Erforschung von Caspase-Mutationen und posttranslationalen Modifikationen durch molekulare Modellierungsansätze

Das vorliegende Protokoll verwendet ein biomolekulares Simulationspaket und beschreibt den molekulardynamischen (MD) Ansatz zur Modellierung der Wildtyp-Caspase und ihrer mutierten Formen. Die MD-Methode ermöglicht es, die dynamische Entwicklung der Caspase-Struktur und die möglichen Auswirkungen von Mutationen oder posttranslationalen Modifikationen zu beurteilen.

Apoptose ist eine Art programmierter Zelltod, der beschädigte Zellen eliminiert und die Entwicklung und Gewebehomöostase von mehrzelligen Organismen steuert. Caspasen, eine Familie von Cysteinproteasen, spielen eine Schlüsselrolle bei der Apoptose-Initiierung und -Ausführung. Die Reifung der Caspasen und ihre Aktivität wird durch posttranslationale Modifikationen hochdynamisch verfeinert. Um die Auswirkungen posttranslationaler Veränderungen zu beurteilen, werden potenzielle Standorte routinemäßig mit Rückständen mutiert, die für Modifikationen persistent sind. Beispielsweise wird der Serinrest durch Alanin oder Asparaginsäure ersetzt. Solche Substitutionen könnten jedoch die Konformation des aktiven Zentrums der Caspase verändern, was zu Störungen der katalytischen Aktivität und der zellulären Funktionen führt. Darüber hinaus könnten Mutationen anderer Aminosäurereste, die sich in kritischen Positionen befinden, auch die Struktur und Funktionen von Caspasen stören und zu Apoptosestörungen führen. Um die Schwierigkeiten bei der Verwendung mutierter Rückstände zu vermeiden, können molekulare Modellierungsansätze leicht angewendet werden, um die mögliche Wirkung von Aminosäuresubstitutionen auf die Caspase-Struktur abzuschätzen. Das vorliegende Protokoll ermöglicht die Modellierung sowohl der Wildtyp-Caspase als auch ihrer mutierten Formen mit dem biomolekularen Simulationspaket (Amber) und Supercomputeranlagen, um die Wirkung von Mutationen auf die Proteinstruktur und -funktion zu testen.

Apoptose ist einer der am besten untersuchten zellulären Prozesse, die die Morphogenese und Gewebehomöostase mehrzelliger Organismen regulieren. Apoptose kann durch eine Vielzahl von externen oder internen Reizen ausgelöst werden, wie die Aktivierung von Todesrezeptoren, Störungen der Zellzyklussignale, DNA-Schäden, endoplasmatischer Retikulumstress (ER) und verschiedene bakterielle und virale Infektionen¹. Die Caspasen - wichtige apoptotische Akteure - werden konventionell in zwei Gruppen eingeteilt: Initiatoren (Caspase-2, Caspase-8, Caspase-9 und Caspase-10) und Effektoren (Caspase-3, Caspase-6 und Caspase-7), abhängig von ihrer Domänenstruktur und dem Platz in der Caspase-Kaskade ^2,3. Bei Zelltodsignalen interagieren die Initiator-Caspasen mit Adaptermolekülen, die die Nähe induzierte Dimerisierung und Autoprocessing zu einem aktiven Enzym ermöglichen. Die Effektor-Caspasen werden durch Spaltung durch Initiator-Caspasen aktiviert und führen nachgeschaltete Ausführungsschritte durch, indem sie mehrere zelluläre Substrate spalten⁴.

