חקר מוטציות קספזיות ושינוי פוסט-תרגומי על ידי גישות מידול מולקולריות

הפרוטוקול הנוכחי משתמש בחבילת סימולציה ביומולקולרית ומתאר את גישת הדינמיקה המולקולרית (MD) למידול הקספאז מסוג בר וצורותיו המוטנטיות. שיטת MD מאפשרת להעריך את האבולוציה הדינמית של מבנה הקספאז ואת ההשפעה הפוטנציאלית של מוטציות או שינויים לאחר תרגום.

אפופטוזיס הוא סוג של מוות תאי מתוכנת המבטל תאים פגומים ושולט על התפתחות הומאוסטזיס רקמות של אורגניזמים רב תאיים. קספזות, משפחה של פרוטאזות ציסטאין, ממלאות תפקיד מפתח בייזום וביצוע אפופטוזיס. ההבשלה של הקספאזות ופעילותן מכווננת על ידי שינויים פוסט-תרגומיים בצורה דינמית ביותר. כדי להעריך את ההשפעה של שינויים לאחר תרגום, אתרים פוטנציאליים עוברים מוטציה שגרתית עם שאריות המתמשכות לכל שינוי. לדוגמה, שאריות הסרין מוחלפות באלנין או בחומצה אספרטית. עם זאת, תחליפים כאלה יכולים לשנות את הקונפורמציה של האתר הפעיל של הקספאזה, מה שמוביל להפרעות בפעילות הקטליטית ובתפקודים התאיים. יתר על כן, מוטציות של שאריות חומצות אמינו אחרות הממוקמות במיקומים קריטיים עלולות גם לשבור את המבנה והתפקודים של קספאזות ולהוביל להפרעות אפופטוזיס. כדי להימנע מהקשיים הכרוכים בשימוש בשאריות שעברו מוטציה, ניתן ליישם בקלות גישות של מודלים מולקולריים כדי להעריך את ההשפעה הפוטנציאלית של תחליפי חומצות אמינו על מבנה הקספאז. הפרוטוקול הנוכחי מאפשר מידול הן של הקספאז מסוג בר והן של הצורות המוטנטיות שלו עם חבילת הסימולציה הביומולקולרית (Amber) ומתקני מחשבי-על כדי לבחון את ההשפעה של מוטציות על המבנה והתפקוד של החלבון.

אפופטוזיס הוא אחד התהליכים התאיים הנחקרים ביותר המווסתים את המורפוגנזה ואת ההומאוסטזיס של הרקמות של אורגניזמים רב-תאיים. אפופטוזיס יכול להיות יזום על ידי מגוון רחב של גירויים חיצוניים או פנימיים, כגון הפעלת קולטני מוות, הפרעה באותות מחזור התא, נזק לדנ"א, מתח רשתית אנדופלסמית (ER) וזיהומים חיידקיים ונגיפים שונים¹. הקספאזות - שחקנים אפופטוטיים מרכזיים - מסווגות באופן מסורתי לשתי קבוצות: יוזמים (caspase-2, caspase-8, caspase-9 ו- caspase-10) ואפקטים (caspase-3, caspase-6 ו- caspase-7), בהתאם למבנה התחום שלהם ולמקום במפל הקספאזה ^2,3. עם אותות המוות התאים, הקספאזות היוזם מתקשרות עם מולקולות מתאם המאפשרות דימריזציה ועיבוד אוטומטי המושרים על ידי קרבה ליצירת אנזים פעיל. הקספאזות המשפיעות מופעלות באמצעות ביקוע על ידי קספאזות יוזמות ומבצעות שלבי ביצוע במורד הזרם על ידי ביקוע מצעים תאיים מרובים⁴.

