小鼠原代视网膜色素上皮细胞的分离

本手稿描述了一种逐步从小鼠眼睛中分离视网膜色素上皮（RPE）细胞的简化方案。该方案包括小鼠眼睛的剜除和解剖，然后是RPE细胞的分离，接种和培养。

视网膜色素上皮（RPE）层紧邻光感受器后面，并拥有一个复杂的代谢系统，在维持光感受器的功能中起着几个关键作用。因此，RPE结构和功能对于维持正常视力至关重要。该手稿介绍了原代小鼠RPE细胞分离的既定方案。RPE分离是研究不同眼部疾病小鼠模型中RPE病理学分子机制的好工具。此外，RPE分离可以帮助比较从野生型和转基因小鼠中分离的原代小鼠RPE细胞，以及测试可以加速视觉障碍治疗开发的药物。手稿提出了一个循序渐进的RPE隔离方案;整个过程，从眼球摘除到播种，大约需要4个小时。接种后5-7天内不应更换培养基，以使分离的细胞不受干扰地生长。该过程之后通过免疫荧光 表征 细胞中的形态、色素沉着和特异性标志物。细胞最多可以传代三到四次。

视网膜色素上皮（RPE）细胞位于脉络膜和神经视网膜之间，形成位于感光器（PR）细胞后面的简单单层立方体细胞¹。RPE在维持PR细胞的健康环境中起着关键作用，主要是通过减少活性氧（ROS）的过度积累和随之而来的^{氧化损伤1}。RPE细胞监督许多功能，例如类视黄醇的转化和储存，散射光的吸收，液体和离子运输以及脱落的PR外段膜^2，3的吞噬作用。RPE（形态/功能）的改变会损害其功能，导致视网膜病变，这是许多眼部疾病的共同特征⁴。许多眼部疾病与RPE细胞形态和功能的改变有关，包括一些遗传性疾病，如色素性视网膜炎、Leber先天性黑朦和白^化病4，⁵，^6，以及与年龄相关的眼部疾病，如糖尿病视网膜病变（DR）和年龄相关性黄斑变性（AMD）^7，8.人类细胞是最理想的，因此研究原代人RPE细胞中的RPE疾病以形成RPE单层是理想的。然而，伦理问题和人类供体的可用性有限，因为大多数这些疾病导致发病率⁹，但不一定导致死亡率¹⁰，从而阻止了原代人RPE细胞的分离。这使得培养来自非人类动物供体的RPE细胞成为首选的替代方案。啮齿动物，特别是小鼠，被认为是研究不同眼部疾病的绝佳模型，因为转基因技术在这些物种中得到了更广泛的建立¹¹。尽管使用培养的原代RPE细胞具有许多优点，但很难维持生长的细胞进行多次传代，或者储存和重复使用细胞。该协议的主要限制是小鼠的年龄;用于RPE分离的小鼠应该非常年轻（18-21天大是最佳的），因为很难从成年小鼠^11，12，13培养RPE细胞。RPE细胞可以在任何年龄从小鼠眼睛中分离出来，但是多达四次细胞传代仅在年轻小鼠（18-21天大）中成功。使用C57BL6小鼠和在RPE细胞上缺失N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDARs）的转基因小鼠从小鼠视网膜中分离RPE以研究升高的氨基酸同型半胱氨酸对AMD¹⁴发育和进展的影响。此外，分离的原代RPE细胞通过抑制RPE细胞的NMDAR来帮助提出AMD的治疗靶点¹⁴。有一些NMDAR阻滞剂已获得美国食品和药物管理局（FDA）的批准，目前用于治疗与阿尔茨海默病（AD）相关的中度至重度混乱（痴呆），例如美金刚¹⁶，这可能是AMD¹⁴的潜在治疗靶点。此外，分离的原代小鼠RPE细胞用于检测炎症标志物，并使用转基因小鼠（CBS）诱导炎症作为同型半胱氨酸诱导的AMD和AD特征的潜在机制，其表现出高水平的同型半胱氨酸^16，17。