Die Reifung und Funktion der Initiator- und Effektor-Caspasen werden durch eine Vielzahl verschiedener intrazellulärer Mechanismen reguliert, unter denen die posttranslationale Modifikation eine unverzichtbare Rolle bei der Zelltodmodulation spielt⁵. Die Zugabe von modifizierenden Gruppen (Phosphorylierung, Nitrosylierung, Methylierung oder Acetylierung) oder Proteinen (Ubiquitinierung oder SUMOylierung) verändert die enzymatische Aktivität von Caspasen oder die Proteinkonformation und -stabilität, die die Apoptose regulieren. Die ortsgerichtete Mutagenese wird häufig angewendet, um die potenziellen posttranslationalen Modifikationsstellen zu untersuchen und ihre Rolle zu erkennen. Eine mutmaßliche Modifikationsstelle wird normalerweise durch eine andere Aminosäure ersetzt, die nicht weiter modifiziert werden kann. So werden potentiell phosphoryliertes Serin und Threonin zu Alanin mutiert, und Lysin-Ubiquitinierungsstellen werden durch Arginin ersetzt. Eine andere Strategie beinhaltet die Substitution einer Aminosäure, die insbesondere posttranslationale Modifikationen nachahmt (z. B. wurden Glutamat und Aspartat verwendet, um phosphoryliertes Serin oder Threonin nachzuahmen)⁶. Einige dieser Substitutionen, die sich in der Nähe eines aktiven Zentrums oder in kritischen Positionen befinden, könnten jedoch die Caspase-Struktur verändern, die katalytische Aktivität stören und den apoptotischen Zelltod unterdrücken⁷. Ähnliche Effekte konnten bei tumorassoziierten Missense-Mutationen in Caspase-Genen beobachtet werden. Zum Beispiel führte die tumorassoziierte Mutation von Caspase-6 - R259H - zu Konformationsänderungen von Schleifen in der Substratbindungstasche, wodurch der effiziente katalytische Umsatz von Substraten reduziert^{wurde 8}. Die G325A-Aminosäuresubstitution in Caspase-8, die im Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom identifiziert wurde, könnte die Caspase-8-Aktivität behindern, was zur Modulation des Kernfaktor-kB (NF-kB)-Signalwegs führte und die Tumorgenese^{förderte 9}.

Um die mögliche Wirkung von Aminosäuresubstitutionen auf Caspase-Struktur und -Funktion zu bewerten, kann molekulare Modellierung angewendet werden. In dieser Arbeit wird der Ansatz der Molekulardynamik (MD) zur Modellierung der Wildtyp-Caspase und ihrer mutierten Formen mit dem biomolekularen Simulationspaket (Amber) beschrieben. Die MD-Methode gibt einen Einblick in die dynamische Entwicklung der Proteinstruktur nach der Einführung von Mutationen. Ursprünglich von Peter Kollmans Gruppe entwickelt, wurde das Amber-Paket zu einem der beliebtesten Softwarewerkzeuge für biomolekulare Simulationen^10,11,12,13. Diese Software ist in zwei Teile unterteilt: (1) AmberTools, eine Sammlung von Programmen, die routinemäßig für die Systemvorbereitung (Atomtypzuordnung, Hinzufügen von Wasserstoff und expliziten Wassermolekülen usw.) und die Trajektorienanalyse verwendet werden; und (2) Amber, das sich um das pmemd-Simulationsprogramm dreht. AmberTools ist ein kostenloses Paket (und eine Voraussetzung für die Installation von Amber selbst), während Amber mit einer separaten Lizenz- und Gebührenstruktur vertrieben wird. Parallele Simulationen auf einem Supercomputer und/oder unter Verwendung von Graphics Processing Units (GPUs) können die Leistung für die wissenschaftliche Erforschung der Proteinstrukturdynamik erheblich verbessern¹⁴. Die neuesten verfügbaren Softwareversionen sind AmberTools21 und Amber20, aber die beschriebenen Protokolle können auch mit den früheren Versionen verwendet werden.

1. Systemvorbereitung

ANMERKUNG: Die molekularen Modelle der nativen und mutierten Proteinformen basieren auf einer geeigneten Kristallstruktur aus der Proteindatenbank^15,16.