ההתבגרות והתפקוד של הקספאזות היוזם והאפקטים מוסדרות על ידי מספר רב של מנגנונים תוך-תאיים שונים, ביניהם השינוי שלאחר התרגום ממלא תפקיד חיוני במודולציה של מוות תאי⁵. תוספת של קבוצות משתנות (פוספורילציה, ניטרוסילציה, מתילציה או אצטילציה) או חלבונים (אוביקוויטינציה או SUMOylation) משנה את הפעילות האנזימטית של קספאזות או את הקונפורמציה והיציבות של החלבון המווסתות אפופטוזיס. מוטגנזה מכוונת אתר מיושמת באופן נרחב כדי לחקור את אתרי השינוי הפוטנציאליים שלאחר התרגום ולהבחין בתפקידם. אתר שינוי פוטטיבי מוחלף בדרך כלל על ידי חומצת אמינו אחרת, אשר לא ניתן לשנות עוד יותר. לפיכך, סרין ותראונין שעברו פוספורילציה עוברים מוטציה לאלנין, ואתרי יוביקוויטינציה של ליזין מוחלפים בארגינין. אסטרטגיה נוספת כוללת החלפת חומצת אמינו המחקה במיוחד שינויים לאחר תרגום (למשל, גלוטמט ואספרטט שימשו לחיקוי סרין זרחני או תראונין)⁶. עם זאת, חלק מהחלפות אלה הממוקמות בקרבת אתר פעיל או במיקומים קריטיים יכולות לשנות את מבנה הקספאזה, להפריע לפעילות הקטליטית ולדכא מוות תאי אפופטוטי⁷. השפעות דומות ניתן לראות במקרים של מוטציות missense הקשורות לגידול בגנים caspase. לדוגמה, המוטציה הקשורה לגידול של caspase-6 - R259H - גרמה לשינויים קונפורמיים של לולאות בכיס קושר המצע, והפחיתה את המחזור הקטליטי היעיל של מצעים⁸. תחליפי חומצות האמינו G325A ב-caspase-8 שזוהו בקרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר עלולים לפגוע בפעילות של קספאז-8, מה שהוביל לאפנון האיתות של גורם גרעיני-kB (NF-kB) וקידם גידולים^9.

כדי להעריך את ההשפעה הפוטנציאלית של תחליפי חומצות אמינו על המבנה והתפקוד של קספאז, ניתן ליישם מודלים מולקולריים. גישת הדינמיקה המולקולרית (MD) מתוארת בעבודה זו עבור מידול הקספאזה מסוג בר וצורותיו המוטנטיות באמצעות חבילת הסימולציה הביומולקולרית (Amber). שיטת MD נותנת מבט על האבולוציה הדינמית של מבנה החלבון לאחר הופעת מוטציות. חבילת אמבר, שפותחה במקור על ידי קבוצתו של פיטר קולמן, הפכה לאחד מכלי התוכנה הפופולריים ביותר לסימולציות ביומולקולריות^10,11,12,13. תוכנה זו מחולקת לשני חלקים: (1) AmberTools, אוסף של תוכניות המשמשות באופן שגרתי להכנת המערכת (הקצאת סוג אטום, הוספת מימן ומולקולות מים מפורשות וכו ') וניתוח מסלול; ו-(2) ענבר, שבמרכזה תוכנית הסימולציה של pmemd. AmberTools היא חבילה חינם (ותנאי מוקדם להתקנת אמבר עצמה), בעוד אמבר מופץ עם רישיון נפרד ומבנה אגרה. סימולציות מקבילות במחשב על ו/או שימוש ביחידות עיבוד גרפיות (GPU) יכולות לשפר באופן משמעותי את הביצועים למחקר המדעי של דינמיקת מבנה חלבונים¹⁴. גרסאות התוכנה הזמינות העדכניות ביותר הן AmberTools21 ו- Amber20, אך ניתן להשתמש בפרוטוקולים המתוארים גם עם הגרסאות הקודמות.

1. הכנת המערכת

הערה: המודלים המולקולריים של צורות החלבון המקוריות והמוטנטיות בנויים על בסיס מבנה גבישי מתאים המתקבל מבנק נתוני החלבון^15,16.