该方案用于从我们实验室开发的野生型C57BL / 6小鼠和转基因小鼠中分离RPE细胞，作为其他已发布的分离方案¹³，¹⁸，¹⁹的简化改编^，以达到易于应用和可靠的方案。该协议中没有性别偏好。虽然小鼠年龄对分离过程至关重要，但年轻，年龄的小鼠（18-21天大）和任何年龄（长达12个月）的老年小鼠用于RPE分离。然而，我们注意到从年轻小鼠中分离的RPE细胞寿命更长，最多可以进行四次传代。从老年小鼠中分离的RPE细胞可以传代一次或两次，然后它们将停止以正常速率生长并改变其形状以更细长（成纤维细胞样细胞）。还观察到色素沉着丧失和对组织培养板的粘附降低，随后出现脱落。

根据奥克兰大学IACUC动物协议编号21063的指南和ARVO在眼科和视觉研究中使用动物的声明的指南使用动物。

1. 溶液制备

1. 通过补充 Dulbecco 的改良鹰培养基/营养混合物 F-12 （DMEM/F12） 和 25% 胎牛血清 （FBS）、1.5% 青霉素/链霉素和 0.02% 庆大霉素来制备完整的 RPE 细胞培养基。
2. 通过向 741 μL Hank 平衡盐溶液 （HBSS） 补充 127 μL 胶原酶储备溶液和 132 μL 透明质酸酶储备溶液来制备酶 A。这使得最终体积为 1 mL，可以治疗四只眼睛。
   1. 通过将 1 mg 溶 组织梭 菌中的胶原蛋白酶溶解在 41 mL HBSS（19.5 单位/mL）中来制备胶原酶储备溶液。
   2. 通过将 1 mg 来自牛睾丸的透明质酸酶溶解在 18.4 mL HBSS（38 单位/mL）中来制备透明质酸酶储备溶液。
3. 通过将两份 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 添加到三份 HBSS 中来制备酶 B。请注意，总体积取决于解剖的眼睛数量;1 mL 酶 B 可用于治疗四只眼睛。

2. 去核

1. 根据IACUC标准²¹，使用二氧化碳（CO₂）吸入对小鼠实施道德安乐死。
   1. 简而言之，将动物置于CO 2室中以每分钟30%-70%的CO₂填充速率引入100%CO 2，以在₂至3分钟内实现无意识，对小鼠的痛苦最小。
   2. 确认死亡（缺乏呼吸和褪色的眼睛颜色），然后将鼠标从笼子移动到配备无菌手术设备的清洁灭菌手术区域（用酒精擦洗）。
2. 将鼠标放在无菌垫上。
3. 通过在眼眶区域按压 5/45 型镊子来诱导眼球突出，然后将镊子移到眼睛的后部，使眼睛去核。在视神经完好无损的情况下，通过将眼睛轻轻地从眼眶腔中拉出来提取眼睛。
4. 使用镊子将眼睛浸入含有 1mL 5% 聚维酮碘的 2 mL 微量离心管中。在室温下孵育眼睛2-3分钟。
5. 从聚维酮碘溶液中取出眼睛，并将它们放入培养皿中。使用无菌转移移液器，用HBSS清洗眼睛，直到聚维酮碘的橙色消失。这大约需要两到三次洗涤。
6. 将眼睛放在新的60mm培养皿中，并将其浸没在步骤1.1中制备的冷（2-8°C）完全RPE细胞培养基中。