1. Um die ausgewählte PDB-Struktur abzurufen, verwenden Sie die Dropdown-Liste Dateien herunterladen und klicken Sie auf PDB-Format. Entfernen Sie Bemerkungen und Verbindungsdaten, und legen Sie eine TER-Karte zwischen separaten Proteinketten in die PDB-Datei ein. Stellen Sie optional den Protonierungszustand von Histidinresten ein, indem Sie den Rückstandsnamen KIS durch HIE, HID oder HIP ersetzen (Supplementary File 1).
   HINWEIS: Es ist sinnvoll, kristallographisch aufgelöste Wassermoleküle (falls in der PDB-Datei vorhanden) nicht zu entfernen.
2. Um das Startmodell vorzubereiten, starten Sie das Programm tleap (AmberTools-Paket) und geben Sie dann Befehle ein, die tleap-Objekte bearbeiten.
   1. Starten Sie das Programm: tleap. Laden Sie das Kraftfeld ff14SB, um das Protein mit molekularer Mechanik zu beschreiben: > Quelle leaprc.protein.ff14SB.
   2. Lastkraftfelder für Wassermoleküle und Atomionen (Na⁺, Cl^-): > Quelle leaprc.water.tip3p.
   3. Laden Sie die PDB-Datei und erstellen Sie Koordinaten für Wasserstoff, wodurch ein Objekt namens mol erstellt wird: > mol = loadpdb protein.pdb.
   4. Überprüfen Sie auf interne Inkonsistenzen, die Probleme verursachen könnten: > überprüfen Sie mol.
      HINWEIS: Disulfidbrücken, falls vorhanden, müssen manuell angegeben werden. Ersetzen Sie die Namen der kovalent gebundenen Cysteine CYS durch CYX und geben Sie den folgenden Befehl in tleap ein, um eine Bindung zwischen SG-Atomen herzustellen: Bindung mol.X.SG mol.Y.SG (X und Y sind Cysteinrestnummern).
   5. Erstellen Sie eine Lösungsmittelbox um das Protein (TIP3P-Wasser, 12 Å Abstand): > solvatebox mol TIP3PBOX 12.0.
   6. Überprüfen Sie die Gesamtladung: > Charge mol und fügen Sie Gegenionen (Na⁺ oder Cl^-) hinzu, um das System zu neutralisieren:
      > Zusätze mol Na⁺ 0.
   7. Erstellen Sie die Topologiedatei prmtop und die Koordinatendatei inpcrd (Eingaben zum Ausführen einer Simulation): > saveamberparm mol protein.prmtop protein.inpcrd. Beenden Sie das tleap-Programm: > beenden.
      HINWEIS: Koordinatendateien im Bernsteinformat können mit dem Werkzeug ambpdb problemlos in das PDB-Format konvertiert werden (siehe Benutzerhandbuch, siehe Materialtabelle).

2. Energieminimierung

HINWEIS: Die Energieminimierung ist notwendig, um fehlerhafte Kontakte und Überlappungen zwischen Atomen im Startsystem zu entfernen, die beim Ausführen von MD zu Instabilität führen.

1. Führen Sie die erste Stufe der Energieminimierung durch (2.500 Schritte des steilsten Abstiegsalgorithmus + 2.500 Schritte des konjugierten Gradientenalgorithmus), um die Positionen der hinzugefügten Wasserstoffatome und Wassermoleküle zu optimieren, während die Proteinkoordinaten durch Positionsbeschränkungen für schwere Atome fixiert bleiben.
   1. Führen Sie das Programm pmemd wie folgt aus:
      pmemd -O -i min1.in -p protein.prmtop -c protein.inpcrd -o protein_min1.out
      -r protein_min1.rst -ref protein.inpcrd.
   2. Befolgen Sie die erforderlichen Argumente: -i FILE-Steuerdaten; -p FILE molekulare Topologie, Kraftfeldparameter, Atomnamen; -c FILE Anfangskoordinaten; -o FILE benutzerlesbare Protokollausgabe; -r FILE Endkoordinaten; -ref FILE Referenzkoordinaten für Positionsbeschränkungen.
   3. Geben Sie Optionen in der Eingabedatei min1.in an:
      &cntrl
      imin=1, maxcyc=5000, ncyc=2500,
      cut=10.0, ntb=1,
      NTC=1, NTF=1,
      ntpr=10,
      ntr=1,
      restraintmask=':1-517 & !@H=',
      restraint_wt=2,0
      /
      HINWEIS: Eingabeoptionen: imin=1 Minimierung durchführen; maxcyc=5000 maximale Anzahl von Minimierungszyklen; Die Ncyc=2500-Minimierungsmethode wird nach ncyc-Zyklen vom steilsten Abstieg auf konjugierten Gradienten umgestellt; cut=10,0 nicht gebundener Cutoff (Å); ntb=1 periodische Grenzen werden auferlegt, konstantes Volumen; NTC=1 Es werden keine Einschränkungen auf Bindungslängen angewendet (für eine bessere Energiekonvergenz); ntf=1 Alle Wechselwirkungen werden berechnet; NTPR=10 Energieinformationen werden in jedem NTPR-Schritt in die Ausgangsdatei gedruckt; ntr=1-Flag zum Zurückhalten bestimmter Atome mit einem harmonischen Potential; restraintmask=':1-517 & !@H=' spezifiziert zurückgehaltene Atome; restraint_wt=2,0 Gewicht (kcal/mol∙Ų) für Positionsbeschränkungen.
2. Führen Sie die zweite Stufe der Energieminimierung (5.000 steilste Abstiegsstufen + 5.000 konjugierte Gradientenstufen) ohne Einschränkungen durch, um das gesamte System zu optimieren.
   1. Verwenden Sie min2.in und protein_min1.rst als Eingaben: pmemd -O -i min2.in -p protein.prmtop
      -c protein_min1.rst -o protein_min2.out -r protein_min2.rst.
   2. Geben Sie Optionen in der Eingabedatei min2.in an:
      &cntrl
      imin=1, maxcyc=10000, ncyc=5000,
      cut=10.0, ntb=1,
      NTC=1, NTF=1,
      ntpr=10
      /

