Method Article
Este manuscrito descreve um protocolo simplificado para o isolamento de células de epitélio pigmentado da retina (RPE) a partir de olhos de rato de forma stepwise. O protocolo inclui a enucleação e dissecação dos olhos do rato, seguido pelo isolamento, semeadura e cultivo de células RPE.
A camada de epitélio pigmentado da retina (RPE) fica imediatamente atrás dos fotorreceptores e abriga um complexo sistema metabólico que desempenha vários papéis críticos na manutenção da função dos fotorreceptores. Assim, a estrutura e função RPE são essenciais para sustentar a visão normal. Este manuscrito apresenta um protocolo estabelecido para o isolamento celular RPE do mouse primário. O isolamento rpe é uma ótima ferramenta para investigar os mecanismos moleculares subjacentes à patologia RPE nos diferentes modelos de camundongos de distúrbios oculares. Além disso, o isolamento do RPE pode ajudar na comparação de células RPE do camundongo primário isoladas de camundongos do tipo selvagem e geneticamente modificados, bem como testar drogas que podem acelerar o desenvolvimento da terapia para distúrbios visuais. O manuscrito apresenta um protocolo de isolamento RPE passo a passo; todo o procedimento, desde a enucleação até a semeadura, leva aproximadamente 4 horas. A mídia não deve ser alterada por 5-7 dias após a semeadura, para permitir o crescimento das células isoladas sem perturbação. Esse processo é seguido pela caracterização da morfologia, pigmentação e marcadores específicos nas células por meio da imunofluorescência. As células podem ser passagemdas no máximo três ou quatro vezes.
As células de epitélio pigmentado da retina (RPE) estão localizadas entre o coroide e a retina neural, formando uma monocamada simples de células cuboidais que fica atrás das células fotorreceptoras (PR)1. O RPE desempenha um papel fundamental na manutenção de um ambiente saudável para as células de RP, principalmente pela redução do acúmulo excessivo de espécies reativas de oxigênio (ROS) e consequente dano oxidativo1. As células RPE supervisionam muitas funções, como a conversão e armazenamento de retinóides, a absorção de luz dispersa, transporte de fluidos e íons, e fagocitose da membrana do segmento externo 2,3 do galpão PR. Alterações no RPE (morfologia/função) podem prejudicar sua função levando à retinopatia e esta é uma característica comum compartilhada por muitos distúrbios oculares4. Muitas doenças oculares estão associadas a alterações na morfologia e função das células RPE, incluindo algumas doenças genéticas como retinite pigmentosa, amaurose congênita leber e albinismo 4,5,6, bem como distúrbios oculares relacionados à idade, como retinopatia diabética (DR) e degeneração macular relacionada à idade (AMD)7,8 . As células humanas são as mais desejáveis, portanto seria ideal estudar distúrbios de RPE em células RPE humanas primárias para a formação de monocamadas RPE. No entanto, questões éticas e a limitada disponibilidade de doadores humanos devido ao fato de que a maioria desses transtornos levam à morbidade9, mas não necessariamente a mortalidade10, impedindo assim o isolamento das células RPE humanas primárias. Isso torna a cultivo de células RPE de doadores de animais não humanos uma alternativa preferida. Os roedores, particularmente os camundongos, são considerados um grande modelo para estudar diferentes doenças oculares, uma vez que a tecnologia transgênica é mais amplamente estabelecida nestas espécies11. Embora o uso de células RPE primárias cultivadas ofereça muitas vantagens, tem sido difícil manter células em crescimento por muitas passagens, ou armazenar e reutilizar as células. A principal limitação deste protocolo é a idade dos camundongos; camundongos que são usados para o isolamento de RPE devem ser de uma idade muito jovem (18-21 dias de idade é ideal), pois tem sido difícil cultivar células RPE de camundongos adultos 11,12,13. As células RPE podem ser isoladas dos olhos do rato em qualquer idade, porém até quatro passagens celulares só foram bem sucedidas com camundongos jovens (18-21 dias de idade). O isolamento rpe das retinas do camundongo, utilizando tanto camundongos C57BL6 quanto camundongos transgênicos com exclusão dos receptores N-metil-D-aspartato (NMDARs) nas células RPE, foi realizado para estudar o efeito da homocisteína de aminoácido elevado no desenvolvimento e progressão da AMD14. Além disso, células primárias de RPE isoladas ajudaram a propor um alvo terapêutico para AMM pela inibição dos NMDARs nas células RPE14. Existem alguns bloqueadores de NMDAR que são aprovados pela Food and Drug Administration (FDA) e são atualmente usados para tratar confusão moderada a grave (demência) relacionada à doença de Alzheimer (DA), como a memantina16, que poderia ser um alvo terapêutico potencial para a AMD14. Além disso, células de RPE de camundongos primários isolados foram utilizadas para a detecção de marcadores inflamatórios e a indução proposta de inflamação como um mecanismo subjacente para características induzidas por homocisteína de AMD e AD usando um rato geneticamente modificado (CBS), que apresenta um alto nível de homocisteína16,17.