1. כדי לאחזר את מבנה PDB שנבחר, השתמש ברשימה הנפתחת הורד קבצים ולחץ על פורמט PDB. הסר הערות ונתוני קישוריות, והכנס כרטיס TER בין שרשראות חלבונים נפרדות בקובץ PDB. לחלופין, הגדר את מצב הפרוטונציה של שאריות היסטידין על-ידי החלפת שם השאריות HIS ב-HIE, HID או HIP (קובץ משלים 1).
   הערה: סביר שלא להסיר מולקולות מים שנפתרו באופן קריסטלוגרפי (אם קיימות בקובץ PDB).
2. כדי להכין את המודל ההתחלתי, הפעל את תוכנית tleap (חבילת AmberTools) ולאחר מכן הזן פקודות המטפלות באובייקטי tleap .
   1. הפעל את התוכנית: tleap. טען את שדה הכוח ff14SB כדי לתאר את החלבון באמצעות מכניקה מולקולרית: מקור > leaprc.protein.ff14SB.
   2. שדות כוח עומס עבור מולקולות מים ויונים אטומיים (Na⁺, Cl^-): מקור > leaprc.water.tip3p.
   3. טען את קובץ PDB ובנה קואורדינטות עבור מימן, תוך יצירת אובייקט בשם mol: > mol = חלבון loadpdb.pdb.
   4. בדוק אם יש חוסר עקביות פנימי שעלול לגרום לבעיות: > לבדוק mol.
      הערה: גשרים דיסולפידיים, אם קיימים, חייבים להיות מוגדרים באופן ידני. החלף את השמות של ציסטאין קשור קוולנטי CYS ב- CYX והקלד את הפקודה הבאה ב- tleap כדי ליצור קשר בין אטומי SG: mol.X.SG mol.Y.SG קשר (X ו- Y הם מספרי שאריות ציסטאין).
   5. צור קופסת ממס סביב החלבון (מים TIP3P, מרחק 12 Å): > solvatebox mol TIP3PBOX 12.0.
   6. בדוק את הטעינה הכוללת: > טען מול, והוסף מונים (Na⁺ או Cl^-) כדי לנטרל את המערכת:
      > תוספות מול נה ⁺ 0.
   7. צור את קובץ prmtop הטופולוגי ואת קובץ הקואורדינטות inpcrd (כניסות להפעלת סימולציה): > saveamberparm mol protein.prmtop protein.inpcrd. צא מתוכנית tleap: > מתפטר.
      הערה: ניתן להמיר בקלות קובצי קואורדינטות בפורמט ענבר לתבנית PDB באמצעות הכלי ambpdb (עיין במדריך למשתמש, ראה טבלת חומרים).

2. מזעור אנרגיה

הערה: מזעור האנרגיה נחוץ כדי להסיר מגעים פגומים וחפיפות בין אטומים במערכת ההפעלה שמובילים לחוסר יציבות בעת הפעלת MD.

1. בצע את השלב הראשון של מזעור האנרגיה (2,500 צעדים של אלגוריתם הירידה התלול ביותר + 2,500 צעדים של אלגוריתם גרדיאנט מצומד) כדי לייעל את מיקומם של אטומי מימן ומולקולות מים שנוספו תוך שמירה על קואורדינטות החלבון קבועות על ידי ריסון מיקום על אטומים כבדים.
   1. הפעל את תוכנית pmemd באופן הבא:
      pmemd -O -i min1.in -p protein.prmtop -c protein.inpcrd -o protein_min1.out
      -r protein_min1.rst -ref protein.inpcrd.
   2. עקוב אחר הארגומנטים הנדרשים: -i נתוני בקרת קבצים; -p טופולוגיה מולקולרית FILE, פרמטרים של שדה כוח, שמות אטומים; -c קואורדינטות ראשוניות של קובץ; -o קובץ פלט יומן קריא למשתמש; -r קואורדינטות סופיות של FILE; -קואורדינטות הפניה לקובץ ref עבור ריסון מיקום.
   3. ציין אפשרויות בקובץ הקלט min1.in:
      &cntrl
      imin=1, maxcyc=5000, ncyc=2500,
      cut=10.0, ntb=1,
      ntc=1, ntf=1,
      NTPR=10,
      ntr=1,
      מסכת איפוק=':1-517 & !@H=',
      restraint_wt=2.0
      /
      הערה: אפשרויות קלט: imin=1 לבצע מזעור; maxcyc = 5000 מספר מקסימלי של מחזורי מזעור; שיטת המזעור ncyc=2500 עוברת מירידה תלולה ביותר לשיפוע מצומד לאחר מחזורי ncyc; cut=10.0 ניתוק לא בונדד (Å); ntb = 1 גבולות תקופתיים מוטלים, נפח קבוע; ntc=1 לא חלים אילוצים על אורכי קשרים (להתכנסות אנרגטית טובה יותר); ntf=1 כל האינטראקציות מחושבות; מידע אנרגטי NTPR = 10 מודפס לקובץ החוצה בכל שלב NTPR ; דגל ntr=1 לריסון אטומים מוגדרים באמצעות פוטנציאל הרמוני; מסכת ריסון=':1-517 & !@H=' מציינת אטומים מאופקים; restraint_wt=משקל 2.0 (קק"ל/מול∙Ų) עבור ריסון תנוחה.
2. בצע את השלב השני של מזעור האנרגיה (5,000 מדרגות ירידה תלולות ביותר + 5,000 מדרגות שיפוע מצומדות) ללא ריסון כדי לייעל את המערכת כולה.
   1. השתמש ב- min2.in וב - protein_min1.rst כקלט: pmemd -O -i min2.in -p protein.prmtop
      -c protein_min1.rst -o protein_min2.out -r protein_min2.rst.
   2. ציין אפשרויות בקובץ הקלט min2.in:
      &cntrl
      imin=1, maxcyc=10000, ncyc=5000,
      cut=10.0, ntb=1,
      ntc=1, ntf=1,
      NTPR=10
      /