3. Heizung

HINWEIS: Diese Phase zielt darauf ab, das System von 0 K auf 300 K zu erwärmen. Anfangsgeschwindigkeiten werden Atomen zugewiesen, da das auf der PDB-Datei basierende Startmodell keine Geschwindigkeitsinformationen enthält.

1. Führen Sie den Erwärmungsprozess mit Positionsbeschränkungen an den Proteinatomen durch (50 ps, konstantes Volumen).
   1. Verwenden Sie heat.in und protein_min2.rst als Eingaben: pmemd -O -i heat.in -p protein.prmtop
      -c protein_min2.rst -o protein_heat.out
      -r protein_heat.rst -x protein_heat.mdcrd -ref protein_min2.rst
   2. Befolgen Sie die erforderlichen Argumente: -x FILE-Koordinatensätze, die über die MD-Trajektorie gespeichert wurden.
   3. Geben Sie Optionen in der Eingabedatei heat.in an:
      &cntrl
      imin=0, irest=0, ntx=1,
      nstlim=25000, dt=0,002,
      ntc=2, ntf=2,
      cut=10.0, ntb=1,
      ntpr=500, ntwx=500,
      ntt=3, gamma_ln=2,0,
      tempi=0.0, temp0=300.0,
      ntr=1, restraintmask=':1-517',
      restraint_wt=1,0,
      nmropt=1
      /
      &wt TYPE='TEMP0',
      istep1=0, istep2=25000,
      Wert1=0,1, Wert2=300,0 /
      &wt TYPE='ENDE' /
      HINWEIS: Eingabeoptionen: imin=0 run MD; irest=0 eine neue Simulation ausführen; ntx=1 Es werden keine Anfangsgeschwindigkeiten aus der rst-Datei gelesen; nstlim=25000 Anzahl der MD-Schritte; dt=0,002 Zeitschritt (ps); ntc=2 Bindungen mit Wasserstoff werden mit dem SHAKE-Algorithmus eingeschränkt; ntf=2 Kräfte für die beschränkten Bindungen werden nicht berechnet; ntwx=500 Koordinaten werden alle NTWX-Schritte in die MDCD-Datei geschrieben; ntt=3 Langevin-Temperaturregulierung; gamma_ln=2,0 Kollisionsfrequenz für die ^{Langevindynamik (ps−1}); tempi=0,0 Anfangstemperatur; temp0=300,0 Referenztemperatur; nmropt=1 Parameter, die in einer &WT-Namensliste angegeben sind, werden gelesen; TYPE='TEMP0' variiert die Zieltemperatur.

4. Gleichgewicht

HINWEIS: Dieses Stadium ist notwendig, um die Dichte des Wassers einzustellen und den Gleichgewichtszustand des Proteins zu erhalten.

