初代マウス網膜色素上皮細胞の単離

この原稿では、網膜色素上皮(RPE)細胞をマウスの目から段階的に単離するための簡略化されたプロトコルについて説明しています。このプロトコルには、マウスの目の除核と解剖、それに続くRPE細胞の単離、播種、培養が含まれます。

網膜色素上皮(RPE)層は、光受容体のすぐ後ろにあり、光受容体の機能を維持する上でいくつかの重要な役割を果たす複雑な代謝システムを持っています。したがって、RPEの構造と機能は、正常な視力を維持するために不可欠です。この原稿は、初代マウスRPE細胞単離のための確立されたプロトコルを提示します。RPE単離は、眼疾患のさまざまなマウスモデルにおけるRPE病理の根底にある分子メカニズムを調査するための優れたツールです。さらに、RPE単離は、野生型マウスと遺伝子改変マウスから単離された初代マウスRPE細胞の比較や、視覚障害の治療法の開発を加速できる薬剤の試験に役立ちます。原稿は、段階的なRPE分離プロトコルを提示します。除核から播種までの全手順は約4時間かかります。培地は、単離された細胞を乱すことなく増殖させるために、播種後5〜7日間は交換しないでください。このプロセスに続いて、免疫蛍光 法による 細胞内の形態、色素沈着、および特異的マーカーの特性評価が行われます。細胞は最大3〜4回継代することができる。

網膜色素上皮(RPE)細胞は、脈絡膜と神経網膜の間に位置し、視細胞(PR)細胞の背後にある直方体細胞の単純な単層を形成する¹。RPEは、主に活性酸素種(ROS)の過剰な蓄積とその結果として生じる酸化的損傷を減らすことにより、PR細胞の健康な環境を維持する上で重要な役割を果たします¹。RPE細胞は、レチノイドの変換と貯蔵、散乱光の吸収、流体とイオンの輸送、および脱落したPR外セグメント膜の食作用など、多くの機能を監督しています^2,3。RPE(形態/機能)の変化は、網膜症につながる機能を損なう可能性があり、これは多くの眼疾患に共通する特徴です⁴。多くの眼疾患は、網膜色素変性症、レーバー先天性無気力症、白皮症などの遺伝性疾患を含むRPE細胞の形態と機能の変化に関連しています4,5,6、および糖尿病性網膜症(DR)や加齢黄斑変性症(AMD^)などの加齢性眼疾患^7,8。.ヒト細胞が最も望ましいため、RPE単層を形成するための初代ヒトRPE細胞におけるRPE障害を研究することが理想的です。しかしながら、倫理的問題およびこれらの障害のほとんどが罹患率⁹につながるが必ずしも死亡率¹⁰ではないという事実によるヒトドナーの限られた利用可能性は、それによって初代ヒトRPE細胞の単離を妨げる。これにより、ヒト以外の動物ドナーからのRPE細胞を培養することが好ましい代替手段になります。げっ歯類、特にマウスは、トランスジェニック技術がこれらの種でより広く確立されているため、さまざまな眼疾患を研究するための優れたモデルと見なされています¹¹。初代RPE培養細胞を用いることには、多くの利点がありますが、増殖細胞を何回も継代維持したり、細胞を保存・再利用したりすることは困難でした。このプロトコルの主な制限はマウスの年齢です。RPE単離に使用されるマウスは、成体マウス11、^12、13からRPE細胞を培養することが困難であったため^、非常に若い年齢(18〜²¹日齢が最適)であるべきである。RPE細胞はどの年齢でもマウスの目から単離することができますが、最大4つの細胞継代は若いマウス(18〜21日齢)でのみ成功しました。C57BL6マウスとRPE細胞でN-メチル-D-アスパラギン酸受容体(NMDAR)を欠失したトランスジェニックマウスの両方を使用して、マウス網膜からのRPE単離を実施し、^AMD14の発生と進行に対するアミノ酸ホモシステインの上昇の影響を研究しました。さらに、単離された初代RPE細胞は、RPE細胞¹⁴におけるNMDARの阻害によるAMDの治療標的の提案に役立った。食品医薬品局(FDA)によって承認され、現在、^AMD14の潜在的な治療標的となる可能性のあるメマンチン¹⁶など、アルツハイマー病(AD)に関連する中等度から重度の混乱(認知症)の治療に使用されているNMDAR遮断薬がいくつかあります。さらに、単離された初代マウスRPE細胞を炎症マーカーの検出に使用し、高レベルのホモシステインを示す遺伝子改変マウス(CBS)を使用して、AMDおよびADのホモシステイン誘発機能の根底にあるメカニズムとして炎症の誘発を提案しました^16,17。