Este protocolo foi usado para isolar células RPE de camundongos tipo selvagem C57BL/6 e camundongos transgênicos desenvolvidos em nosso laboratório como uma adaptação simplificada de outros protocolos de isolamento publicados 13,18,19 para alcançar um protocolo facilmente aplicável e confiável. Não há preferência sexual neste protocolo. Enquanto as idades dos camundongos são fundamentais para o processo de isolamento, camundongos jovens, idosos (18-21 dias) e camundongos mais velhos em qualquer idade (até 12 meses) foram usados para o isolamento de RPE. No entanto, notamos que as células RPE isoladas dos camundongos jovens viviam mais tempo, e até quatro passagens podiam ser realizadas. As células RPE isoladas de camundongos mais velhos poderiam ser passagemdas uma ou duas vezes, então parariam de crescer a uma taxa normal e mudariam sua forma para serem mais alongadas (células semelhantes a fibroblastos). Também foi observada perda de pigmentação e diminuição da adesão à placa de cultura tecidual seguida de descolamento.
Os animais foram utilizados de acordo com as diretrizes do protocolo animal IACUC da Universidade de Oakland número 21063 e as diretrizes da Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmômica e De Visão.
1. Preparação da solução
2. Enucleação
3. Dissecção
4. Centrifugação
5. Cultura celular
6. Passaging
7. Imunofluorescência
NOTA: A imunofluorescência foi realizada de acordo com os métodos publicados anteriormente 8,14,15,16,17,18 para manchar e validar a especificidade do RPE. A coloração das células RPE primárias foi tipicamente feita nas passagens P1 e P2. Aqui, uma breve visão geral do protocolo imunofluorescente é apresentada.
Validação da especificidade, pureza e função/formação de barreiras de células RPE isoladas
As células isoladas foram examinadas sob um microscópio leve para verificar sua viabilidade, morfologia e pigmentação. Imagens de P0 e P1 (Figura 1A,B) e imagens de P0 e P4 foram capturadas (Figura 1C,D) para mostrar as mudanças nas células; forma, tamanho e pigmentação à medida que as passagens avançavam para a quarta passagem (setas pretas apontam para as células RPE isoladas em P4). Foi utilizado um anticorpo para a proteína RPE65 para verificar a identidade das células isoladas. A coloração da imunofluorescência das células isoladas foi realizada com um anticorpo contra RPE65, seguido de exame sob o microscópio fluorescente (Figura 1E,F: baixa ampliação e Figura 1G,H: alta ampliação, mostrando células RPE manchadas positivamente em verde e um marcador nuclear, DAPI, em azul). RPE65 é um isomerohydrolase expresso no RPE. É essencial para a regeneração do pigmento visual necessário para a visão mediada por varas e cone21 . Para validar a função de barreira do isolado
foram utilizadas células, proteína citoesqueletal F-actin e proteína de junção apertada ZO-1 imunofluorescência8 para as células isoladas (Figura 1I,J: zo-1 verde e coloração nuclear azul). e Figura 1K,L: F-actin vermelho e coloração nuclear azul). No entanto, a forma típica de paralelepípedos do RPE é muito evidente quando as células são totalmente confluentes.