1. Führen Sie den Ausgleich bei 300 K ohne Einschränkungen durch (500 ps, konstanter Druck).
   1. Verwenden Sie equil.in und protein_heat.rst als Eingaben: pmemd -O -i equil.in -p protein.prmtop
      -c protein_heat.rst -o protein_equil.out -r protein_equil.rst -x protein_equil.mdcrd.
   2. Geben Sie Optionen in der Eingabedatei equil.in an:
      &cntrl
      imin=0, irest=1, ntx=5,
      nstlim=250000,
      dt=0,002,
      ntc=2, ntf=2,
      cut=10.0, ntb=2, ntp=1, taup=2.0,
      ntpr=1000, ntwx=1000, ntwr=50000,
      ntt=3, gamma_ln=2,0,
      temp0=300,0
      /
      HINWEIS: Eingabeoptionen: irest=1 Starten Sie die Simulation neu; ntx=5 Koordinaten und Geschwindigkeiten werden aus einer zuvor generierten RST-Datei gelesen; ntb=2 periodische Grenzen werden auferlegt, konstanter Druck; NTP=1 isotrope Druckskalierung; taup=2,0 Druckrelaxationszeit (ps); NTWR=50000 Bei jedem NTWR-Schritt wird die erste Datei geschrieben, um die Wiederherstellung nach einem Absturz zu gewährleisten.

5. Produktionsdynamik

1. Nachdem das Gleichgewicht erfolgreich erreicht wurde, führen Sie eine Produktions-MD-Simulation (10 ns oder länger) bei konstantem Druck durch und generieren die Trajektoriendatei für die anschließende Analyse der Proteinstruktur.
   1. Verwenden Sie prod.in und protein_equil.rst als Eingaben: pmemd -O -i prod.in -p protein.prmtop
      -c protein_equil.rst -o protein_prod.out -r protein_prod.rst -x protein_prod.mdcrd.
   2. Geben Sie Optionen in der Eingabedatei prod.in an:
      &cntrl
      imin=0, irest=1, ntx=5,
      nstlim=5000000,
      dt=0,002,
      ntc=2, ntf=2,
      cut=10.0, ntb=2, ntp=1, taup=2.0,
      ntpr=1000, ntwx=1000, ntwr=50000,
      ntt=3, gamma_ln=2,0,
      temp0=300,0, ig=-1
      /
      HINWEIS: Die parallele Version von pmemd (pmemd. MPI) oder GPU-beschleunigte Version (pmemd.cuda) können auf Computerclustern und Supercomputern verwendet werden. Eine lange MD-Simulation kann in mehrere Segmente unterteilt und sequentiell durchgeführt werden. Es wird dringend empfohlen, ig=-1 (zufällige Seed-Option) für jeden Simulationsneustart festzulegen. Die Programme ptraj oder cppptraj können für die Analyse und Verarbeitung von Koordinatentrajektorien verwendet werden. Weitere Informationen finden Sie im Benutzerhandbuch der Software.

Das vorliegende Protokoll kann leicht in Studien zur posttranslationalen Modifikation von Caspasen oder pathogenen Mutationen angewendet werden. In diesem Abschnitt wird der MD-Modellierungsworkflow veranschaulicht (Abbildung 1), der erfolgreich bei der Untersuchung von Caspase-2⁷ eingesetzt wurde. Unter Verwendung von in vitro ortsgerichteter Mutagenese potenzieller Phosphorylierungsstellen (Ser/Thr to Ala) und biochemischer Ansätze wurde gezeigt, dass die Ser384Ala-Mutation die Caspase-2-Verarbeitung verhindert und die enzymatische Aktivität und die Induktion des apoptotischen Zelltods blockiert (ergänzende Abbildung 1). Weder die massenspektrometrische Analyse noch die Phos-Tag-Technologie bestätigten jedoch, dass Ser384 einer Phosphorylierung unterzogen^{wird 7}. Um zu verstehen, wie Ser384 die Caspase-2-Aktivität reguliert, wurde eine MD-Modellierung der dreidimensionalen Proteinstruktur durchgeführt (Abbildung 1).