このプロトコルは、他の公開された分離プロトコル^13,18,19の単純化された適応として、私たちの研究室で開発された野生型C57BL/6マウスとトランスジェニックマウスの両方からRPE細胞を単離するために使用され、容易に適用可能で信頼性の高いプロトコルに到達しました。このプロトコルには性別の好みはありません。マウスの年齢は単離プロセスにとって重要ですが、RPE単離には、若齢の高齢マウス(18〜21日齢)および任意の年齢(12か月まで)の高齢マウスが使用されました。しかし、若齢マウスから分離されたRPE細胞は生存期間が長く、最大4回の継代を行うことができることに気づきました。年配のマウスから単離されたRPE細胞は、1回または2回継代することができ、その後、それらは正常な速度で成長を停止し、より細長い(線維芽細胞様細胞)形状に変化する。色素沈着の喪失および組織培養プレートへの接着性の低下とそれに続く剥離も観察された。

動物は、オークランド大学IACUC動物プロトコル番号21063のガイドラインおよび眼科および視覚研究における動物の使用に関するARVOステートメントのガイドラインに従って使用されました。

1. 溶液調製

1. ダルベッコの改変イーグル培地/栄養混合物F-12(DMEM/F12)に25%ウシ胎児血清(FBS)、1.5%ペニシリン/ストレプトマイシン、および0.02%ゲンタマイシンを添加して、完全なRPE細胞培養培地を調製します。
2. 741 μLのハンクスバランス塩溶液(HBSS)に127 μLのコラゲナーゼストック溶液と132 μLのヒアルロニダーゼストック溶液を補充して、酵素Aを調製します。これにより、最終容量は1 mLになり、4つの目を治療できます。
   1. クロストリジウム・ヒストリチカム由来のコラゲナーゼ1 mgを41 mLのHBSS(19.5単位/mL)に溶解して、コラゲナーゼストック溶液を調製します。
   2. ウシ精巣由来のヒアルロニダーゼ1 mgを18.4 mLのHBSS(38単位/mL)に溶解して、ヒアルロニダーゼストック溶液を調製します。
3. HBSS3部に0.25%トリプシン-EDTAを2部添加して酵素Bを調製します。総量は解剖された目の数に依存することに注意してください。1 mLの酵素Bを使用して、4つの目を治療することができます。

2.除核

1. IACUC基準²¹に従って二酸化炭素(_CO2)吸入を使用してマウスを倫理的に安楽死させる。
   1. 簡単に説明すると、動物をCO2チャンバーに入れて、チャンバー容積の30%〜70%の充填率で_CO2を100%_CO2で導入し、マウスへの苦痛を最小限に抑えながら、2〜3分以内に意識喪失を達成します。
   2. 死亡(呼吸不足と目の色あせ)を確認し、マウスをケージから滅菌された手術器具を備えた清潔な滅菌手術領域(アルコールでこすった)に移動します。
2. マウスを滅菌アンダーパッドの上に置きます。
3. 眼窩領域の5/45スタイルのピンセットを押してプロプトーシスを誘発し、続いてピンセットを目の後部に移動して、目を除核します。眼窩腔から目をそっと引っ張って、視神経を無傷で目を抽出します。
4. 鉗子を使用して、1mLの5%ポビドンヨードを含む2mLの微量遠心チューブに目を沈めます。室温で2〜3分間目をインキュベートします。
5. ポビドンヨード溶液から目を取り除き、ペトリ皿に入れます。滅菌トランスファーピペットを使用して、ポビドンヨードのオレンジ色がなくなるまでHBSSで目を洗います。これには約2〜3回の洗浄が必要です。
6. 新しい60 mmペトリ皿に目を置き、ステップ1.1で調製した冷たい(2〜8°C)完全なRPE細胞培養培地に浸します。