3. 解剖

1. 在手术显微镜下，使用M5S型镊子和Vannas剪刀去除结缔组织和眼外肌。
   注意:解剖是在完全无菌环境中的组织罩下进行的。但是，出于视频目的，解剖显微镜放置在引擎盖外，以实现更高质量的演示/拍摄。在眼睛下方放置一小块不起毛的薄纸可以提高解剖过程中的稳定性。然后可以将眼睛暂时（不超过1小时）放在冷的RPE细胞培养基中。但是，最好在清洁眼睛后立即直接进行下一步。
2. 将眼睛转移到每四只眼睛含有 1 mL 酶 A 溶液的 2 mL 微量离心管中。然后，将眼睛在37°C的培养箱中孵育40分钟。
3. 从培养箱和微量离心管中取出眼睛。然后，将它们转移到每四只眼睛含有 1 mL 酶 B 溶液的新微量离心管中。将管在37°C的培养箱中孵育50分钟。
4. 将眼睛放在含有 10 mL 完整 RPE 细胞生长培养基的新 60 mm 悬浮培养皿中。然后将眼睛在4°C孵育30分钟。
5. 将培养皿放在手术显微镜下并开始解剖。
6. 从眼罩的后部（视网膜后部）取出眼睛的前部（角膜、虹膜和晶状体）。
   1. 用M5S型镊子抓住眼睛，并用#11刀片或注射器的针头在锯齿口部分（浅蓝色末端的视网膜最前部）切开一个切口。
   2. 用一对镊子抓住切口的内部，用另一对镊子抓住角膜。开始慢慢地从视网膜上拉出或撕裂角膜。确保以小增量撕裂并在去除角膜的同时向下移动撕裂，以确保 RPE 基本保持完整并导致更干净的撕裂。
      注意:一旦角膜完全分离，就可以看到虹膜和晶状体。
   3. 将角膜和虹膜分开。
7. 将晶状体与眼罩分开，轻轻按压眼睛的后半部分。
8. 要从 RPE 层中去除神经视网膜，请用一对镊子抓住眼罩的外层，并将第二对镊子的手臂定位在 RPE 和神经层之间。从那里，轻轻地将神经视网膜从RPE层拉开或舀开。丢弃神经视网膜。
   注意:在视频中，神经视网膜和晶状体一起被移除。但是，对于初学者来说，单独删除每个会更容易。剩下的是 RPE、脉络膜和巩膜。
9. 丢弃角膜、虹膜、晶状体和神经视网膜。将剩余的眼罩移动到培养皿上没有碎屑的新区域。
10. 要将 RPE 与脉络膜和巩膜分离，请用 5/45 型镊子轻轻刮擦眼罩内部，以确保 RPE 细胞的分离。当悬浮在完整的RPE细胞生长培养基中时，RPE细胞看起来混浊。
11. 使用 3.2 mL 无菌转移移液管吸出细胞，并转移到含有完整 RPE 细胞生长培养基的新 15 mL 离心管中。

4. 离心

1. 将含有初级RPE细胞的15 mL离心管放入离心机内，并在室温下以300 x g 离心细胞10分钟。
2. 吸出上清液并用 10 mL 完全 RPE 生长培养基重悬沉淀。完整的 RPE 生长培养基比其他污染细胞（如 Müller 细胞或脉络膜内皮细胞）对 RPE 生长更具特异性。Müller细胞需要高葡萄糖培养基，而脉络膜内皮细胞需要特定的生长因子。通过改变培养基和传代培养物，只有RPE细胞会继续生长。

5. 细胞培养

1. 将重悬的原代RPE细胞接种到无菌100mm培养皿上，并将它们转移到培养箱中（通过用特定的RPE / Müller细胞标记物染色细胞来验证纯度后，如图 1E-N所示）。将细胞在37°C和5%CO₂下孵育。
   注意:使用的标记在 材料表中提及。此步骤在建立区域性后执行。
2. 孵育细胞约5天以生长。在此期间，请勿更换培养基，干扰细胞或移动细胞培养板（这是方案中的关键步骤;分离后，应孵育细胞并且5天内不要受到干扰）。
   注意:细胞数量取决于用于隔离的眼睛数量。隔离的眼睛数量越多，细胞数量就越多。从两只眼睛中分离的RPE将产生~440，000-880，000个细胞，或100毫米培养皿的5%-10%，可容纳880万个细胞。

6. 传代

1. 吸出培养基并用 2 mL PBS 洗涤。然后吸出PBS。
2. 加入 4 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA （1x），或足以覆盖培养皿底部。在室温下孵育5-10分钟。
3. 加入 8 mL 预热的 RPE 培养基或步骤 6.2 中使用的胰蛋白酶体积的两倍。然后收集细胞并将其放入 15 mL 离心管中。
4. 在室温下以300 ×g 离心7分钟。吸出上清液并将沉淀重悬于 10 mL 的完整 RPE 细胞培养基中。将整个悬浮液铺在无菌的100毫米培养皿中。
   注意:细胞最多可传代四到五次¹⁸。然而，最一致的实验结果是在两到三次传代后发现的。经过两到四次传代后，细胞改变其形状（如图 1D所示）以更加细长，积聚在板的中间，停止生长并分离。
5. 按照先前发表的方法⁸，¹⁴，^15，16，使用免疫荧光方案对RPE特异性进行染色和验证。

