsistências internas que possam causar problemas: > verifique mol.
      NOTA: Pontes de dissulfeto, se presentes, devem ser especificadas manualmente. Substitua os nomes das cisteínas ligadas covalentemente CYS por CYX e digite o seguinte comando em tleap para criar uma ligação entre átomos SG: ligação mol.X.SG mol.Y.SG (X e Y são números de resíduos de cisteína).
   5. Crie uma caixa de solvente em torno da proteína (água TIP3P, distância de 12 Å): > solvatebox mol TIP3PBOX 12.0.
   6. Verifique a carga total: > mol de carga e adicione contraíons (Na⁺ ou Cl^-) para neutralizar o sistema:
      > adições mol Na⁺ 0.
   7. Crie o arquivo prmtop de topologia e o arquivo inpcrd de coordenadas (entradas para executar uma simulação): > saveamberparm mol protein.prmtop protein.inpcrd. Saia do programa tleap: > saia.
      NOTA: Os arquivos de coordenadas no formato âmbar podem ser facilmente convertidos para o formato PDB usando a ferramenta ambpdb (consulte o Manual do Usuário, consulte Tabela de Materiais).

2. Minimização de energia

NOTA: A minimização de energia é necessária para remover quaisquer contatos defeituosos e sobreposições entre átomos no sistema de partida que levam à instabilidade ao executar o MD.

1. Realizar o primeiro estágio da minimização de energia (2.500 passos do algoritmo de descida mais íngreme + 2.500 passos do algoritmo de gradiente conjugado) para otimizar as posições de átomos de hidrogênio e moléculas de água adicionados, mantendo as coordenadas de proteína fixadas por restrições posicionais em átomos pesados.
   1. Execute o programa pmemd da seguinte maneira:
      pmemd -O -i min1.in -p protein.prmtop -c protein.inpcrd -o protein_min1.out
      -r protein_min1.rst -ref protein.inpcrd.
   2. Siga os argumentos necessários: -i FILE dados de controle; -p Topologia molecular FILE, parâmetros de campo de força, nomes de átomos; -c Coordenadas iniciais do FILE; -o FILE de saída de log legível pelo usuário; -r Coordenadas finais do FILE; -ref Coordenadas de referência FILE para restrições de posição.
   3. Especifique as opções no arquivo de entrada min1.in:
      &cntrl
      imin=1, maxcyc=5000, ncyc=2500,
      cut=10.0, ntb=1,
      ntc=1, ntf=1,
      ntpr=10,
      ntr=1,
      restraintmask=':1-517 & !@H=',
      restraint_wt=2,0
      /
      NOTA: Opções de entrada: imin=1 executar minimização; maxcyc=5000 número máximo de ciclos de minimização; O método de minimização ncyc=2500 é alternado da descida mais íngreme para o gradiente conjugado após ciclos ncyc ; corte=10,0 ponto de corte não colado (Å); ntb=1 são impostos limites periódicos, volume constante; ntc=1 nenhuma restrição é aplicada aos comprimentos de ligação (para melhor convergência de energia); ntf=1 todas as interações são calculadas; ntpr=10 informações de energia são impressas no arquivo de saída a cada passo ntpr ; ntr=1 sinalizador para conter átomos especificados usando um potencial harmônico; restraintmask=':1-517 & !@H=' especifica átomos contidos; restraint_wt=2,0 peso (kcal/mol∙Ų) para restrições posicionais.
2. Realize o segundo estágio da minimização de energia (5.000 degraus de descida mais íngremes + 5.000 degraus de gradiente conjugado) sem restrições para otimizar todo o sistema.
   1. Use min2.in e protein_min1.rst como entradas: pmemd -O -i min2.in -p protein.prmtop
      -c protein_min1.rst -o protein_min2.out -r protein_min2.rst.
   2. Especifique as opções no arquivo de entrada min2.in:
      &cntrl
      imin=1, maxcyc=10000, ncyc=5000,
      cut=10.0, ntb=1,
      ntc=1, ntf=1,
      ntpr=10
      /

3. Aquecimento

NOTA: Esta etapa visa aquecer o sistema de 0 K a 300 K. As velocidades iniciais são atribuídas aos átomos, uma vez que o modelo inicial baseado no arquivo PDB não contém informações de velocidade.