3.解剖

1. 手術用顕微鏡下で、M5Sスタイルのピンセットとバンナスはさみを使用して、結合組織と外眼筋を取り除きます。
   注:解剖は、完全に無菌環境で組織フードの下で行われます。ただし、ビデオ目的で、解剖顕微鏡はフードの外側に配置され、より高品質のデモンストレーション/撮影が実現しました。糸くずの出ないティッシュペーパーの小片を目の下に置くと、解剖時の安定性が向上します。その後、冷たいRPE細胞培養培地で一時的に(1時間以内で)目を保持することができます。ただし、目を洗浄した直後にそのまま次のステップに進むことが好ましい。
2. 4つの目ごとに1 mLの酵素A溶液を含む2 mLの微量遠心チューブに目を移します。その後、37°Cのインキュベーターで40分間眼をインキュベートします。
3. インキュベーターと微量遠心チューブから目を取り除きます。次に、それらを4つの目ごとに1mLの酵素B溶液を含む新しいマイクロ遠心チューブに移します。チューブをインキュベーター内で37°Cで50分間インキュベートします。
4. 10 mLの完全RPE細胞増殖培地を含む新しい60 mm浮遊培養皿に目を置きます。その後、目を4°Cで30分間インキュベートします。
5. 皿を手術用顕微鏡の下に置き、解剖を開始します。
6. 眼球の前部(角膜、虹彩、水晶体)をアイカップの後部(網膜後部)から外します。
   1. M5Sスタイルの鉗子で目をつかみ、#11ブレードまたは注射器の針でオラセラタセクション(水色が終わる網膜の最も前部)を切開します。
   2. 1対の鉗子で切開部の内側をつかみ、別の一対の鉗子で角膜をつかみます。網膜から角膜をゆっくりと引っ張ったり引き裂いたりし始めます。RPEがほとんど無傷のままで、よりきれいな裂け目になるように、角膜を取り除きながら少しずつ裂き、涙を下に移動してください。
      注意: 角膜が完全に剥離すると、虹彩と水晶体が見えます。
   3. 角膜と虹彩の両方を分離します。
7. 目の後半分を穏やかに圧縮して、レンズをアイカップから分離します。
8. RPE層から神経網膜を除去するには、1対のピンセットでアイカップの外層をつかみ、2対目のピンセットの腕をRPE層と神経層の両方の間に配置します。そこから、神経網膜をRPE層からそっと引っ張るかすくい取ります。神経網膜を捨てます。
   注:ビデオでは、神経網膜と水晶体が一緒に除去されています。ただし、初心者の場合は、それぞれを個別に削除する方が簡単です。残っているのは、RPE、脈絡膜、強膜です。
9. 角膜、虹彩、水晶体、神経網膜を廃棄します。残りのアイカップを破片のない皿の新しい領域に移動します。
10. 脈絡膜と強膜からRPEを分離するには、5/45スタイルのピンセットでアイカップの内側をそっとこすり、RPE細胞を確実に分離します。RPE細胞は、完全なRPE細胞増殖培地に懸濁すると白濁して見えます。
11. 3.2 mL滅菌トランスファーピペットを使用して細胞を吸引し、完全なRPE細胞増殖培地を含む新しい15 mL遠沈管に移します。