3. חימום

הערה: שלב זה נועד לחמם את המערכת מ-0 K ל-300 K. מהירויות התחלתיות מוקצות לאטומים מכיוון שהמודל ההתחלתי המבוסס על קובץ PDB אינו מכיל מידע על מהירות.

1. בצע את תהליך החימום עם ריסון המיקום על אטומי החלבון (50 ps, נפח קבוע).
   1. השתמש ב- heat.in וב - protein_min2.rst ככניסות: pmemd -O -i heat.in -p חלבון.prmtop
      -c protein_min2.rst -o protein_heat.out
      -r protein_heat.rst -x protein_heat.mdcrd -ref protein_min2.rst
   2. עקוב אחר הארגומנטים הנדרשים: -x ערכות קואורדינטות של FILE שנשמרו מעל מסלול MD.
   3. ציין אפשרויות בקובץ הקלט heat.in:
      &cntrl
      imin=0, irest=0, ntx=1,
      nstlim=25000, DT=0.002,
      ntc=2, ntf=2,
      cut=10.0, ntb=1,
      ntpr=500, ntwx=500,
      ntt=3, gamma_ln=2.0,
      טמפי=0.0, טמפ0=300.0,
      ntr=1, מסכת איפוק=':1-517',
      restraint_wt=1.0,
      נמרוט=1
      /
      &wt TYPE ='TEMP0',
      istep1=0, istep2=25000,
      value1=0.1, value2=300.0 /
      &wt TYPE = 'סוף' /
      הערה: אפשרויות קלט: imin = 0 הפעל MD; irest=0 הפעל סימולציה חדשה; ntx=1 לא נקראות מהירויות ראשוניות מקובץ ה-RST ; nstlim = 25000 מספר צעדי MD; dt = 0.002 צעד זמן (PS); קשרי ntc=2 המערבים מימן מוגבלים באמצעות אלגוריתם SHAKE; כוחות ntf=2 עבור איגרות החוב המוגבלות אינם מחושבים; קואורדינטות ntwx=500 נכתבות לקובץ MDCDRD בכל שלב NTWX ; ntt=3 ויסות טמפרטורה לנגווין; gamma_ln=2.0 תדירות התנגשות עבור דינמיקת לנגווין (ps⁻¹); טמפי = 0.0 טמפרטורה ראשונית; temp0 = 300.0 טמפרטורת ייחוס; nmropt=1 פרמטרים שצוינו ברשימת שמות &WT נקראים; TYPE = 'TEMP0' לשנות את טמפרטורת היעד.

4. שיווי משקל

הערה: שלב זה נחוץ כדי להתאים את צפיפות המים ולקבל את מצב שיווי המשקל של החלבון.