1. Realizar o processo de aquecimento com restrições posicionais nos átomos de proteína (50 ps, volume constante).
   1. Use heat.in e protein_min2.rst como entradas: pmemd -O -i heat.in -p protein.prmtop
      -c protein_min2.rst -o protein_heat.out
      -r protein_heat.rst -x protein_heat.mdcrd -ref protein_min2.rst
   2. Siga os argumentos necessários: -x conjuntos de coordenadas FILE salvos ao longo da trajetória do MD.
   3. Especifique as opções no arquivo de entrada heat.in:
      &cntrl
      imin=0, irest=0, ntx=1,
      nstlim=25000, dt=0,002,
      ntc=2, ntf=2,
      cut=10.0, ntb=1,
      ntpr=500, ntwx=500,
      ntt=3, gamma_ln=2,0,
      tempi=0,0, temp0=300,0,
      ntr=1, máscara de retenção=':1-517',
      restraint_wt=1,0,
      nmropt=1
      /
      &wt TYPE='TEMP0',
      istep1=0, istep2=25000,
      valor1=0,1, valor2=300,0 /
      &wt TYPE='FIM' /
      Observação : opções de entrada: imin = 0 executar MD; irest=0 execute uma nova simulação; ntx=1 nenhuma velocidade inicial é lida a partir do primeiro arquivo; nstlim=25000 número de passos de MD; dt=0,002 passo de tempo (ps); As ligações ntc=2 envolvendo hidrogênio são restringidas usando o algoritmo SHAKE; ntf=2 forças para as ligações restritas não são calculadas; ntwx=500 coordenadas são gravadas no arquivo mdcrd a cada passo ntwx ; ntt=3 Regulação da temperatura de Langevin; gamma_ln=2,0 frequência de colisão para a dinâmica de Langevin (ps⁻¹); tempi=0,0 temperatura inicial; temperatura de referência temp0=300,0 ; nmropt=1 parâmetros especificados em uma lista de nomes &wt são lidos; TYPE='TEMP0' varia a temperatura alvo.

4. Equilíbrio

NOTA: Esta etapa é necessária para ajustar a densidade da água e obter o estado de equilíbrio da proteína.

1. Realizar o equilíbrio a 300 K sem quaisquer restrições (500 ps, pressão constante).
   1. Use equil.in e protein_heat.rst como entradas: pmemd -O -i equil.in -p protein.prmtop
      -c protein_heat.rst -o protein_equil.out -r protein_equil.rst -x protein_equil.mdcrd.
   2. Especifique as opções no arquivo de entrada equil.in:
      &cntrl
      imin=0, irest=1, ntx=5,
      nstlim=250000,
      dt=0,002,
      ntc=2, ntf=2,
      cut=10.0, ntb=2, ntp=1, taup=2.0,
      ntpr=1000, ntwx=1000, ntwr=50000,
      ntt=3, gamma_ln=2,0,
      temp0=300,0
      /
      NOTA: Opções de entrada: irest=1 reinicie a simulação; As coordenadas e velocidades ntx=5 são lidas a partir de um arquivo rst gerado anteriormente; ntb=2 limites periódicos são impostos, pressão constante; ntp=1 escala de pressão isotrópica; taup=2,0 tempo de relaxamento da pressão (ps); ntwr=50000 a cada passo ntwr , o primeiro arquivo é gravado, garantindo a recuperação de uma falha.

5. Dinâmica de produção

1. Após o equilíbrio ter sido alcançado com sucesso, realize uma simulação de MD de produção (10 ns ou mais) a pressão constante e gere o arquivo de trajetória para análise subsequente da estrutura da proteína.
   1. Use prod.in e protein_equil.rst como entradas: pmemd -O -i prod.in -p protein.prmtop
      -c protein_equil.rst -o protein_prod.out -r protein_prod.rst -x protein_prod.mdcrd.
   2. Especifique as opções no arquivo de entrada prod.in:
      &cntrl
      imin=0, irest=1, ntx=5,
      nstlim=5000000,
      dt=0,002,
      ntc=2, ntf=2,
      cut=10.0, ntb=2, ntp=1, taup=2.0,
      ntpr=1000, ntwx=1000, ntwr=50000,
      ntt=3, gamma_ln=2,0,
      temp0=300,0, ig=-1
      /
      NOTA: A versão paralela do pmemd (pmemd. MPI) ou versão acelerada por GPU (pmemd.cuda) pode ser usada em clusters de computadores e supercomputadores. Uma longa simulação de MD pode ser dividida em vários segmentos e realizada sequencialmente. É altamente recomendável definir ig=-1 (opção de semente aleatória) para cada reinicialização da simulação. Os programas ptraj ou cppptraj podem ser usados para a análise e processamento de trajetórias de coordenadas. Para obter mais informações, consulte o Manual do Usuário do software.