4.遠心分離

1. 初代RPE細胞を含む15 mL遠沈管を遠心分離機内に置き、細胞を300 x gで室温で10分間遠心分離します。
2. 上清を吸引し、ペレットを10 mLの完全なRPE増殖培地で再懸濁します。完全なRPE増殖培地は、ミュラー細胞や脈絡膜内皮細胞などの他の汚染細胞よりもRPE増殖に特異的です。ミュラー細胞は高グルコース培地を必要とし、脈絡膜内皮細胞は特定の成長因子を必要とします。培地を交換し、培養物を継代することにより、RPE細胞のみが増殖し続けます。

5. 細胞培養

1. 再懸濁した初代RPE細胞を滅菌済みの100 mmペトリ皿にプレートし、インキュベーターに移します( 図1E-Nに示すように、特定のRPE/ミュラー細胞マーカーで細胞を染色して純度を検証した後)。細胞を37°Cおよび5%_CO2でインキュベートする。
   注意: 使用されているマーカーは、 材料の表に記載されています。この工程は、培養が確立された後に行われる。
2. 細胞を約5日間インキュベートして増殖させます。この間、培地を交換したり、細胞を乱したり、細胞培養プレートを動かしたりしないでください(これはプロトコルの重要なステップであり、分離後、細胞をインキュベートし、5日間乱さないでください)。
   注:セルの数は、分離に使用される目の数によって異なります。分離された目の数が多いほど、より多くの細胞が生成されます。両眼からのRPE単離は、~440,000-880,000細胞、または880万個の細胞を保持できる100mmペトリ皿の5%-10%を生成します。

6.継代

1. 培地を吸引し、2 mLのPBSで洗浄します。次に、PBSを吸引します。
2. 4 mLの0.25%トリプシン-EDTA(1x)、または皿の底を覆うのに十分な量を追加します。室温で5〜10分間インキュベートします。
3. 8 mLの予熱RPE培地、またはステップ6.2で使用したトリプシンの量の2倍の量を追加します。次に、細胞を収集し、15 mLの遠沈管に入れます。
4. 室温で300 x g で7分間遠心分離します。上清を吸引し、ペレットを10 mLの完全RPE細胞培養培地に再懸濁します。懸濁液全体を滅菌100 mmペトリ皿にプレートします。
   注:細胞は4〜5回まで継代することができます¹⁸。ただし、最も一貫した実験結果は、2〜3回の継代後に見つかります。2〜4回の継代後、細胞の形状はより細長いように変化し( 図1Dに示すように)、プレートの中央に蓄積し、成長を停止し、剥離しました。
5. 以前に公開された方法8,14,15,16に従って免疫蛍光プロトコルを使用して、RPE特異性を染色および検証します。

7.免疫蛍光

注:免疫蛍光法は、RPE特異性を染色および検証するために、以前に公開された方法⁸、^14、15、16、^17、18に従って実施されました。 初代RPE細胞の染色は、典型的には継代P1およびP2で行われた。ここでは、免疫蛍光プロトコルの概要を説明します。

1. 細胞培養チャンバースライドに細胞をシードします(8ウェルチャンバースライドの場合はウェルあたり30,000細胞)。
2. 細胞を完全RPE細胞培養培地中で37°Cおよび5%_CO2 で24〜48時間培養する。
3. 細胞が80%〜90%コンフルエントになったら、培地を吸引し、チャンバースライドを1x PBSで洗浄します。
4. スライドを4%パラホルムアルデヒドで10〜15分間固定します。
5. 4%パラホルムアルデヒドを吸引し、ブロッキング溶液でブロックします(材料の表を参照)。
6. ブロッキング溶液を吸引し、一次抗体RPE65を添加し、37°Cで3時間インキュベートします(ブロッキングバッファー中の抗体濃度は1:200-1:250の範囲で、容量は150-200 μL/スライド)。次に、PBS / TX-100で3回洗浄します(各洗浄で5〜10分)。
7. 一次抗体を吸引し、二次抗体を追加します(ブロッキングバッファー中の抗体濃度1:1,000、容量150-200 μL/スライド)。37°Cで1時間インキュベートします。
8. 二次抗体を吸引します。PBS / Trtion X-100で3回洗浄します(各洗浄で5〜10分)。
9. DAPI封入剤を一滴加えて核にラベルを付け、スライドの上にカバーガラスを置きます。カバーガラスの下に気泡がないことを確認してください。
10. 次に、高解像度顕微鏡(HRM)カメラと画像処理ソフトウェアを備えた蛍光顕微鏡で画像を撮影します( 材料表を参照)。