1. בצע את שיווי המשקל ב 300 K ללא כל ריסון (500 ps, לחץ קבוע).
   1. השתמש ב - equil.in וב - protein_heat.rst ככניסות: pmemd -O -i equil.in -p חלבון.prmtop
      -c protein_heat.rst -o protein_equil.out -r protein_equil.rst -x protein_equil.mdcrd.
   2. ציין אפשרויות בקובץ הקלט equil.in:
      &cntrl
      imin=0, irest=1, ntx=5,
      nstlim=250000,
      dt=0.002,
      ntc=2, ntf=2,
      cut=10.0, ntb=2, ntp=1, taup=2.0,
      ntpr=1000, ntwx=1000, ntwr=50000,
      ntt=3, gamma_ln=2.0,
      טמפ0=300.0
      /
      הערה: אפשרויות קלט: irest=1 הפעל מחדש את הסימולציה; קואורדינטות ומהירויות ntx=5 נקראות מקובץ RST שנוצר בעבר; ntb = 2 גבולות תקופתיים מוטלים, לחץ מתמיד; ntp=1 שינוי קנה מידה בלחץ איזוטרופי; taup = 2.0 זמן הרפיית לחץ (ps); NTWR=50000 בכל שלב NTWR , קובץ ה-RST נכתב, מה שמבטיח התאוששות מקריסה.

5. דינמיקת ייצור

1. לאחר שיווי משקל הושג בהצלחה, לבצע סימולציית MD הייצור (10 ns או יותר) בלחץ קבוע, וליצור את קובץ המסלול לניתוח הבא של מבנה החלבון.
   1. השתמש ב- prod.in וב - protein_equil.rst ככניסות: pmemd -O -i prod.in -p protein.prmtop
      -c protein_equil.rst -o protein_prod.out -r protein_prod.rst -x protein_prod.mdcrd.
   2. ציין אפשרויות בקובץ הקלט prod.in:
      &cntrl
      imin=0, irest=1, ntx=5,
      nstlim=5000000,
      dt=0.002,
      ntc=2, ntf=2,
      cut=10.0, ntb=2, ntp=1, taup=2.0,
      ntpr=1000, ntwx=1000, ntwr=50000,
      ntt=3, gamma_ln=2.0,
      טמפ0=300.0, IG=-1
      /
      הערה: הגרסה המקבילה של pmemd (pmemd. MPI) או גרסה מואצת GPU (pmemd.cuda) ניתן להשתמש באשכולות מחשב ומחשבי-על. ניתן לחלק סימולציית MD ארוכה למספר מקטעים ולבצע אותה ברצף. מומלץ מאוד להגדיר ig=-1 (אפשרות זרע אקראית) עבור כל הפעלה מחדש של סימולציה. ניתן להשתמש בתוכניות ptraj או cppptraj לניתוח ועיבוד של מסלולי קואורדינטות. לקבלת מידע נוסף, עיין במדריך למשתמש של התוכנה.

הפרוטוקול הנוכחי יכול להיות מיושם בקלות במחקרים של שינוי לאחר תרגום של caspases או מוטציות פתוגניות. בחלק זה, מודגם תהליך העבודה של מידול MD (איור 1), אשר שימש בהצלחה במחקר של caspase-2⁷. באמצעות מוטגנזה מכוונת אתר במבחנה של אתרי זרחון פוטנציאליים (Ser/Thr to Ala) וגישות ביוכימיות, הוכח כי המוטציה Ser384Ala מנעה עיבוד קספאז-2 וחסמה את הפעילות האנזימטית ואת האינדוקציה של מוות תאי אפופטוטי (איור משלים 1). עם זאת, לא ניתוח ספקטרומטריית מסות ולא טכנולוגיית Phos-Tag אישרו כי Ser384 עובר זרחון⁷. כדי להבין כיצד Ser384 מווסת את פעילות קספאז-2, בוצע מידול MD של מבנה החלבון התלת-ממדי (איור 1).