O presente protocolo pode ser prontamente aplicado em estudos de modificação pós-translacional de caspases ou mutações patogênicas. Nesta seção, é ilustrado o fluxo de trabalho de modelagem de DM (Figura 1), que tem sido utilizado com sucesso no estudo da caspase-2⁷. Usando mutagênese in vitro direcionada ao local de potenciais sítios de fosforilação (Ser/Thr a Ala) e abordagens bioquímicas, demonstrou-se que a mutação Ser384Ala impediu o processamento da caspase-2 e bloqueou a atividade enzimática e a indução da morte celular apoptótica (Figura 1 Suplementar). No entanto, nem a análise de espectrometria de massa nem a tecnologia Phos-Tag confirmaram que o Ser384 sofre fosforilação⁷. Para compreender como o Ser384 regula a atividade da caspase-2, foi realizada a modelagem MD da estrutura proteica tridimensional (Figura 1).

Os modelos moleculares das formas selvagens e mutantes da caspase-2 foram construídos utilizando a estrutura cristalina 1pyo (as estruturas disponíveis da caspase-2 estão listadas na Tabela Suplementar 1). O mutante Ser384Ala foi criado removendo o átomo de O γ no resíduo Ser384 (em PDB, os resíduos Ser e Ala distinguem-se por ter o átomo O^γ). As coordenadas de hidrogênio geralmente estão ausentes nas estruturas cristalinas. Portanto, átomos de hidrogênio foram adicionados à estrutura da proteína e, em seguida, ela foi solvida por uma camada de 12 Å de espessura de água TIP3P para permitir simulações de solventes explícitos. Íons de sódio foram adicionados para neutralizar o sistema. Os modelos iniciais obtidos de caspase-2 foram submetidos à minimização de energia, equilíbrio e subsequente simulação de MD de 10 ns de acordo com o protocolo de modelagem MD, utilizando os arquivos de dados de min1.in, min2.in, heat.in, equil.in e controle de prod.in.

Na estrutura cristalina da caspase-2, Ser384, juntamente com Arg219 e Arg378, estão envolvidos na formação da superfície da cavidade no sítio ativo. Arg219 e Arg378 formam ligações de hidrogênio com o grupo carboxila do substrato, enquanto Ser384 não intervém em interações diretas com o substrato. Simulações de DM confirmaram que a substituição de Ser384Ala não afetou os resíduos catalíticos Cys320 (nucleófilo) e His277 (base geral), mas induziu uma grande alteração conformacional em Arg378. Seu grupo guanidínio voltou-se para o solvente a granel de modo que o átomo^{de N ε} não poderia formar uma ligação essencial de hidrogênio com o grupo carboxila do substrato (Figura 1). Na enzima nativa, ocorre uma interação eletrostática entre o átomo O^γ de Ser384 (carga parcial negativa) e o grupo guanidínio Arg378 (carga positiva). No entanto, a substituição de serina aparentemente interrompe essa interação. Assim, demonstrou-se que a substituição do Ser384Ala afetou o reconhecimento do substrato pelos resíduos de arginina no sítio ativo da caspase-2, prejudicando a atividade enzimática e a capacidade de desencadear a morte celular apoptótica. O mecanismo descoberto parece evolutivamente conservado e comum para outros membros da família caspase. Assim, a implementação de simulações de DM permitiu confirmar os resultados bioquímicos e obter novos insights sobre a estrutura molecular do centro ativo das caspases.

Figura 1: Fluxo de trabalho de modelagem MD usado para estudar a estrutura da caspase. A caspase-2 do tipo selvagem e seu mutante Ser384Ala foram investigados seguindo as instruções na seção de protocolo. Foi revelado que a substituição do Ser384Ala induz uma importante alteração conformacional no resíduo do sítio ativo Arg378. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 1 Suplementar: Função da caspase-2 na morte celular. Em resposta a estímulos extrínsecos e intrínsecos, a caspase-2 do tipo selvagem pode ser ativada por um mecanismo autoproteolítico. A caspase-2 ativa cliva Bid, que, por sua vez, promove a permeabilização da membrana externa mitocondrial e a morte celular apoptótica. A mutação Ser384Ala impede a ativação da caspase-2 e a indução da morte celular. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 1: Estruturas de Caspase-2 disponíveis no Banco de Dados de Proteínas. As estruturas são classificadas por data de lançamento. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Arquivo Suplementar 1: Diferentes etapas na edição de um arquivo PDB. Clique aqui para baixar este arquivo.