Die molekularen Modelle von Wildtyp- und mutierten Formen von Caspase-2 wurden unter Verwendung der 1pyo-Kristallstruktur konstruiert (verfügbare Caspase-2-Strukturen sind in der Zusatztabelle 1 aufgeführt). Die Ser384Ala-Mutante wurde durch Entfernen des O-γ-Atoms im Ser384-Rest erzeugt (in PDB unterscheiden sich Ser- und Ala-Reste durch das^O-γ-Atom). Wasserstoffkoordinaten fehlen normalerweise in Kristallstrukturen. Daher wurden der Proteinstruktur Wasserstoffatome hinzugefügt, und dann wurde sie durch eine 12 Å dicke Schicht TIP3P-Wasser gelöst, um weitere explizite Lösungsmittelsimulationen zu ermöglichen. Natriumionen wurden hinzugefügt, um das System zu neutralisieren. Die erhaltenen Ausgangsmodelle von Caspase-2 wurden einer Energieminimierung, einem Gleichgewicht und einer anschließenden 10-ns-MD-Simulation gemäß dem MD-Modellierungsprotokoll unterzogen, wobei die min1.in-, min2.in-, heat.in-, equil.in- und prod.in-Steuerdatendateien verwendet wurden.

In der Kristallstruktur von Caspase-2 sind Ser384 zusammen mit Arg219 und Arg378 an der Bildung der Hohlraumoberfläche im aktiven Zentrum beteiligt. Arg219 und Arg378 bilden Wasserstoffbrückenbindungen mit der Carboxylgruppe des Substrats, während Ser384 nicht in direkte Wechselwirkungen mit dem Substrat eingreift. MD-Simulationen bestätigten, dass die Ser384Ala-Substitution die katalytischen Reste Cys320 (Nukleophil) und His277 (allgemeine Base) nicht beeinflusste, sondern eine größere Konformationsänderung in Arg378 induzierte. Seine Guanidiniumgruppe wandte sich dem Bulk-Lösungsmittel zu, so dass das^N-ε-Atom keine essentielle Wasserstoffbindung mit der Carboxylgruppe des Substrats eingehen konnte (Abbildung 1). Im nativen Enzym findet eine elektrostatische Wechselwirkung zwischen dem^O-γ-Atom von Ser384 (partielle negative Ladung) und der Arg378-Guanidiniumgruppe (positive Ladung) statt. Die Serinsubstitution stört diese Wechselwirkung jedoch offenbar. So wurde gezeigt, dass die Ser384Ala-Substitution die Substraterkennung durch die Argininreste im Caspase-2-Aktivzentrum beeinflusst, die enzymatische Aktivität und die Fähigkeit, den apoptotischen Zelltod auszulösen, beeinträchtigt. Der entdeckte Mechanismus scheint evolutionär konserviert und für andere Caspase-Familienmitglieder üblich zu sein. So ermöglichte die Durchführung von MD-Simulationen, die biochemischen Ergebnisse zu bestätigen und neue Einblicke in die molekulare Struktur des aktiven Zentrums der Caspasen zu erhalten.