7. 免疫荧光

注意:按照先前发表的方法⁸，^14，15，16，¹⁷，¹⁸进行免疫荧光^，以染色和验证RPE特异性。原代RPE细胞的染色通常在P1和P2传代处进行。这里简要概述了免疫荧光方案。

1. 将细胞接种在细胞培养室载玻片上（8孔室载玻片每孔30，000个细胞）。
2. 在37°C和5%CO₂ 的完整RPE细胞培养基中培养细胞24-48小时。
3. 当细胞汇合80%-90%时，吸出培养基并用1x PBS清洗腔室载玻片。
4. 用4%多聚甲醛固定载玻片10-15分钟。
5. 吸出4%的多聚甲醛，然后用封闭溶液封闭（见 材料表）。
6. 吸出封闭溶液并加入一抗RPE65，并在37°C下孵育3小时（封闭缓冲液中的抗体浓度范围为1:200-1:250，体积为150-200μL/载玻片）。然后，用PBS / TX-100洗涤三次（每次洗涤5-10分钟）。
7. 吸出一抗并加入二抗（封闭缓冲液中的抗体浓度为1:1，000，体积为150-200μL/载玻片）。在37°C孵育一小时。
8. 吸出二抗。用PBS / Trtion X-100洗涤三次（每次洗涤5-10分钟）。
9. 添加一滴DAPI封片剂以标记细胞核，并在载玻片上放置盖玻片。确保盖玻片下方没有气泡。
10. 然后，用荧光显微镜拍摄图像，并配合高分辨率显微镜（HRM）相机和图像处理软件（见 材料表）。

验证分离的 RPE 细胞的特异性、纯度和屏障功能/形成
在光学显微镜下检查分离的细胞以验证其活力，形态和色素沉着。捕获来自P0和P1的图像（图1A，B）以及来自P0和P4的图像（图1C，D）以显示细胞的变化;当传代进行到第四代时，形状，大小和色素沉着（黑色箭头指向P4中分离的RPE细胞）。RPE65蛋白的抗体用于验证分离细胞的身份。用抗RPE65抗体对分离的细胞进行免疫荧光染色，然后在荧光显微镜下检查（图1E，F:低放大倍率，图1G，H:高放大倍率，显示阳性染色的RPE细胞为绿色，核标记DAPI为蓝色）。RPE65是一种在RPE中表达的异构体水解酶。它对于视杆细胞和视锥细胞介导的视觉所需的视觉色素的再生至关重要²¹ .验证隔离的屏障功能
细胞，细胞骨架蛋白F-肌动蛋白和紧密连接蛋白ZO-1免疫荧光染色⁸ 用于分离的细胞（图1I，J:绿色ZO-1和蓝色核染色）。和 图1K，L:红色F-肌动蛋白和蓝色核染色）。然而，当细胞完全汇合时，RPE的典型鹅卵石形状非常明显。

在将二抗添加到RPE细胞而不添加一抗的实验中使用阴性对照，以确保抗体的特异性和所得颜色对所使用的抗体具有特异性（未显示）。

为了验证Müller细胞对分离的RPE的纯度和污染，使用Müller细胞的特定细胞标记vimentin对分离的细胞进行免疫荧光染色（绿色和蓝色用于核染色， 如图1M，N所示）使用Müller细胞作为阳性对照。分离的RPE细胞显示vimentin染色阴性。

在光学显微镜下检查分离的细胞以验证其活力，形态和色素沉着。捕获来自P0和P1的图像（图1K，L）以及来自P0和P4的图像（图1M，N），以显示当传代进行到第四代时细胞形状，大小和色素沉着的变化（黑色箭头指向P4中分离的RPE细胞）。