O controle negativo foi utilizado nos experimentos em que o anticorpo secundário foi adicionado às células RPE sem adicionar o anticorpo primário, para garantir que a especificidade do anticorpo e da cor resultante seja específica para os anticorpos utilizados (não mostrados).
Para validar a pureza e contaminação do RPE isolado pelas células Müller, utilizou-se a coloração de imunofluorescência das células isoladas com um marcador celular específico para células Müller, vimentina, (verde e azul para coloração nuclear como mostrado na Figura 1M,N) utilizando células Müller como controle positivo. Células RPE isoladas apresentaram coloração negativa para vimentina.
As células isoladas foram examinadas sob um microscópio leve para verificar sua viabilidade, morfologia e pigmentação. Imagens de P0 e P1 (Figura 1K,L) e imagens de P0 e P4 foram capturadas (Figura 1M,N) para mostrar as mudanças na forma, tamanho e pigmentação das células à medida que as passagens avançavam para a quarta passagem (setas pretas apontam para as células RPE isoladas em P4).
Figura 1: Validação do isolamento RPE. (A) Microscópio leve para passagem RPE zero (P0). (B) Microscópio leve para passagem RPE um (P1). (C) Caracterização da morfologia em P0. (D) Caracterização da morfologia em P4. (E) Imunostaining para RPE65 em baixa ampliação. (F) Imunostaining para RPE65 com coloração nuclear com DAPI. (G) Imunostaining para RPE65 em alta ampliação. (H) Imunostaining para RPE65 com coloração nuclear com DAPI em alta ampliação. (I) Coloração ZO-1 para células RPE. (G) Coloração ZO-1 para células RPE com coloração nuclear com DAPI. (K) Coloração de f-actin para células RPE. (L) Coloração de F-actin para células RPE com coloração nuclear com DAPI. (M) Coloração de vimentina para células RPE. (N) Mancha de vimentina para células Müller como um controle positivo (RMc-1) com coloração nuclear com DAPI. As barras de escala são iguais a 300 μm, 20 μm, 300 μm, 300 μm, 50 μm, 10 μm, 50 μm, 50 μm e 50 μm, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O protocolo atual é um procedimento detalhado relatado, modificado e simplificado para o isolamento de RPE a partir de olhos de rato. O protocolo inclui enucleação, dissecção, coleta, semeadura, cultura e caracterização de células RPE isoladas dos olhos do rato.
Existem algumas limitações e passos críticos que devem ser cumpridos para o isolamento bem sucedido de RPE, como a idade dos ratos, o número de olhos dissecados, o tamanho da placa ou prato da cultura tecidual, e cuidados após a semeadura, armazenamento e passagem. Para ser capaz de passar as células isoladas até três ou quatro vezes, as melhores idades dos camundongos são entre 18 e 21 dias. Para ter um número razoável de células isoladas que são capazes de crescer e se multiplicar, pelo menos dois olhos são necessários para o isolamento único. O número de células que resultam em isolamento é proporcional ao número de olhos dissecados (~220.000 células/olho). Recomenda-se uma placa/frasco petri de 100 mm estéril para obter um número maior de células em uma passagem precoce (P0). Após a semeadura, as células não devem ser perturbadas movendo a placa de cultura tecidual da incubadora ou mudando a mídia por pelo menos 5 dias. Além disso, uma das limitações dessa técnica é o armazenamento e a passagem das células isoladas. As células não podem ser armazenadas (congeladas e ressarcidas) e só podem ser passagemdas três ou quatro vezes. Após a passagem 4, as células começam a mudar seu tamanho e forma para se alongarem (forma de fuso) com uma diminuição acentuada na pigmentação celular (Figura 1D).