単離されたRPE細胞の特異性、純度、バリア機能/形成の検証
単離した細胞を光学顕微鏡で検査し、生存率、形態、および色素沈着を検証しました。P0とP1からの画像(図1A、B)とP0とP4からの画像(図1C、D)をキャプチャして、細胞の変化を示しました。継代が4番目の継代に進むにつれての形状、サイズ、および色素沈着(黒い矢印はP4の単離されたRPE細胞を指している)。RPE65タンパク質の抗体を使用して、単離された細胞の同一性を検証しました。単離した細胞の免疫蛍光染色をRPE65に対する抗体で行い、続いて蛍光顕微鏡下で調べた(図1E、F:低倍率、および図1G、H:高倍率、陽性染色されたRPE細胞を緑色で、核マーカーDAPIを青色で示す)。RPE65は、RPEで発現するイソメロヒドロラーゼである。これは、桿体および錐体を介した視覚に必要な視覚色素の再生に不可欠です²¹。分離のバリア機能を検証するには
細胞は、細胞骨格タンパク質Fアクチンおよびタイトジャンクションタンパク質ZO-1の両方を単離した細胞について⁸ の免疫蛍光染色法を用いた(図1I、J:緑色ZO-1および青色核染色)。 図1K、L:赤色のF-アクチンおよび青色の核染色)。ただし、RPEの典型的な石畳の形状は、細胞が完全にコンフルエントである場合に非常に明白です。

陰性対照は、二次抗体を一次抗体を添加せずにRPE細胞に添加した実験において使用し、抗体の特異性および得られた色が使用された抗体に特異的であることを確認した(図示せず)。

ミュラー細胞による単離されたRPEの純度と汚染を検証するために、ミュラー細胞をポジティブコントロールとして使用して、ミュラー細胞の特定の細胞マーカーであるビメンチンによる単離細胞の免疫蛍光染色を使用しました( 図1M、Nに示すように核染色には緑と青)。単離されたRPE細胞は、ビメンチンに対して陰性染色を示した。

単離した細胞を光学顕微鏡で検査し、生存率、形態、および色素沈着を検証しました。P0およびP1からの画像(図1K、L)およびP0およびP4からの画像(図1M、N)をキャプチャし、継代が4番目の継代に進むにつれて細胞の形状、サイズ、および色素沈着の変化を示しました(黒い矢印はP4の単離されたRPE細胞を指しています)。

図1:RPEアイソレーションの検証 。 (A)RPEパッセージゼロ(P0)用の光学顕微鏡。(B)RPE継代1(P1)用の光学顕微鏡。(C)P0での形態特性評価。(D)P4での形態特性評価。(E)RPE65の低倍率での免疫染色。(F)DAPIによる核染色によるRPE65の免疫染色。(g)高倍率でのRPE65の免疫染色。(h)高倍率DAPIによる核染色によるRPE65の免疫染色。(i)RPE細胞に対するZO-1染色。(G)DAPIによる核染色によるRPE細胞のZO-1染色。(k)RPE細胞のFアクチン染色。(L)DAPIによる核染色によるRPE細胞のFアクチン染色。(m)RPE細胞に対するビメンチン染色。(N)ポジティブコントロールとしてのミュラー細胞のビメンチン染色(RMc-1)とDAPIによる核染色。スケールバーは、それぞれ300 μm、20 μm、300 μm、300 μm、50 μm、10 μm、50 μm、50 μm、および50 μmに等しくなります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