Abbildung 1: MD-Modellierungsworkflow zur Untersuchung der Caspase-Struktur. Der Wildtyp Caspase-2 und seine Ser384Ala-Mutante wurden gemäß den Anweisungen im Protokollabschnitt untersucht. Es zeigte sich, dass die Ser384Ala-Substitution eine wichtige Konformationsänderung im aktiven Zentrumsrest Arg378 induziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Abbildung 1: Funktion von Caspase-2 beim Zelltod. Als Reaktion auf extrinsische und intrinsische Reize kann Wildtyp-Caspase-2 durch einen autoproteolytischen Mechanismus aktiviert werden. Aktives Caspase-2 spaltet Bid, was wiederum die permeabilisierung der mitochondrialen äußeren Membran und den apoptotischen Zelltod fördert. Die Ser384Ala-Mutation verhindert die Caspase-2-Aktivierung und die Induktion des Zelltods. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatztabelle 1: Caspase-2-Strukturen in der Proteindatenbank verfügbar. Die Strukturen sind nach Erscheinungsdatum sortiert. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Zusatzdatei 1: Verschiedene Schritte beim Bearbeiten einer PDB-Datei. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Der beschriebene MD-Ansatz ermöglicht die Modellierung sowohl der Wildtyp- als auch der mutierten Form von Caspase unter Verwendung der biomolekularen Simulationspakete. Einige wichtige Fragen der Methodik werden hier diskutiert. Zunächst muss eine repräsentative Kristallstruktur von Caspase aus der Proteindatenbank ausgewählt werden. Wichtig ist, dass sowohl monomere als auch dimere Formen von Caspase akzeptabel sind. Es ist eine gute Idee, hochauflösende Strukturen mit einer minimalen Anzahl fehlender Rückstände zu wählen. Der Protonierungszustand einiger Reste kann manuell in der Eingabe-PDB-Datei eingestellt werden. Zum Beispiel wurde in Abbildung 1 ein Wasserstoffatom an das N^ε2-Atom (HIE-Form) des katalytischen Rests His277 gebunden. Zweitens muss eine Lösungsmittelbox um das Protein herum für weitere explizite Lösungsmittelsimulationen erstellt werden. Eine Energieminimierung ist erforderlich, um die Koordinaten der hinzugefügten Wasserstoffatome und Wassermoleküle zu optimieren. Drittens muss die Erwärmung und Äquilibrierung vor der Produktionsdynamiksimulation durchgeführt werden. In der Erwärmungsphase sollte man darauf achten, dass sich die Hohlräume und Bindungstaschen auf der Proteinoberfläche mit Wassermolekülen füllen (ggf. kann man die Anzahl der MD-Schritte erhöhen). Im Gleichgewichtsstadium muss der Erwerb der Gleichgewichtskonformation des Proteins durch Analyse der quadratischen Abweichung seiner Rückgratatome von den Ausgangspositionen^{bestätigt werden 12}. Viertens ist die Überwachung der Konformationsänderungen der Proteinstruktur während der Produktionsdynamiksimulation erforderlich. Zu diesem Zweck sollte man der Ausgangsstruktur Trajektorienrahmen überlagern, indem man die Backbone-Atome anpasst und dann die Konformationsänderungen mit einem molekularen Visualisierungswerkzeug (VMD, PyMOL usw.) analysiert. ¹⁷. Bei Bedarf kann man die Anzahl der MD-Schritte erhöhen und/oder die Simulation in mehrere nacheinander durchgeführte Segmente aufteilen. Fünftens wird empfohlen, die GPU-beschleunigte Version des MD-Simulationsprogramms (pmemd.cuda) zu verwenden, deren Leistung deutlich über die mit der traditionellen CPU-Implementierung^14,18 erreichbare Leistung hinausgeht.

Eine mögliche Einschränkung der beschriebenen Methode ist die Verfügbarkeit bestimmter Caspase-Strukturen in der Proteindatenbank. Unter der "Caspase"-Anfrage finden sich jedoch mehr als 900 PDB-Einträge, was darauf hindeutet, dass Caspase-Strukturen detailliert untersucht wurden. Einige Schwierigkeiten können auftreten, wenn eine Kristallstruktur mit niedriger Auflösung (dh auf einem groben Detaillierungsgrad) erhalten wird oder einige Fragmente fehlen, die für die Caspase-Funktion wichtig sind.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich MD-Modellierungsansätze bei der Vorhersage struktureller Veränderungen von Proteinen nach Mutationen ihrer Gene, Modifikationen oder intermolekularen Interaktionen als wirksam erwiesen haben. Die Anwendung der MD-Simulation auf dem Gebiet des Zelltods eröffnet große Möglichkeiten, die molekularen Mechanismen der Caspase-Regulation durch posttranslationale Modifikationen zu untersuchen. In diesem Zusammenhang könnte die Langzeit-MD-Simulation das dynamische Verhalten funktioneller Regionen und die mögliche Wirkung von Aminosäuresubstitutionen bewerten, um die molekularen Ursachen im Zusammenhang mit mutiertem oder modifiziertem Caspase-2 sowie anderen Caspasen aufzuklären. Zum Beispiel wurden Missense-Mutationen von Initiator-Caspase-Genen (Caspase-2/Caspase-8/Caspase-9/Caspase-10) bei gastrointestinalen Karzinomen und in Tumoren des zentralen und peripheren Nervensystems nachgewiesen¹⁹. Zusammen ist die MD-Modellierung von Caspasen ein leistungsfähiger In-silico-Ansatz , um die Mechanismen zu verstehen, die den programmierten Zelltod und damit verbundene Störungen regulieren, und um neue wirksame Therapien zu entwickeln.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der Russian Science Foundation unterstützt (17-75-20102, die Protokollentwicklung). Die im Abschnitt über die repräsentativen Ergebnisse beschriebenen Experimente (Analyse der Phosphorylierung) wurden von der Stockholmer (181301) und der schwedischen (190345) Krebsgesellschaft unterstützt.