Este protocolo é diferente de outros protocolos publicados valiosos e confiáveis para o isolamento RPE do mouse primário1 3,19,20 na medida em que é simplificado com alguns passos que são fáceis de seguir. As células RPE são capazes de ser identificadas por sua morfologia, pigmentação e marcadores RPE específicos, como RPE65 4,5,21. A validação da pureza e contaminação das células de Müller foi obtida por coloração de células isoladas com um marcador celular específico para células Müller (vimentin)22. Muitas técnicas têm sido utilizadas para avaliar a integridade da barreira hemintiana -retina in vitro, como o exame de microscópio eletrônico (EM), avaliação de proteínas de junção apertada (TJPs), ensaio de vazamento fitic dextran e medição de resistência elétrica transeptélial (TER) que avalia a função fisiológica do RPE como monocamada 8,23 . As células RPE desempenham um papel importante na manutenção do BRB externo, e para validar essa função, avaliamos proteínas de junção apertadas (TJPs) como Zona ocludin-1 (ZO-1) e proteínas citoesqueléticos como f-actin como publicado anteriormente8. A avaliação do TJPs é um método mais conveniente para a avaliação da função de integridade e barreira do BRB que não requer equipamentos caros que podem não estar disponíveis em todos os laboratórios de pesquisa, em oposição à avaliação EM ou TER.
O isolamento primário do RPE é uma técnica que pode ser uma ferramenta importante para estudar mecanismos e patogênese subjacentes, e para propor novas aplicações terapêuticas para diferentes doenças oculares. A técnica atual possibilitou o estudo das alterações na estrutura e função celular de RPE e seu impacto no BRB externo na degeneração macular relacionada à idade8. Além disso, ajudou a estudar as mudanças nas células RPE isoladas de camundongos C57BL6 de tipo selvagem e diferentes camundongos geneticamente modificados, bem como testar os diferentes compostos farmacológicos que buscam um alvo terapêutico para a AMD14,16.
Em conclusão, muitos protocolos publicados disponíveis demonstraram o isolamento primário do RPE do mouse. O protocolo apresentado é um procedimento simplificado resultante da modificação de alguns protocolos existentes, utilizando material, métodos e equipamentos disponíveis na maioria dos laboratórios de pesquisa para isolar células RPE primárias dos olhos do mouse.
Os autores não têm conflitos de interesse em declarar que são relevantes para o conteúdo deste artigo.
Este trabalho contou com o apoio do Instituto Nacional de Olhos (NEI), Instituto Nacional de Olhos (NEI) do Fundo R01 EY029751-04
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Beaker : 100mL | KIMAX | 14000 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C7657-25MG | For working enzyme, A |
Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile | 13-711-20 | ||
DMEM/F12 | gibco | 11330 | Media to grow RPE cells |
Fetal Bovine Serum (FBS) | gibco | 26140079 | For complete RPE cell culture media |
Gentamicin Reagent Solution | gibco | 15750-060 | For complete RPE cell culture media |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Scientific | 88284 | For working enzymes (A&B) |
Heracell VISO 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
Hyaluronidase from bovine testes | Sigma-Aldrich | H3506-500MG | For working enzyme A |
Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL | B-D | 309577 | |
Micro Centrifuge Tube: 2 mL | Grainger | 11L819 | |
Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab78036 | For IF staining |
Pen Strep | gibco | 15140-122 | For complete RPE cell culture media |
Positive Action Tweezers, Style 5/45 | Dumont | 72703-DZ | |
Scissors Iris Standard Straight 11.5cm | GARANA INDUSTRIES | 2595 | |
Sorvall St8 Centrifuge | ThermoScientific | 75007200 | |
Stemi 305 Microscope | Zeiss | n/a | |
Surgical Blade, #11, Stainless Steel | Bard-Parker | 371211 | |
Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style | Corning | 430589 | |
Tissue Culture Dish : 100x20mm style | Corning | 353003 | |
Tornado Tubes: 15mL | Midsci | C15B | |
Tornado Tubes: 50mL | Midsci | C50R | |
Trypsin EDTA (1x) 0.25% | gibco | 2186962 | For working enzyme B |
Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips | Dumont | 501764 | |
Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL | Electron Microscopy Sciences Dumont | 50-241-57 | |
Underpads, Moderate : 23" X 36" | McKesson | 4033 | |
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge | FST | 15000-08 | |
Zeiss AxioImager Z2 | Zeiss | n/a | |
Zeiss Zen Blue 2.6 | Zeiss | n/a |
An erratum was issued for: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. The Discussion and References sections were updated.
The third paragraph of the Discussion section was updated from:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
to:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
In the References section, a 24th reference was added:
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