現在のプロトコルは、マウスの目からRPEを分離するための報告、修正、および簡略化された詳細な手順です。このプロトコルには、マウスの目から分離されたRPE細胞の核摘出、解剖、収集、播種、培養、および特性評価が含まれます。

マウスの年齢、解剖された目の数、組織培養プレートまたは皿のサイズ、播種、保管、継代後の注意など、RPE分離を成功させるために満たさなければならないいくつかの制限と重要なステップがあります。単離された細胞を3〜4回まで継代できるようにするために、最良のマウス年齢は18〜21日の間である。成長および増殖することができる妥当な数の単離された細胞を有するためには、単一の単離のために少なくとも2つの眼が必要である。単離される細胞の数は、解剖された眼の数(~220,000細胞/眼)に比例します。滅菌済みの100 mmペトリ皿/フラスコは、早期継代でより多くの細胞を得るために推奨されます(P0)。播種後、組織培養プレートをインキュベーターから移動したり、培地を少なくとも5日間交換したりして、細胞を乱してはなりません。また、この技術の制限の1つは、単離された細胞の貯蔵および継代である。細胞は保存(凍結および再解凍)できず、継代は3〜4回しかできません。継代4の後、細胞はサイズと形状を変化させ始め、細胞の色素沈着が著しく減少して細長い(紡錘形)になります(図1D)。

このプロトコルは、初代マウスRPE^単離のための他の貴重で信頼性の高い公開プロトコル1 ³、^19、20とは異なり、従うのが簡単ないくつかの手順で簡素化されています。RPE細胞は、その形態、色素沈着、およびRPE65 ^4,5,21などの特異的RPEマーカーによって同定することができる。ミュラー細胞の純度と汚染の検証は、単離した細胞をミュラー細胞の特定の細胞マーカー(ビメンチン)で染色することによって達成されました²²。電子顕微鏡(EM)検査、タイトジャンクションタンパク質(TJP)の評価、FITICデキストラン漏出アッセイ、単分子膜としてのRPEの生理学的機能を評価する経上皮電気抵抗(TER)測定など、in vitroで血液網膜関門(BRB)の完全性を評価するために多くの技術が使用されてきました^8,23。.RPE細胞は外側のBRBを維持する上で重要な役割を果たしており、この機能を検証するために、Zona ocludin-1(ZO-1)などのタイトジャンクションタンパク質(TJP)や、以前に発表されたF-アクチンなどの細胞骨格タンパク質を評価しました⁸。TJPの評価は、EM評価やTERとは対照的に、すべての研究室で利用できるとは限らない高価な機器を必要としないBRBの完全性とバリア機能の評価のためのより便利な方法です。

一次RPE単離は、根底にあるメカニズムと病因を研究し、さまざまな眼疾患の新しい治療用途を提案するための重要なツールとなる可能性のある技術です。現在の技術により、加齢黄斑変性症におけるRPE細胞の構造と機能の変化、およびそれらが外側のBRBに与える影響を研究することができました⁸。さらに、野生型C57BL6マウスおよび異なる遺伝子改変マウスから単離されたRPE細胞の変化の研究、ならびに^AMD14,16の治療標的を求めるさまざまな薬理学的化合物の試験にも役立ちました。

結論として、利用可能な多くの公開プロトコルが初代マウスRPE単離を実証した。提示されたプロトコルは、マウスの目から初代RPE細胞を単離するためにほとんどの研究室で利用可能な材料、方法、および機器を使用して、いくつかの既存のプロトコルを変更することから生じる簡略化された手順です。

著者は、この記事の内容に関連することを宣言する利益相反はありません。

この研究は、国立眼研究所(NEI)、国立眼研究所(NEI)基金R01 EY029751-04によってサポートされました。

An erratum was issued for: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. The Discussion and References sections were updated.

The third paragraph of the Discussion section was updated from:

This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation^13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE65^4,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)²². Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer^8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published⁸. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.

to:

This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation^13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE65^4,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)²². Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer^8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published⁸. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.

In the References section, a 24^th reference was added:

24. Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).