图 1:RPE 隔离验证。 （A） 用于 RPE 通道零 （P0） 的光学显微镜。（B）用于RPE通道一的光学显微镜（P1）。（C）P0处的形态特征。（D）P4的形态特征。（E）低放大倍率下RPE65的免疫染色。（F）用DAPI核染色对RPE65进行免疫染色。（G）高放大倍率下RPE65的免疫染色。（H）在高放大倍率下用DAPI进行核染色对RPE65进行免疫染色。（I） RPE 细胞的 ZO-1 染色。（G） 用 DAPI 核染色对 RPE 细胞进行 ZO-1 染色。（K）用于RPE细胞的F-肌动蛋白染色。（L）用DAPI核染色对RPE细胞进行F-肌动蛋白染色。（M）RPE细胞的Vimentin染色。（N） 缪勒细胞的Vimentin染色作为阳性对照（RMc-1），用DAPI进行核染色。比例尺分别等于 300 μm、20 μm、300 μm、300 μm、50 μm、10 μm、50 μm、50 μm 和 50 μm。请点击此处查看此图的大图。

当前协议是从小鼠眼睛中分离RPE的报告，修改和简化的详细程序。该协议包括从小鼠眼睛分离的RPE细胞的剜除，解剖，收集，接种，培养和表征。

成功进行RPE分离必须满足一些限制和关键步骤，例如小鼠年龄，解剖的眼睛数量，组织培养板或培养皿的大小以及接种，储存和传代后的注意事项。为了能够传代分离的细胞多达三到四次，最好的小鼠年龄在18-21天之间。为了获得合理数量的能够生长和繁殖的分离细胞，单次分离至少需要两只眼睛。导致分离的细胞数量与解剖的眼睛数量成正比（~220，000个细胞/眼）。建议使用无菌的100 mm培养皿/烧瓶，以便在早期传代（P0）中获得更多的细胞。接种后，不应通过将组织培养板从培养箱中移出或更换培养基至少5天来干扰细胞。此外，该技术的局限性之一是分离细胞的存储和传代。细胞不能储存（冷冻和解冻），只能传代三到四次。传代4后，细胞开始改变其大小和形状，变得细长（纺锤形），细胞色素沉着显着减少（图1D）。

该协议不同于其他有价值且可靠的已发表的用于原代小鼠RPE^分离13，^19，20的方案，因为它通过几个易于遵循的步骤进行了简化。RPE细胞能够通过其形态，色素沉着和特定的RPE标志物（例如RPE65^4，5，21）进行识别。通过用特定的Müller细胞标记物（vimentin^）染色分离的细胞来实现Müller细胞纯度和污染的验证22。许多技术已被用于评估体外血液视网膜屏障 （BRB） 的完整性，例如电子显微镜 （EM） 检查、紧密连接蛋白 （TJP） 评估、FITIC 葡聚糖泄漏测定和跨上皮电阻 （TER） 测量，用于评估 RPE 作为单层的生理功能^8，23.RPE细胞在维持外部BRB中起着重要作用，为了验证此功能，我们评估了紧密连接蛋白（TJP），例如Zona ocludin-1（ZO-1）和细胞骨架蛋白（例如F-actin），如先前发表的⁸。与EM评估或TER相比，TJPs评估是评估BRB完整性和屏障功能的更方便的方法，不需要所有研究实验室都无法提供的昂贵设备。

原发性RPE分离是一种技术，可以成为研究潜在机制和发病机制的重要工具，并针对不同的眼部疾病提出新的治疗应用。目前的技术能够研究RPE细胞结构和功能的变化及其对年龄相关性黄斑变性中外BRB的影响⁸。此外，它有助于研究从野生型C57BL6小鼠和不同转基因小鼠中分离的RPE细胞的变化，以及测试寻求AMD^14，16治疗靶点的不同药理化合物。

总之，许多可用的已发表方案证明了原代小鼠RPE分离。所提出的方案是通过修改一些现有方案而得出的简化程序，使用大多数研究实验室中可用的材料，方法和设备从小鼠眼睛中分离原代RPE细胞。

作者没有与本文内容相关的利益冲突声明。

这项工作得到了国家眼科研究所（NEI），国家眼科研究所（NEI）基金R01 EY029751-04的支持。

An erratum was issued for: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. The Discussion and References sections were updated.

The third paragraph of the Discussion section was updated from:

This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation^13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE65^4,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)²². Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer^8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published⁸. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.

to:

This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation^13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE65^4,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)²². Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer^8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published⁸. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.

In the References section, a 24^th reference was added:

24. Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).