A abordagem MD descrita permite modelar as formas selvagens e mutantes de caspase usando os pacotes de simulação biomolecular. Várias questões importantes da metodologia são discutidas aqui. Primeiro, uma estrutura cristalina representativa da caspase precisa ser selecionada do Banco de Dados de Proteínas. É importante ressaltar que as formas monomérica e dimérica de caspase são aceitáveis. Escolher estruturas de alta resolução com um número mínimo de resíduos ausentes é uma boa ideia. O estado de protonação de alguns resíduos pode ser definido manualmente no arquivo PDB de entrada. Por exemplo, na Figura 1, um átomo de hidrogênio foi anexado ao átomo de N^ε2 (forma HIE) do resíduo catalítico His277. Em segundo lugar, uma caixa de solvente deve ser criada em torno da proteína para simulações de solvente explícito adicionais. A minimização de energia é necessária para otimizar as coordenadas dos átomos de hidrogênio adicionados e moléculas de água. Em terceiro lugar, o aquecimento e o equilíbrio devem ser realizados antes da simulação da dinâmica de produção. Na fase de aquecimento, deve-se garantir que as cavidades e bolsas de ligação na superfície da proteína se encham de moléculas de água (se necessário, pode-se aumentar o número de etapas de MD). Na fase de equilíbrio, a aquisição da conformação de equilíbrio da proteína precisa ser confirmada pela análise do desvio raiz-média-quadrado de seus átomos da espinha dorsal em relação às posições iniciais¹². Em quarto lugar, é necessário monitorar as mudanças conformacionais da estrutura da proteína durante a simulação da dinâmica de produção. Para este propósito, deve-se sobrepor quadros de trajetória na estrutura inicial, encaixando os átomos da espinha dorsal e, em seguida, analisar as mudanças conformacionais usando uma ferramenta de visualização molecular (VMD, PyMOL, etc.) ¹⁷. Se necessário, pode-se aumentar o número de etapas de DM e/ou dividir a simulação em vários segmentos realizados sequencialmente. Em quinto lugar, recomenda-se a utilização da versão acelerada por GPU do programa de simulação MD (pmemd.cuda), cujo desempenho excede significativamente o alcançável pela implementação tradicional da CPU^14,18.

Uma possível limitação do método descrito é a disponibilidade de certas estruturas de caspase no Banco de Dados de Proteínas. No entanto, mais de 900 entradas do APO são encontradas no âmbito do pedido "caspase", indicando que as estruturas da caspase foram investigadas em pormenor. Algumas dificuldades podem surgir quando uma estrutura cristalina é obtida em baixa resolução (ou seja, em um nível grosseiro de detalhe) ou carece de alguns fragmentos importantes para a função caspase.

Em resumo, as abordagens de modelagem MD provaram ser eficazes na previsão de mudanças estruturais de proteínas após mutações de seus genes, modificações ou interações intermoleculares. A aplicação da simulação de DM no campo da morte celular abre grandes oportunidades para estudar os mecanismos moleculares de regulação da caspase por modificações pós-traducionais. A este respeito, a simulação de DM a longo prazo poderia avaliar o comportamento dinâmico de regiões funcionais e o efeito potencial das substituições de aminoácidos para elucidar as causas moleculares associadas à caspase-2 mutada ou modificada, bem como a outras caspases. Por exemplo, mutações missense de genes iniciadores da caspase (caspase-2/caspase-8/caspase-9/caspase-10) foram detectadas em cânceres gastrointestinais e em tumores dos sistemas nervoso central e periférico¹⁹. Juntos, a modelagem MD de caspases é uma poderosa abordagem in silico para entender os mecanismos que regulam a morte celular programada e distúrbios associados e para o desenvolvimento de novas terapias eficazes.

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Fundação Russa de Ciência (17-75-20102, o desenvolvimento do protocolo). Os experimentos descritos na seção de resultados representativos (análise da fosforilação) foram apoiados pelas Sociedades de Câncer de Estocolmo (181301) e Suécia (190345).