המודלים המולקולריים של צורות פראיות ומוטנטיות של קספאז-2 נבנו באמצעות המבנה הגבישי 1pyo (מבני caspase-2 זמינים מפורטים בטבלה משלימה 1). המוטציה Ser384Ala נוצרה על ידי הסרת אטום O γ בשאריות Ser384 (ב- PDB, שאריות Ser ו- Ala נבדלות על ידי קיום אטום^{O γ}). קואורדינטות מימן נעדרות בדרך כלל במבנים גבישיים. לכן, אטומי מימן נוספו למבנה החלבון, ואז הוא נפתר על ידי שכבה עבה של 12 Å של מי TIP3P כדי לאפשר סימולציות נוספות של ממסים מפורשים. יוני נתרן נוספו כדי לנטרל את המערכת. המודלים ההתחלתיים שהתקבלו של caspase-2 היו נתונים למזעור אנרגיה, שיווי משקל והדמיית 10 ns MD לאחר מכן על פי פרוטוקול מידול MD, תוך שימוש בקבצי הנתונים של בקרת min1.in, min2.in, heat.in, equil.in ובקרת prod.in.

במבנה הגבישי של caspase-2, Ser384, יחד עם Arg219 ו- Arg378, מעורבים ביצירת פני השטח של החלל באתר הפעיל. Arg219 ו-Arg378 יוצרים קשרי מימן עם קבוצת הקרבוקסיל של המצע, בעוד ש-Ser384 אינו מתערב באינטראקציות ישירות עם המצע. סימולציות MD אישרו כי החלפת Ser384Ala לא השפיעה על השאריות הקטליטיות Cys320 (נוקלאופיל) ו- His277 (בסיס כללי) אלא גרמה לשינוי קונפורמציה גדול ב- Arg378. קבוצת הגואנידיניום שלו פנתה לכיוון הממס בתפזורת, כך שאטום^{N ε} לא יכול היה ליצור קשר מימן חיוני עם קבוצת הקרבוקסיל של המצע (איור 1). באנזים המקורי, מתרחשת אינטראקציה אלקטרוסטטית בין אטום^{O γ} של Ser384 (מטען שלילי חלקי) לבין קבוצת הגואנידיניום Arg378 (מטען חיובי). עם זאת, החלפת הסרין ככל הנראה משבשת את האינטראקציה הזו. לפיכך, הוכח כי החלפת Ser384Ala השפיעה על זיהוי המצע על ידי שאריות הארגינין באתר הפעיל caspase-2, ופגעה בפעילות האנזימטית וביכולת לגרום למוות של תאים אפופטוטיים. המנגנון שהתגלה נראה משומר אבולוציונית ומשותף לבני משפחה אחרים של קספאז. לפיכך, יישום סימולציות MD אפשר לאשר את התוצאות הביוכימיות ולקבל תובנות חדשות על המבנה המולקולרי של המרכז הפעיל של caspases.

איור 1: זרימת עבודה של מידול MD המשמשת לחקר מבנה הקספאזה. ה-caspase-2 מסוג פרא והמוטציה Ser384Ala שלו נחקרו בהתאם להוראות בסעיף הפרוטוקול. התגלה כי החלפת Ser384Ala גורמת לשינוי קונפורמי חשוב בשאריות האתר הפעיל Arg378. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור משלים 1: תפקודו של קספאז-2 במוות תאי. בתגובה לגירויים חיצוניים ופנימיים, ניתן להפעיל קספאז-2 מסוג פרא על ידי מנגנון אוטו-פרוטאוליטי. פעיל caspase-2 cleaves ביד, אשר, בתורו, מקדם permeabilization הממברנה החיצונית המיטוכונדריאלית ומוות תאים אפופטוטיים. המוטציה Ser384Ala מונעת הפעלת קספאז-2 והשראת מוות תאי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 1: מבני Caspase-2 הזמינים בבנק נתוני החלבון. המבנים ממוינים לפי תאריך שחרור. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

קובץ משלים 1: שלבים שונים בעריכת קובץ PDB. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

גישת ה-MD המתוארת מאפשרת מידול הן של צורות פראיות והן של צורות מוטנטיות של קספאז באמצעות חבילות הסימולציה הביומולקולרית. מספר נושאים חשובים של המתודולוגיה נדונים כאן. ראשית, יש לבחור מבנה גבישי מייצג של קספאז מתוך בנק נתוני החלבון. חשוב לציין שגם צורות מונומריות וגם דימריות של קספאז מקובלות. בחירת מבנים ברזולוציה גבוהה עם מספר מינימלי של שאריות חסרות היא רעיון טוב. ניתן להגדיר את מצב הפרוטונציה של שאריות מסוימות באופן ידני בקובץ PDB הקלט. לדוגמה, באיור 1, אטום מימן היה מחובר לאטום N^ε2 (צורת HIE) של השאריות הקטליטיות His277. שנית, יש ליצור קופסת ממס סביב החלבון לצורך סימולציות נוספות של ממס מפורש. מזעור אנרגיה נדרש כדי לייעל את הקואורדינטות של אטומי מימן נוספים ומולקולות מים. שלישית, החימום ושיווי המשקל חייבים להתבצע לפני סימולציית דינמיקת הייצור. בשלב החימום יש לוודא שהחללים וכיסי הקשירה על פני החלבון יתמלאו במולקולות מים (במידת הצורך, ניתן להגדיל את מספר שלבי ה-MD). בשלב שיווי המשקל, יש לאשר את רכישת קונפורמציית שיווי המשקל של החלבון על ידי ניתוח סטיית השורש-ממוצע-ריבוע של אטומי עמוד השדרה שלו מהמיקומים ההתחלתיים¹². רביעית, נדרש מעקב אחר השינויים הקונפורמיים של מבנה החלבון במהלך סימולציית דינמיקת הייצור. לשם כך, יש להניח מסגרות מסלול על המבנה ההתחלתי על ידי התאמת אטומי עמוד השדרה ולאחר מכן לנתח את השינויים הקונפורמיים באמצעות כלי הדמיה מולקולרית (VMD, PyMOL וכו '). ¹⁷. במידת הצורך, ניתן להגדיל את מספר שלבי ה-MD ו/או לפרק את הסימולציה למספר מקטעים המבוצעים ברצף. חמישית, מומלץ להשתמש בגרסה המואצת GPU של תוכנית הסימולציה MD (pmemd.cuda), שביצועיה עולים באופן משמעותי על זה שניתן להשיג על ידי יישום המעבד המסורתי^14,18.

מגבלה אפשרית של השיטה המתוארת היא הזמינות של מבני קספאז מסוימים בבנק נתוני החלבון. עם זאת, יותר מ -900 ערכי PDB נמצאים תחת הבקשה "caspase", המציין כי מבנים caspase נחקרו בפירוט. קשיים מסוימים עשויים להתעורר כאשר מבנה גבישי מתקבל ברזולוציה נמוכה (כלומר, ברמת פירוט גסה) או חסרים כמה קטעים החשובים לפונקציית הקספאזה.

לסיכום, גישות מידול MD הוכחו כיעילות בחיזוי שינויים מבניים של חלבונים לאחר מוטציות בגנים שלהם, שינויים או אינטראקציות בין-מולקולריות. היישום של סימולציית MD בתחום המוות התאי פותח הזדמנויות נהדרות לחקור את המנגנונים המולקולריים של ויסות קספאז על ידי שינויים לאחר תרגום. בהקשר זה, סימולציית MD ארוכת טווח יכולה להעריך את ההתנהגות הדינמית של אזורים פונקציונליים ואת ההשפעה הפוטנציאלית של תחליפי חומצות אמינו כדי להבהיר את הגורמים המולקולריים הקשורים ל-caspase-2 שעבר מוטציה או שינוי, כמו גם קספאזות אחרות. לדוגמה, מוטציות מיסנס של גנים יוזמים (caspase-2/caspase-8/caspase-9/caspase-10) התגלו בסרטן מערכת העיכול ובגידולים של מערכת העצבים המרכזית וההיקפית¹⁹. יחד, מידול MD של קספאזות הוא גישה רבת עוצמה בסיליקו להבנת המנגנונים המווסתים מוות תאי מתוכנת והפרעות נלוות ולפיתוח טיפולים יעילים חדשים.

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מקרן המדע הרוסית (17-75-20102, פיתוח הפרוטוקול). ניסויים המתוארים בסעיף התוצאות המייצגות (ניתוח של זרחון) נתמכו על ידי אגודות הסרטן של שטוקהולם (181301) ושוודיה (190345).